CN114365717B - 青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法及该动物模型 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法及该动物模型，该构建方法包括如下步骤：1)动物麻醉：对动物进行麻醉，保持动物的眼球微凸；2)眼部麻醉：对动物的左眼和/或右眼进行表面麻醉，作为受试眼；3)病毒感染：将表达EGFP的MCMV基因重组病毒经动物受试眼的角膜中央注入前房中，建立MCMV感染的动物模型。本发明青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法将小鼠巨细胞病毒注射入小鼠眼前房，构建了PSS动物模型，为PSS的发病机制的探索提供了有效的动物模型。

Description

青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法及该动物模型
技术领域
本发明属于动物模型构建的技术领域，具体地指一种青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法及该动物模型。
背景技术
在医学领域中，为了方便对某种疾病的研究，人们创造了多种疾病动物模型，如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)视网膜炎动物模型，心衰动物模型，糖尿病动物模型等。对于由病毒引发的疾病而言，将病毒注射到发病部位，若能引起与临床上相似的症状和体征可视为造模成功。如小鼠的CMV视网膜炎模型，则是通过睫状体上间隙的途径将病毒注射到视网膜与脉络膜中间进而诱发视网膜炎。目前尚未发现然而有研究进行青光眼睫状体炎综合征动物模型相关研究。
青光眼睫状体炎综合征(Posner-Schlossman Syndrome，PSS)又称青光眼睫状体炎危象，简称青睫综合征，主要表现为伴有高眼压的单侧反复发作的非肉芽肿性前葡萄膜炎。1948年Posner和 Schlossman首次对PSS的特征进行了详细描述：该疾病多发于20-50岁的人群，急性发作时眼部炎症可持续数小时至数周，并且尽管眼前节炎症轻微，房水排出通道通畅，患者眼压可显著升高，同时可伴有角膜水肿、角膜后沉着物(KeraticPrecipitates，KP)、患眼瞳孔扩大，虹膜异色等临床表现。除此之外，自限缓解及反复发作为PSS的一大特点。近年来，我们在临床工作中发现PSS逐渐成为临床上的常见病、多发病，且患者反复发作后常可导致眼底损害。PSS具体发病机制尚不明晰，目前临床上尚缺乏根治手段。因此，探索PSS的病因及发病机制具有非常重要的临床意义。
关于PSS的病因，大多数研究者认为和病原体前房感染有关。水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus，VZV)是第一个被报道可能为PSS病因的病原体。然而后续的研究中却未能在患者房水中检测到VZV。随后有研究提出单纯疱疹病毒(Herpes SimplexVirus， HSV)可能为导致PSS的病因，该研究抽取了3名患者的房水进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测，发现HSV 呈阳性而巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)和VZV阴性。然而后续研究亦未能在患者房水中检测出HSV。除此之外，幽门螺旋杆菌也曾被列为可能与PSS的发病相关的病原体。一项来自韩国的研究指出，PSS患者体内抗幽门螺旋杆菌抗体显著高于对照组(80％vs 56.2％)。随着微生物检测技术的进步，越来越多的研究表明CMV前房感染为PSS的首要病因。这一观点由Bloch-Michel等人在1987年首次提出。他们收集了390名前葡萄膜炎患者的房水，其中11名为 PSS患者，经检测仅10名患者房水中含有抗CMV抗体，然而其中7 名为PSS患者。随后，越来越多的研究开始探究CMV在免疫正常的个体中所致前葡萄膜炎的临床特点，并使用PCR的技术来确定房水中CMV DNA的存在。