RU2808256C1 - Способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга - Google Patents
Способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808256C1 RU2808256C1 RU2023101781A RU2023101781A RU2808256C1 RU 2808256 C1 RU2808256 C1 RU 2808256C1 RU 2023101781 A RU2023101781 A RU 2023101781A RU 2023101781 A RU2023101781 A RU 2023101781A RU 2808256 C1 RU2808256 C1 RU 2808256C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stroke
- gene
- gene therapy
- ischemic
- gdnf
- Prior art date
Links
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims abstract 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 31
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 28
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 20
- 101710130688 Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims description 19
- 102100021852 Neuronal cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 15
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 6
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 5
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 claims description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002792 vascular Effects 0.000 abstract description 5
- 101001108364 Homo sapiens Neuronal cell adhesion molecule Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 3
- 102000051566 human NRCAM Human genes 0.000 abstract description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 101150096752 NCAM1 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 9
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 8
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 8
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 102000001068 Neural Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 3
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013310 pig model Methods 0.000 description 3
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 3
- CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N Artemin Chemical compound C1CC2(C)C(O)CCC(=C)C2(O)C2C1C(C)C(=O)O2 CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 description 1
- 101710205806 Artemin Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000634196 Homo sapiens Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000996663 Homo sapiens Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100023616 Neural cell adhesion molecule L1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000275 circle of willis Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 238000009297 electrocoagulation Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 101150082979 gdnf gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001414 neuropoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 1
- -1 newturin Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009861 stroke prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001321 subclavian vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 210000003582 temporal bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает новый способ персонифицированной превентивной генной терапии пациента при высоком риске инсульта путем внутривенной инфузии аутологичиого лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, который готовят на основе лейкоцитов периферической крови пациента и репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущих последовательности гена сосудистого эндотелиалыюго фактора роста VEGF165 человека, гена глиального нейротрофического фактора GDNF человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии NCAM1 человека. 2 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины в неврологии, в частности к методу персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга для сдерживания негативных последствий в области ишемического повреждения при наступлении инсульта.
По данным Всемирной организации здравоохранения ишемические церебральные инсульты занимают ведущее место среди причин смертей в мире. В России частота инсульта составляет около 500 случаев на 100 тыс. населения. Причем, до 84-87% случаев пациенты с инсультом умирают или остаются инвалидами и лишь 8-10% случаев заканчиваются восстановлением нарушенных функций мозга в первые 3 недели заболевания. Поэтому, профилактика инсульта является не только медицинской, но и социально-экономической проблемой. Медицинские меры профилактики инсульта направлены на предотвращение факторов риска, которые включают в себя коррекцию заболеваний сердечно-сосудистой системы, обмена веществ, гемостаза и др. Особенно важное значение превентивная терапия инсульта имеет в первые часы после возникновения сосудистой катастрофы для предотвращения массовой гибели нейронов. Вокруг первичного очага ишемического инфаркта с необратимыми патоморфологическими сдвигами формируется периинфарктная область - «ишемическая полутень» или «пенумбра», кровоснабжение в которой существенно ниже нормального уровня. Жизнеспособность нейронов в этой области сохраняется в течение 3-6 часового периода, так называемого «терапевтического окна», во время которого имеется возможность усилить свойства нейропластичности мозга и повысить жизнеспособность нейронов в условиях ишемии. Таким образом, превентивная терапия при угрозе инсульта, может быть эффективным способом предупредить распространение инфаркта на пограничные с первичным очагом некроза области ткани мозга (ишемическую полутень) в период терапевтического окна. При этом превентивной терапии, нацеленной на сдерживание постишемических повреждений мозга при наступлении инсульта, не существует.
