CN108606981A

CN108606981A - 运用MSCs定向趋化特性运载EPO治疗肺纤维化

Info

Publication number: CN108606981A
Application number: CN201810152125.4A
Authority: CN
Inventors: 袁巍; 陈露; 罗清清; 邢丽苹; 项春生
Original assignee: Ipm Biopharm Co Ltd
Current assignee: Ipm Biopharm Co Ltd
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2038-02-14
Also published as: CN108606981B

Abstract

本发明涉及运用MSCs定向趋化特性运载EPO治疗肺纤维化。将MSCs作为载体，采用基因工程手段引入EPO基因，使EPO在肺部器官分泌并在局部形成微环境，促进携有抗炎及抗纤维化分子的MVs分泌，通过入胞作用进入肺细胞，干预纤维化。如此以来，携带并表达EPO的MSCs可以直接靶向肺纤维化器官，提高结合效率，可以达到事半功倍的效果。同时，可以有效延长生物半衰期，促进MSCs分泌抗炎症、抗纤维化分子，提高治疗效果。

Description

运用MSCs定向趋化特性运载EPO治疗肺纤维化

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及肺纤维化的治疗或预防。本发明通过运用MSCs定向趋化特性运载EPO，进而达到治疗肺纤维化的目的。

背景技术

纤维化(fibrosis)是指由于炎症导致器官实质细胞发生坏死，组织内细胞外基质异常增多和过度沉积的病理过程，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，轻者成为纤维化，重者引起组织结构破坏而发生器官硬化。纤维化可发生于多种器官，如肺、心脏、肝脏、胰腺、肾脏等，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。在全世界范围内，组织纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因。据美国有关统计资料证明，该国因各种疾病而致死的病人中，接近45％可以归于组织纤维增生疾病。

肺纤维化疾病是目前导致全世界致死性纤维化疾病中的主要疾病之一。肺脏间质组织由胶原蛋白、弹性素及蛋白聚糖构成，胶原蛋白是肺组织中的主要的细胞外基质(ECM)蛋白，肺脏中的胶原蛋白与其他类型ECM成分构成三维网状结构，成为肺组织结构的主要骨架。这些蛋白成分保持肺组织结构的完整性，并对维持肺上皮及内皮细胞分化状态起着十分重要的作用。当肺纤维母细胞受到化学性(例如博来霉素、变态源)或物理性(例如粉尘、放射线)伤害时，会分泌胶原蛋白进行肺间质组织的修补，进而造成肺脏纤维化。

目前，肺纤维化的治疗方法主要有多种，包括传统糖皮质激素和免疫抑制剂治疗，内皮素拮抗剂治疗，抗纤维化药物(吡非尼酮、干扰素等)治疗，抗氧化(N-乙酰半胱氨酸)治疗，细胞因子及其特异性抑制剂治疗，靶向基因治疗，肺移植和中医中药治疗。

CN102711820A公开了用于预防和治疗肺纤维化疾病及用于减轻或逆转肺纤维化疾病如特发性肺纤维化症状的方法和组合物。所述组合物包括LOXL2蛋白的抑制剂(例如针对LOXL2蛋白的抗体)。

CN105726538A公开了一种抗肺纤维化的药物组合物及应用，该药物组合物由活性成分和附加剂制备而成，其中所述的活性成分包括6-羟基-7-[4-(2-氧代-2-二乙胺基乙氧基)苯甲酰基]-3，4-二氢-1H-喹啉-2-酮。

CN106389596A公开了一种治疗肺纤维化的药物，该药物处方由中药蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七组成。在该药物中，以蛤蚧、五指牛奶为补虚扶正之药，芒果叶为消炎止咳化痰之药，黄根、三七为化瘀散结之药。

虽然各个方法在治疗肺纤维化中都具有一定的作用，但由于纤维化病因复杂，进而导致这些方法都存在不足。临床治疗目前没有好的方法，治疗效果差，严重危害人类健康。

近年来，鉴于间充质干细胞(MSCs)对不同器官的多种急慢性组织损伤拥有众多治疗潜能，在再生医学领域引起了巨大的关注。MSCs具有向受损部位趋化的特性，并且具有多向分化能力、旁分泌功能以及免疫-炎症调节功能，免疫原性低，易于分离培养，易于导入并表达外源基因，不涉及伦理道德问题，MSCs如今已经广泛地应用于临床试验中。

