CN105218683B - 一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽构成。本发明还公开了该Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白的制备方法，以及在制备治疗由新生血管生成引起的疾病的治疗药物中的应用和在在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。本发明的Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白保留了内皮抑素抑制新生血管增生的活性，能够穿过血脑屏障或眼球屏障与新生血管处过表达的整合素特异性结合，融合蛋白的靶向性和停留时间得到了极大的提高。

Description

一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用，属于生物药物技术领域。

背景技术

内皮抑素(Endostatin，Es)是O′Reilly等人1997年从血管内皮瘤中分离出来的一种内源性血管生成抑制剂。内皮抑素是胶原蛋白XVIII分子C末端的片段，共有184个氨基酸残基，分子量为20kDa。研究证明内皮抑素只能抑制新生血管的生成而不对已存在的血管发生作用。内皮抑素是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂，近年来倍受关注，目前在美国已经进行I期和II期临床试验，在我国已将血管内皮抑素衍生物研制成具有国家自主知识产权的一类新药Endostar(恩度)，用以治疗非小细胞肺癌。但是，内皮抑素仍旧存在一些缺点，例如其入胞能力差、稳定性差、半衰期短等，限制了其在临床上的应用。

申请人在前期的研究中已经成功开发了一种Tat PTD-Es重组蛋白，其中，Tat PTD是人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子的转导域，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，研究表明将其与Es通过基因工程的方法重组表达出来的蛋白质可以穿透眼球屏障到达眼底，增加了Es的入胞能力(专利“一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用”，专利申请号2012101492019)。但申请人在继续研究的过程中发现，重组蛋白Tat PTD-Es对眼底视网膜内皮细胞的靶向性和停留时间仍有待进一步的提高。

整合素为细胞黏附因子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互粘附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。整合素是由α和β两个亚单位形成的异二聚体，表达于血管内皮细胞的有腔面和无腔面，介导内皮细胞的迁移和毛细血管腔的形成，其中α_vβ₃和α_vβ₅整合素的作用尤为重要。正常情况下，在静息期血管内皮细胞表面α_vβ₃整合素有低水平表达，在细胞因子和生长因子的刺激下，其表达上升。研究表明，整合素在新生血管内皮细胞中有高表达，对新生血管的生成起着重要作用，其中，其中α_vβ₃尤为重要。因此，整合素α_vβ₃会成为一些抗血管生成药物的作用靶点。含有精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺序列的多肽RGD可以特异性识别整合素α_vβ₃。RGD存在于多种细胞外基质中，可以与11种整合素特异性结合，能有效促进对细胞的附着。

但由于将不同活性的目的蛋白组合在一起进行融合表达尚存在一系列技术上的难点，例如不同蛋白整合后是否还能具有原有的活性，融合蛋白表达体系的选择等，因此，目前还没有关于将Tat PTD、Endostatin和RGD三者进行融合表达的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用。利用Tat PTD的穿膜作用、Es的抑制新生血管生成的作用以及RGD三肽能够与整合素特异性结合的特性，将三者通过基因工程的方法融合表达，获得了一种能够穿过血脑屏障或者眼球屏障的并能在新生血管表面发挥药效的内皮抑素，达到通过局部滴眼的给药方式预防眼底新生血管疾病的目的。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白，其所具有的氨基酸序列如下：

YGRKKRRQRRRHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASKCRGDC。(如序列表中SEQ ID NO.1所示)

上述Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽构成。其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域的氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2所示，人内皮抑素氨基酸残基序列如SEQ ID NO.3所示，RGD三肽的氨基酸残基序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了能够分别编码上述人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽的核苷酸序列，其分别具有如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。

对于编码上述人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽的核苷酸序列，申请人在试验过程中设计了多组核苷酸序列，但在PCR扩增过程中，发现并非所有的核苷酸序列都能进行基因的表达，经优化筛选，得到如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

本发明还提供了Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)融合基因的构建：采用常规方法制备含有编码Tat PTD-Endostatin的目的基因和编码三肽RGD的目的基因的Tat-Endostatin-RGD融合基因，并扩增；

(2)采用限制性内切酶Bam HI、Xho I分别酶切质粒pET28a，并回收酶切产物，采用Gibson assembly的方法连接酶切质粒和Tat-Endostatin-RGD融合基因；