Chee等人调查了包含48名PSS患者在内的 105名高眼压性前葡萄膜炎的患者，24名患者的房水呈现CMV阳性，其中18名为PSS患者，上述结果表明，CMV可能与多种前葡萄膜炎相关，但PSS是最常见的一种。进一步研究显示，在这18名患者中，11名患者的房水经逆转录PCR检测呈现CMV阳性，即房水中存在活性病毒复制。为了进一步明确病毒复制与疾病急性发作的关系， Chee和Jap检测了PSS急性发作期的67只眼，其中35只眼呈现CMV 阳性。而在PSS患者缓解期抽取房水进行检测，如研究者预想的一样，所有病人均为CMV阴性。在PSS患者急性发作期房水检测出病毒而在缓解期病毒检测阴性进一步提示CMV前房感染与PSS发生发展之间存在关联。其他研究抽取PSS患者的房水进行PCR检测也得出类似的结果。除此之外，使用抗病毒药物可有效缓解PSS发作期症状，也为二者之间的因果关系提供了更进一步的依据。
为进一步明确CMV前房感染是否为PSS的病因，因此有必要构建一种青睫综合征动物模型。
发明内容
本发明的目的是要提供一种青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法及该动物模型，该构建方法将小鼠巨细胞病毒注射入小鼠眼前房，构建了PSS动物模型，为PSS的发病机制的探索提供了有效的动物模型。
为实现上述目的，本发明所设计的一种青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法，包括如下步骤：
1)动物麻醉：对动物进行麻醉，保持动物的眼球微凸；
2)眼部麻醉：对动物的左眼和/或右眼进行表面麻醉，作为受试眼；
3)病毒感染：将表达EGFP(增强绿色荧光蛋白，Enhanced Green FluorescentProtein)的MCMV(小鼠巨细胞病毒，Murine Cytomegalovirus)基因重组病毒经动物受试眼的角膜中央注入前房中，建立MCMV感染的动物模型。
进一步地，所述步骤1)中，采用腹腔注射浓度为1-3％的戊巴比妥钠对动物进行麻醉。
进一步地，所述步骤2)中，采用滴加浓度为0.5-1.5％的盐酸丙美卡因滴眼液对动物的左眼和/或右眼进行表面麻醉。
进一步地，所述步骤3)中，MCMV基因重组病毒为将EGFP 基因插入野生型MCMV基因组中，以使EGFP能够在被感染的细胞中稳定表达。
进一步地，所述步骤3)中，用微量注射泵吸入MCMV基因重组病毒，使用镊子调整小鼠眼球角度，通过玻璃电极垂直穿破受试眼的角膜，针尖进入受试眼的前房后，用微量注射泵将MCMV基因重组病毒缓慢注入。
进一步地，所述步骤3)中，MCMV基因重组病毒的浓度为103-106pfu/mL，注射量为1-2μL；用微量注射泵将MCMV基因重组病毒缓慢注入的速度为0.1-0.2μL/min。
进一步地，所述步骤3)中，使用微电极拉制仪制作玻璃电极，减去尖端解除其气密性，将液体石蜡分别注入10μL微量进样器和玻璃电极以排出空气，推动进样器活塞推至刻度线5-6μL处，擦去排出的石蜡油，将玻璃电极套入进样器针尖，用热熔胶枪封闭两者连接口处，待热熔胶凝固后，将进样器固定于微量注射泵上，再用微量注射泵吸入MCMV基因重组病毒。
再进一步地，所述步骤3)中，注射完毕后等待10-15min，用棉签轻按将玻璃电极拔出，随后继续按压5-10min。
更进一步地，所述步骤3)中，将玻璃电极拔出后使用生理盐水冲洗受试眼的结膜囊后，涂红霉素眼膏，再禁水1～2天后正常进食。
本发明还提供一种青光眼睫状体炎综合征动物模型，所述青光眼睫状体炎综合征动物模型由上述的构建方法构建而成。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
其一，本发明的青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法用插入EGFP的MCMV进行实验，在病毒引起体征改变的同时，能对病毒感染部位进行可视化定位，为后续关于MCMV相关疾病包括PSS 的发病机制的探讨提供了极大的便利。
其二，本发明的青光眼睫状体炎综合征动物模型进一步验证了 CMV前房感染为PSS的病因，为之后关于PSS的发病机制及其治疗的探索提供了有效的动物模型。
其三，本发明对注射病毒浓度梯度稀释进行探索，得到了青睫综合征小鼠模型构建的最适浓度。
