CN107129521A - 一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用。本发明的穿膜肽能够携带功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，到达所需给药的部位，所述的体组织屏障特别是眼屏障。本发明还提供了包含该穿膜肽的复合体、包含该穿膜肽的药物组合物。

Description

一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用。

背景技术

目前，年龄相关性黄斑病变(age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)等新生血管性眼病已成为主要的致盲性眼病，且其患病率呈上升趋势。此外，许多眼后节疾患如高度近视脉络膜新生血管、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞以及眼前节手术后诱发的黄斑囊样水肿等，也往往严重损害视功能，给患者、患者家庭和社会都带来极大的经济负担。尽管激光和手术治疗可改善或部分保存患者视功能、延缓病情发展，但总体上新生血管性眼病对视功能的损害难以逆转，严重危害患者的视觉质量和生活质量。

与激光、手术等治疗方法相比，药物干预是预防和治疗新生血管性眼病的最佳途径，但目前广泛应用的抗血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)重组单克隆抗体或融合蛋白类等药物(Ranibizumab、Conbercept等)，由于其分子量大(分别为48kDa、143kDa)，难以穿透血眼屏障，必须经眼球穿刺至玻璃体腔注射给药，出血、感染、非感染性炎症、血管栓塞、白内障、眼压升高、组织损伤等并发症无法避免。

近年来，蛋白质、核酸等生物大分子药物不断涌现，已成为药物研究领域最具划时代意义、最具前景的治疗药物之一。然而，亲水性强和分子量大使得生物大分子药物扩散穿过细胞膜变得十分困难。由此产生了小分子细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPP)、腺病毒载体等功能性分子，应用于增强蛋白质、核酸等药物细胞内递送能力。腺病毒载体在眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的给药中受到了广泛的关注。但已有研究指出，应用重组病毒运送脱氧核糖核酸(deoxynucleotide acid，DNA)表达盒至眼内，同时在眼内过表达治疗性的基因产物，很可能是弊大于利的，且其存在很大的局限性，如转入效率低，细胞毒性大等。

本发明人所在团队的前期工作中，已经获得了众多抗新生血管活性的多肽(如KV11等)，此外，还有一些抗炎多肽，以及一些神经保护和抗粘连形成多肽等，若能找到适用于携带这些功能肽的引导肽，从而通过无创的方法使得这些小分子功能肽进入眼内，达到持续、稳定、有效治疗湿性AMD、糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿等疾病的作用，则具有较好的应用价值。

综上，亟需找到一种给药方便、可持续给药的药物递送方法，从而能够携带治疗药物有效穿透眼屏障，达到治疗的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有透过细胞膜或体组织屏障功能的肽及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种穿膜肽，所述的穿膜肽选自：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过1-3个(较佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；

(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少75％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

(d)包含取自SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少8个连续氨基酸序列的多肽片段。

在本发明的另一方面，提供所述的穿膜肽或编码该穿膜肽的多核苷酸用途，用于促进功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，或用于与功能性分子连接来制备能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，或用于制备能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物。

在一个优选例中，所述的功能性分子包括(但不限于)：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。

在另一优选例中，所述的体组织屏障是眼屏障，较佳地所述的眼屏障包括：眼组织屏障(形成眼球壁的各层组织及其各层组织间的细胞连接等)，泪液屏障，血眼屏障(血房水屏障、血视网膜屏障)。

在本发明的另一方面，提供一种能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，所述的复合体包括：(1)所述的穿膜肽；和(2)与(1)的穿膜肽操作性连接的功能性分子。

在一个优选例中，所述的功能性分子包括(但不限于)：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。

在另一优选例中，所述的功能性多肽包括(但不限于)：抗新生血管生成的多肽，神经保护性多肽，抗粘连形成的多肽；较佳地，所述的抗新生血管生成的多肽包括(但不限于)：KV11。

在另一优选例中，所述的穿膜肽与功能性多肽之间，还包括连接肽；较佳地，所述的连接肽是：甘氨酸(如Gly₃)或赖氨酸(如Lys₁)。

在另一优选例中，所述的操作性连接包括：共价连接或非共价连接(如偶联、吸附、结合等)。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的穿膜肽；或

所述的多核苷酸编码所述的能够穿透细胞膜的复合体；且，其中与穿膜肽操作性连接的功能性分子是功能性多肽。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包括所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的穿膜肽，或所述的能够穿透细胞膜或体组织屏障的复合体，或所述的多核苷酸，或所述的表达载体，或所述的基因工程化的细胞；和药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的药物组合物是预防或治疗眼部疾病的药物组合物，其剂型包括：点眼给药剂型、球结膜下注射剂型、眼周注射剂型、视网膜下注射给药剂型、眼球内给药(例如玻璃体腔内注射)剂型。

在另一优选例中，所述的眼部疾病包括(但不限于)：新生血管性眼病(如VEGF引起的血管增生)、退行性眼病、炎症性眼病、肿瘤性眼病、视神经病变性眼病。

在本发明的另一方面，提供一种注射用给药器(如注射用针)或药盒，所述的注射用给药器或药盒中包括：所述的穿膜肽或所述的编码该穿膜肽的多核苷酸；或所述的能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体；或所述的药物组合物；或所述的表达载体，或所述的基因工程化的细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.M13KE Ph.D^TM系统DNA图谱及限制性位点。

图2.CC12噬菌体克隆的DNA测序图谱(DNA序列：TAGATGTTTACTCCGCCTTCTATGATTGAGCGGCTT)。

图3.多肽CC12及其连接肽、对照肽的细胞毒性。**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图4.FITC标记的多肽CC12及其连接肽、对照肽的细胞内化摄取呈时间依赖性。ARPE-19细胞暴露于250μM浓度的多肽中0.5h，1h，3h，6h后荧光显微镜拍摄的代表性图片。标尺：200μm。

图5.A为流式细胞分析定量检测进入ARPE-19细胞内的FITC多肽的荧光强度。B为对于A的结果的统计结果，*表示P<0.05，***表示P<0.001。

图6.家兔离体角膜(A)和离体视网膜-脉络膜-巩膜复合体(B)多肽的透过曲线和表观透过系数P_app(n＝3，mean±SD)。***表示P<0.001。

图7.扩散实验后离体组织毒性评价。家兔离体角膜(A)和离体视网膜-脉络膜-巩膜复合体(B)水化值ΔH，各多肽组与空白对照组相比无显著性差异。HE组织染色(C)未发现明显的空泡化或炎症免疫反应，药物透过离体组织无明显渗漏。标尺：1mm。

图8.FITC-多肽或PBS球后注射0.5h后冰冻切片PI染色显示眼后段组织的荧光强度。标尺：50μm。

图9A.FITC-多肽或PBS球后注射3h、6h和24h后冰冻切片PI染色显示眼后段组织的荧光强度。CC12、Penetratin和CC12-KV11多肽的眼后段穿透性呈时间依赖性。标尺：50μm。

图9B.FITC-多肽或PBS结膜囊点眼0.5h和3h后冰冻切片PI染色显示角膜的荧光强度。标尺：50μm。

图10.激光共聚焦眼后段荧光分布图(A)及多肽-FITC或PBS球后注射3h、6h和24h后冰冻切片PI染色显示眼后段组织的荧光强度(B)。CC12、Penetratin和CC12-KV11多肽的眼后段穿透性呈时间依赖性。*、**、***分别表示与KV11-FITC多肽组相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。标尺：50μm。

图11.¹²⁵I-KV11HPLC分析报告。

图12.¹²⁵I-CC12-KV11HPLC分析报告。

图13.¹²⁵I-KV11和¹²⁵I-CC12-KV11结膜囊内点眼0.5h(A)和球后注射1h(B)后眼球内放射性比活度/剂量(ID/g)。***P<0.001。

图14.连接肽CC12-KV11对VEGF诱导HUVECs增殖的影响。细胞增殖实验采用MTS方法检测24h后不同浓度多肽对VEGF诱导HUVECs增殖的作用(mean±SD，n≥3，#表示与空白对照组相比，P<0.05；*表示与VEGF组相比，P<0.05；***表示与VEGF组相比，P<0.001)。

图15.CC12-KV11多肽抑制VEGF诱导HUVECs趋化。趋化24h后各组Transwell小室下室面细胞迁移情况(A)，除Control(图中简写为Contr)空白对照组无VEGF外，其余各组Transwell小室下层均含有25ng/mL VEGF。标尺：50μm。趋化24h后各组VEGF诱导的迁移细胞数量(B，mean±SD，n＝10，###表示与空白对照组相比，p<0.001；***表示与VEGF组相比，p<0.001)。

图16.CC12-KV11多肽抑制VEGF诱导HUVECs管腔形成。空白对照组、VEGF组、不同浓度Ranibizumab或多肽组管腔样结构形成情况(A)，标尺：50μm。各组相对管腔形成长度(B，mean±SD，n＝10，###表示与空白对照组相比，P<0.001；***表示与VEGF组相比，P<0.001)。

图17.CC12-KV11多肽抑制鸡胚尿囊膜新生血管。(A-F)分别代表PBS组、CC1250μg组、KV1150μg和10μg、CC12-KV1150μg和10μg组，滤纸片周围一个直径范围内新生血管生长情况(标尺：2.5mm)。(G)各组鸡胚尿囊膜毛细血管生长数量(mean±SD，n＝10～12；NS表示两组比较无显著性差异；*表示与PBS组相比，P<0.05；**表示与PBS组相比，P<0.01；***表示与PBS组相比，P<0.001)。

图18.CC12-KV11多肽抑制高氧诱导小鼠视网膜新生血管。PBS或多肽结膜囊内点眼和球后注射干预高氧诱导的C57BL/6J小鼠视网膜新生血管图(A)。血管内皮isolectinB4染色，由四个象限组合而成的完整视网膜血管染色图，标尺：1mm；高氧球后注射(B)、结膜囊点眼组(C)无灌注面积百分比，以及高氧球后注射(D)、结膜囊点眼组(E)新生血管簇面积百分比柱状图定量分析。NS表示两组比较无显著性差异；*表示与PBS组相比，P<0.05；**表示与PBS组相比，P<0.01；***表示与PBS组相比，P<0.001。

图19.CC12-KV11多肽结膜囊内给药或球后注射可抑制高氧诱导小鼠视网膜新生血管。高氧诱导小鼠视网膜病变模型视网膜组织切片HE染色(A)。箭头显示突出于内界膜的新生血管有核细胞和管腔样结构，或视网膜内出血；标尺：50μm。各组血管内皮有核细胞计数情况：结膜囊点眼组(B)和球后注射组(C)，n＝8，###表示与空气PBS组相比P<0.001，*表示与高氧PBS组相比P<0.05，**表示与高氧PBS组相比P<0.01，***表示与高氧PBS组相比P<0.001，NS表示无显著性差异。

图20.高浓度(200mM)多肽球后注射给药后7天，CC12、KV11和CC12-KV11多肽组大鼠视网膜显微和超显微结构比较。石蜡切片HE染色后光镜检查显示视网膜显微结构正常完整，未见明显水肿、炎症或其他免疫反应(第一排，标尺：50μm)；透射电镜检查超显微结构，视细胞(第二排，标尺：5μm)、双极细胞(第三排，标尺：1μm)和神经节细胞(第四排，标尺：1μm)形态正常，未见明显水肿、断裂或空泡等异常改变。

图21.各组多肽或PBS球后注射前后ERG典型波形记录图和b波振幅比较，n＝3。

具体实施方式

本发明人经过研究筛选，提供了一种新型的穿膜肽，其能够穿透细胞膜或体组织屏障。本发明的穿膜肽特别适用于穿透眼部的组织屏障，将药物带到眼内所需给药的部位。本发明还提供了包含该穿膜肽的复合体、包含该穿膜肽的药物组合物。

如本文所用，所述的“操作性连接”是指两个或多个分子之间的功能性的空间排列。例如：穿膜肽与功能性分子之间通过共价键相互连接，则它们两者之间发生操作性连接。

如本文所用，所述的“功能性分子”是指对于体内病症具有识别或诊断、预防或治疗功效的物质或者可用于携带对于体内病症具有识别或诊断、预防或治疗功效的物质的载体物质(穿膜肽可以有效地提高这些物质的穿膜效率)。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性小分子、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体等。

如本文所用，所述的“保守性变异多肽”是指CC12多肽的片段、衍生物和类似物。一般地，该“保守性变异多肽”是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

如本文所用，所述的“穿膜肽”、“细胞穿膜肽”、“引导肽”可以互换使用，均是指CC12多肽或其保守性变异多肽。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

穿膜肽

本发明人利用噬菌体展示技术，进行体内定向筛选，并通过测序分析，筛选出一系列多肽序列，根据富集效果和与视网膜靶分子结合强度，选择其中一个具有12个氨基酸的眼部引导多肽(peptide for ocular delivery，POD)，命名为CC12。

