CN113273546A - 聚桂醇在制备慢性高眼压动物模型中的应用及动物模型 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚桂醇在制备慢性高眼压动物模型中的应用，可通过在模型动物的巩膜上静脉中注射聚桂醇的方法构建慢性高眼压动物模型，尤其是慢性轻度眼压升高的动物模型。模型构建方法简单，高眼压维持时间长，无并发症。本发明的慢性高眼压动物模型可以用于模拟人的开角型青光眼的慢性眼压升高过程，适用于筛选青光眼治疗药物的动物实验研究及青光眼发病机制研究，具有临床前研究的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及动物疾病模型，具体涉及聚桂醇在制备慢性高眼压动物模型 中的应用。本发明还涉及一种慢性高眼压动物模型及该慢性高眼压动物模型 在研究青光眼疾病实验研究中的应用。
背景技术
青光眼是一类以视神经损伤和视野缺损为主要表现的不可逆性致盲性眼 病，本质是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的不可逆性死 亡，主要的危险因素是病理性眼内压(Intraocular Pressure，IOP)升高。其发 病率高，预后差，是临床眼病的治疗难点。
目前，常见的青光眼慢性高眼压动物模型及特点有：(1)前房注射磁珠 或透明质酸钠的高眼压模型，特点为：该模型眼压增高明显，但透明质酸钠 维持时间较短，可能需要重复注射，并且由于操作涉及到眼内注射，可能引 起眼内炎症反应，注射物对视网膜可能产生的毒性作用可能干扰试验结果； (2)激光光凝巩膜或小梁网的高眼压模型，特点为：该模型对手术设备要 求高，成功率与激光强度和重复光凝次数等有关；(3)转基因动物模型，特 点为：该模型通过基因修饰的手段构建，模型稳定性高，但耗时长，模型经 济成本高。
在制备慢性高眼压动物模型上，通常使用的药物及使用方法有(1)皮质 类固醇：通过滴眼液、结膜下注射等方式使用；(2)肿瘤坏死因子TGF-β： 主要通过玻璃体腔内或前房内注射的方式使用；(3)α-胰蛋白酶：前房内 注射；(4)苯酚：结膜下注射；(5)组织型谷氨酰胺转移酶载体：玻璃体腔 内注射等。这些药物大部分通过眼内注射的方式，注射物本身可能造成的视 网膜的直接损伤，难以准确模拟高眼压对视网膜产生的影响，存在一定的弊端。另外，除了转基因动物以外，目前尚无药物注射方法能够构建稳定的慢 性高眼压模型。业界亟需一种可操作性强、具有一定范围代表性的慢性高眼 压动物模型，这对于青光眼视神经保护治疗的研究、青光眼发病机制的研究 具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚桂醇在慢性高眼压动物模型 中的应用，能够通过简单的方法构建慢性高眼压动物模型，模型建立成本低、 稳定性高。
本发明进一步要解决的技术问题是提供一种慢性高眼压动物模型，制作 方便，模型稳定性高。
本发明还要解决的技术问题是提供慢性高眼压动物模型在研究青光眼 疾病实验研究中的应用。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了聚桂醇在制备慢性高眼压动物 模型中的应用。
优选地，所述慢性高眼压动物模型的模型动物为大鼠。
优选地，慢性高眼压动物模型的制备方法包括如下步骤：S10、对模型 动物的眼部进行麻醉；S20、将设定浓度的聚桂醇注射到模型动物的巩膜上 静脉内。
进一步优选地，还包括步骤S15、沿角膜缘切开结膜，分离筋膜，暴露 巩膜上静脉。
进一步地，在步骤S10中，所述麻醉的方法为：对模型动物进行全身麻 醉后，再在模型动物的眼内分两次滴入表面麻醉剂，每次1-3滴，两次滴入 的间隔时间为8-12分钟。
优选地，在步骤S20中，所述注射的方法为：将注射器针体沿近心端方 向插入巩膜上静脉的血管腔内，将所述聚桂醇注射至巩膜上静脉中后，注射 器针头停留20-40秒，并按压血管根部1-2分钟，巩固血管硬化效果。
进一步优选地，在步骤S20中，所述聚桂醇为聚桂醇注射液，所述设定 浓度为1-3％。
进一步地，所述聚桂醇注射液的注射量为20-30μL。
本发明第二方面提供了一种慢性高眼压动物模型，该动物模型使用聚桂 醇制备而得。
本发明第三方面提供了慢性高眼压动物模型在研究青光眼疾病中的应 用。
