CN111053626A - 一种造模方法及动物模型及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域,公开了一种高眼压动物模型的造模方法。本发明所述造模方法将巩膜环扎带固定在动物角膜缘后,结扎后缩短眼球冠状面直径导致眼内压增高。本发明还提供所述动物模型及其应用。本发明所述造模方法无侵入性损伤,方法稳定,操作简单,对眼内组织干扰少且费用低,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,尤其涉及一种造模方法、动物模型及其应用。
背景技术
青光眼疾病是以视网膜神经节细胞(RGCs)的调亡、视神经萎缩以及视野缺损性改变为特征的一种进行性视神经病变,为全球第二位致盲眼病。其中,高眼压是造成青光眼视神经损伤最主要的危险因素。因此,在研究青光眼性视神经病变的损伤机制及治疗措施中,高眼压动物模型的构建则起到至关重要的作用。理想的慢性高眼压动物模型制作简单,能模拟人的青光眼自然病理进程,并能提供稳定而持久的高眼压状态。
在青光眼的基础研究和临床前期研究中,高眼压的动物模型是实验成功的重要一环。在既往的研究中,因模型造成的复杂的并发症、难以量化、设备昂贵等原因对科研工作者造成困扰。
根据文献报道,目前高眼压模型的构建方法大多都是通过阻止房水排出的方法从而达到高眼压的效果,如烧灼巩膜表层的房水引流静脉法(Shareef-Sharma模型)及改良方法,通过结扎或烧灼巩膜上静脉减少房水外流的方法达到高眼压;巩膜上静脉注射高渗盐水的方法 (Morre-Morrison模型);通过激光光凝小梁网的方法;前房内注射微珠或透明质酸钠阻塞小梁网的方法;此外,亦有利用转基因技术构建的青光眼模型。
分别介绍如下:
一、烧灼巩膜表层的房水引流静脉法该方法通过结扎或烧灼巩膜上静脉减少房水外流[1],眼压升高的程度与被灼烧的静脉数量成正比。Grozdanic SD等[2,3]的研究中发现,对巩膜静脉结扎或者烧灼巩膜静脉及涡静脉能使眼压明显升高,最长可以维持7个月,同时RGCs 和视神经也会出现坏死。烧灼静脉法其操作简单,但是缺点是影响了眼部的血供,因此,可能会造成眼内局部的淤血及缺血。
二、巩膜上静脉注射高渗生理盐水其原理是通过高渗生理盐水对房水流出通道造成硬化,从而使房水流出受阻,导致眼压升高[4]。 Fortune B等[5]研究发现,当眼压高于35mmHg时,视觉电生理的a、 b波的振幅有降低的改变。此模型适用于急性短期的高眼压模型,因其具有可恢复再生的特点。在模型构建过程中对术者的要求较高,但最主要的缺点是该模型的眼压升高的范围不可控,在实验中很难量化统一。
三、激光光凝通过激光光凝小梁网达到升高眼压的目的[6-7], 可达到慢性高眼压的效果。Fuct等[8]发现激光光凝模型中小梁网色素沉着量的多少与眼压的大小及高眼压持续的时间均有明显的关联性。但是此模型对设备及操作者的要求都很高,不适合普遍推广。
四、前房内注射微珠或透明质酸钠这是利用高分子惰性材料阻塞小梁网引起房水流出阻滞,从而引起高眼压的方法模型[9]。Logan A 等[10]研究发现,前房注射透明质酸钠4天后,高眼压模型构建的成功率可达到88%,但是在一周后眼压开始恢复正常。这种模型更大的缺点是容易出现并发症,如前囊膜穿破、白内障、角膜损伤以及感染等。
虽然制作高眼压动物模型的方法很多,但是目前的青光眼动物模型大多数为对器械和操作者水平要求高,眼压控制不稳定,且大部分为侵入性的,对眼内组织干扰大等缺点。因此,因此构建一种简易的、稳定的、可靠的高眼压动物模型应用于青光眼发病机制和视神经保护研究的工作中势在必行。
发明内容
本发明提供了一种非侵入性、稳定性高的高眼压动物模型的造模方法,将巩膜环扎套环固定在角膜缘后1-2mm的巩膜面,结扎固定后缩短眼球冠状面直径导致眼内压增高。
具体的,本发明提供的高眼压动物模型的造模方法,包括以下步骤:
(1)全身麻醉后的动物眼球表面给予表面麻醉,并进行散瞳处理;
(2)取宽度2-4mm的巩膜环扎带,制作直径小于动物眼球直径的环扎套环;