В настоящее время в эксперименте для терапии нейродегенеративных заболеваний, нейротравм и инсультов активно разрабатываются геннотерапевтические препараты с нейропротекторным действием или для стимулирования нейрорегенерации. Множество различных генетических конструкций было разработано в зависимости от типа генетического вектора и загруженной в вектор рекомбинантной кДНК, кодирующей терапевтическую молекулу (doi:10.1002/jnr.20968). Члены семейства нейротрофинов (NGF, BDNF, NT-3 и NT-4/5), семейства глиальных нейротрофических факторов (GDNF, ньютурин, артемин, персефин), семейство нейропоэтических цитокинов (CNTF, LIF, IL-6), семейства сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGF-A, фактор роста плаценты (PGF), VEGF-B, VEGF-C и VEGF-D), семейства инсулиноподобных факторов роста (IGF-1, IGF-2) и семейства нейрональных молекул клеточной адгезии (NCAM, L1) широко используют для коррекции заболеваний центральной нервной системы. По способу доставки геннотерапевтического препарата в организм пациента различают прямую генную терапию (in vivo), предполагающую непосредственное введение генетической конструкции, и клеточно-опосредованную генную терапию (ex vivo), при которой для доставки терапевтического гена используют клеточные носители.
Преимущественно работы с применением геннотерапевтических препаратов направлены на лечение инсульта после его возникновения. Целесообразность использования генной терапии при ишемическом инсульте головного мозга доказана в многочисленных доклинических исследованиях в моделях на лабораторных животных [http://dx.doi.org/10.1517/17425247.2016.1144588]. Из исследованного уровня техники известны способы доставки рекомбинантных терапевтических генов с нейропротекторным действием с помощью различных векторных систем путем инъекции геннотерапевтического препарата в цереброспинальную жидкость или непосредственно в ткань мозга до или после моделирования инсульта (doi: 10.3389/fnmol.2016.00034).
Для лечения инсульта в острую фазу известен способ одновременной интратекальной инфузии рекомбинантных генов, кодирующих нейротрофические факторы VEGF, GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, с помощью аденовирусных векторов пятого серотипа (Ad5), или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека (Патент RU №2676701, МПК A61K 31/7088 - 10.01.2019, БИ №1).
В другом исследовании с целью превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга крысы представлен способ интратекальной доставки комбинации рекомбинантных генов, кодирующих нейротрофические факторы VEGF, GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, с помощью аденовирусных векторов пятого серотипа (Ad5), или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека для повышения жизнеспособности нейронов при угрозе инсульта и, таким образом, сдерживания массовой гибели нервных клеток период «терапевтического окна» в области ишемической полутени в случае наступления инсульта (Патент RU №2748940, МПК A61K 31/7088, A61K 48/00, А61Р 9/10, А61Р 43/00 - 01.06.2021, Бюл. №16). При этом доставка генов с помощью клеточных носителей (клеточно-опосредованная, ex vivo генная терапия) считается более безопасной, при которой отсутствует неуправляемая трансдукция различных клеток тканей и органов, а также прямое токсическое и иммуногенное действие вирусного вектора на организм реципиента, как в случае прямой (in vivo) генной терапии (doi:10.3390/ijms21186858).
Однако в уровне техники приведенных выше примеров для безопасной превентивной генной терапии существует необходимость использования аллогенных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, а введение генно-клеточного препарата осуществляют путем интратекальной инъекции в цереброспинальную жидкость. Недостатком использования мононуклеарных клеток крови пуповины человека в качестве клеточных носителей терапевтических генов являются существенные ограничения для их активного применения в практической медицине, связанные как с недостаточным количеством клеточного материала, который забирается и хранится в криобанках персонально для донора, так и с рисками аллотрансплантации. Интратекальная инъекция в цереброспинальную жидкость лекарственных средств посредством люмбальной пункции - сложная инвазивная манипуляция, которую в условиях стационара выполняет опытный специалист, и для превентивной генной терапии такой способ введения геннотерапевтического препарата не может быть применен для широкого использования.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами, кодирующими VEGF, GDNF и NCAM, для генио-клеточной терапии инсульта головного мозга в острую фазу (Патент RU №2784233, МПК A61K 48/00, A61K 35/12, А61Р 9/10, А61Р 25/02 - 23.11.2022, Бюл. №33). Данный способ предполагает использование собственных лейкоцитов пациента как в качестве носителей генов, кодирующих нейротрофические факторы, так и продуцентов рекомбинантных терапевтических молекул в организме пациента для сдерживания развития ишемического повреждения мозга. Эффективность генетически модифицированного аутологичного лейкоконцентрата доказана в моделях на мини-свиньях с моделью ишемического инсульта головного мозга при внутривенном введении генно-клеточного препарата в период терапевтического окна.
