CN107998384A - α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及α1‑抗胰蛋白酶应用作为制备治疗神经退行性眼病的药物。采用α1‑抗胰蛋白酶治疗小鼠视网膜色素变性这一典型的神经退行性疾病，可有效延缓视网膜光感受器细胞的变性死亡，保留视功能，达到治疗视网膜色素变性的目的。机制上，发现采用α1‑抗胰蛋白酶可显著抑制视网膜小胶质细胞向促炎M1方向活化，转而向抑炎的M2表型，从而改善视网膜炎症微环境，有效延缓视网膜光感受器细胞死亡的进程。本发明为治疗神经退行性眼病提供了新策略，α1‑抗胰蛋白酶在制备治疗神经退行性疾病药物制剂中将有广阔的应用前景。

Description

α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物

技术领域

本发明涉及α1-抗胰蛋白酶在制备用于治疗神经退行性眼病药物中的应用。

背景技术

神经退行性眼病是一类严重影响人类视觉功能的难治性致盲眼病，包括视网膜色素变性、老年性黄斑变性等。其中，视网膜色素变性是神经退行性眼病的代表，在全球发病率约为1/4000，我国高达1/1000，主要影响20-64岁人群，视力损伤严重，严重影响人类生活质量。然而目前神经退行性眼病尚无有效治疗策略，虽然基因编辑技术快速发展为修复人体神经细胞带来希望，但现行的基因治疗及干细胞替代等开拓性治疗仍未取得确定有效的疗效。

神经炎症是神经退行性眼病的重要病理基础，异常活跃的视网膜炎症反应、免疫细胞功能紊乱引发异常免疫应答、炎症因子大量释放，加剧神经元的损伤和变性，损害视功能。目前研究认为视网膜小胶质细胞是调控视网膜炎症微环境的关键细胞，小胶质细胞活化是神经炎症的重要标志，其活化后呈现一系列动态的功能表型，具有特征性的两种极端状态即小胶质细胞的M1/M2极化(M1：促炎；M2：抑炎)。活化后的M1极化状态下，小胶质细胞表达特异性表面抗原(如CD86，CD16/32，MHC-II等)并且分泌大量炎症因子(如TNF-α，IL-6，IL-1β，IL-23等)和趋化因子(如CCL2，CXCL10等)，形成典型的视网膜促炎微环境。而M2状态下，表达特异性CD206，CD301，CD163等表面抗原，分泌IL-10，TGF-β，IL-4，IL-13等抑炎因子，呈现独特的抑炎微环境。

α1-抗胰蛋白酶(AAT)是一类重要的天然丝氨酸蛋白酶，主要由肝细胞、巨噬细胞等分泌。目前临床上主要应用AAT治疗AAT缺乏症并发的肺气肿。近期研究初步发现AAT还具有抗炎及免疫调控特性，对许多炎性介质和氧化剂基团具有显著的抑制作用，能有效诱导特异性免疫耐受，在糖尿病、移植免疫等领域中展现良好的应用前景。

本发明证实了AAT具有免疫调控作用，可有效抑制神经炎症，拓展了AAT适应症在神经退行性眼病中的应用，其可能机制是改变小胶质细胞极化表型，调控视网膜炎症微环境。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的治疗神经退行性眼病的药物。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，所述药物含有α1-抗胰蛋白酶。

所述药物的给药方式为静脉或腹腔给药治疗形式。

所述药物的给药剂量为每千克体重80mg，隔日给药。

α1-抗胰蛋白酶的给药浓度为50-200微克/微升。优选地，α1-抗胰蛋白酶的给药浓度为100微克/微升，是将α1-抗胰蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液而获得。

本发明将α1-抗胰蛋白酶用于治疗视网膜色素变性，并通过模型建立进行以下效果评价：(1)视觉电生理检查；(2)视网膜病理切片观察；(3)免疫荧光染色、western blot、qPCR等分子生物学技术检测。

本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行腹腔内注射α1-抗胰蛋白酶治疗后，小鼠的视网膜电图(ERG)波形振幅提高，视功能得到改善。