MSCs治疗纤维化的具体机制尚不清楚。学术界认为可能的机制有：旁分泌机制；细胞融合(cell infusion)、细胞间相互作用(如线粒体转移等)、分化(differentiation)、促进血管新生(neovascularization)；抗炎和免疫调节机制；抗氧化机制。近期大量研究表明，MSCs发挥修复作用主要是依靠旁分泌而非分化能力。

细胞源性微囊泡(Microvesicles，MVs)是以出芽方式从细胞膜上脱落的携带母体细胞特征性生物信息分子的纳米级膜性囊泡结构，在许多生理病理学过程中充当细胞间信息传递载体。MVs包含特定的mRNA，miRNA，通过细胞与细胞间通信，可以在细胞间交换遗传信息，将各种功能物质递送到靶细胞，细胞源性微囊泡被认为是极具前景的基因或药物递送平台。MSCs可以通过释放大量的MVs作用于受损组织、细胞从而发挥其修复作用。尽管MSCs在纤维化动物和人体组织实验模型中呈现出一定的治疗效果，其治疗手段多数为直接注射细胞，因其作用机制并不明了，其治疗效果具有不确定性。

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，可与骨髓的EPO受体相互作用，促进红细胞祖细胞形成与分化。大量体内外实验研究表明，EPO对脑，心脏，肾脏等处的急性组织损伤具有保护作用，主要是通过激活相关信号通路，抗氧化，抗凋亡，抗炎症，刺激再生性细胞增殖，促进血管生成。正常生理情况下，EPO浓度极低，且EPO在血液中的半衰期仅有4小时。

发明内容

为了更好地治愈肺纤维化或为治疗肺纤维化提供另一种可行的选择，提高患者的预后或者生活质量，本发明的发明人经过大量、坚持不懈的筛选，发现将MSCs作为载体，采用基因工程手段引入EPO基因，使EPO在上述器官分泌并在局部形成微环境，促进携有抗炎及抗纤维化分子的MVs分泌，通过入胞作用进入靶细胞，干预纤维化。如此以来，携带并表达EPO的MSCs可以直接靶向肺纤维化器官，提高结合效率，可以达到事半功倍的效果。同时，任选地，可以有效延长生物半衰期，促进MSCs分泌抗炎症、抗纤维化分子，提高治疗效果。

本发明的一个方面涉及一种用于治疗或预防肺纤维化的药物，其含有有效量的携带并表达EPO的MSCs。任选地，本发明的药物还含有药学上可接受的载体。

本发明还提供了携带并表达EPO的MSCs在制备用于治疗或者预防肺纤维化的药物中的用途。

在本发明中所述MSCs优选为经血干细胞，较优选所述经血干细胞是同种异体的，最优选为自体的。

在一优选例中，本发明的药物是注射剂。

在另一优选例中，所述的药物用于对需要的对象的患病进行静脉注射。

在另一优选例中，所述注射剂中MSCs细胞的浓度为10⁴-10⁸个细胞/mL。

本发明还意外发现，携带并表达EPO的MSCs与SEQ ID NO：3的寡肽联合使用时候能够显著降低纤维化表型标志α-SMA，同时显著上调上皮表型标志E-cad。而且，组合组的胶原沉积状况更显著改善，肺泡结构也更趋于完整。

因此，另一方面，本发明还提供了一种用于治疗或预防肺纤维化的药物，其含有有效量的携带并表达EPO的MSCs以及SEQ ID NO：3的寡肽。任选地，本发明的药物还含有药学上可接受的载体。

本发明还提供了携带并表达EPO的MSCs和SEQ ID NO：3的寡肽的组合在制备用于治疗或者预防肺纤维化的药物中的用途。

优选地，本发明的寡肽N末端被乙酰化修饰，和/或C末端被酰胺化修饰。

进一步优选地，本发明药物可以进一步含有治疗肺纤维化的其他有效药物，例如吡非尼酮和尼达尼布。

任选地，本发明所述的药物中的携带并表达EPO的MSCs和寡肽分别在分开的容器中存放或者携带并表达EPO的MSCs和寡肽在同一容器中存放。

本发明提供了在受试者中治疗肺纤维化的方法，其包括向所述受试者同时或依次施用携带并表达EPO的MSCs和寡肽。任选地，在本发明的方法中，可以同时或者依次施用其他的治疗肺纤维化的药物活性成分，例如吡非尼酮和尼达尼布等。

对于本发明所述的受试者，其优选为哺乳动物，更优选为人。

对于本发明的携带并表达EPO的MSCs和寡肽，本领域技术人员可以对其作出任何修饰，前体是所述修饰不负面影响其活性。例如，可以对化合物进行修饰或装载在其他载体上，以提高其在体内的半衰期。总之，本领域技术人员可对本发明的化合物或细胞进行各种修饰以提高递送效率或用于其他目的并保持其活性。对于MSCs的修饰，例如，本领域技术人员可以进行进一步基因修饰，以使其表达其他的抵抗肺纤维化的活性成分，例如活性单边。这类修饰也是在本发明的范围之内的。