Однако на сегодняшний день способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга с помощью аутологичных лейкоцитов, продуцирующих рекомбинантные нейропотекторные факторы не известен.
Задачей настоящего изобретения является решение перечисленных проблем, связанных с клеточным носителем терапевтических генов и способа введения генно-клеточного препарата для превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого, экономичного и эффективного способа персонифицированной превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга путем внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного терапевтическими генами, при высоком риске наступления инсульта.
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что в предложенном способе превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга используют аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный искусственным генетическим материалом, для временной продукции рекомбинантных факторов с нейропротекторным действием, повышающих нейропластичность мозга и способных предупредить массовую гибель нейронов в области пенумбры в период терапевтического окна, при возможном наступлении ишемического инсульта. Для получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного искусственным генетическим материалом - лейкоконцентрат получают из цельной крови пациента и трансдуцируют с помощью фармацевтической композиции, в состав которой входят три репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека. При высоком риске ишемического инсульта из лейкоконцентрата пациента и фармацевтической композиции готовят обогащенный рекомбинантными генами vegf165, gdnf и ncam1 лейкоконцентрат, который вводят путем внутривенной инфузии для сдерживания массовой гибели нейронов в области пенумбры (ишемической полутени) при наступлении инсульта.
Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:
Фиг. 1 - данные, полученные при анализе поведенческого теста «Открытое поле». Результаты горизонтальной активности у контрольных и опытных мини-свиней представлены в процентном отношении к базовому уровню, принятому за 100%, до моделирования инсульта (Тренировка) и на 3, 7 и 14 и 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Сплошная линия показывает изменения показателей поведенческого теста у контрольных животных, пунктирная линия - у опытных животных.
Фиг. 2 - результаты морфометрического анализа объема (см3) инфаркта головного мозга контрольных и опытных мини-свиней через 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Серый прямоугольник соответствует данным контрольных животных, белый - опытных мини-свиней. Поперечные линии внутри прямоугольников - медиана значений, границы прямоугольников - 1-ый и 3-ий квартили, Т-образные линии, выходящие из прямоугольников - минимальные и максимальные наблюдаемые значения.
Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется нижеприведенным примером использования аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией, для превентивной генной терапии ишемического инсульта в модели на мини-свиньях.
Пример получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно фармацевтической композицией, содержащей композицию из трех репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека, и его использования для персонифицированной превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях.
В примере были использованы самки вьетнамских вислобрюхих мини-свиней весом 20-25 кг (n=8). Протоколы анестезии, оперативных вмешательств, послеоперационного ухода и эвтаназии животных одобрены Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинског о университета (№5 от 26 мая 2020 года). Дизайн экспериментов включает в себя следующие этапы:
Этап I. Изготовление аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами, кодирующими VEGF165, GDNF и NCAM1.
У подопытных мини-свиней под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно, в асептических условиях из подключичной вены забирали 50 мл крови в контейнеры для крови (гемакон), содержащие 35 мл антикоагулянта (ЦФДА-1) и процессировали для получения лейкоконцентрата по известному способу (Патент RU №2716013, МПК A61K 48/00, A61K 35/00, опубл. 05.03.2020, Бюл. №7). Далее, полученный лейкоконцентрат, обогащали искусственным генетическим материалом с помощью фармацевтической композиции по известному способу (Патент RU №2784233, МПК A61K 48/00, A61K 35/12, А61Р 9/10, А61Р 25/02 - 23.11.2022, Бюл. №33). Фармацевтическую композицию, включающую в себя химерные аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1 в равном соотношении каждого вектора, с помощью стерильного шприца вводили через порт в контейнер для крови, содержащий лейкоконцентрат. Соотношение клеток лейкоконцентрата и аденовирусных векторов в составе фармацевтической композиции составило 1:10, или параметр MOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) равнялся 10 (MOI=10). Репортерный ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок GFP, в составе аденовирусного вектора Ad5/F35-GFP, использовали для получения лейкоконцетрата, продуцирующего репортерный зеленый флуоресцирующий (GFP - green fluorescent protein). Трансдукцию лейкоконцентрата проводили при комнатной температуре (21-22°С), при постоянном покачивании на шейкере. Через 12 часов в контейнер добавляли 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 rpm и температуре 10°С в течение 10 минут с помощью центрифуги Presvac. Далее с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 из контейнера экстрагировали надосадочную жидкость, включающую в себя физиологический раствор, фрагменты клеток крови и свободные вирусные частицы, таким образом, чтобы в контейнере осталось приблизительно 30 мл физиологического раствора, содержащего лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом.
