CN106389596A - 治疗肺纤维化的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗肺纤维化的药物，其特征在于该药物处方由中药蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七组成。处方中以蛤蚧、五指牛奶为补虚扶正之药，芒果叶为消炎止咳化痰之药，黄根、三七为化瘀散结之药。此方是根据中医“辨证论治”的思想，合理用药，以求达标本皆治之效。实验研究证明了该方对肺纤维化的有效性及其作用机制，可用于开发治疗肺纤维化的中药新药。

Description

治疗肺纤维化的药物
技术领域
本发明属于肺纤维化治疗技术领域，尤其涉及一种治疗肺纤维化的药物。
背景技术
肺纤维化(PF)是肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变的一类疾病，其主要症状包括呼吸困难、气短、干咳、喘憋现象，严重时会导致患者呼吸衰竭而死亡。目前对其发病机制仍不太清楚，随着环境污染的不断恶化，发病率正在逐年增加。目前西医对于肺纤维化的传统治疗手段主要是采用激素和免疫抑制剂类药物，但是疗效不理想而且还有副作用。中医文献没有关于肺纤维化的疾病名称，根据其症状可归属于“肺痹”、“肺痿”、“咳嗽”等，临床与实践表明中医药治疗肺纤维化显示一定的优势。
肺纤维化难以用单一病机来解释，很多医家认为：肺纤维化当属本虚标实，以肺肾气虚为本，以痰浊、瘀血、热毒等邪实内阻为标。在本病的发生、发展的整个过程中，正气不足是本病之本，“虚”、“痰”、“瘀”一直贯穿于疾病的始终。单味中药对肺纤维化的作用具有局限性，难以完全治疗病机复杂的疾病，中药复方才是中药研究的重难点。目前中医主要使用药物多以补益药和活血药为主，以祛痰药为佐。邓家刚教授认为，肺纤维化形成的中医病机主要涉及正虚痰瘀等，并依据中医理论和多年的行医经验，组成“蛤芒肺纤方”(原处方：蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七)进行治疗肺纤维化的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全有效的治疗肺纤维化的药物。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：治疗肺纤维化的药物，其处方由蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七组成。
蛤芒肺纤方按重量份由蛤蚧2～10份、五指牛奶6～15份、芒果叶5～20份、黄根5～15份与三七1～5份组成。
所述的治疗肺纤维化药物，可通过显著性的提高模型小鼠体内总SOD活力，降低MDA含量，即通过增加氧自由基清除剂的含量和降低氧自由基代谢产物的损害，对博莱霉素致小鼠肺损伤具有保护作用，从而抑制肺纤维化。
所述的治疗肺纤维化药物，可通过显著地降低HYP表达水平，抑制胶原蛋白的形成，进而减轻肺纤维化的程度。
所述的治疗肺纤维化药物，可通过抑制IL-1β的表达而发挥抑制肺纤维化形成的作用。
所述的治疗肺纤维化药物，可通过抑制NF-κB而起到抗炎作用，进而起到治疗肺纤维化作用。
所述的治疗肺纤维化药物，可通过抗氧化抗自由基损伤、抑制炎症因子的释放抗炎性损伤、影响胶原的代谢减少肺纤维蛋白的形成3个方面发挥抑制肺纤维化的作用。
所述肺纤维化由化学、物理或生物因素引起人体正虚痰瘀所造成。
肺纤维化由抗肿瘤药博莱霉素诱导造成。
该药物为口服制剂。
此药物处方是根据中医“辨证论治”的思想，合理用药，以求达标本皆治之效。
发明人根据先前对蛤芒肺纤方的研究，进一步采用中药药理学方法和分子生物学方法，对抗肿瘤药博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化进行药效及其初步机制研究。实验结果表明该方有效性及其药理作用机制，可用于开发治疗肺纤维化的中药新药。
具体实施方式
实施例1：蛤芒肺纤方对肺纤维化模型小鼠的干预作用
1实验材料
1.1实验动物
18-22g左右昆明种SPF级雄性小鼠，合格证号：scxk桂2009-0002，由广西医科大学实验动物中心提供。
1.2药物与试剂