为了验证其功能，本发明人固相合成了该CC12多肽，并通过体内外定性定量实验(细胞内化摄取、流式细胞分析、扩散池透过性实验、冰冻切片、¹²⁵I同位素示踪法等)，证明了其具有穿透眼屏障特别是视网膜屏障的能力。

本发明的CC12多肽可以是重组多肽、合成多肽。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的CC12多肽的序列可以是：EMFTPPSMIERL(SEQ ID NO:1)。

本发明还包括CC12多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的CC12多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-3个或1-2个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，CC12多肽可以指具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽。该术语还包括具有与CC12多肽相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-3个、1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CC12多肽的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加多肽的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了编码本发明CC12多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CC12多肽的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明还提供了所述的穿膜肽的应用，用于促进功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，或用于与功能性分子连接来制备能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，或用于制备能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。所述的眼组织生理结构包括角膜、结膜、巩膜、视网膜、等组成的生理屏障以及由位于眼组织的上皮细胞、内皮细胞、神经节细胞等各类细胞组成内界膜、神经节细胞层、内丛状层、外丛状层、内核层、外核层、椭圆体带、视网膜色素上皮/Bruch膜复合体等在内的眼组织结构。眼组织屏障则为组成眼球壁的各层生理结构及其的各层组织间的细胞连接，用于防止外来物质进入眼球的组织学屏障，如位于眼球最外层，由坚韧致密的纤维组织构成的纤维膜层，包含有角膜层、巩膜层以及角巩膜缘等；眼球壁中层为葡萄膜层，自前向后分为虹膜、睫状体和脉络膜；眼球壁后层为视网膜层。所述的血眼屏障包括血-房水屏障与血-视网膜屏障。

所述的穿膜肽可以应用到穿过眼屏障的分子运输载体以及细胞穿膜载体的制备中。

复合体

本发明还提供了一种能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，所述的复合体包括：本发明所述的穿膜肽，以及与所述的穿膜肽操作性连接的功能性分子。所述的功能性分子包括但不限于：功能性生物大分子、功能性小分子、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体；较佳地，所述的功能性生物大分子包括但不限于：功能性多肽、功能性核酸；较佳地所述的功能性多肽包括但不限于：功能性抗体。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子可以是具有示踪功能的标志物，包括但不限于荧光染料、MRI造影剂、放射性显影剂、磁性粒子或具有着色功能的化学试剂。例如，所述的具有示踪功能的标志物或功能性小分子可以为FITC。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子可以是功能性小分子，包括无机小分子和有机小分子，其分子量小于1000道尔顿。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子可以是功能性大分子，例如，可以是功能性多肽(如抗体)、功能性核酸。所述的功能性分子可以为分子量大于1000道尔顿的功能性分子，包括但不限于抗凋亡因子、神经营养因子、荧光蛋白或功能性抗体等。

作为本发明的优选方式，所述功能性分子可以是功能性多肽；较佳地，所述功能性多肽包括但不限于具有以下序列(或这些序列基础上的保守性变异多肽)：YTMNPRKLFDY(KV11)。

作为本发明的另一种方式，所述的功能性分子为功能性核酸片段，包括但不限于质粒、siRNA、DNA、寡核苷酸、miRNA、反义核酸等。

作为本发明的一种实施方式，所述功能性分子为具有分子包装载物功能的制剂，包括但不限于脂质体、多聚体、树突状分子、纳米包装制剂等。

作为本发明的一种实施方式，所述的功能性分子为可携带遗传物质的病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体等。

本发明所述的穿膜肽与功能性分子的连接方式可以为共价连接或非共价连接。应理解，只要能够保留穿膜肽及功能性分子的功能、保留良好的穿透细胞膜及体组织屏障的效果，任何连接方式均可包含在本发明中。共价连接通常以形成共价键的方式将两个分子进行连接。而一些非共价连接(不形成共价键)例如偶联、吸附、结合等也可应用。

作为本发明的优选方式，所述的穿膜肽与功能性分子之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。

所述的穿膜肽与功能性分子之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸；例如15、10、8、6、5、4、3、2、1个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响穿膜肽与功能性分子发挥穿透细胞膜及体组织屏障效果，也不影响功能性分子的功能。

作为本发明的一种实施方式，在穿膜肽与功能性分子之间之间包括一连接肽，所述的连接肽上包含至少一个特异性酶切位点。所述的酶切位点选自(但不限于)：肠激酶酶切位点，凝血酶酶切位点，或胰蛋白酶酶切位点。酶切位点的设置便于后续将穿膜肽与功能性分子进行分离。

穿膜肽与功能性分子之间的连接，若以肽键进行连接，则根据需要，功能性分子可以位于穿膜肽的氨基端，也可以位于穿膜肽的羧基端。

作为本发明的一种实施方式，所述的穿膜肽可以通过氨基、羧基或巯基等化学反应实现与功能性分子的连接，包括但不限于所述多肽与多聚物之间的连接，所述多肽在脂质体或纳米粒子表面的共价修饰、酯化反应、硫化反应等。

所述的非共价连接为静电吸附连接或受体配体反应。所述的静电吸附连接包括但不限于所述细胞穿膜载体与核酸分子的间的静电连接。所述的受体-配体反应指的是分别在细胞穿膜肽和功能性分子上连接在可以特异性匹配的受体与配体，通过受体与配体的高度专一性，实现所述多肽与功能性分子的连接。如生物素与亲和素之间的专一性匹配。

基于本发明的穿膜肽可以促进功能性分子透过细胞膜或体组织屏障。因此，任何功能性分子均可被应用于与所述的穿膜肽连接，来构成复合体。作为本发明的优选方式，所述的功能性分子是对于眼部疾病具有预防或治疗作用的分子。

所述眼部疾病包括但不限于：新生血管生成性眼病、退行性眼病、炎症性眼病、肿瘤性眼病或视神经病变性眼病等。

所述新生血管生成性眼病包括但不限于：老年性黄斑变性、视网膜分支静脉栓塞、视网膜中央静脉栓塞、糖尿病性的黄斑水肿、黄斑囊样水肿、葡萄膜炎性黄斑水肿、增生性玻璃体视网膜病变。

所述退行性眼病包括但不限于：视神经萎缩、青光眼、白内障、干眼症、飞蚊症、老花眼、视网膜色素病变、老年性黄斑变性等。

所述炎症性眼病包括但不限于：角膜炎、眼色素层炎、结膜炎、巩膜炎、巩膜表层炎、眼睑炎、巨细胞视网膜炎、后段葡萄膜炎、化脓性眼内炎等。

所述肿瘤性眼病包括但不限于：眼睑、结膜、眼球各层组织以及眼附件的肿瘤、视神经鞘脑膜瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤等。

所述视神经病变性眼病包括但不限于：缺血性视神经病变、Leber遗传性视神经病变、缺血再灌注性损伤、非动脉缺血性视神经病变、慢性视神经萎缩等。

药物组合物及药盒

本发明还提供一种能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的穿膜肽，或所述的能够穿透细胞膜或体组织屏障的复合体，或所述的多核苷酸，或所述的表达载体，或所述的基因工程化的细胞；和药学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的穿膜肽，或所述的能够穿透细胞膜或体组织屏障的复合体，或所述的多核苷酸，或所述的表达载体，或所述的基因工程化的细胞施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

所述药物组合物可以通过点眼给药、球结膜下注射、眼周注射、视网膜下注射、眼内注射的方法实现给药。

所述的点眼给药指的是滴眼剂、眼用凝胶或眼膏等通过无创式的方式在眼表给药。

所述的眼周注射是为了避开了角膜上皮对药物吸收的屏障作用。包括球结膜下注射、球旁注射和球后注射等。

作为本发明的一种实施方式，给药方式为球结膜下注射，药物吸收主要是通过扩散到角膜基质层和角巩膜缘组织入眼，适用于眼前段病变；

作为本发明的一种实施方式，给药方式为球旁注射，药物主要经巩膜渗入，适用于虹膜睫状体部位的病变；

作为本发明的一种实施方式，给药方式为球后注射，在晶状体虹膜隔以后部位达到治疗浓度，适用于眼后段以及视神经疾病。

所述的视网膜下注射，指的是在视网膜色素上皮细胞层与光感受器层间的药物注射。

所述的眼内注射，包括前房注射、玻璃体腔内注射等。

本发明还提供了一种注射用给药器(如注射用针)、药盒或试剂盒，其中包括：所述的穿膜肽或编码该穿膜肽的多核苷酸；或所述的能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体；或所述的药物组合物。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、体内定向进化筛选眼部引导肽

本发明人应用噬菌体展示技术体内定向进化的方法，有目的地从重组噬菌体的各种变异体(肽库，peptide library)中富集特定的重组噬菌体，并通过测序分析，结合富集效果和与视网膜靶组织亲和力的高低，筛选出具有潜在穿透眼屏障能力的优势重组噬菌体肽。

本实施例中应用Ph.D.^TM系统(M13KE)，其基于M13单链噬菌体载体(M13mp19)，在其基因gIII的5’端引入重组位点，从而将12个氨基酸残基组成的多肽的N端融合重组至噬菌体小衣壳蛋白pIII。每个重组噬菌体展示5个单一克隆的多肽，展示不同12肽的重组噬菌体混合形成肽库(Ph.D.-12library)。

在本实施例中，本发明人采用体内定向进化的方法，通过噬菌体肽库结膜囊内点眼或球后注射的方式，回收并检测眼球内房水、虹膜、玻璃体、视网膜、脉络膜中重组噬菌体的含量，并从中挑选单克隆进行测序分析。通过高通量的生物淘选(biopanning)，筛选出较易穿透眼屏障的重组噬菌体肽，为进一步合成POD，并利用该POD增强功能肽在眼部的药物递送奠定基础。

一、实验材料

1、噬菌体展示肽库和E.coli ER2738宿主菌

12肽噬菌体展示肽库(dodecapeptide Phage Display Peptide Library，Ph.D.-12library)和E.coli ER2738宿主菌(New Eng BioLabs公司)，12肽插入重组位点位于M13KE Ph.D^TM系统(图1)的Acc65I/KpnI和EagI之间。Ph.D.-12肽库100μL，1×10⁹克隆多样性(complexities)，-20℃，50％TBS甘油中保存；ER2738于50％甘油中培养，-70℃保存。

2、实验动物

Sprague Dawley大鼠(180-200克)，获自中国科学院上海实验动物中心。

3、主要试剂

96gIII测序引物(上海Raygene公司)：5′-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′。

LB培养基(上海Raygene公司)：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g加ddH₂O至1L；充分混匀，高压蒸汽灭菌，室温保存；其中800mL LB培养基中加入2％(16g)琼脂(agar)，剩余的100mL液态LB培养基用于摇菌，另100mL用于制备Top Agar。

Top Agar(Biowest)：100mL LB+0.6％(0.6g)琼脂糖(argrose)，高压蒸汽灭菌，2.5～3mL/管分装，室温固态保存，用时微波熔化。

IPTG/Xgal(上海Raygene公司)：0.05g IPTG+0.04g Xgal+1mL DMF，4℃避光保存。

LB/IPTG/Xgal Plates：800mL含16g琼脂的LB培养基，冷却至低于70℃，加入1mLIPTG/Xgal，快速倒板，每板20mL，4℃避光保存。

二、实验方法

1.Ph.D.-12肽库给药及眼组织回收

(1)实验分组：Sprague Dawley大鼠分为空白对照组、Ph.D.-12肽库点眼组、Ph.D.-12肽库球后注射组；

(2)给药：将Ph.D.-12肽库溶液稀释100倍至浓度约1×10¹¹pfu/mL。结膜囊内点眼组：用枪头吸取10μL肽库溶液或等体积PBS，每10min点眼一次，共给药6次；球后注射组：采用1mL注射器抽取120μL肽库溶液或等体积PBS，在眶下缘中外1/3处，沿眶下壁垂直进针约0.2cm，越过眼球赤道部后即斜向鼻上方，入针约0.4cm深，确定未刺入眼球内后，回抽胰岛素针无回血即可缓慢推入肽库溶液或PBS；注射后轻轻拔出针头并垫以棉球轻压眼球片刻，观察有无球后出血现象(如眼睑肿胀、眼球突出、运动受限等)；

(3)眼组织回收：最后一次点眼及球后注射1h后，用1M PBS 3～5mL冲洗结膜囊和角膜表面，每次1min，共冲洗三遍。用50μL微量注射器于角巩缘处刺入前房，针头平行于晶体进入，注意进针勿太过倾斜，以防刺穿角膜或戳入晶体。缓慢抽取25～35μL房水，置于标记好的EP管中。之后处死SD大鼠，并取出大鼠眼球，并再次用1M PBS冲洗眼球，每次1min，共冲洗三遍，立即转入作好标记的培养皿中。在体式显微镜低光下，显微镊夹持眼球周围筋膜组织或视神经以固定眼球位置，用1mL注射器针头，自角巩缘处向球心方向刺入眼球；拔出注射器针头，用显微剪刀沿注射器针孔处平行于角巩膜缘方向环形剪开眼球，分离角膜、虹膜组织；小心取出晶体，逐一分离玻璃体、视网膜、脉络膜，最后钝性分离巩膜，注意修剪去除残余的眼球周围筋膜组织；将不同眼组织转入标记好的eppendorf管待测。