(3)将步骤(2)的连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin-RGD，并获得最终重组表达质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin-RGD；

(4)采用热激法将表达质粒转化入大肠杆菌Origami 2(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素、链霉素和四环素的LB平板上培养16h，筛选转化子单菌落并抽提质粒进行PCR验证，获得阳性转化子；

(5)将上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物即为Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白。

步骤(2)中，Gibson assembly的方法连接酶切质粒和Tat-Endostatin-RGD融合基因的反应体系中包含有三种酶，分别为T5外切酶，Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶。

所述步骤(5)具体如下：

①挑选阳性转化子，过夜培养后，按1:75(体积比)接种于LB培养基中，震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃，200r/min，诱导6h，收菌；

②将菌体破壁，采用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定；

③包涵体复性：菌体超声后离心得到包涵体，采用稀释复性或透析复性或超滤复性法对包涵体进行复性；

④分离纯化Tat PTD-Endostatin-RGD融合蛋白：将复性成功的蛋白质经亲和层析或者离子交换层析进行纯化，除盐后得到Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白。

所述③中，复性方法具体如下：菌体破壁后，12000r/min离心30min，弃去上清得到包涵体；采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次去除粘附的杂蛋白；采用变性液对包涵体进行溶解，在室温搅拌2h后，12000r/min离心即获得包涵体溶液；然后将包涵体溶解的、变形的无生物活性的蛋白质复性，使其能够折叠成可溶的、有生物活性的构象。

所述去污剂溶液为浓度不大于2mol/L的尿素或不大于1.5mol/L的盐酸胍，去污剂溶液中含有Triton X-100和Tween 20，浓度均为0.5％(v/v)。

所述变性液为浓度为5-7mol/L的盐酸胍或6-8mol/L的尿素，并含有10mmol/L DTT和5mmol/L EDTANa₂。

所述变性液对包涵体的溶解在还原条件下进行。

所述还原条件是指使用还原剂，所使用的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。

所述复性是通过降低变性试剂的浓度(通过复性缓冲液缓慢地连续或逐步稀释溶解液来降低变性剂的浓度)至无变性作用或弱变形作用的水平来复性。

所述复性时，复性缓冲液中含有至少一种还原和氧化形式的硫醇成分，硫醇成分为GSH/GSSG。本发明对GSSG/GSH氧化还原比对复性率的影响进行了考察，固定GSH的浓度为1mmol/L，对GSSH进行梯度摸索，所设梯度为0，0.2,0.4，0.6，0.8,1.0mmol/L,在不同条件下对重组蛋白的复性条件进行优化，结果发现，GSSG/GSH氧化还原比为0.8:1时，复性效果更好。

所述④中，复性成功后采用亲和层析或者阳离子交换层析纯化目的蛋白质。

亲和层析采用Ni离子亲和层析，缓冲液pH7-9。

阳离子交换层析采用CM-Sepharose，SP-Sepharose，缓冲液pH7-9。

所述除盐为：采用G50-Sephadex、超滤或透析的方法除盐。

本发明的Tat PTD-Endostatin-RGD融合蛋白，能够用于制备治疗由新生血管生成引起的各种疾病的治疗药物，所述疾病包括眼部血管增生疾病及各种肿瘤，如糖尿病引起的视网膜病变、非小细胞肺癌等。

本发明的有益效果：

(1)本发明的Tat PTD-Endostatin-RGD融合蛋白，保留了内皮抑素抑制新生血管增生的活性，能够穿过血脑屏障或眼球屏障与新生血管处过表达的整合素特异性结合，融合蛋白的靶向性和停留时间得到了极大的提高。

(2)本发明采用一步等温反应Gibson assembly进行重组质粒的连接反应，此反应体系中包含三种酶分别为T5外切酶，Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶。此时两条DNA双链的末端需要有20-150bp的重叠。T5外切酶可以识别DNA片段的5′端并在3′端形成单链结构。随后互补的DNA片段可以迅速互相识别，此时Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶可以分别填补连接处缺失的碱基和将两条链进行共价连接。此反应体系省事省力，与常规连接反应性比，省去了酶切回收等繁琐步骤，能够快速进行DNA连接反应。

