RU2676701C1 - Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга - Google Patents
Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676701C1 RU2676701C1 RU2017142047A RU2017142047A RU2676701C1 RU 2676701 C1 RU2676701 C1 RU 2676701C1 RU 2017142047 A RU2017142047 A RU 2017142047A RU 2017142047 A RU2017142047 A RU 2017142047A RU 2676701 C1 RU2676701 C1 RU 2676701C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- brain
- cell
- stroke
- gene
- ischemic stroke
- Prior art date
Links
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 title claims description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title abstract description 63
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title abstract description 27
- 230000034994 death Effects 0.000 title abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000001068 Neural Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 claims abstract 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 claims description 5
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 21
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 16
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 13
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 11
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 5
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 3
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 3
- -1 GDNF) Proteins 0.000 description 3
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 3
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 3
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 229920004936 Lavsan® Polymers 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003582 temporal bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027401 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 3 Human genes 0.000 description 1
- 108091005664 ADAMTS4 Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 101000742062 Bos taurus Protein phosphatase 1G Proteins 0.000 description 1
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040500 Contactin-6 Human genes 0.000 description 1
- 208000025962 Crush injury Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100372758 Danio rerio vegfaa gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100039165 Heat shock protein beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000749869 Homo sapiens Contactin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101001036709 Homo sapiens Heat shock protein beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001046870 Homo sapiens Hypoxia-inducible factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001001487 Homo sapiens Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102100022875 Hypoxia-inducible factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 101150097991 L1CAM gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 108050003738 Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023181 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700037638 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 108700000711 bcl-X Proteins 0.000 description 1
- 102000055104 bcl-X Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000275 circle of willis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 210000000613 ear canal Anatomy 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 101150082979 gdnf gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000009459 hedgehog signaling Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002684 laminectomy Methods 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000011135 mature cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000008035 nerve activity Effects 0.000 description 1
- 101150006061 neur gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000011631 stroke animal model Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000966 temporal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и предназначено для клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта. Терапевтическую эффективную дозу генетического материала, состоящего из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы адгезии NCAM, непосредственно вводят путем интратекальной инъекции в течение 4-х часов после наступления ишемического инсульта головного мозга. Изобретение обеспечивает получение лекарственного препарата со свойством предупреждения и сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга. 2 ил., 1 пр.
Description
Предложенное изобретение относится к генной терапии в регенеративной медицине и касается способов профилактики и лечения ишемического инсульта головного мозга с помощью средства, содержащего генетический материал - рекомбинантные гены человека, и может быть использовано для скорой неотложной помощи при наступлении ишемического инсульта головного мозга.
Проблема терапии острых нарушений мозгового кровообращения остается одной из актуальных в фундаментальной и практической медицине. В настоящее время качество и продолжительность жизни пациентов, перенесших инсульт, зависит от симптоматического лечения. Используемые лекарственные препараты могут лишь несколько замедлить течение болезни и неспособны остановить гибель нервных клеток, ведущую к инвалидности или смерти больного. В связи с этим, существует необходимость поиска новых методов лечения.
В последнее время активно проводятся клинические испытания новых генных, клеточных и генно-клеточных препаратов для стимулирования нейрорегенерации. Известно, что для терапии нейродегенеративных заболеваний во внимание принимаются ростовые и нейротрофические факторы, которые могут быть применены в качестве лекарственных препаратов. К ним относятся мозговой нейротрофический фактор (англ. Brain derived neurotrophic factor, BDNF), фактор роста нервов (англ. Nerve growth factor, NGF), глиальный нейротрофический фактор (англ. Glial derived neurotrophic factor, GDNF), инсулиноподобный фактор роста (англ. Insulinlike growth factor, IGF), основной фактор роста фибробластов (англ. Fibroblast growth factor 2, FGF2) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (англ. Vascular endothelial growth factor, VEGF). Нейропротекторное действие этих факторов доказано в эксперименте in vitro и in vivo [Lunn J.S. et al. Stem cells: comprehensive treatments for amyotrophic lateral sclerosis in conjunction with growth factor delivery // Growth Factors. 2009. Vol. 27, №3. P. 133-140.]. При этом установлено, что комбинации нескольких нейротрофических факторов могут иметь более выраженный эффект на выживание нервных клеток. Клетки для клеточно-опосредованной генной терапии могут быть получены от больного (аутотрансплантация) или здорового человека (аллотрансплантация). Трансплантацию стволовых, прогениторных и дифференцированных клеток активно исследуют как способ доставки генов ростовых и нейротрофических факторов, сдерживающих гибель нейронов и стимулирующих нейрорегенерацию. Наиболее перспективны в этом смысле являются мононуклеарные клетки крови пуповины (МККП). Основанием для применения этих клеток является их пригодность как для алло-, так и для аутотрансплантации у человека, их низкая иммуногенность, доступность, простота получения и хранения [Liu Y. et al. An engineered transcription factor which activates VEGF-A enhances recovery after spinal cord injury. // Neurobiol. Dis. 2010. Vol. 37, №2. P. 384-393.].
