KR102184722B1

KR102184722B1 - 성체줄기세포 유래의 나노베시클 및 이의 표적 치료용 용도

Info

Publication number: KR102184722B1
Application number: KR1020190010380A
Authority: KR
Inventors: 김병수; 김한영; 한인보; 하만트 쿠머
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2020-12-01
Also published as: KR20200128501A; KR20190093141A; KR102223374B1; CN111670029A

Abstract

본원은 철나노입자를 함유하는 성체줄기세포 유래의 나노베시클 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 나노베시클은 세포를 철나노입자로 전처리하여 중간엽줄기세포 치료 효능을 극대화 하며, 세포를 나노사이즈 형태로 재구성함으로써 정맥주사를 용이하게 하고 자석 유도를 통한 질환 부위 타겟팅 효율을 증대시키는 효과를 가져왔다. 특히 본 발명은 세포 치료제로서의 중간엽줄기세포를 대체 할 수 있으며, 엑소좀 기반 치료제의 기능과 효율성을 높일 수 있기 때문에 새로운 바이오의약품으로서 다양한 질환에 적용 될 수 있다.

Description

성체줄기세포 유래의 나노베시클 및 이의 표적 치료용 용도 {Nanovesicles from Adult Stem Cells and its use for targeted therapy}

줄기세포 유래의 엑소좀 및 이를 이용한 표적 치료와 관련된 기술분야이다.

엑소좀은 세포에서 분비되는 50 ~ 200 nm 크기의 소포체로서, 모세포에서 유래된 유전적 또는 단백질 정보를 지니고 있어 다른 세포에 해당 정보를 전달할 수 있는 특징이 있다. 이에 중간엽줄기세포 유래 엑소좀은, 중간엽줄기세포의 치료 효능을 유사하게 지니고 있기 때문에 세포-프리 제생의학 분야에서 치료제로서의 가능성을 제시하였다.

대한민국 공개특허공보 제2018-0003322호 (2018년 1월 9일 공개)는 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 및 제조방법에 관한 것으로, 성체줄기세포를 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시킨 성체줄기세포의 여과물에 포함된 나노 크기의 베지클을 개시한다.

대한민국 공개특허공보 제 10-2017-0010956 (2017년 02월 02일 공개)는 줄기세포 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

하지만, 생체 기관에 대한 표적능이 없고, 전신 투여된 엑소좀은 충분한 치료효과를 발휘하지 못하는 문제점으로 사용이 매우 제한적이었다.

또한 자연적으로 분비되는 엑소좀의 특성상, 극소량이 분비되기 때문에 (중간엽줄기세포 기준 하루동안 10⁶개의 세포에서 1 ~ 4 마이크로그램의 엑소좀이 분비됨) 엑소좀을 치료제로 쓰기에는 공급 차원에서 한계점이 있었다. 또한, 대부분의 연구 또는 발명은 엑소좀을 정맥주사제로 사용하기 보다는, 치료가 필요한 기관에의 표적 효율을 높이기 위해, 대부분 직접 질환 부위에 주사하는 방법을 사용하고 있으나, 이는 침습적이고 안전성이 떨어지는 문제점이 있다.

따라서 인공 엑소좀으로서 나노베시클을 높은 수득률로 합성하고, 치료가 필요한 기관으로의 표적 효율이 생산된 나노베시클의 생산기술이 요구된다.

자연적으로 분비되는 엑소좀의 특성상, 극소량이 분비되기 때문에 (중간엽줄기세포 기준 10⁶ 세포에서 1 ~ 4 마이크로그램의 엑소좀이 하루동안 분비됨) 엑소좀을 치료제로 쓰기에는 공급 차원에서 한계점이 있다. 또한, 대부분의 연구 또는 발명은 엑소좀을 정맥주사제로 사용하기 보다는, 직접 질환 부위에 주사하는 방법을 대부분 사용하고 있어 침습적이고 안전성이 떨어진다. 일반적으로 직접 주사하는 이유는 엑소좀을 정맥주사하면 해당 질환 부위에 타겟팅 효율이 낮기 때문이다. 이에 따라 본 발명은 인공 엑소좀, 즉 나노베지클을 높은 수득률로 합성하고 철나노입자를 결합시킴으로써 타겟팅 효율 또한 자석 유도에 따른 개선된 효과를 보인다.

엑소좀은 세포에서 분비되는 50 ~ 200 nm 크기의 소포체로서, 모세포에서 유래된 유전적 또는 단백질 정보를 지니고 있어 다른 세포에 해당 정보를 전달한다. 이에 따라 중간엽줄기세포 유래 엑소좀은, 중간엽줄기세포의 치료 효능을 유사하게 지니고 있기 때문에 현재 다양한 질환에 중간엽줄기세포의 대체 치료제로서 널리 쓰이고 있다. 본 발명은 중간엽줄기세포 유래 인공 엑소좀, 즉 철-나노베지클을 합성하여 정맥 주사 후 타겟팅 효능과 치료 효과를 증진함으로써, 척수 손상 기능 회복을 촉진시키는 것에 목표를 두고 개발되었다. 해당 기술은 세포 치료제로서의 중간엽줄기세포를 대체 할 수 있으며, 엑소좀 기반 치료제의 기능과 효율성을 높일 수 있기 때문에 새로운 바이오의약품으로서 다양한 질환에 적용 될 수 있다.

한 양태에서 본원은 철나노입자를 그 내부에 포함하는 성체줄기세포 유래의 철나노베시클을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클은 나노베시클의 투여가 필요한 대상체, 예를 들면 포유류에 투여, 특히 본원에 따른 나노베시클의 특징을 고려하면 정맥 투여되고, 상기 투여 후, 상기 대상체의 목적하는 기관 또는 조직에 적절한 자성을 적용하여 상기 투여된 나노베시클을 상기 기관 또는 조직에 표적화하는 단계를 통해 표적화될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클은 중간엽줄기세포로부터 제조된다.

일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클은 나노베시클 1μg 당 약 17ng의 고함량의 철나노입자를 포함한다.

일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클에 포함되는 철나노입자는 직경이 약 10nm 내지 약 15nm이고, 상기 나노베시클은 직경이 약 100nm 내지 약 150nm이나, 이로 한정하는 것은 아니다.
일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클은 중간엽 줄기세포(hMSC)에 철 나노입자를 처리하는 단계; 상기 철 나노입자가 처리된 중간엽 줄기세포(hMSC)를 배양하여 줄기세포 유래 소포체 내에 철 나노입자를 포함시키는 단계; 상기 철 나노입자가 포함된 줄기세포 유래 소포체를 공극의 크기가 상이한 막 필터에 2 내지 6회 압출시켜 철-나노베지클을 성형하는 단계; 상기 성형된 철-나노베지클을 원심분리 및 자성유도를 실시하여 철-나노베지클을 분리하는 단계를 포함하여 제조된다.

삭제

일 구현예에서 상기 전처리 단계에서는 약 1x10⁶개의 세포는 부착배양되며, 약 40μg/mL의 농도로 약 16시간 동안 처리된다.