(3)本发明的重组蛋白的表达过程中，对于采用热激法将表达质粒转入到大肠杆菌的感受态细胞的过程中，对于大肠杆菌感受态细胞的种类进行了优化和筛选，结果发现，采用本发明的E.coli Origami2(DE3)作为感受态细胞，其效果最好，这是因为E.coliOrigami2(DE3)携带硫氧还原蛋白酶和谷胱甘肽还原酶双突变基因，有利于重组蛋白的正确折叠。

附图说明

图1a和图1b为Endostatin、Tat PTD-Endostatin、Endostatin-RGD和Tat PTD-Endostatin-RGD基因的PCR图谱，其中，图1a中，泳道1为Endostatin的PCR产物，泳道2为TatPTD-Endostatin的PCR产物；图1b中，泳道1为Endostatin-RGD的PCR产物，泳道2为Tat PTD-Endostatin-RGD的PCR产物；M为DNA Marker I(200bp、1500bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图2a和图2b为验证重组质粒时的PCR谱图，其中，图2a中，泳道1-3为Endostatin的PCR产物，泳道4-5为Tat PTD-Endostatin的PCR产物；图2b中，泳道1-5为Endostatin-RGD的PCR产物，泳道6-9为Tat PTD-Endostatin-RGD的PCR产物；M为DNA Marker I(200bp、1500bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图3为重组质粒pET28a/Tat PTD-Es-RGD的测序结果

图4为大肠杆菌超声破壁后的SDS-PAGE结果，其中泳道1(a)为空质粒25℃上清，2(a)为空质粒25℃包涵体，3(a)为Es 25℃上清，4(a)为Es 25℃包涵体，5(a)为空质粒37℃上清，6(a)为空质粒37℃包涵体，7(a)为Es 37℃上清，8(a)为Es 37℃包涵体；泳道1(b)为空质粒37℃上清，2(b)为空质粒37℃包涵体，3(b)为Tat PTD Es 37℃上清，4(b)为Tat PTDEs 37℃包涵体，5(b)为空质粒25℃上清，6(b)为空质粒25℃包涵体，7(b)为Tat PTD Es 25℃上清，8(b)为Tat PTD Es 25℃包涵体；泳道1(c)为空质粒25℃上清，2(c)为空质粒25℃包涵体，3(c)为Es-RGD 25℃上清，4(c)为Es-RGD 25℃包涵体，5(c)为空质粒37℃上清，6(c)为空质粒37℃包涵体，7(c)为Es-RGD 37℃上清，8(c)为Es-RGD 37℃包涵体；泳道1(d)为空质粒25℃上清，2(d)为空质粒25℃包涵体，3(d)为Tat PTD-Es-RGD 25℃上清，4(d)为Tat PTD-Es-RGD 25℃包涵体，5(d)为空质粒37℃上清，6(d)为空质粒37℃包涵体，7(d)为Tat PTD-Es-RGD 37℃上清，8(d)为Tat PTD-Es-RGD37℃包涵体；M为蛋白质Marker(14.4kDa，20.0kDa，26.0kDA，33.0kDa，45.0kDa，66.2kDa，94.0kDa)

图5a和图5b为大肠杆菌包涵体经复性分离纯化后所得样品的SDS-PAGE电泳谱图，图5a中，泳道1为Tat PTD-Es，泳道2为Es；图5b中，泳道1为Es-RGD，2为Tat PTD-Es-RGD；M为蛋白质Marker(14.4kDa，20.0kDa，26.0kDA，33.0kDa，45.0kDa，66.2kDa，94.0kDa)

图6为纯化后的重组蛋白对EAHY926细胞增值的抑制作用。

图7为纯化后的重组蛋白对鸡胚尿囊膜血管生成实验的抑制作用。

图8a-图8b为纯化后的重组蛋白对EAHY926细胞迁移的抑制作用；其中，图8a为给药后24h观察结果，图8b为给药后48h观察结果。

图9为纯化后的重组蛋白对血管生成的抑制作用。

图10a-图10d为纯化后的重组蛋白对视网膜新生血管的抑制作用，其中图10a为视网膜血管染色铺片结果；图10b为视网膜HE染色结果；图10c为视网膜VEGF免疫组化结果；图10d为视网膜Endostatin免疫组化结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：Tat PTD-Endostatin-RGD融合蛋白的制备