Для лечения инсульта известны разные способы генной и клеточной терапии, эффективность которой доказана в многочисленных экспериментах на животных. Однако на сегодняшний день готовых, апробированных и эффективных препаратов, содержащих генетический материал, для сдерживания гибели нейронов при инсульте не существует.
Известные способы клеточной терапии инсульта
Способ клеточной терапии ишемического инсульта предполагает использование стволовых клеток различного генеза: индуцированные плюрипотентные клетки [Yuan М. et al. Effects of nucleus pulposus cell-derived acellular matrix on the differentiation of mesenchymal stem cells. // Biomaterials. 2013. Vol. 34, №16. P. 3948-3961.], нейрональные предшественники, полученные из ЭСК и крови пуповины [Zhu J. et al. Enhanced angiogenesis promoted by human umbilical mesenchymal stem cell transplantation in stroked mouse is Notch 1 signaling associated // Neuroscience. 2015. Vol. 290. P. 288-299.]. Положительный эффект у крыс с моделью ишемического инсульта установлен после внутривенной [Boltze J. et al. Determination of the Therapeutic Time Window for Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cell Transplantation following Experimental Stroke in Rats // Cell Transplant. 2012. Vol. 21, №6. P. 1199-1211.] или внутриартериальной [KarlupiaN. et al. Intraarterial transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells is more efficacious and safer compared with umbilical cord mesenchymal stromal cells in a rodent stroke model. // Stem Cell Res. Ther. 2014. Vol. 5, №2. P. 45.DOI 10.1186/scrt434] ксенотрансплантации МККП человека. В клинических испытаниях для трансплантации пациентам после инсульта преимущественно применяются аутологичные клетки, выделенные из красного костного мозга (мононуклеарные и мезенхимные стволовые клетки) или периферической крови (CD34+) [WangX.-L. et al. Umbilical cord blood cells regulate endogenous neural stem cell proliferation via hedgehog signaling in hypoxic ischemic neonatal rats. // Brain Res. 2013. Vol. 1518. P. 26-35.]. В России в НИИ Фундаментальной и клинической иммунологии были проведены клинические испытания клеточной терапии ишемического инсульта в восстановительном периоде с помощью интратекальной трансплантации фетальных клеток плода [Рабинович С.С. и др. Клеточная терапия мозгового инсульта // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. №1. Ст.25-28.] и аутологичных макрофагов [Chernykh E.R. et al. Safety and Therapeutic Potential of M2 Macrophages in Stroke Treatment // Cell Transplant. 2016. Vol. 25, №8. P. 1461-1471.]. Особое внимание заслуживает тот факт, что, для терапии, как инсульта, так и других ишемических и нейродегенративных заболеваний, возможно применение аллогенных МККП без подбора донора на гистосовместимость, что является облигатным обстоятельством для замещения клеток реципиента на клетки донора в онкогематологии.
Известные способы генной терапии инсульта
Несмотря на то, что для лечения инсульта проводятся клинические испытания способа с применением аутологичных или аллогенных клеток различных типов [Jeong Н. et al. Efficacy and Safety of Stem Cell Therapies for Patients with Stroke: a Systematic Review and Single Arm Meta-Analysis // Int. J. Stem Cells. 2014. Vol. 7, №2. P. 63-69.], при этом нет ни одного способа, в котором используется прямая или клеточно-опосредованная генная терапия.