与现有技术相比，本发明使用聚桂醇注射液局部注射至巩膜上静脉中， 可损伤巩膜上静脉的血管内皮，使得静脉周围纤维化，进一步阻断房水回流， 引起眼压缓慢地轻度升高。因而，在注射后1周出现眼压升高，而得到慢性 高眼压动物模型。与通常眼内注射构建的高眼压动物模型相比，没有一过性 高眼压，不穿透前房，不会由眼内注射物直接引起的前房及视网膜炎症反应。 本发明的慢性高眼压动物模型，在巩膜上静脉内注射聚桂醇后，可损伤血管 内皮，促进血栓形成、阻塞血管，从而起到止血作用。静脉旁注射后能使静脉周围纤维化，压迫静脉达到巩固止血目的，并阻断房水回流，导致眼压升 高。由聚桂醇诱导的高眼压呈现慢性轻度升高，与继发性青光眼的发病过程 相似，并且不会产生并发症。
附图说明
图1是本发明一个实施例的慢性高眼压动物模型建立流程图；
图2是本发明一个实施例中巩膜上静脉注射聚桂醇前后对照图；
图3是本发明一个实施例中大鼠眼球组织结构及注射部位示意图；
图4是本发明一个实施例中大鼠巩膜上静脉注射聚桂醇前后不同时间点 的眼压测量结果图；
图5是本发明一个实施例中聚桂醇注射4周大鼠角巩膜缘HE染色图；
图6是图5中G部分局部放大图；
图7是图5中H部分局部放大图；
图8是本发明一个实施例中聚桂醇注射4周大鼠视网膜HE染色图；
图9是本发明一个实施例中聚桂醇注射4周大鼠视网膜不同部位神经节 细胞计数图；
图10是本发明一个实施例中聚桂醇注射4周大鼠视网膜电图；
图11是本发明一个实施例中聚桂醇注射4周大鼠视觉诱发电位图。
附图标记说明
11 上直肌 12 上斜肌
13 内直肌 14 下斜肌
15 下直肌 16 外直肌
2 巩膜上静脉 3 角膜
4 巩膜 5 注射器
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这 些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各 个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点 值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视 为在本文中具体公开。
以下通过实施例对本发明进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的 具体实施方式仅用于说明和解释本发明，本发明的保护范围并不局限于下述 的具体实施方式。
在本发明的具体实施方式中：
所使用的实验动物SD大鼠购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司 (合格证号：430727201101420051)。
所使用的药物和试剂：聚桂醇注射液购自陕西天宇制药，批号：20181205， 有效成分是聚氧乙烯月桂醇醚10ml：100mg。其他药物和试剂均为常规的市 售产品。
所使用的器械和仪器，眼压计为芬兰Vantaa Icare公司生产的Tonolab 型回弹式眼压计；荧光显微镜为德国LeikaDM5000B；视网膜电图 (Electroretinogram，ERG)使用德国罗兰公司生产的Ganzfelz视网膜电图 仪(刺激器为：Q450)；视觉诱发电位(VisualEvoked Potential，VEP)使用 国特医疗多焦视觉电生理系统进行检测。其他均为常见的市售产品。
以下通过一些具体的实施例来进一步说明本发明的方法操作过程及其 取得的效果。
实施例1：
本实施例用于建立慢性高眼压动物模型。
模型动物的准备：
选取7-8周龄的SD健康雄性大鼠40只，随机分为两组，每组20只， 分别作为模型组和对照组。在温度20-26℃、相对湿度60％、自由进食饮水 的环境中饲养1周。手术前3天，每日8-10点测量清醒下眼压，以术前1 天的眼压平均值记录为基线眼压，此后眼压检测均在此时间段进行。
动物模型的建立：
动物模型的建立过程如图1所示，主要包括如下步骤：
S10、对模型动物进行麻醉：在模型组和对照组的大鼠的腹腔按80mg/kg (0.3ml/100g)的剂量注射2％戊巴比妥钠进行全身麻醉后，对大鼠眼部周边 皮肤使用碘伏进行消毒，先后使用聚维酮碘和生理盐水洗眼。铺上手术单， 在大鼠的眼部放置眼睑撑开器撑开大鼠的眼睑，在大鼠的一眼内滴加2滴0.4％ 的盐酸奥布卡因滴眼液进行对眼表进行表面麻醉。十分钟后，放置眼睑撑开 器，再次滴加盐酸奥布卡因滴眼液2滴进行表面麻醉一次。
应当理解的是，可采用各种可行的麻醉方法对大鼠进行全身麻醉和眼部 表面麻醉，全身麻醉及表面麻醉只要达到动物全身及眼球局部刺激无反抗反 应即视为麻醉满意，在本发明中并不限定使用特定的麻醉药物。