일 구현예에서 막을 통한 압출은 약 10 마이크로미터, 5 마이크로미터, 1 마이크로미터 및 약 400나노미터 공극의 막필터에 순차적으로 압출되고, 그 결과 150nm의 나노베시클이 수득된다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 나노베시클의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 성체줄기세포를 제공하는 단계; 상기 성체줄기세포를 철나노입자의 존재 중에서 배양하여 전처리하는 단계; 및 상기 전처리된 줄기세포를 공극의 크기가 각각 10마이크로미터 이하인 최소 4 종류의 상이한 공극크기를 갖는 막필터를 이용하여 공극의 크기가 감소하는 순으로 순차적으로 압출하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법의 상기 전처리 단계에서는 약 1x10⁶개의 세포는 부착배양되며, 약 40μg/mL의 농도로 약 16시간 동안 처리된다.

본원에 따른 방법에서 성체줄기세포는 중간엽줄기세포로부터 제조될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 방법에 따라 제조된 철나노입자 함유 나노베시클을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 철나노입자 함유 나노베시클을 포함하는 척수손상 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 철나노입자 함유 나노베시클을 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 철나노입자 함유 나노베시클을 포함하는 항염증 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 철나노입자 함유 나노베시클을 포함하는 뇌졸중 또는 심근경색 치료용을 제공한다.

일 구현예에서 상기 각 약학 조성물은 본원에 따른 상기 각 조성물의 투여가 필요한 대상체 예를 들면 포유류에 정맥 투여되고, 상기 투여 후, 상기 대상체의 목적하는 기관 또는 조직에 적절한 자성을 적용하여 상기 투여된 조성물을 상기 기관 또는 조직에 표적화하는 방식으로 투여된다.

본원에 따른 철-나노베시클은 철나노입자를 나노베시클의 내부에 포함을 해서, 철나노입자가 안정적 유지되고, 제조과정에 나노베시클을 이루는 세포막 성분의 손상이 없어서 투여시 치료효과 및 부작용이 적으며, 표적화가 가능한 장점이 있다. 기존 철나노입자가 엑소좀의 외부에 부착된 것과 비교하여 세포막의 성분의 손상이 적다. 또한 기존 안정적 세포주(stable cell line) (대량생산용 동물 세포주)에서, 또는 특별한 처리 없이 줄기세포에서 그대로 자연적으로 분비된 엑소좀을 낮은 수득률로 분리하였다. 반면에 본 발명은 세포를 철나노입자로 전처리하여 중간엽줄기세포 치료 효능을 극대화 하며, 세포를 나노사이즈 형태로 재구성함으로써 정맥주사를 용이하게 하고 자석 유도를 통한 질환 부위 타겟팅 효율을 증대시키는 효과를 가져왔다. 특히 본 발명은 세포 치료제로서의 중간엽줄기세포를 대체 할 수 있으며, 엑소좀 기반 치료제의 기능과 효율성을 높일 수 있기 때문에 새로운 바이오의약품으로서 다양한 질환에 적용 될 수 있다.

도 1은 본원에 따른 철-나노베지클의 합성 및 손상 척수 부위 타겟팅과 치료 결과를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본원에 따른 철-나노베지클의 손상된 척수 치료 기전을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원에 사용된 철나노입자와 중간엽줄기세포에 처리된 철나노입자의 투과전자현미경(TEM) 관찰 결과이다.
도 4는 본원에 사용된 철나노입자의 세포 독성 테스트 겨과와 중간엽줄기세포(hMSC)의 업테이크(uptake) 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본원에 따른 철나노입자를 세포에 처리 후 시간에 따른 성장인자 mRNA 발현 증가를 나타낸 결과이다.
도 6은 본원에 따른 철나노입자를 세포에 처리 후 성장인자 단백질 발현 증가 결과와 그 기전을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 7은 본원에 따른 철-나노베지클(NV-IONP) 합성과정에 단백질과 철의 순도를 나타낸 결과이다.
도 8은 본원에 따른 철-나노베지클(NV-IONP)과 나노베지클(NV)의 형태를 현미경으로 관찰한 결과 및 철나노입자를 정량한 결과이다.
도 9는 본원에 따른 철-나노베지클(NV-IONP) 및 나노베지클(NV)의 사이즈와 자성을 평가한 결과이다.
도 10은 본원에 따른 (좌) NV와 NV-IONP의 공초점 현미경 관찰 (우) NV와 NV-IONP가 처리된 대식세포의 공초점 현미경 관찰 결과이다.
도 11은 본원에 따른 NV와 NV-IONP 내부의 성장인자 mRNA와 단백질 양을 정량한 결과이다.
도 12는 본원에 따른 혈관내피세포(HUVEC)에 NV와 NV-IONP 처리 후 혈관신생을 평가한 결과이다.
도 13은 본원에 따른 NV와 NV-IONP가 처리된 혈관내피세포(HUVEC)의 증식과 이동 능력을 분석한 결과이다.
도 14는 본원에 따른 NV와 NV-IONP가 처리된 혈관내피세포(HUVEC)의 세포 신호 전달 체계 분석한 결과이다.
도 15는 본원에 따른 NV와 NV-IONP의 PC12 신경 세포 사멸 억제 효과를 나타낸다.
도 16은 본원에 따른 NV와 NV-IONP의 성상세포(astrocytes) 성장인자 분비 촉진 결과를 나타낸다.
도 17은 본원에 따른 NV와 NV-IONP의 대식세포 표현형 치환 효과(M1에서 M2)를 나타낸다.
도 18은 중간엽줄기세포와 본원에 따른 나노베지클의 정맥 주사 후의 장기 분포도와 척수 타겟팅 평가한 결과이다.
도 19는 중간엽줄기세포와 본원에 따른 나노베지클의 정맥 주사 후의 장기 분포도와 척수 타겟팅 평가(정량)한 결과이다.
도 20은 중간엽줄기세포와 본원에 따른 나노베지클의 정맥 주사 후의 척수 조직 관찰(좌: 나노베지클 관찰, 우: 철-나노입자 관찰)한 결과이다.
도 21은 척수 손상 모델 마우스에 본원에 따른 철-나노베지클의 정맥 주사 후 척수 조직에서의 성장인자 발현을 나타낸다.
도 22는 척수 손상 모델 마우스에 본원에 따른 철-나노베지클 주사 후 신생혈관 생성을 관찰한 결과이다.
도 23은 손상 척수 조직의 대식세포 타입(M1 대 M2) 관찰한 결과이다.
도 24는 본원에 따른 철-나노베지클 주사 후 손상 척수 조직의 염증 사이토카인 분비(좌: IHC, 우: western blot)를 분석한 결과이다.
도 25는 본원에 따른 철-나노베지클 주사 후 손상 척수 조직의 신경과 성상세포 분포를 관찰한 결과이다.
도 26은 본원에 따른 철-나노베지클 주사 후 손상 척수 조직의 섬유화 진행과 세포 사멸을 관찰한 결과이다.
도 27은 본원에 따른 철-나노베지클의 척수 조직 보호 효과와 그에 따른 척수 기능 회복을 평가한 결과이다.
도 28은 본원에 따른 철-나노베지클을 주사 후에 척수로 표적화하는 사진을 나타낸다.