附图说明
图1为动物模型的右眼眼部症状图；
其中，图A1为对照组小鼠在前房注射PBS前的眼部症状图；图A2为对照组小鼠在前房注射PBS后第10天的眼部症状图；图A3对照组小鼠在前房注射PBS后第28天的眼部症状图；
图B1为103组小鼠在前房注射MCMV前的眼部症状图；图B2 为103组小鼠在前房注射MCMV后第10天的眼部症状图；图B3为 103组小鼠在前房注射MCMV后第28天的眼部症状图；
图C1为104组小鼠在前房注射MCMV前的眼部症状图；图C2 为104组小鼠在前房注射MCMV后第10天的眼部症状图；图C3为 104组小鼠在前房注射MCMV后第28天的眼部症状图；
图D1为105组小鼠在前房注射MCMV前的眼部症状图；图D2 为105组小鼠在前房注射MCMV后第10天的眼部症状图；图D3为 105组小鼠在前房注射MCMV后第28天的眼部症状图；
图E1为106组小鼠在前房注射MCMV前的眼部症状图；图E2 为106组小鼠在前房注射MCMV后第10天的眼部症状图；图E3为 106组小鼠在前房注射MCMV后第28天的眼部症状图；
图2为动物模型的右眼瞳孔直径折线图；
其中，图A为对照组小鼠在前房注射PBS后右眼瞳孔直径折线图；图B为103组小鼠在前房注射MCMV后右眼瞳孔直径折线图；图C为104组小鼠在前房注射MCMV后右眼瞳孔直径折线图；图D 为105组小鼠在前房注射MCMV后右眼瞳孔直径折线图；图E为106组小鼠在前房注射MCMV后右眼瞳孔直径折线图；
图3为动物模型的左眼瞳孔直径折线图；
其中，图A为对照组小鼠在前房注射PBS后左眼瞳孔直径折线图；图B为103组小鼠在前房注射MCMV后左眼瞳孔直径折线图；图C为104组小鼠在前房注射MCMV后左眼瞳孔直径折线图；图D 为105组小鼠在前房注射MCMV后左眼瞳孔直径折线图；图E为106组小鼠在前房注射MCMV后左眼瞳孔直径折线图；
图4为动物模型的右眼眼压折线图；
其中，图A为对照组小鼠在前房注射PBS后右眼眼压折线图；图B为103组小鼠在前房注射MCMV后右眼眼压折线图；图C为104组小鼠在前房注射MCMV后右眼眼压折线图；图D为105组小鼠在前房注射MCMV后右眼眼压折线图；图E为106组小鼠在前房注射 MCMV后右眼眼压折线图；
图5为动物模型的左眼眼压折线图；
其中，图A为对照组小鼠在前房注射PBS后左眼眼压折线图；图B为103组小鼠在前房注射MCMV后左眼眼压折线图；图C为104组小鼠在前房注射MCMV后左眼眼压折线图；图D为105组小鼠在前房注射MCMV后左眼眼压折线图；图E为106组小鼠在前房注射 MCMV后左眼眼压折线图；
图6中图A为注射病毒或PBS后各组小鼠瞳孔直径值；图B为注射病毒或PBS后各组小鼠眼压值；图C为注射病毒或PBS后各组小鼠角膜混浊程度；图D为注射病毒后不同浓度组出现PSS样症状的小鼠数量；图A、B、C中每组的每一个点代表该组的一只小鼠。
图7为动物模型的眼球切片HE染色图；
其中，图A1为注射当天小鼠右眼眼球切片HE染色图；图A2 为注射当天小鼠注射左眼眼球切片HE染色图；图A3为图A1中方框区域的放大图；图A4为图A1中方框区域的放大图；图B1为注射后第10天小鼠右眼眼球切片HE染色图；图B2为注射后第10天小鼠注射左眼眼球切片HE染色图；图B3为图B1中方框区域的放大图；图B4为图B2中方框区域的放大图；图C1为射后第28天小鼠右眼眼球切片HE染色图；图C2为注射后第28天小鼠注射左眼眼球切片HE染色图；图C3为图C1中方框区域的放大图；图C4为C2 中方框区域的放大图；
图8为动物模型的眼球切片荧光图；
其中，图A1为注射当天小鼠右眼眼球切片荧光图；图A2为注射当天小鼠注射左眼眼球切片荧光图；图A3为图A1中方框区域的放大图；图A4为图A2中方框区域的放大图；图B1为注射后第10 天小鼠右眼眼球切片荧光图；图B2为注射后第10天小鼠注射左眼眼球切片荧光图；图B3为图B1中方框区域的放大图；图B4为图 B2中方框区域的放大图；图C1为注射后第28天小鼠右眼眼球切片荧光图；图C2为注射后第28天小鼠注射左眼眼球切片荧光图；图 C3为图C1中方框区域的放大图；图C4为图C2中方框区域的放大图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法，包括如下步骤：