2.噬菌体滴定计数(蓝白斑筛选)

(1)接种和摇菌：从培养皿中挑取E.coli ER2738接种至5～10mL LB培养基中，摇菌4～8h，至对数增长中期(mid-log phase，OD₆₀₀～0.5)；

(2)处理样品(前述步骤“1”获得的不同眼组织样品)：每个样品各取10μL，作为样品的原浓度，再取10μL用LB稀释10倍、100倍，每个样品一共准备3个浓度梯度；

(3)其他准备：微波熔化Top Agar，3mL分装至灭菌的培养管，45℃恒温水浴维持培养管温度；将准备好的LB/IPTG/Xgal Plates 37℃预热至少1h备用；

(4)感染和铺板：当E.coli ER2738摇菌至对数增长中期，200μL分装至微量离心管，每管中加入10μL噬菌体样品感染，震荡混匀，室温下培养5min：之后将其一一对应转入含40℃ Top Agar的培养管中；混匀后立即依次倒入预热的LB/IPTG/Xgal Plates，轻柔地晃动培养皿使Top Agar均匀地涂布于LB/IPTG/Xgal培养皿表面，在培养皿底面做好标记，并放置5min冷却。冷却后倒置培养皿，37℃避光，孵育过夜。

(5)计数：过夜后计数每个培养皿上蓝斑的数量(只计数蓝斑，白斑表明有非重组噬菌体污染)，并乘以相应的稀释倍数，即每10μL样品中含有的噬菌体数量。

3.噬菌体单克隆测序及菌落扩增、富集

(1)噬菌体单克隆菌落的挑选：完成计数后，立即用灭菌的200μL Tip头轻碰挑选独立的单克隆菌落(一般从<100个菌落的培养皿中挑选；保证挑选的每一个斑块只含单一的DNA序列；只挑选蓝斑，白斑表示有环境中噬菌体污染)至10～20mL LB培养液中(～1：200)，37℃摇菌培养约4.5h，从中取200μL进行测序，剩余菌液加入50％等体积甘油，-20℃保存，待扩增用。

(2)重组噬菌体测序：运用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit试剂盒Sanger法，一代测序筛选出的重组噬菌体单克隆单链DNA。测序引物为96gIII。利用Vector 8.0软件将核苷酸序列转换成氨基酸序列，并通过BioEdit软件进行序列同源分析。

(3)筛选出的噬菌体的纯化、扩增传代：根据测序结果，将富集最多的候选重组噬菌体扩增传代。将需要扩增的上述剩余菌液转入离心瓶，8000×G离心20min，取80％上清转移至另一离心瓶，每个离心瓶中加入25mL预冷的PEG/NaCl，充分混匀，4℃过夜使噬菌体沉淀；12000×G，4℃离心20min，弃去上清，加入2mL PBS将离心管底部白色沉淀重悬，并转移至Eppendorf管，置于冰上冷却30min；17000×G离心5min，将80％的上清转移至另一Eppendorf管中，每管中加入500μL PEG/NaCl，充分混匀，置于冰上冷却30min。17000×G离心30min，弃去上清，沉淀加入0.5～1mL PBS重悬；17000×G离心5min，取上清，将纯化后的重组噬菌体依次稀释成10^-2，10^-4，10^-6，10^-8，10^-9，10^-10，10^-11浓度梯度，注意每个浓度梯度更换Tip头。取10^-9，10^-10，10^-11浓度梯度的噬菌体重复上述感染、铺板、计数过程，确定扩增后的噬菌体浓度。-20℃保存于50％甘油中，进行第二轮点眼/球后注射给药。

三、结果

通过结膜囊内点眼和球后注射的方式，体内定向筛选进入眼内并能与视网膜结合的噬菌体肽。经过两轮的筛选后，本发明人随机挑选了98个克隆进行测序，从中发现了5个富集明显的噬菌体克隆。挑选这5个克隆进行扩增、第三轮富集验证，发现其中3个克隆富集明显，且测序结果与给药的噬菌体肽一致。最终根据富集效果和与视网膜的结合强度，确定了以其中1个优势重组噬菌体肽进行下一步的研究，将该重组噬菌体肽含12个氨基酸的肽段命名为CC12，其DNA测序图谱如图2所示。其氨基酸序列为：EMFTPPSMIERL(SEQ ID NO:1)；其测序DNA序列为：TAGATGTTTACTCCGCCTTCTATGATTGAGCGGCTT(SEQ ID NO:2)。

序列分析显示，CC12多肽含有苯丙氨酸(Phe，F)这一疏水芳香族氨基酸，脂溶性较强，且其具备亲水、疏水氨基酸残基交错排列的双亲性特性；同时，CC12多肽可能主要形成随意卷曲结构，并混有不同比例的聚脯氨酸II型(polyproline type II，PPII)空间结构，这一结构特点使其能提供更多氢键结合位点，与细胞膜的作用更加高效，有利于其在体内通过易位或转导作用穿透生物学屏障。

实施例2、眼部引导肽CC12及其连接肽的眼屏障通透性测定

眼对外来物质的吸收具有严格的选择通透性，这一选择过程主要通过眼部的生物学屏障实现。血视网膜屏障是眼部关键的生物学屏障，能够有选择性地调控外来物质进入眼内组织，因而也限制了药物从全身血液循环递送到眼后段的过程。血视网膜屏障由内屏障和外屏障组成，其特点类似于血脑屏障。视网膜毛细血管内皮细胞及其连接构成血视网膜内屏障(inner blood-retinal barrier，iBRB)，视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmentepithelium，RPE)及其连接组成血视网膜外屏障(outer BRB，oBRB)。

透巩膜扩散递送药物至外层视网膜、脉络膜是通过多孔疏松扩散(porousdiffusion)完成的。药物的分子量越大、直径越大，其巩膜透过率越低，且线形分子(例如dextran)比球形分子(例如IgG)更不易扩散透过巩膜。

而药物透过巩膜屏障后，可通过脉络膜毛细血管或视网膜毛细血管的血液进入视网膜和玻璃体。由于脉络膜血管存在窗孔和渗漏，药物容易透过脉络膜血管，此后，药物必须跨越RPE(oBRB)以到达神经视网膜层和玻璃体。而在视网膜毛细血管中的药物则必须跨越毛细血管内皮细胞的屏障(iBRB)。BRB的存在削弱甚至阻碍了许多有效的大分子药物在眼后段中的转运：眼周或全身给药后药物的内向转运，以及玻璃体内给药后药物的外向渗透。

因而在本实施例中，本发明人固相合成了CC12；以Penetratin小肽作为穿透性实验的阳性对照；并与具有明确抑制新生血管活性作用的小肽KV11(Zhao H等，Inhibitionof pathologic retinal neovascularization by a small peptide derived fromhuman apolipoprotein(a).Invest Ophthalmol Vis Sci 2009；50(11):5384–5395)作穿透性的比较。此外，本发明人将CC12连接上KV11，观察连接肽CC12-KV11的穿透性与KV11相比有无变化。另外，将CC12的氨基酸序列打乱，命名为CC12S，明确CC12的穿透作用是否具有序列依赖性。

在体外in vitro实验中，本发明人通过ARPE-19细胞系观察RPE细胞摄取FITC标记的不同小肽的效果，并通过流式细胞分析定量检测进入细胞内的荧光强度。在离体ex vivo实验中，本发明人通过新西兰白兔离体角膜、视网膜-脉络膜-巩膜复合体表观渗透率实验观察不同小肽的通透性效果。在体内in vivo实验中，本发明人通过结膜囊内给药、球后注射给药的方式，在荧光或共聚焦显微镜下定性观察冰冻切片中小肽的眼内通透性及眼内分布；并利用¹²⁵I同位素示踪的方法，定量分析进入眼内的小肽含量。

一、实验材料

人视网膜色素上皮细胞系(Human retinal pigment epithelial cell line，ARPE-19)：购于American Type Culture Collection(ATCC)，冻存。

成年新西兰白兔(2.5千克)：获自中国科学院上海实验动物中心。

Sprague Dawley大鼠(180-200克)：获自中国科学院上海实验动物中心。

二、实验方法

1.固相合成多肽

利用SYMPHONY型12通道多肽合成仪，其自带软件(Version.201)，根据多肽的氨基酸序列，计算所需要配制的保护氨基酸溶液、缩合试剂和切割试剂的浓度。利用所述多肽合成仪合成CC12肽。

2.CC12-KV11、CC12-FITC，FITC-CC12，Penetratin-FITC，KV11-FITC，CC12-KV11-FITC，CC12S-FITC多肽序列

KV11序列：YTMNPRKLFDY(SEQ ID NO:3)；

Penetratin序列：RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:4)；

CC12S序列：MFPPMILETSER(SEQ ID NO:5)；

CC12-KV11序列：EMFTPPSMIERL-GGG-YTMNPRKLFDY(SEQ ID NO:6)；

为了研究上述多肽在眼屏障的通透性，本发明人在上述多肽的C端分别连接了一个赖氨酸(Lys，K)，通过赖氨酸侧链的氨基进行FITC标记，获得CC12-FITC。

在CC12的氨基端，直接进行FITC荧光标记，获得FITC-CC12。在氨基酸的羧基端(C端)进行FITC荧光标记，需在C端加上一个赖氨酸(Lys，K)，再与FITC连接(适用于后续需要在C端进行FITC标记的氨基酸)。在Penetratin序列的C端加上一个赖氨酸(Lys，K)，再与FITC连接，获得Penetratin-FITC。

将FITC标记在KV11序列的C端，获得KV11-FITC。

FITC标记在CC12-KV11的C端，获得CC12-KV11-FITC。

FITC标记在CC12S序列的C端，获得CC12S-FITC。

在氨基酸的C端进行绿色荧光蛋白GFP(238aa，～27kD)标记，需在C端加上一个半胱氨酸(cys，C)。因此将CC12通过半胱氨酸连接到GFP，获得CC12-GFP。

3.ARPE-19细胞的培养

ARPE-19细胞从-80℃冰箱取出后，立即置于37℃水浴箱内，并摇动30～60秒，使其融化。吸出细胞悬液注入离心管，滴加10mL培养液。1000rpm低速离心5分钟后，去除上清液后重悬，接种于90mm培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中，次日更换培养液后每2～3天加入新鲜培养基。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，当细胞长至80～85％时，将细胞传代或用于实验。细胞传代时，每个90mm大皿加入1mL胰蛋白酶溶液，1分钟后，在倒置光学显微镜下观察到原有的梭型贴壁细胞逐渐变圆，在未浮起时加入FBS培养液终止。用吸管将贴壁细胞吹下，将细胞悬液吸起分到三个培养皿中，加入新鲜培养基。实验所用细胞为3～11代细胞。

4.ARPE-19细胞MTS毒性实验

(1)消化和接种细胞：取对数生长期ARPE-19细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞并计数，将细胞密度调整至5×10⁴/mL，以每孔100μL接种于96孔细胞培养板；37℃培养24h后，更换含0.5％FBS的DMEM培养基，继续培养使细胞饥饿过夜；

(2)实验分组：空白对照组，CC12-FITC多肽组，Penetratin-FITC多肽组，KV11-FITC多肽组，CC12-KV11-FITC多肽组，CC12S-FITC多肽组。多肽组设置的浓度梯度均为：10μM、50μM、100μM和300μM；

(3)加药：过夜后弃去细胞培养上清，在96孔板中加入含有0.5％FBS的DMEM培养基，同时加入不同浓度的多肽溶液，每个浓度组至少设置3个复孔，37℃继续培养24h；

(4)MTS方法测定吸光度A值：24h后，弃去上述细胞培养上清，用PBS洗三遍，之后每孔中加入20μL MTS试剂，37℃继续培养3h，酶标仪490nm测定A值。

5.ARPE-19细胞内化摄取多肽实验

(1)消化和接种细胞：取对数生长期ARPE-19细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，按5×10⁴细胞/孔接种到6孔培养板中，37℃培养24h后，更换含0.5％FBS的DMEM培养基，继续培养使细胞饥饿过夜；

(2)实验分组：CC12-FITC多肽组，Penetratin-FITC多肽组，KV11-FITC多肽组，CC12-KV11-FITC多肽组，根据MTS实验，选择250μM作为本实验中多肽的浓度；