종래 엑소좀 기술은 대부분 임상에 사용할 수 없는 안정적 세포주(stable cell line) (대량생산용 동물 세포주)에서, 또는 특별한 처리 없이 줄기세포에서 그대로 자연적으로 분비된 엑소좀을 낮은 수득률로 분리하였다. 반면에 본 발명은 세포를 철나노입자로 전처리한 결과 중간엽줄기세포 치료 효능을 극대화 할 수 있었고, 나노사이즈 형태로 재구성함으로써 정맥주사를 용이하게 하고 자석 유도를 통한 질환 부위 타겟팅 효율을 증대시키는 효과를 가져왔다. 특히 본 발명은 세포 치료제로서의 중간엽줄기세포를 대체 할 수 있으며, 엑소좀 기반 치료제의 기능과 효율성을 높일 수 있기 때문에 새로운 바이오의약품으로서 다양한 질환에 적용 될 수 있다.

이에 한 양태에서 본원은 철나노입자를 그 내부에 포함하는 성체줄기세포 유래의 철-나노베시클(nanovesicle)에 관한 것이다.

본원에 따른 나노베시클은 나노베시클의 투여가 필요한 대상체, 예를 들면 포유류에 투여, 특히 본원에 따른 나노베시클의 특징을 고려하면 정맥 투여되고, 상기 투여 후, 상기 대상체의 목적하는 기관 또는 조직에 적절한 자성을 적용하여 상기 투여된 철-나노베시클을 상기 기관 또는 조직에 표적화하는 단계를 통해 표적화될 수 있다.

본원에서 나노베시클은 나노 크기의 소낭을 의미하는 것으로, 세포내에서 자연적으로 만들어지는 나노크기의 엑소좀과 특징 및 형태가 유사한 일종의 인공 엑소좀 또는 엑소좀 모사 소포체이다.

엑소좀은 세포내에서 자연적으로 만들어지는 나노크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병진행등에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 다양한 세포로부터 당업계에 공지된 기술을 이용하여 분리될 수 있으나, 그 양이 매우 제한적이고, 효능에도 한계가 있었다.

본원에 따른 나노베시클은 성체줄기세포, 특히 중간엽줄기세포 유래이다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 진피 또는 골막 등에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 상기 성체줄기 세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포일 수 있다.

일 구현예에서는 중간엽줄기세포가 유래이다. 중간엽줄기세포는 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하지만, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해 분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다. 이러한 중간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타낸다. 상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modifA ation of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., VirProcy 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mo, h's MB752/1 (Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본원에 따른 나노베시클은 철나노입자를 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서는 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 제조함에 있어서, 상기 세포를 철-나노입자로 전처리하였다.

본원에서 용어 “나노입자” 또는 “나노~”란 1000nm 미만, 예를 들면 약 100nm, 약 50nm, 약 10nm, 약 5nm의 규격(dimension)을 갖는 입자, 물질을 의미하며, 나노 규격의 물질은 원래의 물성과 다른 물성을 나타낸다.

일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클에 포함하되는 철나노입자의 직경은 약 10 내지 15 나노미터, 특히 12 나노미터이다. 상기 크기의 철나노입자는 줄기세포에 처리시에도 뭉침이 적어, 세포내 유입이 용이하며, 또한 본원의 일 구현예에서 제조된 나노베시클, 특히 약 100 내지 200nm 직경의 나노베시클에 최대의 양으로 들어갈 수 있는 크기이다.

일 구현예에서 본원에 따른 나노베시클은 베시클의 내부에 위치해 있다. 일구현예에서 본원에 따른 1μg의 철-나노베시클(NV-IONP) 내부에 약 17ng의 철나노입자가 존재한다.

본원에 따른 철-나노베시클은 직경이 약 100 내지 약 200nm, 특히 약 150nm로, 이로 인해 정맥주사가 용이하다.

본원에 따른 철나노베시클(NV-IONP)은 이하 기술하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 철-나노입자를 포함하는 나노베시클의 제조방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 방법은 중간엽줄기세포와 같은 성체줄기세포를 제공하는 단계; 상기 성체줄기세포를 철나노입자로 전처리하는 단계; 및 상기 세포를 공극이 약 10마이크로미터 이하인, 상이한 공극의 막필터로 순차적으로 압출하여, 철나노베시클을 제조하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법에서 성체줄기세포는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 일구현예에서는 중간엽줄기세포가 사용된다.

본원에 따른 방법에서 상기 전처리 단계에서 성체줄기세포는 적절한 철을 포함하는 배양배지에서 배양된다. 일 구현예에서는 약 1 x 10⁶개의 성체줄기세포에 약 10 내지 80μg/mL의 농도의 철나노입자로 처리된다. 10, 20, 40, 50, 60, 70 또는 80μg/mL의 농도로 처리되나, 그 사이의 범위를 제외하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 세포에 독성이 없으면서도 엑소좀에 철이 다량 포함을 가능하게 하는 40μg/mL의 농도로 처리된다. 본원에 따른 일 구현예에서는 철은 상기 농도에서 약 16시간 동안 처리되나, 이로 제한하는 것은 아니고, 세포독성을 최소화하면서도 엑소좀내 포함량을 많게 하는 선에서 결정될 수 있다.

본원에 따른 방법에서 상기 압출단계에서, 상기 성체 줄기세포는 공극의 크기가 10 마이크로미터 이하, 특히 10 마이크론, 5 마이크론, 1 마이크론, 및 400 나노미터 크기의 4개의 막필터로 순차적으로 압출된다. 일 구현예에서는 상기와 같은 순차적 압출을 통해 나노베시클의 수득율을 향상시키고, 약 150nm의 나노베시클의 수득이 가능하다. 최종적으로, 400 나노미터 압출 이후 최종적으로 0.22μm 시린지 필터(압출 아님)로 거른 후 사용된다.

본원의 방법은 특히, 기존의 방법과 일 구현예에서 다음과 같은 특징을 갖는다. 즉, 기존의 방법은 세포를 압출한 후에 철나노입자를 인위적으로 나노베시클 안에 주입하기 위해서는 나노베시클의 인지질이중막이 방해요소로 작용하기 때문에 전기천공(electroporation)의 방법으로 막을 열어 주입하나 상기 방법은 고가의 장비가 필요하고 또한 엑소좀 안의 단백질과 mRNA들이 유출될 가능성이 높다. 하지만 본원에 따른 방법은 특히 철나노입자를 살아있는 세포에 먼저 처리한 결과 세포대사를 통해 성장인자가 증가하고, 증가된 성장인자가 후에 압출된 나노베시클안에 전달된다. 기존의 방법 즉 베시클의 제조 후에 베시클 안에 철나노입자를 넣게 되면 성장인자는 당연히 증가하지 않고, 오히려 열린 막으로 유출되어, 나노베시클의 효과가 저하되는 문제점이 있다.

이에 상기와 같이 제조된 본원에 따른 철-나노베시클은 인비트로에서 혈관내피세포(Endothelial cells)의 혈관 생성을 촉진하고, 성상세포(Astrocytes)에서 분비되는 성장인자의 분비를 촉진. 또한, 신경세포(Neurons)의 세포사멸을 억제하며 대식세포의 표현형을 M1(염증성) 타입에서 M2(항염증성) 타입으로의 변화를 유도하는 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

또한 본원에 따른 철-나노베시클은 척수 손상 질환 모델에서 정맥 주사한 후 손상 부위 근처의 자석 유도를 통해 NV-IONP 타겟팅을 최대화 하고, 치료 효능을 증진시키는 것으로 나타났다.