Эффективность генной терапии при инсульте доказана в многочисленных экспериментах в моделях на животных. Для доставки генов в мозг преимущественно применяются инъекции вирусных векторов в желудочки мозга или в зону инфаркта. Первым Российским лекарственным препаратом, содержащим генетический материал, является «Неоваскулоген». Препарат разработан ОАО «Институт стволовых клеток человека» на основе плазмидного вектора (pCMV) и рекомбинантного гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165). Препарат предназначен для лечения ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза, продается в России с 2012 года. Также известен способ стимулирования регенерации спинного мозга путем введения в область повреждения плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2 (Патент РФ на изобретение №2459630). В настоящее время ООО «НТфарма» совместно с Научным центром неврологии проводят клинические испытания препарата «АдеВаск» для генной терапии бокового амиотрофического склероза [Zavalishin I.A. et al. Gene therapy of amyotrophic lateral sclerosis. // Bull. Exp. Biol. Med. 2008. Vol. 145, №4. P. 483-486.]. Препарат создан на основе двух аденовирусных векторов, несущих ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и ген ангиогенина (ANG). Способ предполагает введение комбинации аденовирусных векторов в скелетные мышцы пациента. Такой способ не позволяет проводить адресную доставку терапевтических генов в места нейродегенерации. Кроме того, инъекция аденовирусного вектора приведет к трансдукции разных других клеточных типов и в первую очередь мышечных, а повторные инъекции аденовирусного вектора могут вызывать сильную иммунологическую реакцию.
Список потенциальных молекул-нейропротекторов включает разные ростовые и нейротрофические факторы (BDNF, GDNF, VEGF), анти-апоптозные белки (Bcl-2, Bcl-XL), белки теплового шока (Hsp25, Hsp70), противовоспалительные молекулы (IL-1RA) [Rhim Т., Lee М. Targeted delivery of growth factors in ischemic stroke animal models // Expert Opin. DrugDeliv. 2016. Vol. 13, №5. P. 709-723.]. Для нас, из перечисленных, представляются наиболее перспективными сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и молекула адгезии нервных клеток (NCAM). Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) обладает специфической митогенной активность в отношении эндотелиальных клеток [Ferrara N. et al. Molecular and Biological Properties of the Vascular Endothelial Growth Factor Family of Proteins // Endocr. Rev. 1992. Vol. 13, №1. P. 18-32.]. Однако, кроме ангиогенного действия VEGF также проявляет свойства типичного нейротрофического фактора. Он поддерживает выживание чувствительных [SondellM., LundborgG., KanjeM. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system. // J. Neurosci. 1999. Vol. 19, №14. P. 5731-5740.] и двигательных [Islamov R.R. et al. Induction of VEGF and its Flt-1 receptor after sciatic nerve crush injury. // Neuroreport. 2004. Vol. 15, №13. P. 2117-2121.] нейронов, стимулирует пролиферацию нейральных стволовых клеток, астроцитов [Rosenstein J.M. et al. Patterns of brain angiogenesis after vascular endothelial growth factor administration in vitro and in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. Vol. 95, №12. P. 7086-7091.] и шванновских [Sondell M., Lundborg G., Kanje M. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system. // J. Neurosci. 1999. Vol. 19, №14. P. 5731-5740.] клеток. Глиальный нейротрофический фактор (GDNF) имеет выраженное нейропротекторное действие на нейроны головного и спинного мозга [Cheng Н., Wu J.-P., Tzeng S.-F. Neuroprotection of glial cell line-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords following contusive injury. // J. Neurosci. Res. 2002. Vol.69, №3. P. 397-405.], стимулирует рост нервных отростков [Iannotti С.et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. // Exp. Neurol. 2003. Vol. 183, №2. P. 379-393.]. Молекула адгезии нервных клеток NCAM экспрессируется на поверхности нейронов и клеток нейроглии. В ходе нейроонтогенеза и нейрорегенерации опосредуемые NCAM межклеточные взаимодействия обеспечивают выживание и миграцию нейронов, направленный рост нейритов и синаптогенез.