(3)加药：过夜后弃去细胞培养上清，在96孔板中加入含有10％FBS的DMEM培养基，同时加入浓度为250μM的多肽溶液，37℃继续培养；

(4)荧光显微镜观察拍照：37℃孵育0.5h、1h、3h、6h后，弃去细胞上清，用1000IU/mL肝素和PBS冲洗3遍，以去除细胞表面的荧光物质或结合的多肽。加入1mL PBS浸没细胞，立即将6孔板置于荧光显微镜下观察各孔荧光强度并拍照。

6.ARPE-19细胞摄取多肽流式细胞定量分析

(1)消化和接种细胞：取对数生长期ARPE-19细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，按1×10⁶细胞/孔接种到6孔培养板中，37℃培养24h后，更换含0.5％FBS的DMEM培养基，继续培养使细胞饥饿过夜；

(2)实验分组：空白对照组、CC12-FITC多肽组(50μM、250μM)，KV11-FITC多肽组(250μM)，CC12-KV11-FITC多肽组(50μM、250μM)；

(3)加药：过夜后弃去细胞培养上清，在96孔板中加入含10％FBS的DMEM培养基，同时除空白对照组外，加入不同浓度的多肽溶液，37℃继续培养；37℃孵育1h、4h后，弃去细胞上清，用1000IU/mL肝素和PBS冲洗3遍，以去除细胞外结合的多肽。加入胰蛋白酶消化细胞，当光学显微镜下细胞呈现将要分离的圆粒状时，终止胰酶消化，并将细胞轻轻吹打均匀，转移至1.5mL的Eppendorf管中，1000rpm、离心5min×3次，重悬于1mL PBS中，立即转入流式管中，避光待测。

(4)流式细胞分析定量检测荧光强度：流式细胞仪对细胞摄取多肽的效果进行测定，每个样品计数约5000个细胞，所用激发波长Ex：488nm，发射波长Em：508nm。运用FlowJo软件进行数据分析处理，计算FITC阳性的细胞数和平均荧光强度(Fm)。

7.新西兰白兔离体角膜、视网膜-脉络膜-巩膜复合体透过性实验

(1)实验分组：PBS空白对照组，CC12-FITC多肽组，Penetratin-FITC多肽组，KV11-FITC多肽组，CC12-KV11-FITC多肽组，CC12S-FITC多肽组。多肽组药物浓度为50uM。

(2)新西兰白兔角膜、视网膜-脉络膜-巩膜复合体的取样：耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死实验用新西兰白兔，分离结膜并离断肌肉后取出眼球，在距角膜缘约1.5mm的巩膜处做环切，小心剥离去除虹膜、睫状体、晶状体、玻璃体等眼部组织，得到带有1.5mm巩膜环的角膜和剩余的眼杯——视网膜-脉络膜-巩膜复合体，用PBS冲洗3次备用。

(3)扩散池透过性实验和表观透过系数的计算：眼组织取下后立即进行扩散池透过性实验。扩散设备预热并维持在34℃恒温状态后，将新鲜离体角膜和视网膜-脉络膜-巩膜复合体分别小心固定在扩散池的供给池与接收池之间，角膜的上皮层、视网膜-脉络膜-巩膜复合体的巩膜面面向供给池。扩散池的内口径为8mm，扩散面积为50.24mm²。供给池和接收池内各加入34℃的PBS 2mL平衡5min。之后小心弃去供给池中的溶液，加入浓度为50μM多肽溶液，并将扩散池置于具备恒温磁力搅拌器的扩散设备中。分别在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h从接收池中取样500μL，同时每次取样后立即补充等体积等温的PBS。取200μL样品进行荧光分光光度计检测，Ex:490nm，Em:520nm。记录荧光强度(Fm)，并计算对应的表观渗透率P_app(cm/s)：

其中ΔQ/Δt为单位时间内多肽的摩尔量的变化，可由累计透过量-时间曲线稳态部分的斜率求得；C₀是供给池中多肽的初始浓度(50μM)；A是扩散池的有效透过面积(0.5024cm²)。P_app是判断药物分子对生物膜透过能力的重要评价指标。

(4)离体组织水化值：利用离体组织水化值评价药物对眼角膜、视网膜-脉络膜-巩膜复合体的组织毒性。上述实验完成后，将角膜、视网膜-脉络膜-巩膜复合体取下，并沿中轴线切开。一半组织用多聚甲醛固定后，分别行苏木素-伊红HE染色用于观察组织完整性，冰冻切片碘化丙啶PI染色进一步观察多肽在组织中的分布；另一半组织分别称重后(m₀)，置于65℃高温烘箱中干燥48h，称量剩余组织重量(m₁)，从而计算离体组织水化值(thehydration value，ΔH)：

8.多肽眼内分布研究

(1)实验分组：PBS空白对照组，CC12-FITC多肽组，Penetratin-FITC多肽组，KV11-FITC多肽组，CC12-KV11-FITC多肽组，CC12S-FITC多肽组。多肽组药物浓度为500μM；

(2)给药方法：SD大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，结膜囊内点眼组：用枪头吸取10μL FITC标记的多肽溶液或PBS，轻轻闭合眼睑使药物均匀分布，每10min给药一次，共点眼6次；球后注射组：采用1mL注射器抽取100μL FITC标记的多肽溶液或PBS，在眶下缘中外1/3处，沿眶下壁垂直进针约0.2cm，越过眼球赤道部后即斜向鼻上方，入针约0.4cm深，确定未刺入眼球内后，回抽无回血即可缓慢推入同位素标记溶液；注射后轻轻拔出针头并垫以棉球轻压眼球片刻，观察有无球后出血现象(如眼睑肿胀、眼球突出、运动受限等)；

(3)制备冰冻切片：上述给药完成后，于不同时间点0.5h、3h、6h、24h分别处死大鼠，取出眼球，并用PBS冲洗3遍。之后置于4％多聚甲醛中4℃固定过夜，再分别于10％、20％、30％的蔗糖溶液中4℃梯度脱水，每个浓度脱水12h。固定脱水后，O.C.T包埋，标本放入-20℃冰冻切片机内，行10μm切片制备眼组织冰冻切片。

(4)多肽眼内分布观察和FITC荧光强度半定量测定：采用带有荧光滤过系统的共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜观察FITC标记的多肽在眼内的分布，并拍照。各组冰冻切片的荧光强度根据信号强弱按照四个等级进行评价：0级，仅有背景荧光；1级，弱荧光；2级，中等荧光；3级，强荧光。

9.¹²⁵I同位素示踪实验

由于放射性核素¹²⁵I标记多肽需要有酪氨酸Y或组氨酸H的存在，因此本发明人选取本身含有酪氨酸的两个多肽KV11和CC12-KV11标记¹²⁵I，并进行同位素示踪实验。通过同位素点眼和球后注射的方式，定量检测药物进入眼内的含量。

(1)实验分组和同位素标记：将KV11-FITC和CC12-KV11-FITC多肽各500μg多肽溶于500μL双蒸水，取8μL(含8μg)加入1.65mCi ¹²⁵I，并加入600μL PBS，于Iodogen管中37℃反应5min。转移后经双蒸水洗3遍，并将标记后的溶液经Sephadex G-10小柱纯化，以去除游离¹²⁵I。之后用带有放射性检测器的HPLC分析鉴定，记录标记率并计算比活度；用标记后的¹²⁵I-KV11-FITC和¹²⁵I-CC12-KV11-FITC两组多肽进行如下实验。

(2)同位素给药方法：SD大鼠结膜囊内点眼组：用枪头吸取10μL ¹²⁵I标记的多肽溶液，每10min点眼一次，共给药6次；球后注射组：采用1mL注射器抽取100μL溶液，在眶下缘中外1/3处，沿眶下壁垂直进针约0.2cm，越过眼球赤道部后即斜向鼻上方，入针约0.4cm深，确定未刺入眼球内后，回抽无回血即可缓慢推入同位素标记溶液；注射后轻轻拔出针头并垫以棉球轻压眼球片刻，观察有无球后出血现象(如眼睑肿胀、眼球突出、运动受限等)；

(3)进入眼内的放射性检测：最后一次点眼后0.5h，用3mL PBS冲洗结膜囊3遍，每次持续30s，之后过量戊巴比妥钠处死大鼠，立即取眼球，去除角膜及结膜组织；球后注射1h后，过量戊巴比妥钠处死大鼠，立即取眼球，3mL PBS冲洗眼球3遍，每次30s，之后小心去除结膜组织，沿角巩缘环形剪开眼球，去除巩膜，保留眼前节、玻璃体、视网膜、脉络膜。将剩余的眼组织分别称重，装入测量管，利用γ-计数器检测样品的放射性，并换算成单位样品质量的放射性活度(Bq/g)和放射性比活度/剂量(ID/g)：

放射性比活度＝(放射性计数-本底)/(60×E×m)，其中E为测量效率，按50％计算，m为样品质量；放射性比活度/剂量＝放射性比活度/给药剂量，其中，1μCi＝3.7×10⁴Bq。

10.统计学分析

实验结果使用平均值±标准差(SD)表示，数据处理运用统计分析软件SPSS22.0统计软件包运算(Statistical Software，Los Angeles，CA，USA)或GraphPad Prism(SanDiego，CA，USA)。运用two-tailed Student’s t检验进行两组间比较，运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间变量分析比较，运用Tukey’s Multiple Comparison test进行多重比较，P值小于0.05有统计学差异。

三、结果

1、多肽CC12及其连接肽、对照肽的体外固相合成

噬菌体展示技术筛选出的CC12多肽由12个氨基酸组成，为了在其C端标记上FITC绿色荧光，本发明人在C端连接了一个赖氨酸(Lys，K)，通过质谱法(mass spectrometry，MS)检测，确定最终的氨基酸分子量为1968.31Da。为了说明CC12多肽潜在的穿透眼屏障作用是否具有序列依赖性，本发明人将CC12多肽氨基酸序列随机打乱，并合成出数个多肽，其中一个多肽命名为CC12S，分子量为2081.48Da，本发明人将在后续体内外实验中将CC12S作为对照多肽。同时本发明人选取公认的、经典的16个氨基酸穿膜肽Penetratin作为眼屏障通透性实验中的阳性对照多肽，连接FITC后其最终氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKKK(SEQID NO:7)-FITC，分子量为2764.33Da。另外，本发明人前期研发的抗新生血管活性的多肽KV11作为抑制新生血管活性实验的阳性对照，其氨基酸序列为YTMNPRKLFDYK(SEQ ID NO:8)-FITC，分子量为2078.41Da。同时，通过3个甘氨酸-GGG-将KV11连接于筛选出的潜在眼部引导肽CC12上，命名为CC12-KV11，标记上FITC的CC12-KV11多肽的氨基酸分子量为3682.31Da。眼部引导肽及对照肽的基本信息如表1所示，包括分子量、等电点、荷电量及亲水性。

由于多肽分子量小，因而可以经体外固相合成方法获得，并进行HPLC纯化，带FITC标记的多肽冻干后为橙黄色粉末状，水溶性好。经HPLC检测，多肽纯度均>95％。

表1、眼部引导肽和对照肽基本信息

2、多肽CC12及其连接肽、对照肽的细胞毒性

采用MTS法对多肽CC12及其连接肽、对照肽的细胞毒性进行考察。与空白对照组相比，CC12-FITC、KV11-FITC、CC12-KV11-FITC、CC12S-FITC多肽组在300μM浓度范围内对ARPE-19细胞的生长几乎没有影响；Penetratin-FITC多肽组在10μM浓度时未表现出细胞毒性，但当浓度≥50μM后，它对ARPE-19细胞的生长有明显的毒性作用，且其毒性/抑制作用呈剂量依赖性：50μM、100μM、300μM浓度组平均OD值分别为1.028±0.054、0.530±0.014、0.259±0.016，与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，如图3所示。Penetratin的细胞毒性可能与其破细胞膜/穿膜作用有关。

3、多肽CC12及其连接肽、对照肽细胞摄取能力定性评价

ARPE-19细胞摄取不同FITC标记多肽的能力如图4所示，荧光强弱在可代表被摄取进入细胞内的多肽的多少。结果显示，ARPE-19细胞摄取多肽CC12-FITC、Penetratin-FITC和CC12-KV11-FITC呈时间依赖，随着孵育时间的延长，细胞摄取这几组多肽而呈现的细胞内荧光强度逐渐增加。但CC12-FITC及其连接肽CC12-KV11-FITC在同一时间点的荧光强度不如Penetratin-FITC多肽组，考虑多肽CC12和连接肽可能部分通过细胞内吞/摄取作用进入细胞，部分通过细胞间隙或其他途径穿透眼屏障。而ARPE-19细胞几乎不摄取KV11-FITC多肽，但随着孵育时间的延长，3～6h时也可观察到微弱的绿色荧光。