Этап II. Превентивная генная терапия: внутривенное введение здоровым мини-свиньям аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, до моделирования инсульта.
Под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно в асептических условиях животным опытной группы (n=3) внутривенно в объеме 30 мл через ушную вену вводили свежеприготовленный аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генами VEGF165, GDNF и NCAM1. Животным контрольной группы (n=3) вводили 30 мл физиологического раствора. Животным репортерной группы (n=2) вводили свежеприготовленный аутологичный лейкоконцетрат, продуцирующий репортерный белок GFP. Репортерную группу использовали для анализа миграции, выживания и способности продукции рекомбинантного белка генетически модифицированными лейкоцитами в головном мозге подопытных животных.
Этап III. Моделирование ишемического инсульта головного мозга у подопытных мини-свиней.
Животным из опытной и репортерной групп через 2 суток после инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, моделировали ишемический инсульт головного мозга. Контрольным животным инсульт моделировали в плановом порядке. Подопытных животных наркотизировали с помощью Zoletil® 100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно и подключали к ингаляционному наркозному аппарату (Minor Vet Optima, Zoomed), по которому подавали изофлуран (Laboratories Karizoo, S.A., Spain) в 2,0-2,5% в смеси с кислородом. После трепанации левой височной кости рассекали твердую мозговую оболочку и под операционным микроскопом путем электрокоагуляции прижигали дистальные ветви средней мозговой артерии. Для уменьшения кровотока в вилизиевом круге дополнительно перевязывали правую сонную артерию. Послеоперационный уход включал в себя анальгезирующую (кеторол 30 мг/мл, 2 р/д, в/м, 10 дней), антибактериальную (цефотаксим в/м, 1 гр/5 мл, 1 р/д, 7 дней) и инфузионную (введение физиологического раствора (0,9% NaCl) 400,0 мл подкожно капельно 1 р/д, 3 дня) терапию.
Этап IV. Оценка способности клеток аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, к миграции в периинфарктую область мозга.
Через неделю после внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного репортерным геном GFP (репортерная группа), в периинфарктной области левого полушария с помощью флуоресцентной микроскопии были обнаружены GFP-позитивные лейкоциты (7,4 [8,5] клеток/мм2). Эти данные свидетельствуют о том, что генетически модифицированные лейкоциты после внутривенной инфузии мигрируют в периинфарктную область и продуцируют рекомбинантные белки, которые по паракринному механизму могут повышать нейропластичность в периинфарктной области и оказывать положительное влияние на сохранность нервной ткани в условиях ишемии.
Этап V. Оценка эффективности превентивной генной терапии ишемического инсульта с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, после моделирования инсульта.
Тест "Открытое поле" использовали для оценки уровня общей локомоторной активности у экспериментальных животных до моделирования инсульта и на 3, 7, 14 и 21 сутки после операции. Мини-свиней помещали в арену (3×3 м), разделенную на 6 квадратов. Горизонтальную активность оценивали путем подсчета количества пересеченных линий за 10 мин. Через 3 суток после моделирования инсульта горизонтальная активность у контрольных и опытных животных значительно снизилась, по отношению с показателями, зарегистрированными у этих животных до операции. Через 7 суток у опытных мини-свиней был установлен рост горизонтальной активности, тогда как у контрольных животных этот показатель продолжал снижаться. Через 14 суток горизонтальная активность у опытных мини-свиней не изменялась, а у контрольных животных происходило ее увеличение. На 21 сутки эксперимента значения у мини-свиней из опытной и контрольной групп не отличались (Фигура 1).