Известные способы клеточно-опосредованной генной терапии инсульта
Эффективность применения клеточной терапии для лечения инсульта в эксперименте с использованием нейрональных предшественников, полученных из эмбриональных стволовых [Mohamad О. et al. Vector-free and transgene-free human iPS cells differentiate into functional neurons and enhance functional recovery after ischemic stroke in mice. // PLoS One 2013. Vol. 8, №5. e64160. DOI 10.1371/journal.pone.0064160], индуцированных плюрипотентных клеток [Yuan M. et al. Effects of nucleus pulposus cell-derived acellular matrix on the differentiation of mesenchymal stem cells. // Biomaterials. 2013. Vol. 34, №16. P. 3948-3961.], мезенхимных стволовых клеток, выделенных из красного костного мозга [Не Q. et al. Transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) improves brain ischemia-induced pulmonary injury in rats associated to TNF-α expression // Behav. Brain Funct. 2016. Vol. 12, №9.DOI 10.1186/s 12993-016-0093-0] или крови пуповины [Zhu H. et al. Phase III Clinical Trial Assessing Safety and Efficacy of Umbilical Cord Blood Mononuclear Cell Transplant Therapy of Chronic Complete Spinal Cord Injury. // Cell Transplant. 2016. Vol. 25, №11. P. 1925-1943.] предполагает применение этих клеток, как носителей терапевтических генов для доставки в мозг. Так, в эксперименте мезенхимные стволовые клетки применялись для доставки в мозг BDNF [NomuraT. et al. Infusion of brain-derived neurotrophic factor gene-modified human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat. // Neuroscience. 2005. Vol. 136, №1. P. 161-169.], PIGF [Liu H. et al. Neuroprotection by P1GF gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischaemia. // Brain. 2006. Vol. 129, №10. P. 2734-2745.] и VEGF [Chen Y. et al. Regulation of naotai recipe on the expression of HIF-1α/VEGF signaling pathway in cerebral ischemia/reperfasion rats. // Chinese J. Integr. Tradit. West. Med. 2014. Vol. 34, №10. P. 1225-1230.]. Преимущество клеточно-опосредованной генной терапии над прямой обусловлено, тем, что кроме доставки терапевтического гена, клеточно-опосредованная терапия обеспечивает толерантность иммунной системы реципиента к вирусным антигенам, позволяет контролировать продукцию терапевтических молекул, а клеточные носители могут дифференцироваться в заданном направлении и быть источником биологически активных молекул, например, стимуляторов регенерации.
В способе [Suzuki К. et al. Highly efficient transient gene expression and gene targeting in primate embryonic stem cells with helper-dependent adenoviral vectors // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. Vol. 105, №37. P. 13781-13786.], чтобы избежать конфликт с вирусным носителем, доставку терапевтического гена осуществляли с помощью клеточного носителя. Терапевтический ген, кодирующий глиальный нейротрофический фактора роста (GDNF) для генетической модифиации мезенхимных стволовых клеток доставляется с помощью ретровирусного вектора. Существенным недостатком этого способа является интеграция вируса в геном трансплантируемых клеток, что может привести к мутациям и последующей опухолевой трансформацией генетически модифицированных клеток.
Известен способ получения генетически модифицированных клеток для лечения ишемических заболеваний сердца [Chen Н.К. et al. Combined cord blood stem cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction // Eur. J. Clin. Invest. 2005. Vol. 35, №11. P. 677-686.]. Авторами для стимулирования ангиогенеза предложен способ получения лекарственного препарат на основе стволовых клеток пуповинной крови и двух векторов, кодирующих VEGF и Angiopoietin-1 на базе аденоассоциированного вируса. Важным недостатком препарата является интеграция вирусного вектора в геном стволовых клеток и последующая непредсказуемая дифференцировка стволовых клеток или их опухолевая трансформация. Кроме того, для приготовления эффективной лекарственной формы препарата по этому способу требуется большое количество стволовых клеток, что также усложняет процедуру получения генно-клеточного препарата.
Для лечения нейродегенеративных заболеваний с помощью генетически модифицированных МККП известны разные способы. Так для лечения разных случаев нейродегенерации известен способ трансплантации МККП путем инъекции в периферическую кровь реципиента [Bachstetter A.D. et al. Peripheral injection of human umbilical cord blood stimulates neurogenesis in the aged rat brain. // Neurosci. 2008. Vol. 9, №22. DOI 10.1186/1471-2202-9-22].