4、多肽CC12及其连接肽、对照肽细胞摄取能力的定量评价

流式细胞分析实验结果如图5所示。结果表明，ARPE-19细胞与多肽共孵育1h，ARPE-19对高浓度CC12-FITC(250μM)及高浓度连接肽CC12-KV11-FITC(250μM)的摄取(细胞内荧光强度)显著高于高浓度KV11-FITC多肽组(250μM)，结果具有统计学差异(P<0.001，P<0.01)。而随着孵育时间的延长，4h时CC12-FITC多肽的细胞内荧光强度显著高于高浓度KV11-FITC多肽组(P<0.001)；而无论高浓度或是低浓度组，连接肽CC12-KV11-FITC多肽的细胞内荧光强度均显著高于高浓度KV11-FITC多肽组(P<0.001或P<0.05)，其中，高浓度CC12-KV11-FITC多肽组与高浓度KV11-FITC多肽组在细胞内的平均荧光强度相比，提高了约10.2倍。孵育时间延长、药物浓度提高，细胞对这两组多肽的摄取均逐渐增加。值得一提的是，ARPE-19细胞对高浓度KV11-FITC小肽也有一定程度的摄取，实验结果与荧光显微镜照片的结果一致。

5、多肽CC12及其连接肽、对照肽表观透过系数测定

利用扩散池进行多肽表观透过系数测定的实验结果如图6所示，多肽透过离体角膜(图6A)及离体视网膜-脉络膜-巩膜复合体(图6B)的过程呈时间依赖性。随着测定时间的延长，FITC标记的多肽透过离体生物膜的浓度也随之升高，利用荧光分光光度计检测到的荧光强度也越强。且随着时间的推移，CC12、Penetratin、CC12-KV11多肽透过离体角膜或视网膜-脉络膜-巩膜复合体的浓度显著高于KV11、CC12S多肽。根据测定得到的单位时间内透过的多肽的摩尔量的变化、多肽的初始浓度、有效透过面积，计算出表观透过系数P_app值，本发明人发现，4h内离体角膜Penetratin的P_app值显著高于其他各组(P<0.001)，但在透过视网膜-脉络膜-巩膜复合体方面，Penentratin不如CC12多肽(P<0.001)；而CC12、Penetratin、CC12-KV11多肽组的P_app值均显著高于KV11和CC12S组。显示了CC12多肽在透视网膜-脉络膜-巩膜复合体方面出色的穿屏障作用，同时，连接上CC12后，无论是透角膜或是透视网膜-脉络膜-巩膜复合体，CC12-KV11多肽的穿屏障作用也较KV11多肽显著提高(P<0.001)。

6、多肽CC12及其连接肽、对照肽扩散实验后离体组织毒性测定

(1)离体组织水化值测定

采用离体组织水化值ΔH对多肽的急性毒性组织损伤进行评估。结果发现，各组多肽孵育过的离体角膜或离体视网膜-脉络膜-巩膜复合体与空白组(PBS组)相比均不存在显著性差异(P>0.05)，表明离体实验中所选择的多肽浓度对离体组织无损伤、刺激性作用，显示出较好的安全性，如图7A、7B所示。

(2)组织结构完整性评价

采用HE组织染色观察离体组织经过扩散实验后的结构完整性。如图7C所示，所有多肽组的角膜保持了完整的角膜上皮结构，所有多肽组的视网膜-脉络膜-巩膜复合体也均保持了完整的结构，没有出现明显的空泡化、无炎症或免疫反应。表明多肽对离体眼组织无明显毒性损伤作用，并由此判断药物扩散过程中未出现离体组织的破损渗漏。该结果与离体组织水化值的实验结果一致。

7、多肽CC12及其连接肽、对照肽的眼内分布

通过点眼和球后注射FITC标记的多肽，于一定的时间点(0.5h、3h、6h和24h)取眼球固定脱水，行冰冻切片观察多肽的眼内分布和眼屏障通透性，利用荧光强度评分对从眼球外穿透进入眼球内的FITC-多肽荧光强度进行半定量分析。结果如图8～10所示。

从图8、10A中可以看出，球后注射给药0.5h后，筛选出的CC12多肽、阳性对照肽Penetratin、连接肽CC12-KV11在眼后段组织中，绿色荧光均匀分布于内界膜(internallimiting membrane，ILM)、神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)、内丛状层(innerplexiform layer，IPL)和外丛状层(outer plexiform layer，OPL)，而在内核层(innernuclear layer，INL)和外核层(outer nuclear layer，ONL)中也有纤维状绿色荧光分布。此外，椭圆体带(ellipsoid zone，EZ)和视网膜色素上皮/Bruch膜复合体(RPE/Bruch’smembrane complex，RPE/BM)组织中的荧光强度很高，而最外层脉络膜(Chororid，Chr)中的荧光则相对较弱。表明这三组多肽经球后注射给药后能够快速而广泛地分布于眼内，特别是眼后段的各组织中。KV11多肽和CC12S多肽在视网膜内层均无明显的绿色荧光，PBS空白对照组在眼后段仅有少许本底背景荧光。各组多肽的体内穿透能力结果同前离体实验的结果基本一致。另外，如图9A所示，CC12、Penetratin和CC12-KV11多肽的组织荧光强度在3～6h达到高峰，并可维持至24h。

另一方面，结膜囊内点眼组也可在眼后段组织观察到荧光信号；由于角膜的五层特殊结构和其致密性，使得角膜冰冻切片上只能观察到CC12、Penetratin、CC12-KV11多肽荧光渗透至角膜上皮层，3h仍然具有荧光信号；而KV11和CC12S仅能在给药0.5h后的角膜冰冻切片中观察到角膜上皮层极微弱的荧光(图9B)。推测药物经由结膜囊内进入眼内，特别是进入眼后段的主要途径为结膜-巩膜途径，仅有小部分药物可以经由角膜途径进入眼内。

在荧光强度评分方面，CC12、Penetratin和CC12-KV11多肽经球后注射到达眼后段的荧光强度相近，且在给药后3～24h均高于KV11和CC12S组，结果具有显著性差异，如图10B所示。进一步表明筛选出的CC12多肽能较出色地穿透眼屏障，并携带KV11生物肽共同穿越眼球屏障，且眼内滞留能力较好，因为其未经过玻璃体就到达视网膜脉络膜等眼后段组织，因而不容易被水解或代谢消除。

在CC12的氨基端连接FITC的产物，经球后注射和结膜囊内点眼可以在眼后段组织检测到绿色荧光信号。

CC12与绿色荧光蛋白融合表达的产物，经球后注射和结膜囊内点眼可以在眼后段组织检测到绿色荧光信号。

8、KV11、CC12-KV11多肽进入眼内含量的定量检测

采用¹²⁵I标记多肽的同位素示踪法定量检测可标记的两个多肽KV11和CC12-KV11进入眼内的含量。标记¹²⁵I后的多肽经HPLC分析鉴定图如下所示(图11、12)，KV11标记率约为95％，比活度为157μCi/μg；CC12-KV11标记率约为91％，比活度为126μCi/μg。

结膜囊内点眼0.5h后，¹²⁵I-KV11多肽组和¹²⁵I-CC12-KV11多肽组测得的眼球内单位样品质量的放射性比活度分别为6674.9±1390.7Bq/g，103221.2±12989.4Bq/g(P<0.001)，放射性比活度/剂量分别为：0.64±0.13％，5.58±0.70％(P<0.001)。¹²⁵I-CC12-KV11多肽组在点眼0.5h后眼球内的放射性比活度/剂量是¹²⁵I-KV11多肽组的8.7倍，如图13A所示。

而球后注射1h后，¹²⁵I-KV11多肽组和¹²⁵I-CC12-KV11多肽组测得的眼球内单位样品质量的放射性比活度分别为3944.0±273.1Bq/g，41318.2±4196.3Bq/g(P<0.001)，放射性比活度/剂量分别为：0.36±0.025％，3.84±0.39％(P<0.001)。¹²⁵I-CC12-KV11多肽组在球后注射1h后眼球内的放射性比活度/剂量是¹²⁵I-KV11多肽组的10.7倍，如图13B所示。球后注射组与结膜囊内点眼组眼内多肽定量检测结果同前多肽眼内分布及离体组织扩散实验结果基本一致。

四、实施例小结

本实施例中，通过体外、离体、体内实验，采用定性、定量的方法加以证实，验证了多肽CC12所具备的一定细胞穿膜能力和较好的穿透离体眼组织及体内眼屏障的作用。并通过连接KV11，将有功能的生物肽协同带入眼内，显示了小分子多肽CC12及其连接肽CC12-KV11良好的组织屏障穿透性。

在体外细胞学水平的评价中，选用了代表血视网膜外屏障的RPE(眼后段药物局部递送的关键屏障)细胞ARPE-19作为研究对象，结果显示CC12及其连接肽CC12-KV11多肽细胞学毒性极低，安全性好，并在细胞内的摄取量相对较高，流式细胞学分析结果也表明这两组多肽的细胞内摄取显著高于KV11多肽。在实验设置的浓度范围内，CC12及CC12-KV11多肽对RPE细胞的安全性明显优于Penetratin多肽组。虽然在同一时间点，CC12及CC12-KV11多肽细胞内的荧光强度弱于Penetratin组，但本发明人考虑，Penetratin的高正电荷性使得它很可能是通过破坏带负电的细胞膜起到穿膜作用(这一点在Penetratin对ARPE-19的MTS细胞毒性实验中也可得到证实)，而本发明的多肽基本属于电中性(表1)，其穿膜作用可能为内吞或经载体转运，且其穿屏障作用更值得关注。因而推测，实施例1筛选出的多肽CC12及其连接肽，可能部分通过穿膜作用、部分通过跨细胞间隙从而显示出良好的穿屏障作用。

在离体眼组织透过性实验中，CC12、Penetratin、CC12-KV11的P_app值均在10^-6cm/s，显著高于KV11或CC12S多肽，其P_app值已接近一些小分子药物，具有良好的角膜、视网膜-脉络膜-巩膜复合体透过性。

离体组织水化值是评估药物对组织的刺激性、毒性的重要参数。实验中各组的离体组织水化值在76.91～84.20％，基本落在正常范围76～83％之间，且与PBS空白对照组相比无显著性差异。同时，HE染色的组织切片也进一步证实了眼组织在4h的多肽溶液浸润中并未受到明显损伤，组织结构完整、无渗漏。

CC12多肽的眼内分布和定量检测结果相近，结膜囊内点眼和球后注射均能快速且广泛分布于眼组织中，冰冻切片结果显示3～6h多肽在眼后段的荧光强度达到峰值，直至24h仍可见均匀的绿色荧光分布，推测CC12及其连接肽CC12-KV11入眼可能同时涉及角膜及非角膜(结膜巩膜)转运途径，提示CC12能够通过结膜囊内频繁点眼或球后注射的方式应用于药物递送，治疗眼底疾病。

同时，在本实施例中，对多肽的安全性也进行了验证(MTS细胞毒性实验、离体组织水化值实验和HE染色组织切片)，具有安全性。

实施例3、眼部引导肽CC12及其连接肽抑制体内外新生血管的有效性测定

血管新生是一个复杂的过程，目前主要认为血管新生有两种类型：局部新生血管(angiogenesis)和系统性新生血管(vasculogenesis)。血管新生包括在VEGF、bFGF等促血管生长因子作用下血管内皮细胞增殖、迁移和趋化、毛细血管管腔样结构形成等一系列复杂变化。体内血管新生受到血管生长促进因子和血管生长抑制因子[如色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)、血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)]之间动态平衡的调控。因此，在血管新生过程中，如果VEGF等诱导的血管内皮细胞增殖、迁移趋化和管腔形成中一个或者多个环节受到破坏，异常新生血管生长将得到有效抑制。

在本实施例中，本发明人通过经典的新生血管的体内外实验加以探索连接肽CC12-KV11抑制体外血管新生的作用效果及其具体作用环节：VEGF诱导的血管内皮细胞增殖、迁移趋化和管腔形成实验，鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)新生血管模型、高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型等实验以阐明CC12-KV11多肽抑制新生血管的有效性。