이에 본원은 다른 양태에서 본원은 상기와 같은 효과가 효과적으로 적용될 수 있는 다양한 질환의 치료에 사용되는 본원에 따른 철-나노베시클을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본원에 따른 약학조성물은 성체줄기세포, 특히 중간엽줄기세포가 사용될 수 있는 질환의 치료라면 특히 제한되지 않는다.

일 구현예에서 본원에 따른 철-나노베시클은 혈관내피세포(Endothelial cells)의 혈관 생성을 촉진하고, 성상세포(Astrocytes)에서 분비되는 성장인자의 분비를 촉진. 또한, 신경세포(Neurons)의 세포사멸을 억제하며 대식세포의 표현형을 M1(염증성) 타입에서 M2(항염증성) 타입으로의 변화를 유도한 바, 이와 같은 변화가 필요한 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다.

일 구현예에서 질환은 척수손상 치료제이다.

다른 구현예에서는 혈관신생 효과, 염증 억제가 필요한 뇌졸중 또는 심근경색의 치료에 사용될 수 있다.

다른 구현예에서는 본원에 따른 약학 조성물은 항염증 조성물이다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 약학 조성물은 혈관신생 촉직용 조성물이다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 약학 조성물은 신경세포사멸 억제용 또는 상기 억제를 통한 척수신경 손상 치료용 조성물이다.

본원에 따른 상기 각 약학 조성물은 본원에 따른 상기 각 조성물의 투여가 필요한 대상체 예를 들면 인간, 원숭이, 및 마우스 등을 포함하는 포유류에 투여되고, 특히 정맥투여되고, 상기 투여 후, 상기 대상체의 목적하는 기관 또는 조직에 적절한 자성을 적용하여 상기 투여된 조성물을 상기 기관 또는 조직에 표적화하는 방식으로 투여된다. 적절한 자성이란 투여된 조성물이 충분한 양으로 목적하는 기관 예를 들면 척수와 같은 기관으로 유도할 수 있는 자성으로, 본원의 실시예의 기재 및 당업자의 지식을 근거로 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

본원에서 사용된 용어 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 본 용어가 적용되는 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본원에 따른 조성물은 치료적으로 유효한 양의 철나노베시클을 포함한다. 치료적으로 유효한 양이란 신경변성 질환의 하나 이상의 증상을 경감, 호전시키거나 이롭게 변경하는데 필요한 양을 의미한다.

본원의 조성물은 상기 언급한 본원에 따른 철나노베시클을 유효성분으로 포함하며, 그 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.

또한 본원에 따른 철나노베시클 또는 조성물은 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본원에서 사용된 담체란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미한다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 또는 만노스를 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.

필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 철나노베시클 또는 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나, 특히 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 경우 비경구 투여. 특히 정맥 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 철-나노베시클의 제조

150mm 디쉬에 배양되는 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)(Lonza)(1 x 10⁶)에 합성한 철나노입자(IONP, 약 12 나노미터 크기, 서울대학교 화학생물공학부의 현택환 교수님 연구실 합성)를 40μg/mL의 농도로 16시간 동안 처리하고 PBS로 세척하였다. 총 10개의 150mm 디쉬 분량의 세포를 사용하였다. 상기 사용된 철나노입자는 투과전자현미경을 통해 사이즈와 형태를 관찰한 결과 약 12nm의 원형 형태를 나타냈다 (도 3의 왼편 사진 참조). 또한 상기 철나노입자로 처리된 중간엽줄기세포를 고정하고 투과전자현미경을 통해 관찰한 결과, 세포 내 엔도좀(endosome)에 다량의 철나노입자가 관찰되었다(도 3의 중간 및 오른편 사진 참조).

이어, 상기 철나노입자를 함유한 중간엽줄기세포(hMSC-IONP)를 2 x 10⁶ cells/mL 농도로 PBS에 분산 후 포어가 10 마이크론, 5 마이크론, 1 마이크론, 및 400 나노미터 크기의 막필터를 순차적으로 압출(extrusion)하여 약 150 나노미터 크기의 나노베시클(NV)을 생성하였다.

상기 철-나노베지클(NV-IONP) 합성과정에 단백질과 철의 순도를 조사하였다. 상기 hMSC-IONP를 압출한 용액을 밀도 기울기 원심분리(density-gradient centrifugation)를 수행한 후, 생성된 층들을 각각 수합해 단백질 및 철이온을 각각 정량한 결과, 분획 2에 NV-IONP가 위치해있고 분획 4에 나노베지클에 들어가지 못한 철나노입자가 분리됨이 관찰되었다. 이에 분획 2만을 분리하여 재 원심분리하고, 자석 유도를 통해 펠렛을 생성한 결과, 최종적으로 분획 6에 NV-IONP가 존재를 확인하여 철-나노베지클(NV-IONP) 만을 분리하였다 (도 7 참조).

철-나노베지클(NV-IONP)을 사용전까지 500 uL 씩 분주하여 -75℃에 보관하였다. 본원에 따른 철-나노베시클의 제조방법은 도 1에 도식적으로 나타냈다.

실시예 2. 본원의 나노베시클 제조에 사용된 철나노입자의 독성 평가

상기 실시예 1에 사용된 철나노입자의 독성 및 hMSC의 uptake를 측정하였다, 구체적으로 CCK-8 assay (Dojindo, Japan)를 제조사의 방법대로 사용하여, 세포독성을 분석한 결과 본원에 따른 철-나노입자는 중간엽줄기세포에서 40μg/mL의 농도까지 특별한 독성을 보이지 않는 것으로 나타났다 (도 4 왼편 그래프 참조, 중간엽줄기세포: hMSC, 철나노입자 처리된 중간엽줄기세포: hMSC-IONP).

나아가 본원에 따른 철-나노입자에 RITC(적색 형광체)를 결합시킨 후 중간엽줄기세포에에 처리한 후 형광현미경으로 분석한 결과 세포 내에 고른 분포를 나타냈다(도 4 오른편 사진, 중간엽줄기세포: hMSC, 철나노입자 처리된 중간엽줄기세포: hMSC-IONP).