本发明的作为活性成分的携带并表达EPO的MSCs和寡肽可以连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含合适的药学上可接受的载体，包括促进活性成分加工成制剂(例如适于注射或输注的制剂)的赋形剂和助剂。

适于注射或输注的制剂可包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的(冻干)条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

在本发明中施用携带并表达EPO的MSCs和寡肽的量可为能协同治疗受试者中肺纤维化的任何量，其可以是相当于约0.1-15mg寡肽，优选0.01-20mg寡肽和10⁶-10⁹携带并表达EPO的MSCs的剂量。更优选地，剂量单位包括约1-4mg的寡肽和10⁷-10⁸携带并表达EPO的MSCs。最优选地，剂量单位包括约2-3mg的寡肽和5X10⁷携带并表达EPO的MSCs。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

在本发明中，施用的有效量以及合适的单位剂量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

根据本发明，本发明的药学药物可以以任意有效剂量施用给药受试者。优选地，本发明的药物可以以多次剂量给药，例如从约2至约12次剂量，更优选约4-8次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周或两周或一周给药约一次的频率将本发明的药物给药至受试者，例如注射或输注，例如静脉注射或器官内注射。在特别优选的实施方案，给药为通过静脉注射施用。

应当理解本发明的药物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以基于给药频率为每日一次、每周一次、每月一次等确定。剂量单位也可基于以两次/周、三次/周等确定。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药物中可包含涉及该药学产品的说明书，且该说明书可以含有如下内容：适应症(例如肺纤维化)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

附图说明

图1：MenSCs转染EPO的mRNA与蛋白表达情况。由图1可见，MenSCs转染EPO基因后，EPO mRNA与蛋白表达水平均显著增加。**表示与对照相比，P＜0.01。

图2：肺组织上皮表型(E-cad)和纤维化表型(α-SMA)mRNA表达量。博来霉素模型组可以促进纤维化表型标志(α-SMA)明显升高，上皮表型标志(E-cad)明显下降。MenSCs组和EPO-MenSCs组可以有效逆转博来霉素促纤维化作用，EPO-MenSCs组效果更好。**表示博来霉素模型组与对照组相比，P＜0.01。##表示给药组与博来霉素模型组相比，P＜0.01。#表示给药组与博来霉素模型组相比，P＜0.05。

图3各组小鼠第14天肺组织胶原沉积结果(Masson染色，100倍)，其中，A为对照组；B为模型组；C为MenSCs组；D为EPO+MenSCs组。由图3可见，对照组小鼠肺部结构正常，肺泡间有少量胶原，模型组小鼠第14天时胶原大量增生，肺泡结构被破坏，并逐渐向肺间质延伸、聚集。MenSCs组胶原沉积情况较模型组明显改善，EPO+MenSCs组胶原沉积状况显著改善，肺泡结构趋于完整。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：构建EPO过表达载体

在NCBI网站查找EPO编码序列，根据核苷酸序列NM 000799.2，设计一对引物，其中正向引物：5’GCCCGCTCTGCTCCGACAC 3’；反向引物：5’TGCCCATGCCCGTGAGACC 3’。克隆EPO的cDNA全序列，产物长度1，168bp。EPO的PCR产物插入质粒，再连接到慢病毒载体。

实施例2：经血干细胞的获取

1、样本采集

样本采集的志愿者为20-30岁女性，伦理审查通过后，签署知情同意书，在月经周期的中期，使用201510657971.8中实施例所描述的方法，收集经血，转入含采集液的储存管中，24小时内送入实验室。

2、样本处理

样本包装经消毒后，在百级操作台上处理；PBS稀释经血，使用120目细胞筛过滤，取滤液离心；收集沉淀使用PBS重悬，密度梯度离心收集单个核细胞；以201510657971.8描述的方法配置培养基，即加了4mmol/L谷氨酰胺、5mg/mL的人血清替代物(购自武汉维诺赛生物科技有限公司，货号R007)、10ng/mL的EGF、10ng/mL的PDGF-BB、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α MEM培养基。。

3、细胞体外扩增培养实验：

将上述步骤2中获得的单个核细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞长至一定程度时，传代培养。