一、实验材料

1.血管内皮细胞

原代人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)购自美国ScienCell公司。

2.实验动物及鸡胚

生后1～2d受精鸡胚：获自上海市农业科学院。

出生7天C57BL/6J乳鼠连同母鼠：获自中国科学院上海实验动物中心。

Sprague Dawley大鼠(180-200克)：获自中国科学院上海实验动物中心。

3.细胞培养试剂

内皮细胞培养基(ECM)：获自ScienCell。

内皮细胞生长添加物(ECGS)ScienCell。

VEGF：采用重组人VEGF₁₆₅：获自R&D。

MTS：获自Promega公司。

Growth Factor Reduced Matrigel：获自BD。

4.视网膜血管染色所用试剂

Alexa Fluor 568conjugated：获自Molecular Probes。

isolectin B4：获自Invitrogen。

5.其他试剂及药品

多聚甲醛：获自Sigma。

Ranibizumab(Lucentis)：获自Novartis公司。

0.4％盐酸奥布比卡因滴眼液：获自参天制药(中国)有限公司。

0.5％金霉素眼膏：获自上海通用药业股份有限公司。

冰冻试剂OCT：获自Sakura Finetek。

醋酸可的松：获自上海信宜药业有限公司

6.主要试剂的配制

细胞消化酶：0.25％Trypsin+1mM EDTA·4Na。

4％多聚甲醛配制：先配制PH7.4的0.01M PBS溶液，再以4％的浓度，以PBS为溶剂溶解多聚甲醛(加热60℃以上溶解)。

0.25％胰蛋白酶消化液：每0.25g胰蛋白酶溶于100mL 0.1M Tris缓冲液(pH7.8)。

0.5％Triton X-100：取0.25mL Triton X-100原液，加入49.75mL 1M PBS，充分震荡混匀。

10μg/mL isoletin B4：500μg isolectin B4溶于1mL 1M PBS，50μL/管分装，使用时稀释50倍，离心取上清。

二、方法

1.血管内皮细胞体外培养

HUVECs采用含5％FBS、1％ECGS的ECM培养基培养，接种于预先包被明胶的细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱内培养。细胞生长接近融合后，以0.25％胰蛋白酶消化传代，选取3～8代HUVECs细胞用于后续实验。

2.血管内皮细胞增殖实验

(1)消化和接种细胞：取对数生长期HUVECs，胰蛋白酶消化后收集细胞并计数，将细胞密度调整至3.5×10⁴/mL，以每孔100μL接种于96孔细胞培养板；37℃培养24h后，更换含0.5％FBS的ECM培养基，继续培养使细胞饥饿过夜；

(2)实验分组：空白对照组(无VEGF无多肽)，VEGF(5ng/mL)组，VEGF(5ng/mL)+CC12-FITC多肽(10μM、100μM、200μM)组，VEGF(5ng/mL)+KV11-FITC多肽(10μM、100μM、200μM)组，VEGF(5ng/mL)+CC12-KV11-FITC多肽(10μM、100μM、200μM)组，VEGF(5ng/mL)+Ranizumab(0.5mg/mL、5mg/mL)组。

(3)加药：过夜后弃去细胞培养上清，在96孔板中加入含有5ng/mL VEGF、0.5％FBS的ECM培养基，同时加入不同浓度的多肽溶液，每个浓度组至少设置3个复孔，37℃继续培养24h；

(4)MTS方法测定吸光度A值：24h后，弃去上述细胞培养上清，用PBS洗三遍，之后每孔中加入20μL MTS试剂，37℃继续培养3h，酶标仪490nm测定A值。

3.血管内皮细胞趋化实验

(1)收集细胞：取对数生长期的HUVECs细胞，以含0.5％FBS ECM培养基培养，使细胞饥饿过夜；第二天胰蛋白酶消化制备细胞悬液；

(2)平衡Transwell小室系统：为了促进细胞贴壁，在使用前用含0.5％FBS的ECM培养基对小室系统进行平衡，在下室和上室分别加入600μL和100μL培养基，37℃培养箱内孵育过夜；

(3)实验分组：空白对照组(无VEGF无多肽)，VEGF(25ng/mL)组，VEGF(25ng/mL)+CC12-FITC多肽(100μM)组，VEGF(25ng/mL)+不同浓度KV11-FITC多肽(10μM、50μM、100μM)组，VEGF(25ng/mL)+不同浓度CC12-KV11-FITC多肽(10μM、50μM、100μM)组，VEGF(25ng/mL)+Ranizumab(0.5mg/mL、5mg/mL)组；

(4)加药：加药前吸弃培养基，取约4×10⁵HUVECs细胞，预先与不同浓度多肽(0～100μM)混合，37℃预处理30min；然后将细胞与多肽的混合悬液(共100μL)加入Transwell小室的上室；Transwell小室下层加入600μL含25ng/mL VEGF的ECM培养基，空白对照组不加VEGF；

(5)染色：37℃细胞培养箱内继续培养24h后，取出上层小室，使用PBS轻轻冲洗2～3次，放入4％多聚甲醛中室温固定30min，PBS冲洗3次，晾干。将小室放入苏木素染液中染色10min，取出小室，PBS冲洗3次，用棉签轻轻将上层小室上表面的细胞擦去，剩下的细胞即为发生趋化迁移至下表面的细胞；

(6)显微镜下观察计数：光学显微镜下每个小室膜选取5个视野，观察并拍照，计数每个视野内迁移趋化的细胞数。趋化迁移率被矫正为百分比，将VEGF组的迁移率设为100％。

4.血管内皮细胞管腔形成实验

(1)准备：将96孔板、200μL Tip头等提前置于4℃冰箱预冷待用；将Growth FactorReduced Matrigel置于4℃冰箱过夜以使其充分液化；

(2)铺胶：用预冷的Tip头吸取充分液化的Matrigel加入预冷的96孔细胞培养板，每孔50μL，置于37℃静置30min使Matrigel充分凝固；

(3)实验分组：空白对照组(无VEGF无多肽)，VEGF(15ng/mL)组，VEGF(15ng/mL)+CC12-FITC多肽(100μM)组，VEGF(15ng/mL)+不同浓度KV11-FITC多肽(10μM、50μM、100μM)组，VEGF(15ng/mL)+不同浓度CC12-KV11-FITC多肽(10μM、50μM、100μM)组，VEGF(15ng/mL)+Ranizumab(0.5mg/mL、5mg/mL)组；

(4)细胞处理：收集对数生长期的HUVECs，将每孔1×10⁴细胞预先与不同浓度的多肽(0～100μM)混合，37℃孵育30min后，向细胞悬液中加入VEGF，使得VEGF终浓度为15ng/mL，混匀后加入预先包被Matrigel的96孔板，37℃继续培养6h；

(5)观察与图像分析：6h后40倍倒置相差显微镜下观察并拍照，每孔记录4个视野。拍照后采用NIH ImageJ 1.32图像分析软件分析计算每孔内管状结构形成的长度。以VEGF组管状结构形成长度为100％，计算成管率：

成管率＝(多肽处理组管腔形成长度/VEGF组管腔形成长度)×100％。

5.鸡胚尿囊膜新生血管实验

(1)实验分组：PBS组，CC12多肽50μg组，KV11多肽10μg、50μg组，CC12-KV11多肽10μg、50μg组。

(2)鸡胚孵育：将生后2天(d)的受精鸡蛋，苯扎溴铵溶液消毒后放入37℃、湿度60％～70％的恒温孵育箱内孵育5d，钝端朝上倾斜45°，每日定时翻动鸡蛋两次。

(3)滤纸片的制备：采用5mm打孔机，将Whatman滤纸制成直径为5mm的圆形滤纸片，高压灭菌。用灭菌的双蒸水将醋酸可的松片配制成5μg/μL的悬浊液，混匀。在每个滤纸片上加5μL的醋酸可的松悬浊液，风干约5min。然后在每个滤纸片上加5μL不同浓度的多肽溶液或5μL PBS溶液，制备为分别含有PBS，50μg CC12多肽，10μg或50μg KV11多肽，10μg或50μgCC12-KV11多肽的滤纸片，风干，备用。

(4)鸡胚开窗：用照蛋灯在距鸡胚头前1cm、正对鸡胚的位置(两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位)以记号笔划线作标记，在气室顶端用眼科镊子在蛋壳上开一个小孔并穿透气室壳膜，用眼科镊子揭去蛋壳，开一个直径小于1.0cm的小窗，在壳膜上滴加一滴灭菌的生理盐水，使尿囊膜与蛋壳分开，撕去卵壳膜。

(5)加药：观察鸡心的位置和血管走向，沿远离鸡心的方向继续剥开蛋壳至蛋壳和气室膜相贴处，选择大血管之间的相对无血管区，将分别含有PBS、50μg CC12多肽，10μg或50μg KV11多肽，10μg或50μg CC12-KV11多肽的滤纸片放置在卵黄囊表面。透明胶封闭蛋壳开口，恒温孵育箱内继续培养2d后观察，毋需翻蛋；

(6)结果观察：揭去透明胶，环状扩大蛋壳开口，充分暴露鸡胚尿囊膜，使得滤纸片距胚体和蛋壳至少保持5mm的距离。观察滤纸片周围2.5mm范围内毛细血管生长情况，并拍照计数毛细血管数量。

6.高氧诱导小鼠视网膜新生血管实验

(1)高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型的建立

1)将出生7d的C57BL/6J乳鼠连同母鼠置于恒温氧气箱中，温度保持在25℃±0.2℃，每天检测4次氧浓度，使氧浓度保持在75％±5％，气流速度为1.2～1.5L/min。每两天更换一次垫料、饲料和饮水。维持12小时昼夜交替照明规律，同时将在正常氧浓度环境中饲养的乳鼠做为对照组；

2)恒温氧箱内饲养5d后(即小鼠出生后第12天)，停止氧气供给，使其处于正常氧浓度的空气环境中，温度仍保持在25℃±0.2℃，继续饲养5天；

3)至生后第17天，称重，若体重>6g，则以过量麻醉处死小鼠，取眼球；若体重<6g，可能存在不正常表型，应当舍弃。

(2)多肽药物干预病理性视网膜新生血管

1)实验分组：每组包括1窝(5～7只)C57B/6J乳鼠，每只乳鼠取右眼作为实验眼。按球后注射、结膜囊点眼分为两大组，每组又分为：空气+PBS组，高氧+PBS组、高氧+KV11组、高氧+CC12-KV11组。空气组动物自始至终均在环境空气中饲养，高氧组如上述高氧诱导建模。

2)小鼠结膜囊内给药和球后注射方法：为维持小分子药物在眼部的浓度，最大程度减小其被体内蛋白酶降解引入的干扰，在小鼠生后第12天和第14天，均行结膜囊点眼或球后注射。结膜囊点眼方法基本同前，每次3μL/眼，10min一次，共频点6次；球后注射采用胰岛素针抽取25μL药物溶液(500μM)或等体积PBS，在眶下缘中外1/3处，沿眶下壁垂直进针约0.1cm，越过眼球赤道部后即斜向鼻上方，入针约0.1cm深，确定未刺入眼球内后，回抽胰岛素针无回血即可缓慢推入多肽药物或PBS；注射后轻轻拔出针头并垫以棉球轻压眼球片刻，观察有无球后出血现象(如眼睑肿胀、眼球突出、运动受限等)。各组动物在生后17d，即视网膜新生血管生成的高峰期处死取眼球，进行血管内皮染色及视网膜铺片观察。

3)视网膜的分离：将取出的眼球立即转入作好标记含4％多聚甲醛的培养皿中，室温固定1～2h后取出。在体式显微镜低光下，显微镊夹持眼球周围筋膜组织或视神经以固定眼球位置，用1mL注射器针头，自角巩缘处向球心方向刺入眼球；拔出注射器针头，用显微剪刀沿注射器针孔处平行于角巩膜缘方向环形剪开眼球，去除眼前节组织；在视网膜与其下脉络膜巩膜分离处钝性分离色素上皮层、脉络膜和巩膜组织至后极部，在视神经处，用显微剪刀剪开视网膜与视神经，分离出如小碗状的视网膜；用小楷毛笔轻轻刷去残留在视网膜上的色素颗粒和玻璃体。

4)小鼠视网膜血管内皮细胞特异性染色和视网膜铺片：将分离出的视网膜浸于0.5％Triton X-100中，4℃过夜。染色前用PBS冲洗3遍。小心吸弃PBS，立即加入500μLAlexa Fluor 568conjugated isolectin B4(10μg/mL)，避光保存，室温摇床过夜。PBS洗3～4遍，至少15min，之后将视网膜组织转移至载玻片上(光感受器细胞面朝下)；用显微剪刀将视网膜组织按照4个象限放射状剪为4份(距视神经至少1mm)，使视网膜能够平铺在载玻片上；滴加少量30％甘油封片。

5)影像分析及图像处理：荧光显微镜下，观察视网膜新生血管以及无灌注区的情况。所有荧光图片均在统一的技术标准下摄片。每个视网膜拍摄4张重叠图像，每个图像包含一个象限，再通过视盘和主要的放射状血管将这些图像组合成完整的视网膜融合图片。正常的视网膜血管为树枝状的浅、深层血管；新生血管簇则显示为无定形、深染的团状物，突出远离正常的血管平面；缺血区或无灌注区呈无染色区。注意在分析过程中辨别操作过程中造成的破损、气泡等人工伪迹。