(3)将环扎带两端相对位置末端楔形剪除,制作宽度为1-3mm的套管;
(4)环扎带两端分别套入套管制作环扎套环,调整环扎套环的直径和两端长度;
(5)将制成的环扎套环套扎在动物角膜缘后1-2mm的巩膜面,拉紧环扎带两端的尖端,结扎固定环扎套环;
(6)保持稳定后,固定套环中的环扎带两端至不可回退,监测眼压,即形成高眼压动物模型。
作为优选,所述全麻为采用1-1.5%戊巴比妥进行腹腔麻醉,优选剂量为40-45g/kg。
作为优选,所述表面麻醉采用盐酸丙美卡因滴眼液或盐酸奥布卡因滴眼液。
作为优选,所述散瞳采用复方托吡卡胺滴眼液。
作为优选,所述的步骤(2)中环扎套环套的平滑面接触巩膜处;所述的步骤(2)中环扎套环是2-10mm直径,2-4mm宽的硅橡胶巩膜外环扎套环。
作为优选,所述的步骤(5)通过调整环扎套环的位置,达到不同程度的眼压。
作为优选,所述的步骤(6)中平均眼压稳定在30-60mmHg;优选通过Tonopen眼压计和回弹式眼压计测量眼压。
本发明所述巩膜外环扎套环法无侵入性损伤,造模方法稳定,眼压可以调控量化,操作简单,对眼内组织干扰少且费用低,适合高眼压模型的大范围推广应用。
本发明还提供所述造模方法制备的动物模型。作为优选,其为小鼠、大鼠,兔、狒狒或猴子。
目前用于构建高眼压模型的动物以兔、鼠、猴为主。其中,兔眼的房角结构与人眼有形态学差异;猴的高眼压模型是目前被公认的最理想的高眼压模型,但因造价昂贵、饲养困难,在国内难以普及;鼠眼的结构与人眼最为近似,价格低廉,易于获得和饲养,便于操作,是最常用于制作青光眼模型的实验动物。本发明所述方法制备的动物模型能更好的模拟青光眼高眼压状态,为服务临床打好基础,实现了非侵入性、操作简单、模型稳定的优势。
本发明提供了一种稳定、简单可行、易推广的高眼压模型的构建方法,通过巩膜环扎的方法,缩短了冠状面眼球直径,造成眼压升高,从而获得高眼压动物模型。通过这种办法构建的高眼压动物模型,其眼压的高低可通过调节环扎套环的直径和长度进行调控,并且不受动物种类的限制,可以在多种类型动物如小鼠、大鼠、兔、猴等实现高眼压模型,更好的模拟青光眼高眼压状态,为研究高眼压模型提供新思路。
本发明所述高眼压动物模型造模方法可在人为升高眼内压的基础上,避免前房穿刺灌注法(经典模型)带来的副作用,同时可对构建模型的眼内压指标进行量化,且对模型没有损伤性侵入的操作。该模型可用于高眼压导致的视网膜损伤、药物对视网膜损伤的修复和保护以及高眼压致眼内某些物质发生改变等方面的研究,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为高眼压造模成功的小鼠动物模型;
图2为高眼压造模过程中小鼠环扎后的眼压监测。
图3为眼底彩照和同时期视网膜荧光血管造影图:
A:造模前眼底彩照和视网膜血管造影图;
B:为高眼压造模成功后眼底彩照提示视网膜苍白水肿,视网膜血管变细或消失。视网膜荧光血管造影提示视网膜血管变细,且呈现断流现象
图4为视网膜电生理检查波形图:
视网膜电生理结果波峰变平,见图4A;视网膜电流图b波幅值明显增高,见图4B;视觉诱发电位潜伏期延长,波幅明显降低,见图4C。
图5为视网膜光学相干断层扫描图(OCT);
A为正常大鼠视网膜后极部OCT图示,视网膜各层组织信号清晰;
B为本发明所述方法造模成功后OCT图示,提示视网膜因高眼压造成视网膜缺血水肿,各层信号强弱不均,分层模糊,厚度出现变化。
图6为视网膜HE染色图;
A为正常大鼠视网膜HE染色;
B为本发明所述方法造模动物视网膜组织HE染色。
参考文献:
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具体实施方式:
本发明公开了一种造模方法、动物模型及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:
一种高眼压小鼠模型的造模方法,包括以下步骤:
(1)C57BL/6J小鼠全身麻醉后,取侧卧位;
(2)眼球表面给予表面麻醉,散大瞳孔处理;