使用1％的戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射对小鼠进行麻醉，保持小鼠眼球微凸，将小鼠固定于脑立体定位仪上。用0.5％盐酸丙美卡因滴眼液对小鼠右眼进行表面麻醉。吸入1μL表达EGFP的 MCMV基因重组病毒(MCMV基因重组病毒，将egfp基因插入野生型MCMV基因组中，使EGFP能够在被感染的细胞中稳定表达，作为实验组)或无菌PBS(作为对照组)，使用镊子调整小鼠眼球角度，通过玻璃电极垂直穿破小鼠角膜，注意避免进针过深损伤晶状体及虹膜等眼内结构，确认针尖处于小鼠前房后，用微量注射泵将液体缓慢注入，注射速度为0.1μL/min，注射完毕后等待10min左右，用棉签轻按将玻璃电极缓慢拔出，随后继续按压5min以避免前房内液体流出，为预防感染，使用生理盐水冲洗结膜囊后，涂红霉素眼膏，将手术后的小鼠放至加热垫上，待小鼠清醒后放回笼中，术后的小鼠禁水一天，正常进食。
本实施例中，使用微电极拉制仪制作玻璃电极，用剪刀减去少许尖端解除其气密性，注意保持针尖粗细适中便于后续注射穿刺，将液体石蜡分别注入10μL微量进样器和玻璃电极以排出空气，推动进样器活塞推至刻度线5-6μL处，擦去排出的石蜡油，将玻璃电极套入进样器针尖，用热熔胶枪封闭两者连接口处，待热熔胶凝固后，将进样器固定于微量注射泵上。
本实施例中，实验设计如下：将25只BALB/c雌性小鼠随机分为5组，每组5只。应用本发明青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法，在对照组小鼠右眼前房注射1μL无菌平衡盐溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)(作为对照组)，在4组实验组小鼠(每组5只)右眼前房分别注射1μL 103pfu/mL(作为103组)、1μL 104pfu/mL(作为104组)、1μL 105pfu/mL(作为105组)、1μL 106pfu/mL(作为105组)表达EGFP的MCMV。前房注射前及注射后的第1、3、5、7、 10、13、16、19、22、25、28天分别测量双眼眼压、瞳孔直径。另取9只小鼠在右眼前房注射1μL 106pfu/mL MCMV后第10天进行心脏灌流，取双眼眼球制作石蜡切片，使用玻片扫描仪观察荧光信号。另外取石蜡切片进行HE染色，随后使用显微镜进行观察。
对MCMV前房感染后的动物模型进行检测，结果如下：
(1)MCMV前房感染后眼部症状图。MCMV前房感染可诱导一过性瞳孔散大，并呈现浓度梯度依赖性，如图1所示。
A.对照组小鼠在前房注射PBS前(A1)、注射后第10天(A2)、注射后第28天(A3),右眼瞳孔直径无明显变化。
B.103组小鼠在前房注射MCMV前(B1)、注射后第10天(B2)、注射后第28天(B3),右眼瞳孔直径无明显变化。
C.104组小鼠在前房注射MCMV前(C1)、注射后第10天(C2)、注射后第28天(C3),右眼瞳孔直径先扩大，随后逐渐恢复。
D.105组小鼠在前房注射MCMV前(D1)、注射后第10天(D2)、注射后第28天(D3),右眼瞳孔直径先扩大，随后逐渐恢复。
E.106组小鼠在前房注射MCMV前(E1)、注射后第16天(E2)、注射后第28天(E3),右眼瞳孔直径先扩大，随后无法恢复。
(2)MCMV前房感染后右眼瞳孔直径折线图。MCMV前房感染可诱导一过性瞳孔散大，并呈现浓度梯度依赖性，如图2所示，各图中1-5表示5只不同的小鼠。
A.对照组小鼠在前房注射PBS前后右眼瞳孔直径无明显变化 (A4)。
B.103组小鼠在前房注射MCMV前后右眼瞳孔直径无明显变化。
C.104组小鼠在前房注射MCMV前后2只小鼠右眼瞳孔分别于注射后第3天及10天达到峰值，随后逐渐恢复。
D.105组小鼠在前房注射MCMV前后5只小鼠右眼瞳孔均于注射后第10天出现达到峰值，随后逐渐恢复。
E.106组小鼠在前房注射MCMV前后5只小鼠右眼瞳孔均于注射后第16天出现达到峰值，随后无法恢复。
(3)MCMV前房感染后左眼瞳孔直径折线图。MCMV前房感染不会诱导对侧眼瞳孔散大，如图3所示，各图中1-5表示5只不同的小鼠。