실시예 3. 본원에서 제조된 철-나노베시클의 효능 분석 1

실시예 1에서와 같은 hMSC와 hMSC-IONP에서 각각 추출된 NV와 NV-IONP의 형태를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 NV-IONP 안에 철나노입자의 분포가 관찰되었다(도 8의 왼편 사진). 또한 유도 결합 플라즈마 질량분광법(ICP-MS)을 통해 각각의 나노베지클 내부의 철 이온을 정량한 결과 1μg의 NV-IONP 내부에 약 17ng의 고함량의 철나노입자가 존재하는 것을 확인하였다(도 8의 오른쪽 그래프). 기존의 방법은 세포를 압출한 후에 철나노입자를 인위적으로 나노베시클 안에 주입하기 위해서는 나노베시클의 인지질이중막이 방해요소로 작용하기 때문에 전기천공(electroporation)의 방법으로 막을 열어 주입하나 상기 방법은 고가의 장비가 필요하고 또한 엑소좀 안의 단백질과 mRNA들이 유출될 가능성이 높다. 나아가 본원에 따른 방법은 특히 철나노입자를 살아있는 세포에 먼저 처리한 결과 세포대사를 통해 성장인자가 증가하고, 증가된 성장인자가 후에 압출된 나노베시클안에 전달된다. 기존의 방법 즉 베시클의 제조 후에 베시클 안에 철나노입자를 넣게 되면 성장인자는 당연히 증가하지 않고, 오히려 열린 막으로 유출되어, 나노베시클의 효과가 저하되는 문제점이 있다.

또한 NV와 NV-IONP의 사이즈를 나노입자 추적 분석법(NTA)으로 확인한 결과 두 나노베지클 모두 약 평균 150nm의 크기를 갖는 것으로 나타났다(도 9 왼편 그래프 참조). 또한 네오디뮴 자석을 이용하여 시험관에 분산된 NV-IONP를 자석으로 유도한 결과, 일정 시간 뒤에 대부분의 NV-IONP가 네오디뮴 자석으로 끌려오는 것을 확인하였다 (도 9 오른편 사진 참조).

또한 RITC-철나노입자를 사용하여 NV-IONP를 합성하고, NV와 NV-IONP의 인지질막을 DiO(초록 형광체)로 염색한 후 공초점 현미경으로 관찰 결과 NV-IONP에서 철나노입자(red)와 NV(green)의 형광이 겹치는 것으로 나타났으며(도 10 왼쪽 사진 참조) 이는 NV-IONP에 철나노입자가 안정적인 상태로 나노베지클 내에 존재하는 것을 나타낸다.

또한 대식세포(Raw 264.7 세포, 출처는 한국세포주은행)에 NV와 NV-IONP를 처리하고 16시간 후에 공초점 현미경으로 관찰 결과 마찬가지로 적색과 초록색의 형광이 NV-IONP 실험군에서 겹치는 것으로 나타났으며, 이는 NV-IONP 내의 철나노입자가 세포 안으로 uptake 되는 과정에서 유출되지 않음을 나타낸다 (도 10 오른쪽 사진 참조).

실시예 4. 본원에서 제조된 철-나노베시클(NV-IONP)의 효능분석 2

본원에서 제조된 NV-IONP는 혈관내피세포(Endothelial cells)의 혈관 생성을 촉진하고, 성상세포(Astrocytes)에서 분비되는 성장인자의 분비를 촉진. 또한, 신경세포(Neurons)의 세포사멸을 억제하며 대식세포의 표현형을 M1 (염증성) 타입에서 M2 (항염증성) 타입으로의 변화를 유도하는 것으로 나타났다.

실시예 4-1. 고농도의 성장 인자 함유

실시예 1에서와 같이 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)에 철나노입자를 40μg/mL의 농도로 16시간 동안 처리한 다음 PBS로 세척하여 철나노입자를 제거한 후 세포를 24시간 및 48시간 배양한 후 세포에서 발현되는 성장인자의 mRNA 발현 수준을 정량 역전사중합효소연쇄반응(qRT-PCR) (장비: StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems))을 이용하여 분석하였다. 결과는 도 5에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 조사된 각 성장인자의 발현이 처리 후 배양 시간에 따라 증가한 것으로 나타났다. 또한 NV (hMSC 유래)와 NV-IONP (hMSC-IONP 유래) 내부의 성장인자 mRNA를 qRT-PCR로 분석한 결과, hMSC-IONP 에서 증가되었던 성장인자 mRNA들이 NV-IONP 내부로 유입되는 것으로 나타났다 (도 11 참조).

이어 단백질 수준에서의 발현 양상을 웨스턴블랏으로 수행하였다. 철나노입자 처리 후, PBS로 세척하여 제거한 후 세포를 48시간 배양한 후 단백질을 추출하여 도 6에 표시된 각 성장인자의 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있다. 도 5의 결과와 일치되게, 각 성장인자의 단백질 발현이 증가한 것으로 나타났다. 또한 NV와 NV-IONP 내부의 성장인자 단백질들의 양을 평가하기 위해 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 마찬가지로 NV-IONP 내부에 더 많은 성장인자 단백질들이 분포되는 것으로 나타났다 (도 11 참조).

또한 성장인자의 발현 증가 기전을 분석한 결과 철나노입자가 중간엽줄기세포 내 엔도좀의 낮은 pH에서 일부분 이온화되며, 이온화된 철이온들이 JNK / c-Jun 세포 신호 체계를 자극하여 성장인자의 분비가 촉진되는 것으로 나타났다 (도 6 참조).

실시예 4-2. 혈관신생 촉진 효과

NV-IONP 내부의 다량의 성장인자들이 혈관내피세포 HUVEC (Lonza)의 혈관신생을 촉진하는지 평가하였다. NV와 NV-IONP를 각각 40μg/mL 처리하였고, NV-IONP 내부의 철나노입자의 영향을 배제하기 위해 NV-IONP 40μg/mL 내부의 철나노입자 농도와 동일한 0.68μg/mL의 철나노입자를 다른 대조군으로 사용하였다. Control은 아무 것도 처리 안한 세포이다. 각각의 첨가물이 존재하는 환경에서 Matrigel이 코팅된 디쉬에 8시간 배양한 결과, NV-IONP가 처리된 HUVEC 세포에서 증대된 혈관신생이 관찰되었다. 정량 평가 결과 NV 처리에 비해 NV-IONP 처리시 관형성 숫자가 증가하는 것으로 나타났다 (도 12 참조). 이는 본원에 따른 NV-IONP가 혈관신생을 촉진함을 나타낸다.

이어 철나노입자 (0.68μg/mL), NV (40μg/mL), NV-IONP (40μg/mL)가 처리된 HUVEC 세포의 증식 속도(상기 언급된 CCK-8 assay로 NV, NV-IONP 처리 후 24, 48, 72시간 째에 분석)와 이동 능력을 하기 상처 회복 능력 테스트로 분석하였다. NV-IONP가 처리된 HUVEC 세포의 증식 속도가 가장 빨랐으며 72시간 후의 세포 양이 가장 많은 것으로 나타났다. 또한, 상처 회복 능력 테스트(NV, NV-IONP를 처리한 후 바닥의 세포를 파이펫 팁으로 일직선으로 상처를 낸 후 무혈청 세포 배양액 상에서 배양하여 증식을 억제한 상태로 일정 시간 간격으로 긁힌 일직선 상처가 얼마나 다시 메꾸어지는지를 현미경으로 관찰한 결과로 이동능력이 좋을수록 세포가 빈공간, 즉 상처쪽으로 이동하는 지를 분석)를 시행한 결과 NV-IONP가 처리된 HUVEC 세포의 이동 능력이 가장 활발한 것으로 나타났다 (도 13 참조). HUVEC은 혈관내피세포로, 혈관재생 angiogenesis를 동물실험이 아닌 세포실험으로 평가할 때 가장 많이 쓰이는 세포이다. 혈관재생 효과를 세포 in vitro에서 확인할 수 있는 효과인 상술한 바와 같은 본원의 우수한 1)관형성 2)증식속도 3)이동능력 (상처회복테스트) 효과는 실제 인비보에서 사용시 혈관이 손상된 척수에서 높은 혈관재생 효과를 나타내는 것이다.