1.融合基因的构建：采用PCR的方法以Tat PTD-Es为模板获得融合基因(结果见图1a-图1b)，并进行回收。

2.双酶切空质粒pET28a：采用BamH I和Xho I对大肠杆菌表达质粒pET28a进行双酶切，并进行片段回收。

3.融合基因与质粒的连接：将100ng的PCR回收产物和100ng的空质粒酶切回收产物加入到Gibson聚合连接反应体系中，50℃反应1h，连接产物用于下一步转化。

4.重组质粒的转化：将6μl上述连接液迅速加入到100μl预冷的感受态细胞E.coliDH5α中并混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2-3min，加入900μl的LB液体培养基，37℃，180rpm震荡1h，取转化液100μl涂布于LB(100μg/ml Kan)平板上，37℃培养12-16h。

5.阳性转化子的鉴定：随机挑选若干个具有Kan抗性的转化子菌落，经LB液体培养基培养，小量扩增后，抽提重组质粒为模板，进行PCR验证(结果见图2a-图2b)，并进行测序，测序结果见图3，结果表明测序正确。

6.重组质粒转入工程菌中：将测序正确的重组质粒，采用热激法转入感受态细胞E.coli Origami2(DE3)中，涂布于LB平板(100μg/ml Kan,50μg/ml Str,25μg/ml Tet)，平板与37℃培养12-16h。

7.待平板上长出菌落后进行阳性转化子的筛选鉴定。

8.挑选阳性转化子，过夜培养后，按1:75(体积比)接入LB培养基中，震荡至OD₆₀₀约为0.6-0.8(约3h)，加入IPTG(终浓度为0.25mmol/L)，37℃，225rpm，诱导6h，收菌。

9.包涵体溶解：将菌体破壁后，12000rpm离心获得沉淀即为包涵体；采用含有去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次以后以除去粘附的杂蛋白；然后用变形性液溶解包涵体，室温下搅拌2h后，12000rpm离心即获得包涵体溶液。去污剂溶液为浓度为2mol/L的尿素，去污剂溶液中含有Triton X-100和Tween 20，浓度均为0.5％(v/v)；变性液为浓度为6-8mol/L的尿素，并含有10mmol/L DTT和5mmol/L EDTANa₂。

10.蛋白复性：在冰浴搅拌的同时将包涵体溶液缓慢连续滴加到复性缓冲液中，使复性液中的蛋白浓度不超过0.01mg/mL，冰浴继续搅拌2min后，于4℃冰箱中静置24-48h。复性缓冲液为：pH 7.4，20mmol/L PB、1mol/L尿素、1mmol/L GSSG、0.1mmol/L GSH。采用SDS-PAGE和Western Blot对目的蛋白进行鉴定。

11.分离纯化Tat PTD-Endostatin-RGD融合蛋白：将复性成功的融合蛋白经Ni离子亲和层析进行纯化，除盐后得到高纯的目的蛋白。

大肠杆菌超声破壁后的SDS-PAGE结果见图4，大肠杆菌包涵体经复性分离纯化后所得样品的SDS-PAGE电泳谱图见图5a-图5b。

实施例2：Tat PTD-Endostatin-RGD融合蛋白的生物活性研究

考察Tat PTD-Es-RGD抑制内皮细胞增殖的活性：以Es，Tat PTD-Es，Es-RGD为对照(此处作为对照的其他三种蛋白与TatPTD-Es-RGD的制备方法相同)，采用CCK-8法考察纯化后Tat PTD-Es-RGD抑制血管内皮细胞增殖的活性，具体实施步骤如下：

将人脐静脉内皮细胞(EAHY926)的冻存液在37℃水浴锅内快速融化，800r/min离心3min，弃上清。用无菌PBS重悬细胞沉淀，800r/min离心3min，弃上清。用DMEM培养基(含有10％FBS)将细胞沉淀重悬并吹打均匀，形成细胞悬液，于细胞计数板上进行细胞计数。然后接种于培养瓶中，于CO₂恒温培养箱(5％CO₂，37℃)中培养24h，换液，以后每隔2天换液一次。待细胞长至融合状态，细胞用PBS清洗一遍，然后加入0.25％胰蛋白酶1ml，37℃消化约1min，在倒置显微镜下观察，待细胞变大变圆，细胞间隙增大，加入含有10％FBS的培养基终止消化，用无菌的塑料滴管反复捶打培养瓶壁上的细胞，使大部分细胞脱落形成细胞悬液，于倒置显微镜下计数，然后以10⁵/ml密度接种于新的培养瓶中，恒温培养箱中继续培养。