本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行腹腔内注射α1-抗胰蛋白酶治疗后，小鼠的视网膜厚度增加。

本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行腹腔内注射α1-抗胰蛋白酶治疗后，小鼠视网膜神经细胞的死亡数量明显减少，神经细胞的存活增加。

本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行腹腔内注射α1-抗胰蛋白酶治疗，能有效减少视网膜小胶质细胞的表达M1型标记物，增加视网膜小胶质细胞的表达M2型标记物，抑制视网膜炎症反应。

总的来说，本发明将α1-抗胰蛋白酶经腹腔内注射干预视网膜色素变性小鼠模型，提供了α1-抗胰蛋白酶在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。实验证明，α1-抗胰蛋白酶具有抗炎和神经保护作用，减轻视网膜损伤，改善视网膜功能，为临床治疗神经退行性疾病开辟新途径。α1-抗胰蛋白酶主要是通过调控视网膜小胶质细胞的极化状态，显著抑制视网膜小胶质细胞向促炎M1方向活化，转而向抑炎的M2表型，从而调控视网膜炎症微环境。

附图说明

图1a～图1b是反映AAT治疗后小鼠视网膜电图(ERG)的改变。其中，图1a是不同光强度刺激下a波的改变情况；图1b是b波的变化情况。C57为野生型小鼠，rd1+PBS为视网膜变性小鼠的溶剂对照组，rd1+AAT为视网膜变性小鼠的治疗组。暗适应12小时后，在1.0，3.0及10.0cdsm/²光照强度下，统计视网膜电图(ERG)的a波及b波震幅，可见治疗组与对照组相比振幅明显改善：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图2a～图2g是AAT治疗后小鼠眼的光相干断层扫描(OCT)的情况。其中，

图2a说明OCT扫描以距视乳头3mm的点为圆心，水平、垂直、鼻侧、颞侧四个方向扫描；

图2b反映视网膜平均厚度的计算方法，即以距视乳头3mm的点为圆心，测定1.5mm半径范围内视网膜的平均厚度。

图2c是不同部位视网膜容积的均值统计图，说明AAT治疗后OCT检测视网膜容积均值增加。

图2d是视网膜厚度的统计图，说明在AAT治疗后视网膜的厚度显著增加，***p<0.001。

图2e反映在C57小鼠的视网膜各层结构都正常可见，包括外核层(ONL)、外界膜(ELM)及内外节连接层(IS/OS)。

图2f反映在视网膜变性小鼠的溶剂对照组(rd1+PBS)，ONL、ELM及IS/OS层次消失；

图2g反映在视网膜变性小鼠的治疗组(rd1+AAT)，外核层(ONL)和外界膜(ELM)可被检测到。

图3a是AAT治疗后，小鼠视网膜的ONL层细胞核数量统计图，1，2，3分别代表视网膜中央部、中周部及周边部。可见在不同部位，治疗组的小鼠视网膜ONL层细胞核数量都增加：**P<0.01，***P<0.001。

图3b是AAT治疗后，小鼠视网膜厚度的统计图，可见治疗组的小鼠视网膜ONL层厚度及总厚度均增加：*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4a是AAT治疗后小鼠视网膜冰冻切片免疫荧光图，用DAPI标记细胞核，Rhodopsin标记光感受器视杆细胞，IBA1标记小胶质细胞，TUNEL标记死亡细胞；其中PBS为溶剂对照组，AAT为治疗组，可见治疗后死亡数量减少，视杆细胞存活增加，小胶质细胞数量减少。

图4b是AAT治疗后小鼠视网膜冰冻切片TUNEL染色阳性细胞数量统计图，可见治疗组TUNEL阳性细胞数量较对照组明显减少，**P<0.01；

图4c是AAT治疗后小鼠视网膜冰冻切片IBA1染色阳性细胞数量统计图，可见治疗组IBA1阳性细胞数量较对照组明显减少，***P<0.001；

图5a～图5b是AAT治疗后小鼠视网膜小胶质细胞表达M1、M2型标记物的免疫荧光铺片图，IBA1为小胶质细胞标记物，CD16/32为M1型标记物，CD206为M2型标记物；PBS为视网膜变性小鼠的溶剂对照组；AAT为视网膜变性小鼠的治疗组。

图5a反映在AAT治疗后，小鼠视网膜小胶质细胞表达M1型标记物减少；

图5b反映表达M2型标记物的小胶质细胞在AAT治疗后增加.