이어 철나노입자 (0.68μg/mL), NV (40μg/mL), NV-IONP (40μg/mL)가 처리된 HUVEC 세포에서 혈관신생, 증식, 이동능력에 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 AKT/ERK 신호 전달 체계를 웨스턴블랏으로 분석하였다. 그 결과 도 14에 나타난 바와 같이 NV-IONP 처리된 HUVEC에서 인산화가 가장 많이 된 것으로 나타났다. 따라서, 본원에 따른 NV-IONP가 AKT/ERK 신호 전달 체계를 활성화 시킴으로써 HUVEC의 혈관 생성 효과를 나타내는 것으로 판단된다.

실시예 4-3. 신경세포 사멸 억제 효과

척수 손상 부위에서는 혈관 손상에 따른 저산소 환경과 외부 대식세포의 유입에 따른 염증이 발생기 때문에 척수 부위의 신경세포가 세포사멸(apoptosis) 단계로 진입함으로 인해 신경 전달 체계가 파괴된다. 따라서, NV와 NV-IONP가 성장인자를 전달함에 따라 신경 세포 사멸을 억제할 수 있는지 분석하였다.

IONP, NV, 및 NV-IONP (처리량: 철나노입자 (0.68μg/mL), NV (40μg/mL), NV-IONP (40μg/mL)를 PC 12 세포(Paragon Biotech)에 각각 16시간 처리한 후 제거하였고, 그 후 LPS(염증 유발)을 상기 세포에 처리(1ug/mL, 마찬가지로 24시간)하고, 저산소 조건(2% O₂)에 24시간 동안 배양하였다. 도 15에 기재되어 있다. 도 15에서 FDA(fluorescein diacetate)가 초록색으로 살아있는 세포, EB(ethidium bromide)는 적색으로 죽은 세포를 나타낸다. 도 15에 나타난 바와 같이 미처리된 세포에서는 약 50~60%의 세포 사멸이 관찰된 반면, NV-IONP가 처리된 세포에서는 세포 사멸 억제 효과를 관찰되었다. 이어 상기 세포에서 mRNA를 추출하여, 세포사멸 유발 인자인 Bax(Bcl2 Associated X)와 억제 인자(Bcl-2)의 mRNA를 정량 역전사 PCR(qRT-PCR)로 분석하였다. 도 15의 아래 패널에 나타난 바와 같이 NV-IONP가 유발 인자를 낮추고 억제 인자의 발현을 높이는 결과를 나타냈다.

이어 NV와 NV-IONP가 성장인자를 전달함에 따라 성상세포를 활성화시켜 성상세포에서 분비되는 성장인자의 양이 증가하는지 qRT-PCR과 ELISA를 통해 유전자와 실제 분비되는 단백질을 양을 정량하여 분석하였다.

실시예 4-4. 성상세포의 성장인자 분비 촉진

IONP, NV, 및 NV-IONP 각각을 철나노입자 (0.68μg/mL), NV (40μg/mL), NV-IONP (40μg/mL)의 농도로 rat cortex astrocyte (Lonza, primary cell)에 16시간 처리한 후 제거하고 그리고 48시간 후에 세포를 융해 또는 세포배양액을 분리하여 도 16에 기재된 각 인자에 대하여 qRT-PCR과 ELISA (키트 사용: R&D Systems의 Duo Set)를 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다. 결과는 도 16에 기재되어 있다. 그 결과, NV-IONP가 처리된 성상세포에서 성장인자 분비가 가장 많은 것으로 관찰되었다. 또한 성장인자의 일부인 BDNF(신경보호인자)의 분비량도 증가한 것으로 나타났다. 성상세포 astrocyte는 신경조직의 혈관내피세포나 신경세포들을 물리적으로 지지하고 생화학적으로 도와주는 역할을 한다. 신경조직에 물리적인 손상이나 경색이 일어났을 경우, 성상세포는 성장인자 또는 신경보호인자를 분비하여 손상된 혈관이나 신경조직을 회복한다. 따라서 본원에 따른 NV-IONP에 의해 성장인자와 신경보호인자의 분비가 촉진되고, 이는 척수손상 모델에서 혈관재생과 신경조직를 효과적으로 보호할 수 있음을 나타낸다.

실시예 4-5. 대식세포의 표현형 치환 효능

Raw 264.7 세포(마우스 대식세포 세포주, 한국세포주은행)에 LPS를 200 ng/mL로 처리하여 M1으로 활성화시킨 후, IONP, NV, 및 NV-IONP 각각 (처리 농도: 철나노입자 (0.68μg/mL), NV (40μg/mL), NV-IONP (40μg/mL))을 상기 농도로 16시간 처리한 후 제거. 그리고 48시간 후에 세포를 융해 또는 세포배양액을 분리하여 도 17에 기재된 단인자에 대하여 qRT-PCR과 ELISA(R&D Systems의 Duo Set)를 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다. 결과는 도 17에 기재되어 있다. 그 결과 NV-IONP가 처리된 대식세포에서 M1 마커(TNF-α와 IL-6)가 줄어들었고 M2 마커(Arg-1, CD206, IL-10, VEGF) 등등이 증가한 것으로 관찰되었다.

척수손상이 일어났을 경우, 당연하게도 심한 염증이 동반된다. 상기 실험은 in vitro에서 대식세포주인 Raw264.7을 LPS로 염증성 M1으로 유도한 후 NV, NV-IONP 처리를 통해 항염증성 M2 타입으로 유도여부를 확인하기 위한 것이다. 손상된 척수부위에는 대식세포가 염증성 M1 타입으로 주로 존재하는데, 상기 실험 결과는 나노베시클이 손상된 척수의 세포를 항염증성 M2타입으로 유도하여 염증을 억제하는데 효과를 나타내는 것이다.

실시예 5. 척수 손상 질환 모델에서 표적 및 치료 효능 증진 효과

본원에서 제조된 NV-IONP를 척수 손상 질환 모델에 정맥 주사한 후 손상 부위 근처의 자석 유도를 통해 NV-IONP 타겟팅을 최대화 하고, 치료 효능을 증진시키는 것으로 확인하였다.

실시예 5-1. 척수압박 동물모델의 제조

7-10주령 25-30g C57BLC 마우스(오리엔트바이오)는 차의과학대학 동물윤리위원회 규정 범위내에서 사육을 실시하였다. 마취는 C57BLC 마우스를 졸레틸(50mg/kg, Virbac Laboratories, France)과 럼푼(10mg/kg, Bayer, Korea)을 1:1 비율로 g 당 1ul 주사하여 마취하였다. 안락사가 필요한 경우, 동물은 가이드라인 (GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS Eighth Edition)을 참조하여 안락사 시켰다.