(3)小鼠内层视网膜血管内皮细胞核计数

生后17天，取出小鼠眼球固定于4％多聚甲醛，24h后用0.01M PBS冲洗浸泡，去除角膜、晶状体等眼前节组织；经乙醇梯度脱水，制成石蜡标本；每个小鼠视网膜沿矢状位方向制作连续切片10张，切片间每间隔30μm取一5μm切片；切片脱蜡、复水；1％苏木素染色10min，盐酸酒精分化5sec，伊红染色2min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，50％中性树胶封片；显微镜下观察并拍照，每张切片取4个非重叠视野，计数突破入视网膜内界膜的血管内皮细胞数量，每个眼球10张切片的平均值即为该眼球视网膜新生血管内皮细胞的数量。

7.统计学分析

实验结果使用平均值±标准差(SD)表示，数据处理运用统计分析软件SPSS22.0统计软件包运算(Statistical Software，Los Angeles，CA，USA)或GraphPad Prism(SanDiego，CA，USA)。运用two-tailed Student’s t test进行两组间比较，运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间变量分析比较，运用Tukey’s Multiple Comparison test进行多重比较，P值小于0.05有统计学差异。

三、结果

1、CC12-KV11多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖有一定的抑制作用

如图14所示，MTS细胞增殖实验中，空白对照组(无VEGF无多肽)平均OD值为0.704±0.023；VEGF(5ng/mL)组平均OD值为0.814±0.025，与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，说明5ng/mL VEGF能够有效诱导HUVECs增殖。

VEGF+CC12-FITC多肽组在10μM、100μM浓度的平均OD值分别为0.772±0.038、0.750±0.033，与VEGF组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明较低浓度的CC12-FITC多肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs细胞增殖的作用；而当CC12-FITC多肽的浓度达200μM时，平均OD值为0.694±0.017，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，说明高浓度CC12-FITC可在一定程度上抑制VEGF诱导的HUVECs细胞增殖；VEGF+KV11-FITC多肽(10μM～200μM)组平均OD值分别为0.712±0.102、0.532±0.064、0.343±0.042，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.001)；VEGF+CC12-KV11-FITC多肽(10μM～200μM)组平均OD值为0.728±0.036、0.547±0.027、0.378±0.032，当CC12-KV11-FITC浓度达到或超过50μM时，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，说明连接了穿膜肽后的多肽CC12-KV11-FITC多肽仍具有一定的抑制VEGF诱导HUVECs细胞增殖的作用。

VEGF+Ranizumab 0.5mg/mL和5mg/mL组平均OD值分别为0.615±0.034和0.520±0.027，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，说明Ranizumab可以有效抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。

由此可见，连接多肽CC12-KV11在浓度达到或超过50μM时，仍具有原多肽KV11抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的作用。

2、CC12-KV11多肽能有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞趋化

如图15所示，VEGF诱导HUVECs趋化24h后，空白对照组(无VEGF无多肽)平均10.70±6.075个细胞发生趋化，迁移至上室下表面；VEGF(25ng/mL)组平均趋化细胞数量为177.1±26.07个，与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，说明25ng/mL VEGF能够有效诱导HUVECs发生趋化迁移。

VEGF+CC12-FITC多肽组，在较高的浓度(100μM)时仍可见到较多的细胞趋化，趋化细胞数量为171.9±11.39个，与VEGF组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明CC12多肽本身不具有抑制VEGF诱导HUVECs细胞趋化的作用。VEGF+KV11-FITC多肽组，当KV11多肽浓度在10μM～100μM范围时，HUVECs趋化细胞数量明显减少，分别为111.9±18.7个、69.0±10.61个和46.40±11.35个，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，且100μM KV11多肽的抑制效果强于10μM KV11多肽，说明KV11多肽抑制VEGF诱导HUVECs细胞趋化的作用具有剂量依赖性；VEGF+CC12-KV11-FITC多肽组，当CC12-KV11多肽浓度在10μM～100μM范围时，HUVECs趋化细胞数量也逐渐减少，分别为123.7±12.10个、67.80±12.76个和50.30±13.21个，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，且CC2-KV11多肽抑制VEGF诱导HUVECs细胞趋化的作用同样具有剂量依赖性。

VEGF+Ranizumab组，仅见少量细胞发生趋化迁移，0.5mg/mL和5mg/mL组HUVECs趋化细胞数量分别为22.20±7.913和12.90±9.134，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。

由此可见，CC12-KV11连接多肽与KV11多肽相比，在抑制VEGF诱导的血管内皮细胞趋化方面的有效性相当，并且同样具有良好的剂量依赖性。

3、CC12-KV11多肽抑制VEGF诱导的管腔样结构形成

HUVECs接种到Matrigel上6h后，空白对照组(无VEGF无多肽)血管内皮细胞排列形成管腔样结构少，VEGF(15ng/mL)组管腔样结构形成明显增多，彼此交错呈网状，两组间管腔形成长度相比差异具有统计学意义(P<0.001)，表明15ng/mL VEGF能够有效诱导HUVECs管腔样结构形成(图16)。

将VEGF组管腔样结构形成长度记为100％，VEGF+KV11多肽组浓度为10μM时，HUVECs管腔样结构形成相对长度为96.78％±14.30％，与VEGF组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)；当KV11多肽浓度达到50μM及100μM时，HUVECs管腔样结构形成依次减少，相对长度分别为49.30％±19.08％和38.96％±10.53％，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，说明KV11多肽能够有效抑制VEGF诱导HUVECs细胞管腔形成，并且抑制作用具有剂量依赖性；同样的，VEGF+CC12-KV11多肽组浓度为10μM时，HUVECs管腔样结构形成相对长度为87.83％±16.83％，与VEGF组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)；当CC12-KV11多肽浓度达到50μM及100μM范围内时，HUVECs管腔样结构形成依次减少，相对长度分别为52.10％±14.69％和40.96％±12.18％，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。而VEGF+CC12多肽组在较高浓度(100μM)时仍可见到较多的管腔样结构形成，相对管腔长度为83.59％±18.11％，与VEGF组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明CC12多肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs管腔形成的作用(图16)。

VEGF+Ranizumab组，仅见少许管腔样结构形成，0.5mg/mL和5mg/mL组HUVECs管腔形成的相对长度分别为45.50％±11.14％和24.93％±8.589％，与VEGF组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。

基于上述结果，KV11、CC12-KV11多肽在50～100μM浓度均能有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成，并且具有良好的剂量依赖性。

4、CC12-KV11多肽抑制鸡胚尿囊膜新生血管

鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane，CAM)实验结果如图17所示。PBS组滤纸片周围2.5mm范围内鸡胚尿囊膜毛细血管生长良好(图17A)，无明显炎症反应，平均毛细血管数量为66.00±20.04。

CC12多肽50μg组，滤纸片周围相同范围内鸡胚尿囊膜毛细血管生长良好(图17B)，平均毛细血管数量为67.10±14.99，与PBS组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)。

KV11和CC12-KV11多肽10μg组，滤纸片周围2.5mm范围内鸡胚尿囊膜毛细血管数量减少(图17C、17D)，平均毛细血管数量分别为42.73±11.30、37.09±7.08，与PBS组相比差异具有统计学意义(P<0.05、P<0.001)；KV11和CC12-KV11多肽50μg组，滤纸片周围2.5mm范围内鸡胚尿囊膜毛细血管数量明显减少，出现部分无血管区(图17E、17F)，平均毛细血管数量分别为39.90±7.80、36.18±8.26，与PBS组相比差异具有统计学意义(P<0.001、P<0.01)。

由此可见，CC12-KV11多肽能够有效抑制体内新生血管的形成，并且具有一定的剂量依赖性。

5、CC12-KV11多肽抑制高氧诱导小鼠视网膜新生血管

(1)血管内皮细胞特异性染色观察CC12-KV11多肽结膜囊内给药和球后注射抑制小鼠视网膜新生血管情况

模型组C57BL/6J小鼠自生后7天至12天被暴露于75％±2％的高氧环境中，之后转回空气中继续饲养5天。在此期间，各组小鼠对处理耐受良好，未发现任何明显的全身不良反应。

Alexa Fluor 568conjugated Griffonia simplicifoia(Bandeiraea)isolectinB4作为一种内皮细胞的特异性标记物，能够标记最小的毛细血管和内皮细胞，并除外周细胞和星形胶质细胞。在isolectin B4染色的铺片中，正常的视网膜血管分浅层和深层，浅层血管由呈放射状分布的大血管和树枝状分布的小血管组成，深层血管则主要呈现树枝状分布。新生血管簇则显示为无定形、深染的团状物，突出远离正常的血管平面；缺血区或无灌注区呈无染色区。

无论是结膜囊内点眼或是球后注射，空气对照组小鼠视网膜血管形态均正常、排列规整，未见明显视网膜无灌注区或新生血管簇等改变。

高氧PBS组小鼠视网膜可见无灌注(avascular，AV)区，在无灌注区和周边有灌注区交界处可见异常新生血管簇(neovascular tufts)和视网膜内微血管异常(intraretinal microvascular abnomality，IRMA)；高氧+KV11多肽组小鼠视网膜也可见少量病理性新生血管簇、AV、IRMA；与高氧+PBS组相比，高氧+CC12-KV11多肽组小鼠视网膜AV面积明显缩小，视网膜异常新生血管减少(图18)。

结果表明，KV11经点眼或球后注射的穿透眼屏障能力有限，其抑制病理性新生血管的效果弱于直接进行玻璃体腔注射；而连接了穿膜肽的CC12-KV11多肽则能够穿透眼屏障，抑制高氧后相对缺氧诱导的病理性新生血管，并可同时改善生理性的视网膜内血管修复，其穿透能力和抗新生血管有效性再次得到印证。

(2)组织切片方法定量观察CC12-KV11多肽抑制小鼠视网膜新生血管的情况

C57BL/6J小鼠视网膜组织切片HE染色观察并计数突出于内界膜的有核细胞数结果如图19所示。结膜囊内给药，空气+PBS组突出于视网膜内界膜的有核细胞数为1.38±1.85个；高氧+PBS组可见大量突出于内界膜长入玻璃体腔的血管内皮有核细胞，排列成管腔样结构，突出于视网膜内界膜的有核细胞数为24.13±5.92个，显著高于空气+PBS组(P<0.001)，说明高氧能够有效诱导小鼠视网膜新生血管形成。

高氧+KV11组仍可见不少突出于视网膜内界膜的有核细胞核，为20.38±3.58个，与高氧+PBS组相比无统计学差异(P>0.05)，考虑与KV11结膜囊内点眼给药穿透能力有限有关。而高氧+CC12-KV11组仅见少量突出于内界膜长入玻璃体腔的有核细胞，平均数量为16.50±4.24个，与高氧+PBS组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，说明CC12-KV11多肽通过结膜囊内给药能够有效抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管。球后注射组的结果与上述结果相近，但CC12-KV11多肽抑制视网膜新生血管的效果优于结膜囊内点眼(P<0.001)，结果如图19所示。

结膜囊内给药或球后注射各多肽，均未发现任何视网膜毒性或炎性反应，KV11多肽及其连结肽CC12-KV11在该给药浓度具有良好的安全性。

四、实施例小结

目前新生血管的研究主要针对血管内皮细胞，其体外研究的经典实验包括MTS细胞增殖实验、Transwell细胞趋化实验和Matrigel细胞管腔形成实验等。在本实施例中，本发明人采用了上述经典的体外细胞实验，证实了CC12肽与KV11通过-GGG-连接后，能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖、迁移趋化和管腔形成，并且抑制作用具有良好的剂量依赖性。

Ranibizumab(商品名Lucentis)是人源化的抗VEGF重组单克隆抗体，分子量约为48kDa。其抗新生血管的主要机制为与VEGF-A1、VEGF-A2结合，从而阻止VEGF与内皮细胞表面的受体结合，进而抑制VEGF的生物活性，抑制内皮细胞增殖、迁移和管腔样结构形成，减少血管通透性，阻碍新生血管的形成。目前，玻璃体腔注射Ranibizumab被广泛应用于治疗视网膜和脉络膜新生血管性疾病的研究，已被证明具有较好的抑制眼部新生血管的作用。因此本发明人选择目前研究较广泛的抗VEGF抗体Ranibizumab作为体外血管内皮细胞实验的阳性对照组。

虽然体外实验中，CC12-KV11多肽在趋化和管腔形成方面抑制新生血管的效果稍差于Ranibizumab，但是鉴于小分子多肽类药物无可比拟的独特优势：分子量小，结构简单，可以通过体外固相化学合成，便于通过化学修饰来优化药物特性；对眼组织通透性强，眼部结膜囊内给药或球后注射后，可以迅速分布于眼部组织而发挥药物作用，毒性低，极少诱发组织免疫反应，安全性高，无内毒素残留等，本发明人认为小分子CC12-KV11多肽是极具临床应用前景的新生血管抑制剂。