(3)取人巩膜外环扎术中所应用的宽度为3mm的硅橡胶环扎带3cm,准备制作直径小于鼠眼球直径的环扎套环。
(4)将环扎带两端相对位置末端楔形剪除,制作环扎带末端为尖端的外观,制作宽度为1mm的软硅胶透明套管。
(5)环扎带两端分别套入宽度为1mm的软硅胶透明套管,调整环扎套环的直径和两端长度;
(6)将制成的环扎套环套扎在鼠角膜缘后1mm的巩膜面;
(7)套环固定在巩膜表面,拉紧并结扎固定环扎套环;
(8)通过调整环扎套环卡扣卡槽的位置,达到不同程度的眼压;
(9)通过两种不同眼压计分别测量眼压,进行对比;
(10)保持稳定后,固定套环中的环扎带两端至不可退回,形成高眼压动物模型(图1)。小鼠巩膜环扎过程中,分别与环扎即可 (0min),环扎后10min、20min、30min、40min进行实时监测眼压值,结果显示眼压值持续维持45mmHg-55mmHg之间(图2)。
所述的步骤(1)中采用1%戊巴比妥腹腔麻醉(45g/kg)。
所述的步骤(2)中采用盐酸丙美卡因滴眼液或奥布卡因滴眼液行表面麻醉。
所述的步骤(2)中采用复方托吡卡胺滴眼液快速散瞳。
所述的步骤(3)中硅橡胶环扎套环的平滑面接触巩膜处。
所述的步骤(3)中环扎套环是3mm直径,1mm宽的硅橡胶环扎套环。环扎带有三种。最粗的A直径9mm,取剪取一半直径4.5mm。第二种B直径6.5mm,取剪半直径3.25mm。最细的环扎带C直径3mm,不需要减半直接用。不同直径适用于不同物种高眼压模型的建立。
所述的步骤(3)中平均眼压稳定在45mmHg左右。
所述的步骤(4)用两种眼压计进行眼压测量。
实施例2:
兔子充分麻醉后,眼球表面给予奥布卡因表面麻醉,取人巩膜环扎术中所应用的硅橡胶环扎带制作环扎套环。环扎带两端分别套入软硅胶套环,套扎在兔子角膜缘后1.5mm的巩膜外,固定位置后拉紧并结扎环扎带,通过眼压计测量眼压,保持稳定后,固定套环中的环扎带两端至不可退回。
实施例3:造模动物的眼压测量
Tonopen眼压计测量:眼压计在每次使用前均进行校准,校准成功后,眼压测量由同一个人单独完成。测量前再用1%奥布卡因滴眼液 0.1ml点已建模成功的实验眼,表面麻醉实验眼,共点三次后开始测量,用手术巾包裹小鼠或兔子身体,露出头部后,左手撑开鼠或兔上下眼睑,注意不要压迫眼球,右手持眼压笔测量,测量头尽量保持与角膜垂直,迅速力度均匀的轻触角膜中央,听到滴答声为测量一次,记录眼压值,共测量10次取一次平均值,共取三次平均值,取变异系数。取可信区间。95%的眼压值,弃去偏差极大值与极小值。
回弹式眼压计测量:测量前准备同Tonopen眼压计。打开眼压计,安装一次性探针。将眼压计靠近小鼠/兔子眼睛,用左手调整好距离,固定好眼压计,轻按测量按钮,完成6次测量,即获得单词测量值和平均值。
利用以上两种眼内压测量方法,对小鼠或兔子在巩膜环扎术造成的高眼压模型视网膜缺血过程中,环扎术即刻(0min),环扎术后10min、 20min、30min、40min进行实时眼内压监测,结果显示眼内压值持续维持40mmHg-50mmHg之间。
实施例4:建模鉴定
模型成功标志:
1、角膜水肿;
2、眼内压值持续维持40mmHg-50mmHg之间。
3、视网膜荧光血管造影提示视网膜微血管充盈减少,血管充盈迟缓甚至视网膜的动静脉血流明显被阻断,见图3;
4、视网膜电生理结果波峰变平,见图4A;视网膜电流图b波幅值明显增高,见图4B;视觉诱发电位潜伏期延长,波幅明显降低,见图 4C。视网膜电流图(electroretinogram,ERG)是视网膜细胞经光刺激后产生的一系列电位变化所组成的复合波,广泛应用于视网膜的功能评价。ERG以a波、b波和OPs波为代表。a波主要由光感受器产生, OPs波对血管功能改变敏感,b波振幅波动能较好地反应高眼压视网膜损伤的程度[9]。依据《小鼠与小鼠视网膜电图闪光视觉诱发电位记录标准化方案建议》[10]行ERG检测,使用APS-2000视觉电生理系统。实验小鼠麻醉后点眼散瞳(复方托吡卡胺滴眼液散瞳),暗适应30分钟。在弱红光下,角膜记录电极安放在右眼角膜缘,并将对侧眼进行遮盖,接地电极刺入尾部皮下,参考电极刺入小鼠右侧口腔颊黏膜。安置好电极后再次暗适应5分钟,记录ERG最大混合反应和振荡电位 (OPs),F-ERG是以白色闪光作为刺激,光强度为2.58cd/(s.m2),间隔15s,通频带为0.1-500Hz,扫描时间250ms,叠加4次。OPs同样为白色闪光刺激,闪光强度2.58cd/(s.m2),闪光间隔15s,通频带为 100-500Hz,扫描时间250ms,叠加8次。所需数据为ERG最大混合反应a波和b波的潜伏期及波幅,a波的波幅为基线到a波波谷间电位差值的绝对值;a波波谷至b波波峰电位差值的绝对值为b波的波幅。