Известен способ генетической модификации МККП с помощью двухкассетного плазмидного вектора, кодирующего два терапевтических гена. Этот способ позволяет получать генетически модифицированные клетки, сверхэкспрессирующие два ростовых фактора VEGF и GDNF [патент РФ №2431669, МПК C12N 15/00 опубл. 20.10.2011, БИ №29]. Известен также способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга с помощью генетически модифицированных МККП, трансдуцированных аденовирусом, несущим ген GDNF [патент РФ №2521225, МПК А61К 48/00, опубл. 27.06.2014, БИ №18]. В другой модификации этого способа двухкассетный плазмидный вектор содержит один терапевтический ген, кодирующий VEGF, и второй ген, кодирующий нейрональную молекулу адгезии L1 [Ризванов А.А. и др. Генно-клеточная терапия бокового амиотрофического склероза мононуклеарными клетками пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующими гены нейронной молекулы адгезии L1cam и сосудистого эндотелиального фактора роста vegf. // Гены и Клетки. 2010. Vol. 5, №4. Р. 55-65.]. Предполагается, что нейрональная молекула адгезии повысит выживаемость, адресную миграцию и, следовательно, продолжительность терапевтического воздействия трансплантированных клеток. Однако, указанные способы с использованием плазмидного вектора, имеют серьезный недостаток. Плазмидный вектор имеет очень короткий срок экспрессионной активности. Кроме того, в указанных способах не изучена клиническая эффективность вышеуказанных лекарственных препаратов в терапии нейродегенеративных заболеваний. Поэтому прототип характеризуется недостаточной продукцией терапевтических молекул и неизвестной эффективностью действия при его применении.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ лечения бокового амиотрофического склероза (БАС) путем введения МККП, одновременно трансдуцированных аденовирусами, несущими гены VEGF, GDNF и NCAM. Установлено, что такой способ генно-клеточной терапии сдерживает развитие симптомов и продлевает жизнь у мышей с моделью БАС [Islamov R.R. et al. Tandem delivery of multiple therapeutic genes using umbilical cord blood cells improves symptomatic outcomes in ALS // Mol. Neurobiol., 2017. 54:4756-4763 DOI 10.1007/s12035-016-0017-x.].
Целью заявленного изобретения является средство для генно-клеточной терапии инсульта головного мозга, сдерживающее гибель нейронов в зоне ишемической полутени при инсульте головного мозга.
Способы генной терапии для инсульта головного мозга и средство для сдерживания гибели нейронов в зоне ишемического инсульта полутени при инсульте головного мозга в настоящее время не известны.
Поставленная цель достигается применением генетического материала, состоящего из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы адгезии NCAM в качестве средства сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способом клеточно-опосредованной терапии ишемического инсульта средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга, в котором терапевтическую эффективную дозу средства сдерживания гибели нейронов непосредственно вводят путем интратекальной инъекции в течении 4-х часов после наступления ишемического инсульта головного мозга.
Таким образом, рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы, содержащие фрагменты ДНК, кодирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста изоформы 165 (VEGF 165), глиальный нейротрофический фактор GDNF и нейрональную молекулу адгезии 1 (англ. Neural cell adhesion molecule 1, NCAM1) используют для клеточно-опосредованной генной терапии. Комбинация терапевтических генов, кодирующих VEGF 165, GDNF и NCAM1 используется для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга. Генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины используются для доставки терапевтических генов в головной мозг.
Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется примером клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга для сдерживания гибели нейронов в очаге нейродегенерации с помощью генетически модифицированных клеток (МККП+Ad5-VEGF165+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM1) в модели ишемического инсульта головного мозга на крысах.
Пример клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта в моделях на крысах.
Первый этап. Получение генетически модифицированных МККП, сверхэкспрессирующих рекомбинантные гены VEGF165, GDNF и NCAM1 [препарат: МККП+Ad5-VEGF+GDNF+NCAM].
Аденовирусные векторы
Рекомбинантные репликативно-дефектные вирусные векторы созданы на основе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5) в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (г.Москва), как было описано ранее [Povysheva T.V. et al. Post-spinal cord injury astrocyte-mediated functional recovery in rats after intraspinal injection of the recombinant adenoviral vectors Ad5-VEGF and Ad5-ANG // J Neurosurg Spine. 2017. Vol. 27, №1. p. 105-115.]. В настоящем исследовании были использованы Ad5, несущие гены VEGF 165 (Ad5-VEGF), GDNF (Ad5-GDNF) и NCAM1 (Ad5-NCAM).