采用CCK-8测定纯化后的重组蛋白抑制人脐静脉内皮细胞增殖的活性。收集对数期细胞，调整细胞浓度为8000/孔，接种于96孔板内，每孔100μl，于CO₂恒温培养箱(5％CO₂，37℃)中培养过夜；加入药物(将纯化后的重组蛋白设6个浓度梯度：0.2μmol/L，1μmol/L，2μmol/L，4μmol/L，6μmol/L，8μmol/L)，用培养基稀释，并于30min后加入bFGF使其终浓度为5ng/ml，每个浓度设置5个平行孔，继续培养48h；用注射器将细胞上清小心吸出，加入100μl的新鲜培养基；每孔加入10μl CCK-8溶液，CO₂培养箱中继续培养3h后终止培养，用酶联免疫检测仪于波长490nm处测定各孔吸光度(A₄₉₀)值，并计算其抑制率：抑制率＝[1-(实验组A₄₉₀/对照组A₄₉₀)]×100％。重复试验5次，取平均值。

不同浓度纯化后的目的蛋白对内皮细胞EAHY926的增殖有明显抑制作用(图6)，结果显示纯化后的Tat PTD-Es-RGD对EAHY926有明显的抑制作用，并具有浓度依赖性，当浓度增加至8μmol/L时，抑制率达到80％。

实施例3：Tat PTD-Es-RGD对鸡胚绒毛尿囊膜血管(CAM)生成的抑制作用

1.试验方法：

1.1孵育CAM的方法：方法如下：选择来源于受精率大于90％的种鸡场、生长良好的白种皮蛋(表面清洁光滑、大小均匀，蛋形规范，气孔气室均匀)，清洗干净后用1‰的苯扎溴酚擦拭鸡蛋外壳消毒，将种鸡蛋置于隔热式电热恒温培养箱中培养，温度(38±1)℃，湿度保持在60-80％，并保持一定的通风换气条件。鸡蛋气室向上，长轴与蛋托约呈70°-80°角。每天转蛋3次，转蛋角度以水平位置前仰后仰各45°为宜。鸡蛋孵育5天后，用照蛋灯照蛋，挑选出发育良好的鸡胚。将其移至超净台内，用75％酒精消毒后晾干。用牙科钻或齿轮在鸡蛋壳表面刻出凹痕，用针尖在种鸡蛋气室表面扎一小孔，在凹痕处滴少量生理盐水，用吸耳球对准气室表面的小孔轻轻吸气，此时看到凹陷处的生理盐水下降，即该处CAM下陷，形成假气室。用灭菌透明胶带封闭假气室，制备假气室后稳定48h。

1.2给药方法：将鸡胚按重量随机分组，生理盐水组，阴性对照组：bFGF 20μl(5ng/ml)/只；Es组100μl(50ng/ml)+bFGF 20μl(5ng/ml)/只；Tat PTD-Es组100μl(50ng/ml)+bFGF 20μl(5ng/ml)/只；Es-RGD组100μl(50ng/ml)+bFGF 20μl(5ng/ml)/只；Tat PTD-Es-RGD组100μl(50ng/ml)+bFGF 20μl(5ng/ml)/只。揭开稳定48h后种鸡蛋的透明胶带，按上述给药剂量将药物滴加到1cm²的明胶海绵上，并将其放置于鸡胚绒毛尿囊膜上。加药后用透明胶带再次将假气室封口，标记后放入培养箱中继续培养48h，拍照并对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成进行计数。

2.结果

Tat PTD-Es-RGD对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用结果见图7，与阴性对照组相比，Tat PTD-Es-RGD组的血管束明显少于阴性对照组，表明Tat PTD-Es-RGD能明显抑制CAM血管的生成。

实施例4：Tat PTD-Es-RGD对内皮细胞迁移的抑制作用

考察Tat PTD-Es-RGD抑制内皮细胞迁移的活性：以Es、Tat PTD-Es、Es-RGD作为对照，采用划痕实验的方法考察纯化后的Tat PTD-Es-RGD抑制内皮细胞迁移的活性，具体步骤实施如下：