5、视网膜光学相干断层扫描:与正常的视网膜OCT断层扫描结果比较,高眼压造模后视网膜各层组织信号强弱不均;内核层和外核层信号明显增强,厚度增加,见图5。
待ERG检测完毕后,将C57BL/6小鼠全身使用干净的小布单包裹,暴露出右眼,放置于实验板上,并固定在OCT扫描仪的下颌架上,通过调整实验板的位置找出小鼠的视盘,调整小鼠被检眼的位置,使小鼠的视盘位于监视器的中央,扫描方式选用HD 5Line Raster,每只小鼠获取3张清晰的OCT图片。利用OCT自带软件进行视网膜厚度的测量。OCT在扫描小鼠的视网膜时,为了得到清晰的图像,可以进行多次扫描,直至得到满意的图像,指示器上的信号强度要求至少达到3或者3以上。与正常的视网膜OCT断层比较,缺血时相的各层结构欠清晰,内界膜信号增强。利用OCT自带软件进行视网膜厚度的测量发现,高眼压模型视网膜缺血时视网膜厚度明显增厚约 230.46±6.68,与正常视网膜厚度186.08±2.56相比,有统计学差异 P<0.01。
6、视网膜HE染色,最终视网膜病理切片见视神经纤维层水肿明显,视网膜神经节细胞层排列紊乱,见图6。
分别取正常组、高眼压造模45min组处死动物,迅速用镊子摘取眼球,并保存较长的一段视神经(约4mm)。用生理盐水洗去血污后立即放入4%中性多聚甲醛溶液中,固定48~72h。室温下用TS-12A生物组织自动脱水机将所有固定后的组织脱水、透明。浸蜡与包埋,在LEICA RM2235轮转式石蜡切片机上切片,然后进行脱蜡、HE染色。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高眼压动物模型的造模方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)全身麻醉后的动物眼球表面给予表面麻醉,并进行散瞳处理;
(2)取宽度2-4mm的巩膜环扎带,制作直径小于动物眼球直径的环扎套环;
(3)将环扎带两端相对位置末端楔形剪除,制作宽度为1-3mm的套管;
(4)环扎带两端分别套入套管制作环扎套环,调整环扎套环的直径和两端长度;
(5)将制成的环扎套环套扎在动物角膜缘后1-2mm的巩膜面,拉紧环扎带两端的尖端,结扎固定环扎套环;
(6)保持稳定后,固定套环中的环扎带两端至不可回退,监测眼压,即形成高眼压动物模型。
2.根据权利要求1所述的造模方法,其特征在于,所述全身麻醉为采用1-1.5%戊巴比妥进行腹腔麻醉,优选剂量为40-45g/kg。
3.根据权利要求1所述的造模方法,其特征在于,所述表面麻醉采用盐酸奥布卡因滴眼液或丙美卡因滴眼液进行眼表麻醉。
4.根据权利要求1所述的造模方法,其特征在于,所述散瞳采用复方托吡卡胺滴眼液。
5.根据权利要求1所述的造模方法,其特征在于,所述的步骤(2)中环扎套环直径2-10mm,宽2-4mm。
6.根据权利要求1所述的造模方法,其特征在于,所述的步骤(5)通过调整环扎套环位置,达到不同程度的眼压。
7.根据权利要求1所述的造模方法,其特征在于,所述的步骤(6)眼压稳定在30-60mmHg;优选通过Tonopen眼压计或回弹式眼压计测量眼压。
8.根据权利要求1-7任一项所述造模方法制备的动物模型。
9.根据权利要求8所述的动物模型,其特征在于,其为小鼠、大鼠,兔、狒狒或猴子。
10.根据权利要求8或9所述的动物模型在科研中的应用。
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