(4)MCMV前房感染后右眼眼压折线图。MCMV前房感染可诱导一过性眼压升高，如图4所示，各图中1-5表示5只不同的小鼠。
A.对照组前房注射无菌PBS前后，小鼠右眼眼压无明显变化。
B.103组前房注射MCMV前后，小鼠右眼眼压无明显变化。
C.104组前房注射MCMV前后，2只小鼠右眼眼压在第10天升高，随后逐渐恢复。
D.105组前房注射MCMV前后，3只小鼠右眼眼压在第10天升高，随后逐渐恢复。
E.106组前房注射MCMV前后，4只小鼠右眼眼压在第13天升高，随后逐渐恢复。
(5)MCMV前房感染后左眼眼压折线图。MCMV前房感染不会诱导对侧眼眼压升高，如图5所示，各图中1-5表示5只不同的小鼠。
(6)MCMV前房感染可诱导一过性角膜水肿，如图1所示。
将角膜水肿程度分为以下四个等级：1级，角膜完全透明；2级，角膜水肿但虹膜易见；3级，角膜水肿但虹膜难以显影；4级，角膜水肿，虹膜不可见。
对照组和103组各时间点均未出现角膜水肿(1级)。在104组和 105组中，分别有2只和3只在注射后第10天出现角膜水肿(2级， 2-3级)并可逐渐恢复透明。在106组中，4只小鼠在注射后10天出现角膜水肿(2-3级)，并且在注射后28天仍未恢复。
(7)MCMV前房感染后右眼瞳孔直径，眼压及角膜统计图。 MCMV所致眼压升高及瞳孔散大呈现浓度梯度依赖性，如图6所示。
A.斯皮尔曼统计学分析显示病毒浓度与瞳孔直径存在相关关系，相关系数为0.830(P<0.0001,n＝25)。
B.斯皮尔曼统计学分析显示病毒浓度与眼压存在相关关系，相关系数为475(P<0.05,n＝25)。
C.斯皮尔曼统计学分析显示病毒浓度与角膜水肿程度存在相关关系，相关系数为0.662(P<0.001,n＝25)。
D.卡方趋势性检验显示出现体征改变的小鼠比例与病毒浓度存在相关关系(P<0.01,n＝25)。
(8)MCMV前房感染后眼球切片HE染色图。MCMV前房感染后第10天和第28天时可以观察到羊脂KP，如图7所示。
A3、A4、B3、B4、C3、C4分别代表A1、A2、B1、B2、C1、 C2的矩形框放大。左栏:右眼；右栏:左眼。
A.注射当天眼球切片未观察到KP。
B.注射后第10天眼球切片可以观察到羊脂状KP(黑色箭头)粘附在内皮细胞层。
C.注射后第28天，粘附内皮细胞层的羊脂状KP(黑色箭头)减少。比例尺:100μm。
(9)MCMV前房感染后眼球切片荧光图。MCMV前房感染后第10天虹膜可见荧光信号，第28天时几乎消失，如图8所示。
左栏:右眼；右栏:左眼。A3、A4、B3、B4、C3、C4分别代表A1、 A2、B1、B2、C1、C2的矩形框放大。白色箭头表示荧光信号。黄色箭头表示角膜。黄色箭头表示虹膜。红色线段表示角膜的厚度，黄色线段表示虹膜的长度。
A.注射当天双眼眼球切片(A1、A2、A3、A4)未观察到荧光信号
B.注射后第10天右眼(B1、B3)虹膜可见明显荧光信号，而左眼(B2、B4)无明显荧光信号。并且，与注射当天(A1,A3)相比，注射后第10天(B1,B3)右眼角膜厚度明显增加，虹膜长度明显缩短。
C.注射后第28天右眼(C1,C3)虹膜荧光信号几乎消失。同时角膜厚度减小，虹膜长度恢复(C1,C3)。比例尺:200μm。
本实施例青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法将适当浓度的MCMV注射到BALB/c小鼠眼前房后，可诱导小鼠出现一过性角膜雾状混浊、瞳孔扩大，眼压升高等类似PSS体征，表明小鼠前房注射适量MCMV可构建PSS小鼠模型，验证了CMV前房感染为 PSS病因。