实施例3：构建EPO过表达载体转染宫血干细胞

选取实施例2中传代3-6代的宫血干细胞(MenSCs)接种到10cm培养皿，待细胞80％融合时，加入2ml实施例1所获得的浓缩病毒溶液及6mg/L polybrene过夜。更换含有2μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基筛选，直至大多数细胞死亡，荧光显微镜下观察活细胞呈现绿色(载体包含绿色荧光蛋白片段)。用qPCR法验证EPO mRNA表达情况(图1A)，同时收集总蛋白，用Western Blot方法检测EPO蛋白表达情况(图1B)。结果表明，MenSCs转染EPO基因后，EPOmRNA与蛋白表达水平均显著增加。**表示与对照相比，P＜0.01。

实施例4：转染EPO的MenSCs体内抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化

选择8-10周龄雌性C57BL/6小鼠，体重18-22g。于第0天腹腔注射氯胺酮麻醉，分别给予无菌生理盐水或含2.15U/kg博来霉素的生理盐水溶液50μl，采用注射器(0.9mm针头)气管注射。静脉注射500,000个MenSCs或EPO-MenSCs，对照组注射等量无菌溶媒介质。第1-14天每天称量体重，第14天将小鼠安乐死，取左肺用于RNA分析上皮表型(E-cad)和纤维化表型(α-SMA)表达量，右肺用福尔马林固定，用Masson染色分析胶原含量。所有动物使用遵守动物保护和利用委员会(IACUC)相关规定。

结果肺组织上皮表型(E-cad)和纤维化表型(α-SMA)mRNA表达量由图2所示。各组小鼠第14天肺组织胶原沉积结果(Masson染色，100倍)由图3所示。

由图2可以看出，博来霉素模型组可以促进纤维化表型标志α-SMA明显升高，上皮表型标志(E-cad)明显下降。MenSCs组和EPO-MenSCs组可以有效逆转博来霉素促纤维化作用，EPO-MenSCs组效果更好。**表示博来霉素模型组与对照组相比，P＜0.01。##表示给药组与博来霉素模型组相比，P＜0.01。#表示给药组与博来霉素模型组相比，P＜0.05。

由图3(其中，A为对照组；B为模型组；C为MenSCs组；D为EPO+MenSCs组)可见，对照组小鼠肺部结构正常，肺泡间有少量胶原，模型组小鼠第14天时胶原大量增生，肺泡结构被破坏，并逐渐向肺间质延伸、聚集。MenSCs组胶原沉积情况较模型组明显改善，EPO+MenSCs组胶原沉积状况显著改善，肺泡结构趋于完整。

实施例5：转染EPO的MenSCs联合寡肽体内抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化

选择8-10周龄雌性C57BL/6小鼠，体重18-22g。于第0天腹腔注射氯胺酮麻醉，分别给予无菌生理盐水或含2.15U/kg博来霉素的生理盐水溶液50μl，采用注射器(0.9mm针头)气管注射。静脉注射500，000个EPO-MenSCs和0.30mg SEQ ID NO：3的寡肽(组合组)，对照组注射等量EPO-MenSCs(单一组)。第1-14天每天称量体重，第14天将小鼠安乐死，取左肺用于RNA分析上皮表型(E-cad)和纤维化表型(α-SMA)表达量，右肺用福尔马林固定，用Masson染色分析胶原含量。所有动物使用遵守动物保护和利用委员会(IACUC)相关规定。

结果证实，组合组相对单一组而言显著降低纤维化表型标志α-SMA(平均21.6％，n＝5)，同时显著上调上皮表型标志E-cad(平均17.4％)。同时，组合组的胶原沉积状况更显著改善，肺泡结构也更趋于完整。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江生创精准医疗科技有限公司

<120> 运用MSCs定向趋化特性运载EPO治疗肺纤维化

<130> JZYL2018001

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

gcccgctctg ctccgacac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

tgcccatgcc cgtgagacc 19

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于联合治疗肺纤维化

<400> 3

Ala Gln Met Asp Pro Met Glu Thr Asp Gly

1 5 10

Claims

1.携带并表达EPO的MSCs在制备用于治疗或者预防受试者肺纤维化的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中MSCs为经血干细胞。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是注射剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是静脉注射剂。

5.根据权利要求2所述的用途，其中所述经血干细胞是同种异体的，或为自体的。

6.携带并表达EPO的MSCs和SEQ ID NO：3的寡肽的组合在制备用于治疗或者预防受试者中肺纤维化的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中MSCs为经血干细胞。

8.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物是注射剂。

9.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物是静脉注射剂。

10.根据权利要求7所述的用途，其中所述经血干细胞是同种异体的，或为自体的。