本实施例中，采用CAM模型评估CC12-KV11多肽抑制体内新生血管的效果，发现该多肽具有良好的抑制CAM新生血管形成的作用，并且具有一定的剂量依赖性。而在OIR新生血管动物模型中，本发明人发现，不通过玻璃体腔注射的方式，CC12-KV11多肽也能通过结膜囊内点眼和球后注射的方法，有效抑制OIR新生血管的生长，同时减少视网膜无灌注区，改善视网膜微血管，这一结果表明CC12-KV11多肽有望在DR、AMD、早产儿视网膜病变、缺血型RVO、肿瘤生长与转移等新生血管性视网膜病变的治疗中发挥关键作用，且引起治疗方式、给药途径的新变革。研究同时发现，CC12-KV11进入眼内后不会影响正常的视网膜血管的构建，具有良好的安全性。

但小分子多肽类药物也存在半衰期短，在体内容易被蛋白酶降解等局限性，因此往往需要反复给药以维持有效的药物浓度，达到较好的抑制体内新生血管的作用。本实施例中，本发明人在C57BL/6J小鼠出生后第12天和第14天均给予结膜囊内点眼或球后注射，结果显示CC12-KV11多肽能够有效抑制小鼠视网膜新生血管的生长，而单纯采用KV11多肽眼外给药无法达到其眼内玻璃体腔内给药的效果。

综上，通过经典的体外细胞实验和体内CAM、OIR新生血管动物模型，证明连接上筛选出的CC12多肽后，CC12-KV11多肽仍能够有效抑制血管内皮细胞的增殖、迁移趋化、管腔形成和新生血管的形成，且在眼部的通透性较KV11增强，是一种安全有效、给药便捷的多肽类新生血管抑制剂。

实施例4、眼部引导肽CC12及其连接肽的安全性

在前面的实施例中，本发明人已通过多项体内外实验部分证实了眼部引导多肽及其连接肽CC12-KV11的安全性，本实施例中，本发明人进一步采用光镜和透射电镜观察神经视网膜的显微和超微结构的形态学改变，并通过电生理技术视网膜电流图(electroretinogram，ERG)、视诱发电位(VEP)评价球后注射给药前后视神经、视网膜的功能学变化。

并且，随着人们对CPP分子机制理解的深入，CPP在多种疾病的药物治疗中的应用也随之扩展，并得到广泛认可。本实施例采用圆二色(cicular dichroism，CD)谱法对实验中涉及的多肽的三维空间构型进行进一步研究，探索、解释造成多肽眼部透过性差异的机理。

一、实验材料

1.动物

成年新西兰白兔(2.5千克)：获自中国科学院上海实验动物中心。

Sprague Dawley大鼠(180-200克)：中国科学院上海实验动物中心。

二、方法

1.光镜检查

SD大鼠球后注射给药后7天，处死取眼球，立即4℃固定于4％多聚甲醛中至少24h，并行全层平坦部切口以利于固定液的穿透。后置于蔗糖溶液中梯度脱水，方法同前。眼球在瞳孔至视神经切开后行大体标本观察。组织经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，行5μm切片HE染色，置于光镜下观察。

2.透射电镜检查

(1)取材和固定：SD大鼠球后注射给药后7天，处死取眼球，4℃固定于2.5％戊二醛固定液，行全层平坦部切口以利于固定液的穿透。24h后，在冰上迅速去除前节和玻璃体，在每张视网膜的每个象限随机选取一大小为3mm×2mm的样本继续在2.5％戊二醛中固定2h。0.1M PBS漂洗15min×3遍，4℃固定于1％锇酸2h。0.1M PBS漂洗15min×3遍。

(2)脱水：将样本依次浸入50％乙醇15min，70％乙醇(含3％醋酸铀)15min，90％乙醇15min，90％乙醇和90％丙酮1：1混合液15min，90％丙酮15min，4℃脱水。最后室温下再将标本浸入纯丙酮中15min，3遍。

(3)包埋和固化：室温下，将标本转移至纯丙酮和618包埋混合液(体积比2：1)中处理3h，后转至纯丙酮和618包埋混合液(体积比1：2)中过夜。37℃转至纯618包埋液中包埋3h。置入烘箱内，依次设置烘箱的温度和时间：37℃过夜、45℃12h，60℃ 24h。

(4)切片、染色和电镜观察：采用超薄切片机(LKB-1)行50～60nm切片，3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色。PHILIPS CM-120透射电镜观察摄片。

3.电生理检查

(1)实验分组：新西兰大白兔随机分为如下几组：CC12-FITC多肽组，KV11-FITC多肽组，CC12-KV11-FITC多肽组。每只动物右眼球后注射多肽作为实验眼，左眼球后注射等体积的PBS作为对照眼。于给药前(Day 0)和给药后7天(Day7)行明适应、暗适应ERG和闪光VEP检查；

(2)给药方法：新西兰大白兔球后注射方法同前，多肽组药物浓度为200mM。球后注射：采用1mL注射器抽取250μL多肽溶液，在眶下缘中外1/3处行球后注射，确定未刺入眼球内后，回抽无回血即可缓慢推入多肽溶液；注射后轻轻拔出针头并垫以棉球轻压眼球片刻，观察有无球后出血现象(如眼睑肿胀、眼球突出、运动受限等)；

(3)ERG检查：为了检测视网膜的功能改变，采用UTAS-E2000电生理仪记录各组给药前后ERG的情况，包括暗适应反应(视杆反应，Rod response)、最大暗适应反应(视锥和视杆反应，Maximal response)和明适应反应(视锥反应，Cone response)。计算10个反应b波振幅的平均值，比较实验眼和对照眼的振幅。

(4)VEP检查：进行闪光VEP检查方法。测量比较各组VEP波幅和潜伏期时间，并进行给药前后对比分析。

4.统计学分析

实验结果使用平均值±标准差(SD)表示，数据处理运用统计分析软件SPSS22.0统计软件包运算(Statistical Software，Los Angeles，CA，USA)或GraphPad Prism(SanDiego，CA，USA)。运用two-tailed Student’s t test进行两组间比较，运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间变量分析比较，运用Tukey’s Multiple Comparison test进行多重比较，P值小于0.05有统计学差异。

三、结果

1、CC12及其连接多肽对正常大鼠神经视网膜显微结构的影响

给药后7天，光镜检查显示各组多肽以200mM浓度给药并未影响神经视网膜的显微结构，视网膜组织形态正常、层次清晰，与正常对照组相比未发现任何明显可见的区别。正常对照组与实验组均未发现对视网膜存在任何毒性或炎性反应，如图20。

2、CC12及其连接多肽对正常大鼠神经视网膜超显微结构的影响

给药后7天，透射电镜检查显示各组多肽对视网膜超微结构无明显影响，视网膜细胞排列紧密，自视细胞层至神经纤维层细胞形态正常。在视细胞层(photoreceptorcells)，细胞轮廓清晰、连续，线粒体无明显肿胀，嵴清晰；在内层视网膜，如神经节细胞(ganglion cells)及其有髓神经纤维、双极细胞(bipolar cells)和Müller均未见明显水肿、空泡或断裂等异常改变，如图20。

3、CC12及其连接多肽对正常兔神经视网膜功能的影响

对各组多肽处理前后的全视野闪光ERG分析比较显示，CC12、KV11和CC12-KV11多肽实验眼和PBS对照眼无显著性差异(P>0.05)，且给药前Day 0和给药后Day 7，各组实验眼在视杆反应、最大反应和视锥反应中的b波形态和振幅均未见明显改变，与对照眼相比，ERGb波振幅无统计学差异，如图21。

ERG检查表明，CC12、KV11和CC12-KV11多肽给药后，对正常兔视网膜功能无异常影响。

为了进一步评估各组多肽对视网膜神经节细胞或神经显微是否存在潜在毒性作用，本发明人进行了闪光VEP检查。典型的VEP波形表现为一个先出现的负波和随之的正波，本发明人发现，球后注射给药前和给药后7天所有多肽处理组及对照眼的反应记录中，均出现了典型的VEP波，且给药前后的波形和波幅、潜伏期等数据接近，提示多肽给药后未影响视网膜神经节细胞或神经纤维(表2)。因实验眼数目有限，故未进行进一步的统计分析。

表2、高浓度(200mM)多肽球后注射给药前后各组VEP的比较

四、实施例小结

在本实施例中，本发明人发现正常大鼠眼球后注射小分子多肽CC12、KV11和CC12-KV11后，光镜、透射电镜检查视网膜结构和超微形态均未见明显异常变化。正常兔眼球后注射小分子多肽CC12、KV11和CC12-KV11后，视网膜电生理检查兔眼神经、视网膜功能也未见异常变化，证明了研究中涉及的小分子多肽眼内应用的安全性。

实施例5、眼部引导肽CC12的变体的眼屏障通透性的研究

基于眼部导肽CC12的良好的眼部通透性，本发明人发现其相关的变体也具有穿越眼屏障的功能。具体的实验方法参照实施例2中多肽眼内分布的实施方法。使用的变体主要包括以下三种类型：

1，与CC12的氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，如表3A-E序列；

2，与CC12所示的氨基酸序列有至少75％相同性，如表3A-E序列；

3，包含CC12至少8个连续氨基酸序列的多肽片段，如表3F-H序列。

表3、CC12的变体序列

*表中的序列一致性是基于EMBOSS Needle方法完成的；A-H的多肽序列与CC12多肽序列比较。

-代表氨基酸残基的缺失。

以上CC12的变体通过FITC标记后，经球后注射或结膜囊内点眼后均可以在眼后段组织，如内界膜、神经节细胞层、内丛状层、外丛状层、内核层和外核层上检测到绿色荧光。

综上所述，药物的眼内递送至今仍是极具挑战性和创新性的研究方向，本发明通过体内高通量生物淘选的方式，发现了一种具有良好的眼部通透性的眼部引导多肽，且该多肽能够携带具有明确生物学功能的多肽共同穿越眼屏障；连接多肽抑制体内外新生血管效果良好且安全、无明显毒副作用；本发明为增强多肽类新生血管抑制剂眼内的药物递送，及其通过无创或微创的方式应用于临床治疗新生血管相关性眼病奠定了基础，具有广阔的临床应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种穿膜肽，其特征在于，所述的穿膜肽选自：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少75％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

(d)包含取自SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少8个连续氨基酸序列的多肽片段。

2.权利要求1所述的穿膜肽或编码该穿膜肽的多核苷酸用途，用于促进功能性分子透过细胞膜或体组织屏障，或用于与功能性分子连接来制备能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，或用于制备能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的功能性分子包括：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的体组织屏障是眼屏障，较佳地所述的眼屏障包括：眼组织屏障，泪液屏障，血眼屏障。

5.一种能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体，其特征在于，所述的复合体包括：(1)权利要求1所述的穿膜肽；和(2)与(1)的穿膜肽操作性连接的功能性分子。

6.如权利要求5所述的复合体，其特征在于，所述的功能性分子包括：功能性生物大分子、功能性多肽、功能性抗体、功能性小分子、功能性核酸片段、荧光示踪物、显影剂、脂质体、纳米制剂、多聚体或病毒载体。

7.如权利要求6所述的复合体，其特征在于，所述的功能性多肽包括：抗新生血管生成的多肽，神经保护性多肽，抗粘连形成的多肽；较佳地，所述的抗新生血管生成的多肽包括：KV11。

8.如权利要求5所述的复合体，其特征在于，所述的操作性连接包括：共价连接或非共价连接。

9.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的穿膜肽；或

所述的多核苷酸编码权利要求5-8任一所述的能够穿透细胞膜的复合体；且，其中与穿膜肽操作性连接的功能性分子是功能性多肽。

10.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括权利要求9所述的多核苷酸。

11.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包括权利要求10所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求9所述的多核苷酸。

12.一种能够透过细胞膜或体组织屏障的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求1所述的穿膜肽，或权利要求5-8任一所述的能够穿透细胞膜或体组织屏障的复合体，或权利要求9所述的多核苷酸，或权利要求10所述的表达载体，或权利要求11所述的基因工程化的细胞；和药学上可接受的载体。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是预防或治疗眼部疾病的药物组合物，其剂型包括：点眼给药剂型、球结膜下注射剂型、眼周注射剂型、视网膜下注射给药剂型、眼球内给药剂型。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述的眼部疾病包括：新生血管性眼病、退行性眼病、炎症性眼病、肿瘤性眼病、视神经病变性眼病。

15.一种注射用给药器或药盒，其特征在于，所述的注射用给药器或药盒中包括：权利要求1所述的穿膜肽或权利要求9所述的编码该穿膜肽的多核苷酸；或

权利要求5-8任一所述的能够透过细胞膜或体组织屏障的复合体；或

权利要求12-14任一所述的药物组合物；或

权利要求10所述的表达载体，或权利要求11所述的基因工程化的细胞。