具体实施方式

以下结合实验进一步说明本发明的技术方案。

·1.实验前期准备

·1.1实验动物

野生型C57BL/6小鼠购自广东中医药大学实验动物中心。rd1小鼠购自北京维通利华公司。动物伦理及所有实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》。

·1.2实验试剂和抗体

α1-抗胰蛋白酶(Sigma)；抗IBA1抗体(Wako)；抗CD16/32抗体(BD Biosciences)；抗CD206抗体(R&D Systems,Inc.)；抗Rhodopsin抗体(Santa Cruz)；驴抗兔IgG二抗(488)；驴抗小鼠IgG二抗(555)；驴抗大鼠IgG二抗(647)；DAPI(Life Technologies)；TUNEL试剂盒(Roche)。

·1.3缓冲液

1)封闭液：50ul Triton-X100；0.5g胎牛血清蛋白(BSA)；加入10.0ml PBST或TBST配置而成。

2)PBS/PBST缓冲液：NaCl 16.0g；NaH2PO4 0.46g；KCl 0.40g；Na2HPO4 0.24g，加双蒸水定容至2.0L，按1‰加入Tween-20配置成PBST溶液；

·1.4实验仪器和器材

视网膜电图仪(RETI scan system)；眼的光相干断层扫描仪(SPECTRALIS-OCT，Heidelberg，德国)；激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss，LSM710，德国)；荧光显微镜(A1，AxioVision，Leica，DM4000，德国)；眼科显微器械；

·1.5统计和分析软件

使用GraphPad Prism 6和Photoshop软件(Adobe CC，2015)进行实验数据整理和图片绘制；SPSS软件(版本18.0)进行统计分析；ImageJ软件进行形态学结果定量分析，采用student t-test和one way ANOVA分析组间差异，结果*P<0.05为具有统计学意义。

·2.实验方法及结果

·2.1小鼠选择与分组

1)将AAT溶于磷酸盐缓冲液(PBS)配制成100微克/微升的浓度。

2)将出生后第4天的rd1视网膜变性小鼠随机分成溶剂对照组和治疗组；治疗组腹腔注射AAT(80mg/kg)；溶剂对照组腹腔注射等体积PBS；将出生后第4天的野生型C57小鼠作为正常对照组，腹腔注射等体积PBS；

3)每隔2天予上述小鼠腹腔注射一次，注药类型及剂量同2)中分组所述，一直至出生后第14天；

·2.2视网膜电图(ERG)评价AAT治疗后小鼠的视网膜功能：

1)准备工作：

采用视网膜电图仪(RETI scan system)对出生16天的rd1小鼠和C57小鼠进行ERG检测。检查前对小鼠进行12小时的暗适应。腹腔内注射4.3％水合氯醛(10ml/kg)进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳。

2)ERG检测：

实验全过程在微弱红光照明条件下进行。将小鼠固定于实验板上，安装电极。在角膜上滴少许甲基纤维素，将记录电极(0.2mm铜丝制成的环状角膜电极)紧贴在角巩缘上，将参考电极(针形电极)放置在小鼠同侧颊部皮下，接地电极放置在小鼠尾部皮下。再次暗适应约5分钟后开始进行相关的检查。应国际临床视觉电生理标准化方案进行暗适应ERG(Scot ERG)检测和记录。分别记录3.0cd·m-2和10.0cd·m-2光照强度下小鼠的ERG波形，检测频闪反应时对其进行30Hz的标准闪光刺激，并舍弃前三个反应波。应用软件对波形进行分析和统计。