Мононуклеарные клетки крови пуповины
Заготовку крови пуповины производили по инструкции Банка стволовых клеток КГМУ. Выделение мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП) проводили в градиенте плотности фиколла по стандартной методике [Islamov R.R. et al. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuroprotective factor and a neur // Curr. GeneTher. 2015. Vol. 15, №3. P. 266-276.]. Сразу после выделения МККП высевали на 6 см культуральный планшет из расчета 2 млн. клеток/лунка и одновременно трансдуцировали тремя аденовирусными векторами в комбинации Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в равном соотношении каждого вектора Ad5-VEGF (1/3), Ad5-GDNF (1/3), Ad5-NCAM (1/3), где MOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) был равен 10. Через 12 часов культивирования генетически модифицированные клетки (МККП+Ad5-VEGF+GDNF+NCAM) собирали и растворяли в стерильном физиологическом растворе из расчета 2×106 клеток в 20 мкл. Полученные генетически модифицированные МККП являются лекарственным препаратом, содержащим генетический материал для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга. Второй этап. Способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга для сдерживания гибели нейронов в очаге нейродегенерации в моделях на крысах
Операции на животных
Эксперименты выполнены с разрешения Локального этического комитета Казанского государственного медицинского университета (протокол №10, 2017 г). Половозрелые самцы крыс линии Wistar (250-300 г) приобретены в питомнике лабораторных животных «Пущино» (Пущино, Россия). Содержание и уход за животными производились в соответствии с международными правилами и нормами. Животные находились по одному в клетке в стандартных лабораторных условиях с соблюдением 12-ти часового цикла день/ночь и свободным доступом к пище и воде. Ишемический инсульт головного мозга вызывали методом дистальной окклюзии средней мозговой артерии [Lemarchant S. et al. Anti-inflammatory effects of ADAMTS-4 in a mouse model of ischemic stroke // Glia. 2016. Vol. 64, №9. P. 1492-507. doi: 10.1002/glia.23017.]. Кратко, глубокую анестезию вызывали путем внутрибрюшинного введения Золетила 100 (Virbac Sante Animale, Франция) 3 мг/кг и Ксилы (Interchemiewerken «De Adelaar» B.V», Нидерланды) 4.8 мг/кг. Температуру тела крысы во время операции поддерживали в пределах 37-38°С при помощи терморегулирующей панели. На первом этапе оперативного вмешательства для снижения кровотока в виллизиевом круге справа через вертикальный разрез по серединной линии шеи препарировали общую сонную артерию, которую лигировали с помощью шелковой хирургической нити (3.0), кожную рану ушивали лавсаном. На втором этапе операции слева производили продольный разрез кожи от угла глаза до наружного отверстия слухового прохода. Височную кость освобождали от прилегающей одноименной мышцы и с помощью твердосплавного бора №2 высверливали трепанационное отверстие в височной кости диаметром 10 мм. Под операционным микроскопом иссекали твердую мозговую оболочку, окклюзию средней мозговой артерии проводили с помощью термокоагулятора. После чего трепанационное отверстие укрывали височной мышцей, кожу ушивали лавсаном. Все операционные швы обрабатывали 2% раствором йода.
Через четыре часа после моделирования инсульта животным, находящихся в наркозе, производили ламинэктомию на уровне L4-L5 и интратекально вводили генно-клеточный препарат МККП+Ad5-VEGF+ GDNF+NCAM (2×106 клеток в 20 мкл 0.9% NaCl) (n=7). Животным из контрольной группы вводили 20 мкл 0.9% NaCl (n=6).
13
Третий этап. Оценка эффективности клеточно-опосредованной генной терапии инсульта
Идентификация МККП человека в головном мозге крысы и оценка способности генетически модифицированных МККП человека синтезировать рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM после интратекальной инъекции крысам с моделью ишемического инсульта головного мозга. Для идентификации VEGF, GDNF и NCAM в МККП было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание фронтальных срезов головного мозга крыс с помощью антител в комбинациях: (1) против ядерного АГ человека (HuAN) и (2) против одного из терапевтических генов VEGF, GDNF, или NCAM. Через 3 недели после интратекальной инъекции в очаге инсульта были обнаружены HuAN-позитивные клетки, экспрессирующие VEGF, GDNF и NCAM. Таким образом, через 3 недели после интратекальной инъекции МККП выявляются в зоне «полутени», где они не только сохраняют жизнеспособность, но и активно синтезируют терапевтические молекулы. Этот факт дает основание полагать, что генетически модифицированные МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM за счет синергичной сверхпродукции терапевтических молекул VEGF и GDNF повышают жизнеспособность нервных клеток в очаге инсульта. Дополнительная трансдукция МККП аденовирусом, экспрессирующим NCAM, повышает выживаемость МККП после трансплантации и эффективность их адресной миграции в зону нейродегенерации.