척수 손상을 유발하기 위한 장치는 추에 의한 압박을 응용한 것으로 20g의 무게의 추와 지지봉이 구성되어 있어 흉추 10번 부위에 후궁 절제술을 시행하여 후궁판(lamina)을 제거한 후 직경 1mm 인 추를 1분 동안 척수를 압박하여 척수손상을 유발하였다. 이어 체중을 측정하고 제모기를 사용하여 마우스의 흉추 10번 부위를 중심으로 반경 4cm 정도의 원형으로 제모하였다. 제모 부위를 70% 알코올로 소독하였다. 수술부위를 포비돈과 70% 알코올로 소독하였다. 흉추 10번(T10) 위치를 확인한 후 수술부위만 노출된 멸균 수술포로 덮은 후 외피를 수술용 칼을 이용하여 2cm 정도 절개하였다. 외피 절개 후 노출되는 근육층도 수술용 칼을 이용하여 제 10흉추 부위를 절개하였다. 제 10흉추 극돌기(spinous process)가 노출이 되면 극돌기를 제거하고 후궁판을 경막(dura meter)의 손상이 없이 후방의 척수를 노출시켰다. 이후 추(20g)를 이용하여 1분간 척수를 압박하였다.

실시예 5-2. NV-IONP를 이용한 타겟팅을 최대화 및 치료 효능 확인 1

본원에서 제조된 NV-IONP를 척수 손상 질환 모델에 정맥 주사한 후 손상 부위 근처의 자석 유도를 통해 NV-IONP 타겟팅을 최대화 하고, 치료 효능을 증진시킴을 확인하였다.

구체적으로 hMSC-IONP(철나노입자 처리된 중간엽줄기세포, 철나노입자 40ug/mL 처리 후 48시간 후에 얻은 세포, 세포는 5 x 10^5 주사)와 NV-IONP (hMSC-IONP 유래 나노베지클(상기 48시간 후에 얻은 세포에서 분리된 철-나노베시클, 40ug 주사)을 각각 형광 염료(VivoTrack 680 (Perkin Elmer))로 염색한 뒤, 상기 언급된 양으로 정맥주사하고 자석유도 유무를 통해 장기 분포도와 척수 타겟팅을 다음과 같이 관찰하였다.

주사 후 24시간째에, 도 18 및 도 19에 개시된 주요 장기들과 척수를 분리하여 형광 이미징(eXplore Optix System (Advanced Research Technologies Inc.)을 수행하였다. 도 18에 기재된 바와 같이, hMSC-IONP는 큰 사이즈로 인해 폐 모세혈관을 거의 통과하지 못하고 거의 폐에 축적됨이 관찰된 반면, NV-IONP는 나노입자의 특성상 간 축적량이 상대적으로 높게 나타났다. 하지만 NV-IONP는 작은 사이즈로 인해 폐에 걸리는 현상이 관찰되지 않았다. 치료물질을 정맥주사 할 경우, 심장에 먼저 도달하고 그 다음으로 지나치는 기관이 폐이다. 만약에 치료물질의 크기가 커서 폐 모세혈관에 축적되게 되면, 호흡이 약해지며 물질이 혈액순환을 하지 못하게 되어 목표로 삼는 척수부위에 전달이 되지 않는 문제점이 있다. 하지만 본원의 철-나노베시클은 사이즈가 나노사이즈이기 때문에 폐 모세혈관을 통과할 수 있고 혈액순환을 거쳐 척수부위에 자석으로 유도가 가능하다.

척수 타켓팅을 위해 도 28에 기재된 바와 같이, 지름 5mm, 두께 2mm 사이즈의 네오디뮴 자석을 사용했다. 자석을 손상된 척수부위 위쪽 피부에 올려 테가덤 필름과 자가점착식 붕대로 고정하였다. 자석은 24시간 동안 고정하였고 24시간 지난 후 제거했다. 동물이 여러 마리 일 경우 자석이 다른 동물에 영향을 미칠 수 있으므로 1케이지 당 1마리로 사육했다. 척수 타겟팅 효능 관찰 결과, hMSC-IONP는 자석 유무를 떠나 두 그룹 모두 척수에 타겟팅 되지 못함. 반면 NV-IONP는 자석 유도가 존재할 때에 월등히 높은 척수 타겟팅이 관찰되었다 (도 18 및 도 19 참조). 도 19는 도 18의 결과를 정량 분석한 결과(ROI 분석)로 hMSC-IONP는 대부분 폐와 간에 축적된 반면, NV-IONP는 간에 축적되었지만 척수 타겟팅이 자석 유도를 했을 때 2배 가량 증가한 것으로 나타났다. 또한 척수의 형광량을 전체 장기 형광량으로 나누어 hMSC-IONP와 NV-IONP를 비교한 결과, hMSC-IONP 그룹에 비해 NV-IONP가 자석 유도가 없을 때에도 약 4배 가량 타겟팅 효율이 높은 것으로 관찰되었고, 자석 유도가 존재할 시에는 약 8배 가량 타겟팅 효율이 증가함이 관찰되었다.

도 18 및 도 19의 결과를 토대로 마우스로부터 척수 조직을 분리하여 조직 박편을 제조하여 형광을 관찰한 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, 다른 결과와 마찬가지로 NV-IONP가 주입된 마우스의 척수에서 형광이 강하게 관찰되었다. 프러시안 블루 염색은 조직의 철 이온을 파란색으로 염색하는 염색법으로 본 발명에서는 hMSC-IONP나 NV-IONP에 함유된 IONP을 검출하는 방법으로 활용되었으며, 그 결과 위의 결과와 마찬가지로 NV-IONP가 주입된 마우스의 척수에서 파란색 색소들이 다량 검출되었다.

실시예 5-3. 척수 손상 모델에서 본원에 따른 NV-IONP 주입시 성장인자 및 신생혈관 생성 분석

상기와 같이 처리된 마우스에서 NV와 NV-IONP를 자석 유도 유무에 따라 주사한 후, 14일째에 척수 조직을 분리하여 웨스턴블랏으로 성장인자 발현 여부를 관찰하였다. 결과는 도 21에 나타냈으며, 그 결과 NV-IONP (자석 O) 그룹에서 가장 높은 성장인자 발현이 관찰되었다. 도 21에서 각 번호는 다음과 같다: (i) 처리가 되지 않은 정상 쥐 (ii) 척수손상+PBS (iii) 척수손상+NV (iv) 척수손상+NV-IONP (자석 X, 적용하지 않음) (v) 척수손상+NV-IONP (자석 0, 적용함).

이어 NV와 NV-IONP를 자석 유도 유무에 따라 주사한 후, 28일째에 척수 조직을 분리하여 조직면역염색(immunohistochemistry, IHC)을 통해 von Willebrand factor(vWF, 혈관내피세포 마커)의 발현을 관찰하였다. 결과는 도 22에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 NV-IONP (자석 O) 그룹에서 가장 많은 신생혈관이 관찰되었다.

또한 NV와 NV-IONP를 자석 유도 유무에 따라 주사한 후, 28일째에 척수 조직을 분리하여 조직면역염색(immunohistochemistry, IHC)을 통해 CD86 (M1 마커)와 Arg-1 (M2 마커)의 발현을 관찰하였다. 결과는 도 23에 기재되어 있다. 그 결과, NV-IONP (자석 O) 그룹에서 가장 낮은 CD86 발현과 가장 높은 Arg-1 발현을 확인하였다.