Морфометрический анализ относительного объема инфаркта мозга у подопытных животных через 21 сутки после моделирования ишемического инсульта обнаружил, что объем инфаркта головного мозга у контрольных мини-свиней равнялся 0,322 (0,307-0,328) см3, а у животных из опытной группы он был в 2,4 раза меньше и равнялся 0,134 (0,107-0,142) см3 (Фигура 2). При этом иммунофлуоресцентный анализ коры головного мозга в периинфарктной области обнаружил, что количество клеток, вступивших в апоптоз (каспаза 3-позитивных клеток), в опытной группе (58,00 [56,50-59,00]) было меньше, чем контрольной 65,00 (62,50-69,00).
Полученные нами данные дают основание полагать о положительном терапевтическом эффекте превентивной генной терапии с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, на восстановление двигательной активности и сохранность мозга у мини-свиней после моделирования ишемического инсульта. Положительный эффект внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, может быть обусловлен: во-первых - генетически модифицированные лейкоциты могут проходить через нарушенный гематоэнцефалический барьер и занимать ишемическую область, а секретируемые клетками рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM могут действовать на клетки-мишени по паракринному механизму; а во-вторых -рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM, секретируемые генетически модифицированными лейкоцитами в кровоток, могут диффундировать через поврежденный гематоэнцефалический барьер в ткани мозга и повышать нейропластичность по эндокринному механизму.
Таким образом, приведенный Пример свидетельствует что, аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно композицией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, является эффективным генно-клеточным препаратом для превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга.
Преимущество заявленного способа превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга от известных в мире на дату подачи заявки методов заключается в использовании аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно композицией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, для персонифицированной профилактики инсульта при высоком риске ишемического инсульта у пациентов с транзиторными ишемическими атаками различного происхождения. Композиция рекомбинантных генов включает в себя гены, кодирующие молекулы стимуляторы регенерации в центральной нервной системе. Кроме того, VEGF обладает ангиогенным действием, а экспрессия нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) на поверхности генетически модифицированных лейкоцитов может способствовать их эффективной миграции в область ишемического повреждения мозга и повышать их выживаемость, что обеспечит эффективную локальную (в области ишемической полутени) продукцию рекомбинантных терапевтических молекул генетически модифицированными лейкоцитами.
Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, может быть приготовлен в больничных центрах крови из периферической крови пациента и химерных аденовирусных векторов (Ad5/35), несущих рекомбинантные терапевтические гены. Важно отметить, что процедура приготовления, генетически обогащенного лейкоконцентрата проводится в стандартном контейнере для крови без использования продуктов животного происхождения, антибиотиков и других химических веществ для культивирования клеток in vitro. Продукция рекомбинантных VEGF165, GDNF и NCAM1 генетически модифицированными лейкоцитами начинается в первые сутки после внутривенной инфузии аутологичного генетически обогащенного лейкоконцентрата и продолжается в течение 3 недель, что обусловлено периодом полувыведения генетических конструкций. В этот 3-х недельный период рекомбинантные терапевтические молекулы в случае сосудистой катастрофы увеличат жизнеспособность нейронов мозга и, таким образом, предотвратят массовую гибель нейронов в ишемической полутени в течение 3-6 часового периода терапевтического окна при наступлении инсульта. Ограниченная 3-х недельным периодом экспрессия рекомбинантных генов не исключает повторное безопасное введение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, при сохранении угрозы возникновения инсульта мозга.
Изобретение может быть использовано в специализированных медицинских учреждениях, где пациенту при угрозе инсульта в профилактических целях внутривенно вводят генно-клеточный препарат - аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный искусственным генетическим материалом. Генно-клеточный препарат готовят на основе лейкоцитов периферической крови пациента и композиции репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека. Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно композицией их трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, используют в лечебных целях для повышения нейропластичности мозга и предотвращения массовой гибели нейронов в области ишемической полутени в течение 3-6 часового периода терапевтического окна при наступлении инсульта.