Эффективность сдерживания гибели нейронов при моделировании ишемического инсульта у крысы на фоне клеточно-опосредованной генной терапии. При сравнении площадей инфаркта головного мозга через 3 недели после моделирования инсульта у животных контрольной и терапевтических групп, выявлены статистически значимые различия. Следует обратить внимание на тот факт, что в группе животных, получивших интратекальную инъекцию генетически модифицированных клеток (МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM) в течение 4 часов после моделирования ишемического инсульта головного мозга, медиана площади очага (1,41 [0,64];[2,38]) была на 53,3% ниже, чем в контрольной группе животных с инъекцией физиологического раствора (3,02 [2,48];[3,45]).
Площади очагов инсульта головного мозга через 3 недели после дистальной окклюзии средней мозговой артерии у животных, которым интратекально вводили физиологический раствор через 4 часа после моделирования инсульта (Физиологический раствор) и у животных, которым интратекально вводили генетически модифицированные клетки крови пуповины, экспрессирующих трансгены, кодирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональную молекулу адгезии (NCAM), через 4 часа после моделирования инсульта (МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM) представлены на Фигура 1 и Фигура 2.
Таким образом, Пример 1 свидетельствует что, генетически модифицированные МККП после интратекального введения с помощью церебро-спинальной жидкости (ЦСЖ) достигают головного мозга, где они мигрируют в область ишемической полутени и активно продуцируют рекомбинантные терапевтические молекулы, сдерживающие гибель нейронов. Эти результаты подтверждают возможность применения МККП как клеточных носителей терапевтических генов для клеточно-опосредованной генной терапии инсульта головного мозга.
Преимущество заявленного способа лечения ишемического инсульта с помощью интратекального введения генетически модифицированных клеток от известных в мире на дату подачи заявки заключается в использовании генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, одновременно трансдуцированных тремя рекомбинантными аденовирусами, один из которых экспрессирует нейрональную молекулу адгезии, а два других нейротрофические факторы - молекулы, сдерживающие гибель нейронов. Применение такой комбинации рекомбинантных аденовирусов для модификации МККП является перспективным. Экспрессия нейрональной молекулы адгезии в трансплантированных клетках повышает их адресную миграцию в область ишемической полутени и жизнеспособность клеток-продуцентов терапевтических молекул, что в свою очередь обеспечивает секрецию терапевтических молекул сразу после трансплантации генетически модифицированных клеток и более продолжительное, а значит и более эффективное действие терапевтических молекул на нервные клетки. Лекарственный препарат генетически модифицированных клеток по способу используют в лечебных целях по конкретному назначению, например - путем интратекального введения пациенту с ишемическим инсультом головного мозга.
Приведенный пример осуществления предлагаемого способа не ограничивает применение иных, по сравнению с приведенным в примере, генных и клеточных компонентов. Использовать заявленный генно-клеточный лекарственный препарат рекомендуется также как способ лечения нейродегенеративных заболеваний, например, болезни Хантигтона, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза, травматического повреждения спинного и головного мозга, так как заявленный препарат повышает жизнеспособность нервных клеток ЦНС.
Приведенный пример использования заявляемого изобретения показывают его полезность в практической медицине для лечения людей. Заявляемое изобретение способствует получению лекарственного препарата с лечебным свойством сдерживания гибели нервных клеток при ишемическом инсульте головного мозга.