地塞米松磷酸钠注射液(1ml、5mg，广州白云山天心制药股份有限公司，生产批号：130608)；注射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社，产品批号：120901)；蛤蚧(广西玉林参宝堂中药饮片有限公司，产品批号：130802)；五指牛奶(广西玉林参宝堂中药饮片有限公司，产品批号：130905)；芒果叶(自采，经广西中医药大学中药教研室覃文慧鉴定)；三七(广西玉林参宝堂中药饮片有限公司，产品批号：130902)；黄根(广西玉林参宝堂中药饮片有限公司，产品批号：130601)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所产品批号：20131102)；MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，产品批号：20140109)；羟脯氨酸试剂盒(碱)(南京建成生物工程研究所)；考马斯亮兰(南京建成生物工程研究所产品批号：20140108)；IL-1βELISA测试盒(武汉博士德生物工程有限公司，产品批号：20140109)。
1.3实验主要仪器
BX60显微镜(OLYMPUS 日本)
高速低温离心机(Heraeus LG16-W)
全波长酶标仪(Epoch Biotek公司 美国)
TGL-16B和TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)
紫外分光光度计(TU-1901/1900北京普析通用仪器有限公司)
电子天平(EL204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)
全自动石蜡切片机(德国MICROM(美康)HM355 S型)
电热恒温培养箱(HH·B11·360型 上海跃进公司)
电热恒干燥箱(GZX-DH·400型 上海跃进公司)
研究级显微镜(OLYMPUS 日本BX-60型)
显微摄像(尼康 D700型 单反照相机 日本尼康)
2方法
2.1蛤芒肺纤方制备
按处方配比称取蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七，第一次以8倍量的水煎煮至沸后30分钟过滤，保留滤液，然后再以4倍量的水煎煮至沸后30分钟过滤，保留滤液，将两次滤液混合浓缩至150ml。
2.2造模与分组
18-22g昆明种雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只：A空白组(10只，纯净水)、B模型组(10只，纯净水)、C阳性组(10只，地塞米松，1mg/kg)、D蛤芒肺纤方组。除空白组外其余各组小鼠乙醚吸入麻醉后，保持小鼠呈直立状，根据小鼠的呼吸，自鼻腔缓慢滴入6mg/kg盐酸博莱霉素溶液，滴完后保持直立30秒，待其苏醒后给予水和饲料，肺纤维化小鼠模型建立完成。
2.3给药方法
模型建立14天后每日灌胃(ig)给予各组小鼠相应的药物进行干预14天，空白组和模型组ig等量纯净水。地塞米松，给药量为1mg/kg；蛤芒肺纤方组(剂量为3.3mg/kg生药)，给药容量统一为20mL/kg。
2.4观察指标
各组小鼠分别于给药14天后处死，打开小鼠胸腔，取出肺脏，小鼠肺左大叶固定于4％多聚甲醛溶液中，常规石蜡包埋，切片，采用HE和Masson染色观察肺组织病理改变以及肺纤维化程度；取右肺中叶，在生理盐水中充分漂洗后，滤纸吸干表面水分，精密称取30-50mg，于-80℃冰箱保存，待测肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量；余肺留存并用生理盐水制备成10％肺组织匀浆，用于测定肺组织匀浆中的丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)活力。HE染色观察肺组织病理切片和Masson染色观察胶原纤维的分布情况；采用ELISA法测白介素-1β(IL-1β)含量。
2.5统计学方法
所有数据均以表示，使用SPSS17.0软件中单因素方差分析方法进行统计分析；Homegeneity检验方差齐性，若方差齐时采用最小显著法(LSD)检验；若方差不齐时采用Dunnett’sU检验；等级资料采用SPSS17.0软件中非参数检验法统计分析。
3结果
3.1各组小鼠肺组织匀浆中总SOD活力比较
模型组肺组织匀浆中总SOD活力较空白组显著性的降低(P＜0.01)。与模型组比较，各给药组总SOD活力均显著性升高(P＜0.01)。蛤芒肺纤方组SOD活力升高较明显，和空白组比较没有差异，见表1。
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；以下各表相同。