本实施例采用BALB/c小鼠作为实验动物。相较于C57小鼠， BALB/c小鼠对于MCMV感染更易感。其差异主要在小鼠6号染色体上NK基因复合物(NKC)中包含的一个常染色体显性基因位点，称为Cmv1，这种易感性差异由鼠自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞激活受体Ly49H所介导。C57小鼠可在机体感染MCMV后通过 Ly49H受体激活NK细胞，进而对病毒感染的细胞进行有效清除。 NK细胞在针对CMV的免疫应答中发挥重要的作用。人体对HCMV 的应答由固有免疫系统和适应性免疫系统组成。NK细胞从属于固有免疫系统，是宿主免疫的第一道防线，无需预先致敏就可以对肿瘤和病毒感染的靶细胞产生快速应答，在机体免疫早期发挥重要的监视作用。NK细胞可以被α-干扰素(INF-α)、β-干扰素(IFN-β)，和白细胞介素(IL)-12激活进而产生具有抗病毒效应的细胞因子如γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。然而，眼内组成性表达的 NK细胞抑制因子，包括转化生长因-β(TGF-β)和巨噬细胞迁移抑制因子，可在体外抑制NK细胞的活性。既往关于小鼠针对MCMV 免疫应答的研究显示，NK细胞可通过主要组织相容复合体识别被病毒感染的细胞，对于清除小鼠体内MCMV感染发挥重要作用，这与前述人体对HCMV的免疫应答相符。因此，本实施例采用BALB/c 小鼠进行实验，更好的模拟了免疫机制在该疾病的发生发展中占据的重要作用。
在本实施例中，小鼠的体征在各个浓度梯度组中呈现浓度依赖性。高浓度MCMV虽可引起小鼠体征改变(眼压升高、瞳孔扩大、角膜水肿)但常无法自限缓解，并且小鼠角膜可见明显新生血管长入。在病毒浓度梯度组的探究中，病毒浓度越高，出现体征改变的小鼠比例越高，同时小鼠出现体征改变的时间越早、程度越明显，而对照组小鼠无明显体征改变，说明小鼠体征改变是由病毒所致，并与感染的病毒粒子的个数相关，呈现浓度依赖性。小鼠眼压和瞳孔的改变具有较好的一致性，104组的2只小鼠在瞳孔扩大的同时伴有眼压升高，另外3只小鼠瞳孔及眼压均无明显变化，105组中5只小鼠均有瞳孔扩大，有2只程度较轻，则未伴随眼压的升高，另外3只小鼠在瞳孔扩大的同时伴有眼压升高。注射同一浓度病毒的小鼠症状及体征的差异可能为小鼠免疫力差异所致，更进一步说明了免疫机制在该疾病的发生发展中占据重要地位。
本发明采用插入EGFP的MCMV进行实验，在病毒引起体征改变的同时，能对病毒感染部位进行可视化定位，为后续关于MCMV 相关疾病包括PSS的发病机制的探讨提供了极大的便利。本发明进一步验证了CMV前房感染为PSS的病因，并构建了PSS小鼠模型，为之后关于PSS的发病机制及其治疗的探索提供了可用的动物模型。
以上，仅为本发明的具体实施方式，应当指出，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，其余未详细说明的为现有技术。

Claims (1)

1.一种青光眼睫状体炎综合征动物模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)动物麻醉：采用腹腔注射浓度为1％的戊巴比妥钠对BALB/c小鼠进行麻醉，保持动物的眼球微凸；
2)眼部麻醉：采用滴加浓度为0.5％的盐酸丙美卡因滴眼液对BALB/c小鼠的左眼和/或右眼进行表面麻醉，作为受试眼；
3)病毒感染：将表达EGFP的MCMV基因重组病毒经BALB/c小鼠受试眼的角膜中央注入前房中，MCMV基因重组病毒为将EGFP基因插入野生型MCMV基因组中，以使EGFP能够在被感染的细胞中稳定表达；用微量注射泵吸入MCMV基因重组病毒，使用镊子调整小鼠眼球角度，通过玻璃电极垂直穿破受试眼的角膜，针尖进入受试眼的前房后，用微量注射泵将MCMV基因重组病毒缓慢注入；MCMV基因重组病毒的浓度为104-105pfu/mL，注射量为1μL；用微量注射泵将MCMV基因重组病毒缓慢注入的速度为0.1μL/min；使用微电极拉制仪制作玻璃电极，减去尖端解除其气密性，将液体石蜡分别注入10μL微量进样器和玻璃电极以排出空气，推动进样器活塞推至刻度线5-6μL处，擦去排出的石蜡油，将玻璃电极套入进样器针尖，用热熔胶枪封闭两者连接口处，待热熔胶凝固后，将进样器固定于微量注射泵上，再用微量注射泵吸入MCMV基因重组病毒；注射完毕后等待10min，用棉签轻按将玻璃电极拔出，随后继续按压5min；将玻璃电极拔出后使用生理盐水冲洗受试眼的结膜囊后，涂红霉素眼膏，再禁水1～2天后正常进食，建立MCMV感染的动物模型，采用插入EGFP的MCMV进行实验，在病毒引起体征改变的同时，能对病毒感染部位进行可视化定位。
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