3)实验结果：

可观察到对照组(注射PBS)的rd1小鼠呈现熄灭性ERG，几乎探测不到波形；经过AAT治疗后，在暗适应两种不同的刺激强度(3.0及10.0cd·s/m2)下均发现ERG的a波和b波均出现一个有统计学意义的波形振幅(图1)，提示视网膜神经功能有部分改善。

·2.3光相干断层扫描(OCT)评价AAT治疗后小鼠的视网膜厚度：

1)准备工作：

采用视网膜电图仪(SPECTRALIS-OCT，Heidelberg，德国)对出生16天的rd1小鼠和C57小鼠进行OCT检测。检查前腹腔内注射4.3％水合氯醛(10ml/kg)进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳。

2)OCT检测

麻醉后将小鼠头固定于OCT颌架合适位置上，用镊子夹住球结膜以转动眼球位置，使OCT探测光源对准激光斑点区域。选用计算机内设定的三维立体扫描法扫描激光斑点，以距离视乳头3mm的点为圆心，1.5mm为半径扫描。扫描范围覆盖视网膜的横向、纵向、鼻侧、颞侧四个方向，以计算视网膜的平均厚度。每个激光斑点都必需扫描至少2次，选择其中扫描位置正、成像清晰、稳定者保存以备分析。

·2.4石蜡切片H&E染色观察AAT治疗小鼠视网膜结构的变化：

1)试剂及前期准备：

混合固定液：中性福尔马林(甲醛100m l、Na2HPO46.5g、NaH2PO44g、蒸馏水900m1)；③苏木精染液：苏木精lg，无水乙醇10ml，蒸馏水200ml，硫酸铝钾20g，氧化汞0.5g，使用前每100m l加入冰醋酸3～4ml；④分化液：1％盐酸酒精；⑤1％醇溶性伊红液：伊红1g，80％乙醇10m l，用时加1滴的冰醋酸。

2)组织石蜡包埋与切片：

a.处死出生后16天的rd1小鼠，取得眼球，置于10％福尔马林固定18～24小时；

b.梯度乙醇中进行脱水12小时；

c.依次在二甲苯浸泡2小时、65℃石蜡浸泡3～4h进行透化和浸蜡；

d.自动包埋机将组织包制，切片机获得取3～4um切片贴附于载玻片上；

3)H&E染色：

a.二甲苯脱蜡，100％、95％、75％梯度酒精清洗至水化；

b.苏木精浸染10～15分钟进行染色，流动水清洗；

c.分化、返蓝：1％盐酸酒精分化1-2秒，饱和氨水蓝化数秒流水冲洗15～

d.30分钟；

e.伊红染色：以1％醇溶性伊红浸染5～15秒；

f.常规脱水、透明、封片。

4)实验结果如附图3a～图3b所示，经AAT治疗后，rd1视网膜变性小鼠视网膜外核层(ONL)及视网膜总厚度明显增加，提示视网膜病变减轻。

·2.5TUNEL/Rhodopsin/IBA1免疫荧光检测视网膜细胞凋亡情况：

1)试剂准备：

a.DNA酶的配置：将1mgDNase加入100mlPBS配置成15000U/L的DNA酶液

b.阳性对照液：用50uM TrisHCl pH 7.5配BSA 1mg/mL，然后用其稀释DNase液工作浓度至Dnase 3000U/mL，配比为4：1。

c.阴性对照液：50uL Label Solution。

d.配置反应液：10ul enzyme solution加上90ul label solution配置而成，现配现用，全程冰上操作。

2)采用罗氏(Roche)TUNEL试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit,Fluorescein)，按照说明书要求进行操作。