3.2各组小鼠肺组织匀浆中MDA含量比较
与空白组比较，模型组肺组织匀浆中MDA含量显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组MDA含量显著性的降低(P＜0.01)。蛤芒肺纤方组MDA含量和空白组无显著性差异。见表2
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.3各组小鼠肺组织中HYP含量(ug/mg干重)比较
与空白组相比，模型组肺组织中HYP含量明显升高(P＜0.05)，与模型组相比，各给药组HYP含量均较模型组显著降低(P＜0.05)。蛤芒肺纤方组HYP含量和空白组无显著性差异。见表3。
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.4各组小鼠0.1％肺组织匀浆中IL-1β含量比较
与空白组比较，模型组1％肺组织匀浆中IL-1β水平均显著升高(P＜0.05～0.01)；与模型组比较，各给药组IL-1β水平显著性降低(P＜0.05)。见表4。
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.5各组小鼠肺组织病理形态学观察
光学显微镜下观察，空白组肺结构清晰，肺泡上皮细胞、肺间质血管上皮细胞未见或少见炎症细胞浸润，支气管、肺泡、血管壁均未见胶原纤维明显增生。模型组小鼠均有肺泡炎，表现为肺泡充血、水肿，部分肺泡有透明膜形成，肺泡上皮细胞有中至重度损伤，肺泡炎稍减轻；肺纤维化程度最重，多呈3级肺纤维化变化，胶原纤维组织增生、变厚，肺气肿严重。各给药组都有明显的改善。肺组织病理学分析结果见表5。
表5各组小鼠肺泡炎、肺纤维化程度比较
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
实施例2：蛤芒肺纤方对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)炎症的干预作用
1材料
1.1主要仪器
Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；HF151UV型CO2细胞培养箱(上海HealForce公司)；倒置生物相差显微镜(日本Olympus公司)；MIKRO 220R型高速冷冻离心机(德国Hettich公司)；680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Modulus荧光检测仪(美国TurnerDesigns公司)。
1.2药品与试剂
肺纤方，由蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七等药物组成，经天津药物研究院提取制备；1640基础培养基(美国HyClone公司)；双抗(氨苄青霉素和链霉素)、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；TNF-α(美国Peprotech公司)；地塞米松(Dex，美国Sigma公司)；PGL4.32质粒和海肾荧光素酶质粒、细胞裂解液、双荧光素酶报告基因试剂盒(美国Promega公司)；脂质体2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；TNF-α、IL-6酶联免疫试剂盒(上海西唐)；超纯水由Milli-Q制备。
1.3细胞
人支气管上皮细胞(BEAS-2B)购自上海拜力生物技术有限公司。
2方法
2.1肺纤方对NF-κB抑制能力的测定
BEAS-2B细胞培养于96孔板，细胞融合至60％～70％时共转染PGL4.32及内参Renilla质粒，转染24h后加入各浓度的肺纤方(10-4、10-5、10-6、10-7g/mL)或地塞米松(10- 4mol/L)孵育6h，再加入TNF-α(10ng/mL)刺激6h后裂解细胞，用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组细胞NF-κB的表达量，数据以相对荧光比值表示，相对荧光比值＝NF-κB荧光值/内参Renilla荧光值。
2.2数据统计分析
采用SPSS18.0软件进行数据统计，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1肺纤方体外抗炎活性评价