Claims (6)
- Способ персонифицированной превентивной генной терапии при высоком риске наступления ишемического инсульта головного мозга путем внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного тремя терапевтическими генами, кодирующими
- сосудистый эндотелиальный фактора роста VEGF165,
- глиальный нейротрофический фактор GDNF и
- нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM1,
- отличающийся тем, что
- лечение проводят при угрозе инсульта с целью сдерживания массовой гибели нейронов в области пенумбры в результате воздействия рекомбинантных нейропротекторных факторов VEGF165, GDNF и NCAM1, продуцируемых собственными лейкоцитами, и которые при возникновении инсульта через нарушенный гематоэнцефалический барьер способны проникать из кровотока в область ишемического повреждения с момента наступления инсульта и в период терапевтического окна усиливать жизнеспособность нейронов и, таким образом, повышать сохранность мозга.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808256C1 true RU2808256C1 (ru) | 2023-11-28 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2676701C1 (ru) * | 2017-12-01 | 2019-01-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
| RU2748940C2 (ru) * | 2020-05-18 | 2021-06-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ превентивной генной терапии для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
| RU2784233C1 (ru) * | 2022-02-03 | 2022-11-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2676701C1 (ru) * | 2017-12-01 | 2019-01-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
| RU2748940C2 (ru) * | 2020-05-18 | 2021-06-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ превентивной генной терапии для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
| RU2784233C1 (ru) * | 2022-02-03 | 2022-11-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PARAMBI D. G. T., et al. Gene therapy approach with an emphasis on growth factors: theoretical and clinical outcomes in neurodegenerative diseases, Molecular Neurobiology, 2022, v. 59(1): 191-233. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| El Sanharawi et al. | Protein delivery for retinal diseases: from basic considerations to clinical applications | |
| AU2010213575B2 (en) | Peripheral administration of proteins including TGF-beta superfamily members for systemic treatment of disorders and disease | |
| JP2009525297A (ja) | コンディショニング済み血液組成物およびその製造方法 | |
| CA2327208A1 (en) | Methods of increasing distribution of therapeutic agents | |
| CN109310711A (zh) | 血小板沉淀裂解物的制备及其治疗神经系统疾病的用途 | |
| US20200353008A1 (en) | Compositions and methods for treating nerve injury | |
| JP2016516071A (ja) | 瘢痕形成を軽減するためのｓｄｆ−１の使用 | |
| Obermeyer et al. | Influencing neuroplasticity in stroke treatment with advanced biomaterials-based approaches | |
| AU2007247679B2 (en) | Vitreous administration of erythropoietin | |
| RU2808256C1 (ru) | Способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга | |
| US20210379104A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising isolated mitochondria for preventing or treating tendinopathy | |
| US20110165131A1 (en) | Methods for treating diseases and increasing longevity | |
| TWI327473B (en) | Composition for treating a cerebrovascular disease and a method for increasing expression of erythropoietin | |
| US11969522B2 (en) | Use of immune modulators to improve nerve regeneration | |
| RU2676701C1 (ru) | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга | |
| RU2784233C1 (ru) | Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга | |
| JP2022546622A (ja) | 胃不全麻痺の治療に使用するための神経毒素組成物 | |
| WO2019200152A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of brain damage | |
| AU2010213591B2 (en) | Compositions and methods for minimally-invasive systemic delivery of proteins including TGF-beta superfamily members | |
| RU2748940C2 (ru) | Способ превентивной генной терапии для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга | |
| CN108606981A (zh) | 运用MSCs定向趋化特性运载EPO治疗肺纤维化 | |
| US20220387506A1 (en) | Cell therapies and methods of treatment for small-volume stroke | |
| Sun et al. | Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation Combined with Exercise Training Synergistically Promoted Functional Recovery After Spinal Cord Injury. | |
| Ara et al. | Effect of Various Treatment Modalities After Spinal Cord Injury | |
| WO2005097170A1 (ja) | 血管新生促進剤および血管新生療法 |