收集对数期人脐静脉内皮细胞EAHY926，调整细胞悬液浓度为5×10⁵/孔，接种于6孔板中，每孔2ml，置于37℃，5％CO₂的CO₂培养箱中培养过夜；将直尺提前放入超净台内紫外照射30min后，取6孔板细胞，弃上清，用PBS清洗2遍，在无菌直尺比对的同时用黄枪头轻轻划过细胞表面，形成一条无细胞的直线，每个孔画3条直线，PBS清洗2遍以去掉划掉的细胞。加入2ml含有目的蛋白的DMEM培养基并以PBS作为阴性对照，蛋白浓度调整到8μmol/L，并加入bFGF使其终浓度为5ng/ml，设置3个平行孔，置于CO2恒温培养箱中分别培养24h和48h。取出6孔板，弃上清，置于倒置荧光显微镜下拍照，观察划痕的宽度。重复试验5次，取平均值。

Tat PTD-Es-RGD对内皮细胞迁移的抑制作用见图8a-图8b，与阴性对照组相比，Tat PTD-Es-RGD组的划痕宽度明显宽于阴性对照，表明Tat PTD-Es-RGD能够显著性抑制内皮细胞的细胞迁移。

实施例5：Tat PTD-Es-RGD对血管生成的抑制作用

考察Tat PTD-Es-RGD抑制血管生成的作用：以Es、Tat PTD-Es、Es-RGD作为对照，采用体外血管生成实验考察纯化后的Tat PTD-Es-RGD对血管生成的抑制作用，具体步骤实施如下：

将48孔板、黄枪头放入4℃冰箱中预冷过夜。将Matrigel胶移至4℃冰箱中融化约30min。将融化后的Matrigel胶铺于预冷的48孔板内，100μl/孔，置于CO2培养箱中静置培养约30min。待Matrigel胶凝固后，收集对数期人脐静脉内皮细胞EAHY926，调整细胞悬液浓度为8×10⁴/孔，加入到含有Matrigel胶的48孔板中，每孔加入500μl。加入纯化后的目的蛋白使其终浓度为8μmol/L，并加入bFGF使其终浓度为5ng/ml，设置3个平行孔，置于CO2恒温培养箱中培养约6h。取出48孔板，置于倒置荧光显微镜下拍照，观察血管网的生成情况。重复试验5次，取平均值。

Tat PTD-Es-RGD对体外血管生成的抑制作用见图9，与阴性对照相比，Tat PTD-Es-RGD组没用形成大面积的血管网结构，表明Tat PTD-Es-RGD能够显著性抑制体外血管生成。

实施例6：Tat PTD-Es-RGD对视网膜新生血管的抑制作用

考察Tat PTD-Es-RGD抑制视网膜新生血管的作用：以Es、Tat PTD-Es、Es-RGD作为对照，采用氧致视网膜病变模型考察纯化后的Tat PTD-Es-RGD对视网膜新生血管的抑制作用，具体步骤实施如下：

(1)造模：取132只C57B/6新生幼鼠，于出生第7天时与母鼠一同置于氧箱中，调整氧气浓度使其达到75％，继续生长5天。期间每隔12h将母鼠放到正常空气中生长12h再放回氧箱中。5天后即获得氧致视网膜血管增生模型小鼠。并设立正常空气组。

(2)给药：取出母鼠及幼鼠置于正常空气中，用眼科镊沿眼睑将幼鼠的眼睑拨开使其睁眼。将幼鼠随机分组，阴性对照组：PBS，阳性对照组：贝伐单抗1μl/只(玻璃体注射)；Es注射组：1μl(1mg/ml)/只；Tat PTD-Es注射组：1μl(1mg/ml)/只；Es-RGD注射组：1μl(1mg/ml)/只；Tat PTD-Es-RGD注射组：1μl(1mg/ml)/只；Es滴眼组：2μl(0.2mg/ml)/只；Tat PTD-Es滴眼组：2μl(0.2mg/ml)/只；Es-RGD滴眼组：2μl(0.2mg/ml)/只；Tat PTD-Es-RGD滴眼组：2μl(0.2mg/ml)/只；其中各注射组进行玻璃体注射的给药方式，左眼给药，共给药1次；各滴眼组采用滴眼的给药方式，左眼给药，每天给药3次，共给药5天。每组设12只，取平均值。