또한 NV와 NV-IONP에 의해 대식세포가 M1 타입에서 M2 타입으로 유도됨을 확인함에 따라, 실제 척수 조직에서 분비된 염증 사이토카인이 줄어들었는지 IHC 및 웨스턴블롯으로 확인하였다. 대표적인 염증 사이토카인인 TNF-α를 IHC로 관찰한 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, NV-IONP (자석 O) 그룹에서 가장 낮은 TNF-α 분비가 관찰되었고, western blot 결과 마찬가지로 해당 그룹에서 가장 낮은 IL-6, IL-1β, TNF-α 발현이 관찰되었다.

실시예 5-4. NV-IONP를 이용한 타겟팅을 최대화 및 치료 효능 확인 2

(1) astrogliosis 감소 효과

일반적으로 척수 손상이 일어나면, astrogliosis(가까운 신경세포의 파괴에 기인한 성상세포 수의 비정상적인 증가)를 보이게 되는데, 이는 신경세포들 간의 전달을 방해함으로써 신경전달 체계를 파괴한다. NV와 NV-IONP 주사한 후, 척수 조직의 신경과 성상분포를 28일차에 척수를 분리해 조직면역염색을 했다. Neurofilament (신경, 초록), GFAP (astrogliosis, 빨강) 방법으로 분석하였다. 결과는 도 25에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 NV-IONP (자석 O)가 주사된 마우스 척수에서 astrogliosis (GFAP)가 가장 낮았으며, 신경세포들(NF) 간의 연결성이 가장 높은 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 본원에 따른 NV-IONP 내의 HGF 또는 FGF2의 영향을 받음과 동시에, 억제된 염증반응에 의해 astrogliosis 또한 감소된 것을 나타낸다.

(2) 섬유화 및 세포 사멸에 미치는 효과

척수가 손상된 후 대표적으로 동반하는 현상은 조직의 섬유화(fibrosis) 인데, 이 또한 신경세포들 간의 전달 체계를 방해한다. 또한 염증과 astrogliosis, 혈관 파괴 등으로 인해 신경세포의 세포 사멸도 발생한다. NV와 NV-IONP에 의한 섬유화를 in vivo에서 확인하기 위해 정맥 주사 후 척수 조직에서 섬유화 마커(laminin)을 IHC로 확인하였다. 결과는 도 26에 개시되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 NV-IONP (자석 O) 그룹에서 가장 낮은 섬유화를 관찰하였다. 또한 신경세포의 세포 사멸을 확인하기 위해 TUNEL assay (DeadEnd Fluorometric TUNEL System, Promega 사)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석한 결과, 마찬가지로 NV-IONP (자석 O) 그룹에서 가장 적은 apoptotic cell이 관찰되었다.

(3) 척수 조직 보호 효과와 그에 따른 척수 기능 회복 평가

상기 제시된 철-나노베지클의 혈관생성 촉진, 성장인자 분비 촉진, 항염증, 세포사멸억제 등의 효과를 통해 주사 후 최종 28일 째에 분리된 척수 조직을 관찰하였다. 결과는 도 27에 기재되어 있다. Transverse 방향의 조직 박편을 Masson’s trichrome (섬유화: 초록색 점선)으로 염색한 결과, 회백질과 백질의 보존이 실험군에서 가장 양호한 것으로 관찰되었고, 섬유화 또한 가장 작은 면적으로 진행되었다. 척수 손상과 나노베지클의 주입 후 28일째까지의 척수 기능을 행동 실험 테스트를 통해 정량 평가한 결과, NV-IONP (자석 O) 그룹에서 척수 기능이 가장 높게 회복됨이 나타났다. 이에 나타난 바와 같이 NV-IONP (자석 O) 그룹에서 척수 손상 부위 (초록색 점선)의 두께와 형태가 정상 쥐에 가깝게 보존됨이 관찰되었다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

(a) 중간엽 줄기세포(hMSC)에 철 나노입자를 처리하는 단계;
(b) 상기 철 나노입자가 처리된 중간엽 줄기세포(hMSC)를 배양하여 줄기세포 유래 소포체 내에 철 나노입자를 포함시키는 단계;
(c) 상기 철 나노입자가 포함된 줄기세포 유래 소포체를 공극의 크기가 상이한 막 필터에 2 내지 6회 압출시켜 철-나노베지클을 성형하는 단계;
(d) 상기 성형된 철-나노베지클을 원심분리 및 자성유도를 실시하여 철-나노베지클을 분리하는 단계:를 포함하는,
철 나노입자를 내부에 함유하는 줄기세포 유래 철-나노베지클의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 철 나노입자는 10 내지 80μg/ml의 농도로 10시간 내지 16시간 동안 처리한 것을 특징으로 하는,
철 나노입자를 내부에 함유하는 줄기세포 유래 철-나노베지클의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 철 나노입자는 직경이 10 내지 15nm인 것을 특징으로 하는,
철 나노입자를 내부에 함유하는 줄기세포 유래 철-나노베지클의 제조방법.
제1항에 있어서,
(a) 단계의 철 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 철 나노입자를 내부에 함유하는 줄기세포 유래 철-나노베지클의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 상이한 막 필터는 공극의 크기가 10μm, 5 μm, 1 μm 및 400nm인 4종의 막 필터에 순차적으로 압출하는 것을 특징으로 하는, 철 나노입자를 내부에 함유하는 줄기세포 유래 철-나노베지클의 제조방법.
상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 철-나노베지클을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 대상체에 정맥 투여되며, 자성을 적용하여 상기 철-나노베지클을 대상체의 치료 조직 또는 기관으로 이동시켜 표적화하는 것을 특징으로 하는, 표적 치료용 철-나노베지클 조성물.
제6항에 있어서,
상기 철-나노베지클은 지름이 120 내지 180nm인 것을 특징으로 하는, 표적 치료용 철-나노베지클 조성물.
제6항에 있어서,
상기 철-나노베지클은 1μg 당 10 내지 30ng의 철 나노입자를 함유하는 것을 특징으로 하는, 표적 치료용 철-나노베지클 조성물.
상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 철-나노베지클을 포함하는 조성물로서, 자성을 적용하여 상기 철-나노베지클을 대상체의 치료 조직 또는 기관으로 이동시켜 표적화하는 것을 특징으로 하는, 척수손상 치료용 약학 조성물.
상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 철-나노베지클을 포함하는 조성물로서, 자성을 적용하여 상기 철-나노베지클을 대상체의 치료 조직 또는 기관으로 이동시켜 표적화하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 약학 조성물.
상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 철-나노베지클을 포함하는 조성물로서, 자성을 적용하여 상기 철-나노베지클을 대상체의 치료 조직 또는 기관으로 이동시켜 표적화하는 것을 특징으로 하는, 항염증 약학 조성물.
상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 철-나노베지클을 포함하는 조성물로서, 자성을 적용하여 상기 철-나노베지클을 대상체의 치료 조직 또는 기관으로 이동시켜 표적화하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸증 또는 심근경색 치료용 약학 조성물.
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