S15、暴露巩膜上静脉：待使用显微镊夹取结膜无刺激性反应后，视为 麻醉满意。使用眼睑撑开器撑开大鼠的眼睑，用眼科角膜剪沿上方角膜缘弧 形剪开结膜约4mm，钝性分离筋膜并止血，暴露眼球上方巩膜上静脉(如 图2中A图所示)，通常眼球上方巩膜上静脉有2条。
S20、注射聚桂醇：如图2和图3所示，使用带有33G的Hamilton微量 注射器针头的注射器5以平行于血管走向、沿近心端方向插入巩膜上静脉2 的血管腔内(如图3所示)，在进针过程中注意不要穿透巩膜4，以免造成基 础眼内压力的减低，以及增加眼内炎症风险。当然，微量注射器针头也不限 于使用33G的Hamilton，也可以使用其他类型的微量注射器针头或者玻璃拉 针等直径细小的针头。将浓度为1％在蒸馏水中稀释的聚桂醇注射液20μL注射入巩膜上静脉2的血管腔中。初始速度1-2秒内注射10μL，随后5秒 均匀缓慢注射剩余液体，由于1％聚桂醇可作为血管硬化剂破坏血管内皮， 因而可以观察到巩膜4上静脉硬化变白(如图2中B图中所示)，部分大鼠 的血管硬化变白可延伸至角膜3周边的环状血管网。
注射后针头停留20-40秒，防止注射液返流，并压住血管根部，延长聚 桂醇在巩膜上静脉中的停留时间，以巩固血管硬化效果。大鼠眼球上方的2 条巩膜上静脉通常各自呈现“Y”字型，也有“爪”字型以及其他类型变异。 在进行第一针注射时应在分支上进针，一旦未能一次注射到位，如注射器未 能刺入静脉、刺入后脱出或者偏离预定注射位置，可选取巩膜上静脉的主干 再次注射。如图3所示，在大鼠的巩膜部位存在上直肌11、上斜肌12、内直肌13、下斜肌14、下直肌15和外直肌16等多块动眼肌，和巩膜上静脉2 等血管。注射时注射器5由角膜3向眼球外周沿巩膜上静脉2的走向插入巩 膜上静脉2中，针头不要穿透巩膜4，以免造成基础眼内压力的减小，和增 加眼内炎症的风险。
依次对2条巩膜上静脉2进行聚桂醇注射。
按照同样的方法对大鼠的另一眼睛进行麻醉处理及药物注射。对照组大 鼠不进行聚桂醇注射。
S30、眼压测量：缝合角膜缘处剪开的结膜4，并在聚桂醇注射1周后 使用回弹式眼压计测量大鼠眼球的眼内压，如果测得的眼内压较基线眼压升 高6mmHg以上，表明慢性高眼压大鼠动物模型制备成功。
通过本实施例建立的慢性高眼压动物模型，单次操作可维持大鼠高眼压 状态1-2个月。
实施例2
本实施例用检测模型动物的高眼压及其引起的球内组织变化。
在模型组大鼠聚桂醇注射后1天、1周、2周、3周、4周、2月、6月 分别使用眼压计测量大鼠清醒状态下眼压，观察眼前部表现并分析眼压在不 同时间点的改变，测量结果如图4所示。由图4可以看出，在注射聚桂醇后 5分钟时测得的大鼠眼压为17.5±1.0mmHg。聚桂醇注射后1周时，眼压升 高为23.2±3.5mmHg，大鼠眼部表现为球结膜充血，角膜无水肿、瞳孔直径 无明显改变，前房未见明显混浊。从术后第3周起，结膜充血明显减轻。术 后4周时大鼠眼压为19.7±3.9mmHg，此时结膜轻度充血，角膜透明，瞳孔 及眼前房未见异常改变。与术后4周的对照组的眼压13.0±1.2mmHg相比， 模型组术后4周的眼压升高有统计学意义(t＝5.259，P＜0.01)。说明应用聚 桂醇巩膜上静脉内注射可以引起大鼠慢性的高眼压。
在聚桂醇注射第4周，取模型组大鼠和对照组大鼠各3只进行安乐死， 取出完整眼球，通过对眼球进行石蜡切片HE染色后，在正置显微镜下观察 角巩膜缘处组织形态。如图5和图6所示，对照组大鼠角膜缘形态规则，对 应视网膜形态平整，血管与周围组织边界清晰；如图5和图7所示，模型组 大鼠角巩膜缘处形态与对照组相比，血管形态不规则、周围结缔组织结构紊 乱。说明聚桂醇对慢性高眼压模型大鼠的血管及其周围纤维结缔组织产生损 伤作用。
在正置显微镜下观察视网膜的形态，可见对照组大鼠视网膜结构正常， 视网膜神经节细胞分布均匀(如图5中A图所示)；模型组大鼠视网膜厚度 减少，视网膜神经节细胞数目减少(如图5中B图所示)。说明慢性高眼压 导致大鼠的视网膜出现损伤。
取术后3周的模型组大鼠和对照组大鼠各3只，施行全身麻醉，分别使 用大鼠脑立体定位仪，使用经上丘的逆行示踪法对视网膜神经节细胞进行荧 光金示踪标记，1周后对大鼠进行安乐死，心脏灌注后行视网膜铺片，正置 荧光显微镜下对铺片的视网膜的四个象限的后极部、中周部及周边部(分别 约为视网膜半径的1/6、1/2和5/6处)显影摄片，对标记的视网膜神经节细 胞进行计数。如图9所示，与对照组大鼠视网膜的后极部(图9中A图片)、中周部(图9中C图片)及周边部(图9中E图片)相比，模型组大鼠的视 网膜后极部(图9中B图片)、中周部(图9中D图片)神经节细胞数目改 变不明显，周边部(图9中F图片)的视网膜神经节细胞数目减少。说明慢 性高眼压导致大鼠周边部的视网膜神经节细胞出现死亡，数量减少。