(3)动物处死：a.视网膜铺片：幼鼠生长到第17天时脱颈处死，摘眼球，置于4％多聚甲醛中室温下固定1h；取眼球剥离视网膜，置于96孔板中，PBLEC洗涤3次，每次20min；每孔加入200μl封闭液(1％BSA，0.5％Triton X-100)，4℃封闭过夜；取视网膜PBLEC洗涤3次，每次20min；加入染色液Isolectin B4(1:150稀释)，每孔加入75μl，室温避光孵育2-5h后置于倒置荧光显微镜下拍照并对视网膜新生血管计数。每组设置6只老鼠，取平均值。b.HE染色：幼鼠生长到第17天时脱颈处死，摘眼球，置于4％多聚甲醛中4℃下固定过夜；制作石蜡切片，HE染色，并对突破视网膜內界膜的细胞核进行是计数。c.免疫组化：幼鼠生长到第17天时脱颈处死，摘眼球，置于4％多聚甲醛中4℃下固定过夜；制作石蜡切片，视网膜组织VEGF、Endostatin免疫组化，拍照后观察结果。

Tat PTD-Es-RGD抑制视网膜新生血管的作用见图10a-图10d。图10a.与阴性对照组相比，各注射组、阳性对照组、Tat PTD-Es与Tat PTD-Es-RGD滴眼组视网膜新生血管明显偏少且有显著性差异，而Es和ES-RGD滴眼组与阴性对照相比组视网膜新生血管没有显著性差异；但Tat PTD-Es滴眼组视网膜新生血管相对Tat PTD-Es-RGD滴眼组视网膜新生血管偏多。图10b.与阴性对照组相比，各注射组、阳性对照组、Tat PTD-Es与Tat PTD-Es-RGD滴眼组突破视网膜內界膜细胞核数明显偏少且有显著性差异，而Es和ES-RGD滴眼组与阴性对照组相比没有显著性差异；但Tat PTD-Es滴眼组相对Tat PTD-Es-RGD滴眼组突破视网膜內界膜细胞核数偏多。图10c.VEGF免疫组化：与阴性对照相比，各注射组、阳性对照组、Tat PTD-Es与Tat PTD-Es-RGD滴眼组呈较浅的黄色且有显著性差异，而Es和Es-RGD滴眼组与阴性对照相比颜色均为较深的棕色无显著性差异，但Tat PTD-Es滴眼组相对Tat PTD-Es-RGD滴眼组颜色偏深；图10dEndostatin免疫组化：与阴性对照相比，各注射组、Tat PTD-Es与TatPTD-Es-RGD滴眼组显示阳性结果且有显著性差异，而阳性对照组、Es和Es-RGD滴眼组与阴性对照相比均为染色结果均为阴性无显著性差异。

Claims (6)

1.一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如下：YGRKKRRQRRRHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASKCRGDC；

所述Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)融合基因的构建：采用常规方法制备含有编码Tat PTD-Endostatin的目的基因和编码三肽RGD的目的基因的Tat-Endostatin-RGD融合基因，并扩增；

(2)采用限制性内切酶Bam HI、Xho I分别酶切质粒pET28a，并回收酶切产物，采用Gibson assembly的方法连接酶切质粒和Tat-Endostatin-RGD融合基因；

(3)将步骤(2)的连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin-RGD，并获得最终重组表达质粒pET28a/Tat PTD-Endostatin-RGD；

(4)采用热激法将表达质粒转化入大肠杆菌Origami 2(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素、链霉素和四环素的LB平板上培养，筛选转化子单菌落并抽提质粒进行PCR验证，获得阳性转化子；

(5)将上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物即为Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白。

2.如权利要求1所述的Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽构成；其中，人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域的氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2所示，人内皮抑素氨基酸残基序列如SEQ ID NO.3所示，RGD三肽的氨基酸残基序列如SEQ ID NO.4所示。

3.编码权利要求1或2所述的Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。

4.如权利要求1所述的Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白，其特征在于，步骤(2)中，采用Gibson assembly的方法连接酶切质粒和Tat-Endostatin-RGD融合基因的反应体系中包含有三种酶，分别为T5外切酶，Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶。

5.权利要求1或2所述的Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白在制备治疗由新生血管生成引起的疾病的治疗药物中的应用；所述疾病包括眼部血管增生疾病糖尿病引起的视网膜病变和/或非小细胞肺癌。

6.权利要求1或2所述的Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。