3.1.1抗炎能力的测定肺纤方在细胞水平上对NF-κB的抑制活性评价结果见表6，结果显示：与空白组比较，模型组NF-κB的表达量显著升高(P＜0.001)。与模型组比较，阳性药地塞米松组(1×10-4mol/L)NF-κB的表达量显著降低(P＜0.001)；肺纤方组(10-1、10- 2mg/mL)NF-κB的表达量显著降低(P＜0.001)，肺纤方组(10-3、10-4mg/mL)与模型组之间无显著性差异；抗炎能力随着药物浓度的增加而增强，说明肺纤方对NF-κB有很好的抑制作用。
表6不同浓度肺纤方对NF-κB的抑制作用
注：与空白组比较，###表示P＜0.001；与模型组比较，***表示P＜0.001。
结论：动物实验结果表明，蛤芒肺纤方组显著性的提高模型小鼠体内总SOD活力，降低MDA含量，说明本方能增加氧自由基清除剂的含量和降低氧自由基代谢产物的损害，对博莱霉素致小鼠肺损伤具有保护作用，从而抑制肺纤维化。各组HYP的测定含量表明给药组均能显著地降低HYP表达水平，蛤芒肺纤方组HYP含量甚至达到空白组水平，表明其可以通过抑制胶原蛋白的形成，减轻肺纤维化的程度。通过ELISA测定各组肺匀浆中IL-1β含量，可知模型组在疾病发展过程中IL-1β水平始终偏高，而给药组明显降低，表明其可能通过抑制IL-1β的表达而发挥抑制肺纤维化形成的作用。可见，此方可以从抗氧化、抗自由基损伤方面、抑制炎症因子的释放而发挥抗炎性损伤作用、影响胶原的代谢而减少肺纤维蛋白的形成3个方面发挥抑制肺纤维化的作用。
细胞实验结果表明，肺纤方对NF-κB有很好的抑制作用。NF-κB是一种核转录因子，在体内广泛分布并参与调控多种细胞因子、粘附分子和趋化因子等基因的转录激活，TNF-α是一种重要的炎症介质，无论是间质性肺疾病患者还是动物模型，巨噬细胞释放的TNF-α均增加，TNF-α基因启动子含有NF-κB的结合位点，在肺纤维化过程中，NF-κB受TNF-α的调控，其基因表达增加。据研究表明，在急性肺损伤、特发性肺纤维化和SiO2、百草枯、博莱霉素等诱导的实验性肺纤维化中均有NF-κB被激活。因此，本发明可通过抑制NF-κB而起到抗炎作用。
因此，蛤芒肺纤方可用于开发抗肺纤维化的新药，特别是针对抗肿瘤化疗药物造成的肺纤维化。

Claims (10)

1.一种治疗肺纤维化的药物，其特征在于该药物处方由中药蛤蚧、五指牛奶、芒果叶、黄根与三七组成。
2.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：该药物处方按重量份由蛤蚧2～10份、五指牛奶6～15份、芒果叶5～20份、黄根5～15份与三七1～5份组成。
3.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述的治疗肺纤维化药物可通过显著性的提高模型小鼠体内总SOD活力，降低MDA含量，即通过增加氧自由基清除剂的含量和降低氧自由基代谢产物的损害，对博莱霉素致小鼠肺损伤具有保护作用，从而抑制肺纤维化。
4.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述的治疗肺纤维化药物可通过显著地降低HYP表达水平，抑制胶原蛋白的形成，进而减轻肺纤维化的程度。
5.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述的治疗肺纤维化药物可通过抑制IL-1β的表达而发挥抑制肺纤维化形成的作用。
6.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述的治疗肺纤维化药物可通过抑制NF-κB而起到抗炎作用，进而起到治疗肺纤维化作用。
7.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述的治疗肺纤维化药物可通过抗氧化抗自由基损伤、抑制炎症因子的释放抗炎性损伤、影响胶原的代谢减少肺纤维蛋白的形成3个方面发挥抑制肺纤维化的作用。
8.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述肺纤维化由化学、物理或生物因素引起人体正虚痰瘀所造成。
9.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于：所述肺纤维化由抗肿瘤化疗药物(如博莱霉素)诱导造成。
10.根据权利要求1所述的治疗肺纤维化的药物，其特征在于该药物为口服制剂。
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