Claims (1)
- Способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга, заключающийся в том, что терапевтическую эффективную дозу средства сдерживания гибели нейронов, представляющего собой генетический материал, состоящий из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы адгезии NCAM, непосредственно вводят путем интратекальной инъекции в течение 4-х часов после наступления ишемического инсульта головного мозга.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017142047A RU2676701C1 (ru) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017142047A RU2676701C1 (ru) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676701C1 true RU2676701C1 (ru) | 2019-01-10 |
Family
ID=64958577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017142047A RU2676701C1 (ru) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676701C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021160938A1 (en) | 2020-02-13 | 2021-08-19 | Herantis Pharma Oyj | Systemic administration of a pharmaceutical composition comprising cdnf or manf polypeptide for use in the treatment of reperfusion injury |
| RU2784233C1 (ru) * | 2022-02-03 | 2022-11-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2230060C2 (ru) * | 2000-01-20 | 2004-06-10 | Эйсай Ко., Лтд. | Соединения, фармацевтическая композиция, способ предотвращения гибели нервных клеток, способ профилактики |
-
2017
- 2017-12-01 RU RU2017142047A patent/RU2676701C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2230060C2 (ru) * | 2000-01-20 | 2004-06-10 | Эйсай Ко., Лтд. | Соединения, фармацевтическая композиция, способ предотвращения гибели нервных клеток, способ профилактики |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ISLAMOV R.R. et al. Tandem Delivery of Multiple Therapeutic Genes Using Umbilical Cord Blood Cells Improves Symptomatic Outcomes in ALS. Mol Neurobiol. 2017 Aug; 54(6): 4756-4763. Epub 2016 Aug 6. * |
| ИСЛАМОВ Р.Р. и др. Исследование экспрессии рекомбинантных терапевтических генов в мононуклеарных клетках крови пуповины, трансдуцированных тремя аденовирусными векторами, кодирующими нейротрофические факторы GDNF и VEGF и молекулу нейрональной адгезии NCAM. Гены & клетки. 2014; IX(3): 204-208. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021160938A1 (en) | 2020-02-13 | 2021-08-19 | Herantis Pharma Oyj | Systemic administration of a pharmaceutical composition comprising cdnf or manf polypeptide for use in the treatment of reperfusion injury |
| RU2784233C1 (ru) * | 2022-02-03 | 2022-11-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Фармацевтическая композиция и способ ее использования для терапии повреждений головного и спинного мозга |
| RU2808256C1 (ru) * | 2023-01-25 | 2023-11-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cunningham et al. | The therapeutic potential of the mesenchymal stem cell secretome in ischaemic stroke | |
| Forostyak et al. | The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications | |
| Han et al. | The role of peripheral monocytes and macrophages in ischemic stroke | |
| van Velthoven et al. | Regeneration of the ischemic brain by engineered stem cells: fuelling endogenous repair processes | |
| Pan et al. | Human amniotic fluid mesenchymal stem cells in combination with hyperbaric oxygen augment peripheral nerve regeneration | |
| Cheng et al. | Wharton’s jelly transplantation improves neurologic function in a rat model of traumatic brain injury | |
| Cui et al. | Genetic modification of mesenchymal stem cells in spinal cord injury repair strategies | |
| He et al. | Recent advances in treatment of retinitis pigmentosa | |
| R Zhao et al. | The role of stem cell factor and granulocyte-colony stimulating factor in treatment of stroke | |
| ES2389244T3 (es) | Aplicación terapéutica del SFC | |
| Liu et al. | Overexpression of vascular endothelial growth factor enhances the neuroprotective effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in ischemic stroke | |
| Jiang et al. | The anti-inflammation property of olfactory ensheathing cells in neural regeneration after spinal cord injury | |
| Ejma et al. | The role of stem cells in the therapy of stroke | |
| Ding et al. | Hematogenous macrophages: a new therapeutic target for spinal cord injury | |
| RU2676701C1 (ru) | Средство для сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта головного мозга средством сдерживания гибели нейронов при ишемическом инсульте головного мозга | |
| Yan et al. | Transplantation of endothelial progenitor cells: Summary and prospect | |
| KR20200038172A (ko) | 세포의 텔로미어를 신장시키는 방법 | |
| Yin et al. | Cell therapy for neuropathic pain | |
| Deng et al. | Modified CFBP-bFGF targeting to ischemic brain promoted the functional recovery of cerebral ischemia | |
| Moradi et al. | Regenerative Medicine and Angiogenesis; Focused on Cardiovascular Disease | |
| Su et al. | Efficacy of mesenchymal stem cells from human exfoliated deciduous teeth and their derivatives in inflammatory diseases therapy | |
| Des Rieux | Stem cells and their extracellular vesicles as natural and bioinspired carriers for the treatment of neurological disorders | |
| RU2459630C1 (ru) | Способ стимулирования нейрогенерации с помощью генетических конструкций | |
| JP4554940B2 (ja) | ヒト胎盤由来の間葉系細胞を含む医薬及び該細胞を用いたｖｅｇｆの製造方法 | |
| Emamhadi et al. | Evaluation of mesenchymal stem cells and granulocyte colony stimulating factor in treatment of complete spinal cord injury |