对聚桂醇注射后4周的模型组大鼠及对照组大鼠进行全身麻醉后，置于 黑暗环境中暗适应12小时以上，散瞳后进行ERG检查。对模型组大鼠和对 照组大鼠暗适应3.0模式中的a波及b波的振幅及潜伏期进行比较，如图10 所示，与对照组相比，模型组大鼠的a波振幅减低、潜伏期延长，b波振幅 及潜伏期未见明显改变，说明模型组大鼠的慢性眼压升高引起视网膜感受器 细胞功能下降程度较轻。
对正常瞳孔大小、未经散瞳处理的大鼠全身麻醉后，进行闪光VEP检 查，检查结果如图11所示。由图11可见，模型组大鼠(图11中的D图) 的VEP白光3.0模式的P2波潜伏期相比于对照组大鼠(图11中的C图) 对应的P2波潜伏期延长。说明模型组大鼠的视网膜神经节细胞相关的视觉 传导功能出现障碍，慢性高眼压能够引起大鼠的视路传导功能障碍。
通过本发明的方法得到的慢性高眼压动物模型能够在研究青光眼疾病 中广泛应用。
通过上述实施例可以看出，通过在巩膜上静脉中注射聚桂醇构建慢性高 眼压动物模型的方法，将聚桂醇注射液作为局部血管硬化剂，能够引起模型 动物轻度慢性的眼压升高。所设定浓度范围是1-3％，浓度过高可能引起血 管周围组织硬化过度、筋膜等纤维结缔组织粘连僵硬、药源性视网膜外部损 伤；过低浓度可能引起血管硬化效果不足、血管复通、房水流出通道再次开 放等建模失败的情况。在模型构建过程中无一过性高眼压，也不会产生眼内 并发症。此外，应用聚桂醇制备得到的慢性高眼压动物模型，模型动物的眼 压可稳定保持在19mmHg以上、时间可稳定维持4周以上。并且，模型构建 的创口小、眼部炎性反应轻，角膜无明显水肿及新生血管，应用聚桂醇构建 慢性高眼压动物模型，手术操作易掌握，操作熟练后在5分钟之内即可完成。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在 本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包 括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样 应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.聚桂醇在制备慢性高眼压动物模型中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢性高眼压动物模型的模型动物为大鼠。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，慢性高眼压动物模型的制备方法包括如下步骤：
S10、对模型动物进行麻醉；
S20、将设定浓度的聚桂醇注射到模型动物的巩膜上静脉内。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，还包括步骤S15、沿角膜缘切开结膜，分离筋膜，暴露巩膜上静脉。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤S10中，所述麻醉的方法为：对模型动物进行全身麻醉后，再在模型动物的眼内分两次滴入表面麻醉剂，每次1-3滴，两次滴入的间隔时间为8-12分钟。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤S20中，所述注射的方法为：将注射器针体沿近心端方向插入巩膜上静脉的血管腔内，将所述聚桂醇注射至巩膜上静脉中后，注射器针头停留20-40秒，并按压血管根部1-2分钟。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在步骤S20中，所述聚桂醇为聚桂醇注射液，所述设定浓度为1-3％。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述聚桂醇注射液的注射量为20-30μL。
9.一种慢性高眼压动物模型，其特征在于，使用聚桂醇制备而得。
10.慢性高眼压动物模型在研究青光眼疾病中的应用。
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- 2021-02-25 CN CN202110214890.6A patent/CN113273546A/zh not_active Withdrawn
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