a.制作6-8um视网膜冰冻切片；

b.用4％PFA室温下固定1小时，PBS清洗；

c.阳性对照组加DNase液处理10分钟，室温，PBS清洗；

d.阳性对照及实验组加50ul/10ul反应液，阴性对照加50ul label solution，37℃孵育1小时，注意保湿。

e.PBS清洗后染DAPI 3-5分钟，封片，在荧光显微镜下观察。

f.TUNEL与Rhodopsin、IBA1免疫荧光共染：

先将视网膜切片在Rhodopsin、IBA1一抗中孵育过夜，第二天取出后将荧光二抗与TUNEL工作液混合孵育1小时。

3)实验结果

如附图4a～图4b所示，利用TUNEL染色评估视网膜细胞的凋亡情况，发现AAT可显著减少TUNEL+细胞的数量；利用Rhodopsin标记光感受器视杆细胞，发现存活视杆细胞数量增加；利用IBA1标记小胶质细胞，可见治疗组IBA1阳性细胞数量较对照组明显减少，证实AAT减轻或延缓了视网膜光感受器细胞凋亡的进程。

·2.6视网膜铺片免疫荧光染色：

1)将出生后16天的干预后rd1及C57小鼠分别麻醉，脊椎脱臼法处死，小心取出眼球；

2)将眼球置于20倍以上体积的4％PFA中固定30-60min；

3)在解剖显微镜下用有齿镊固定眼球，先去除视神经，在视神经孔处夹住巩膜轻轻撕开，暴露视网膜组织，依次撕开至角膜缘，去除角膜、虹膜、晶状体等组织，获得完整视网膜；

4)将视网膜置于0.5％Triton X-100/PBS中打孔5min，PBS清洗2次；

5)用5％BSA室温封闭1小时或4℃封闭过夜；

6)新鲜配制免疫荧光一抗抗体(IBA1，CD16/32，CD206，)：5％BSA以1：100比例进行稀释，将视网膜置于抗体中，4℃孵育过夜，期间每隔数小时将EP管轻轻摇晃以充分接触抗体。

7)将视网膜取出孵育二抗，室温1-2小时，注意避光；PBST清洗6次，每次10分钟；

8)将视网膜转移至载玻片上，解剖体视显微镜下用无齿镊去除杂质，并将玻璃体纤维慢慢剥除，以视盘为中心，放射状切开4刀，神经层向上，滴少许抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察并照相。

9)实验结果如5a、5b所示。图5a显示给予AAT治疗后，rd1小鼠在视网膜的小胶质细胞表达M1型标记物CD16/32减少，提示AAT抑制了视网膜小胶质细胞向M1方向极化。图5b显示给予AAT治疗后，rd1小鼠在视网膜的小胶质细胞表达M2型标记物CD206增加，提示AAT促进了视网膜小胶质细胞向M2方向极化，证实AAT有效调控了小胶质细胞的极化方向，影响视网膜炎症。

·2.7结果总结

本实验主要得到以下结论：

1)ERG、OCT、H&E、TUNEL/Rhodopsin染色等实验证实，注射AAT能显著减少视网膜色素变性小鼠神经细胞(光感受器细胞)的丢失，保护视功能，延缓视网膜变薄，减少小胶质细胞的聚集。

2)免疫荧光染色证实，AAT能显著调控视网膜色素变性模型小鼠视网膜小胶质细胞的极化方向，减少促炎的M1型小胶质细胞，促进其向抑炎的M2方向转化。

本研究结果为AAT治疗神经退行性眼病以及AAT作为免疫调控剂的潜在临床应用提供实验依据和理论基础，AAT在制备治疗神经退行性疾病药物制剂中将有广阔的应用前景。

Claims (6)

1.α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，其特征在于：所述药物含有α1-抗胰蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，其特征在于：所述药物的给药方式为静脉或腹腔给药治疗形式。

3.根据权利要求2所述的α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，其特征在于：所述药物的给药剂量为每千克体重80mg，隔日给药。

4.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，其特征在于：α1-抗胰蛋白酶的给药浓度为50-200微克/微升。

5.根据权利要求4所述的α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，其特征在于：α1-抗胰蛋白酶的给药浓度为100微克/微升。

6.根据权利要求4所述的α1-抗胰蛋白酶应用于制备治疗神经退行性眼病的药物，其特征在于：α1-抗胰蛋白酶的给药浓度是将α1-抗胰蛋白酶溶于磷酸盐缓冲液而获得。