WO2022245144A1 - 고압 유체 분산 방법을 이용한 세포 유래 나노소포체의 제조 방법 - Google Patents

고압 유체 분산 방법을 이용한 세포 유래 나노소포체의 제조 방법 Download PDF

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WO2022245144A1
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cells
nano
cell
pressure
derived
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PCT/KR2022/007162
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김창수
강준우
이성덕
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주식회사 뉴메이스
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cell-derived nano-ER using a high-pressure fluid dispersion method.
  • Extracellular vesicles are secreted from eukaryotic cells and have a double lipid membrane structure, and usually include exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies.
  • exosomes are nano-sized (70-150 nm) information carriers that play a role in cell-to-cell signal transmission and contain various physiologically active factors and signal transduction elements, making them a diagnostic treatment for various diseases since the 2010s. It has been spotlighted for its applications as Signaling elements in the extracellular endoplasmic reticulum, including exosomes, are specifically regulated according to the cell type and cellular environment, and various activities (activation, growth, differentiation, necrosis, etc.) of target cells are controlled according to the role of the elements.
  • cell-derived nanovesicles or nanovesicles, artificial exosomes
  • a cell-derived nanovesicles have a double lipid membrane structure on the outside, so they have a structurally similar form to exosomes, but are generally distinguished from exosomes in that they are produced through disruption of cells, and are relatively easy to purify efficiently and mass-produce. It is known that it is suitable for manufacturing in a GMP (good manufacturing practice) environment.
  • cell-derived nanovesicles can easily contain drugs and proteins containing genes therein during manufacture, as well as water-soluble and fat-soluble substances All of them have the advantage of being displayed on the surface.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing cell-derived nano-endoplasmic reticulum comprising the steps of disrupting and dispersing cells under high pressure conditions.
  • Another object of the present invention is to provide a cell-derived nano-ER prepared by the above production method.
  • Another object of the present invention is to provide a drug delivery composition comprising the cell-derived nano-ER.
  • the present invention provides a method for producing cell-derived nano-ER comprising the step of disrupting and dispersing the cells under high pressure conditions.
  • the cells may be stem cells or immune cells.
  • the stem cells may be selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells and dedifferentiated stem cells.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells, but are not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells may be those isolated from tissues selected from the group consisting of cartilage, bone tissue, adipose tissue, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid, placenta, and peripheral blood, but are not limited thereto. not.
  • the immune cells are selected from the group consisting of NK cells, T cells, B cells, macrophages and monocytes. It may be, but is not limited thereto.
  • the high-pressure condition may be passing through a chamber of 30 to 300 microns ( ⁇ m) by applying a pressure of 2,000 psi or more, but is not limited thereto.
  • the concentration of the cells may be 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a cell-derived nano-ER prepared by the above production method.
  • the present invention provides a drug delivery composition comprising the cell-derived nano-ER.
  • the method according to the present invention is a method for preparing by disrupting and dispersing cells under high pressure conditions, (i) increasing the yield of nano-ER to enable mass production of nano-ER, and (ii) uniform distribution of small sizes. It is possible to manufacture nano-endoplasmic reticulum with (iii) no replacement of the existing membrane filter is required, enabling a continuous nano-ER production process per batch, which is more suitable for GMP processes and pharmaceutical production processes that require an aseptic environment. There is, it can be usefully used in the field of medicine using cell-derived nano-ER.
  • PDI polydispersity index
  • FIG. 5 is a distribution diagram according to the size of nano-ER particles measured by a nano-particle tracker (Membrane filtration: stem cell-derived nano-ER prepared using a membrane filter; and High-pressure dispersion: stem cells prepared using a high-pressure disperser). derived nanoendoplasmic reticulum).
  • Figure 6 is a result of observing the nano-ER prepared using a high-pressure disperser with a transmission electron microscope (TEM).
  • TEM transmission electron microscope
  • the present invention includes a method for producing cell-derived nano-endoplasmic reticulum comprising the steps of disrupting and dispersing cells under high pressure conditions.
  • nano-ER refers to an endoplasmic reticulum of a double lipid membrane structure of nm size having cargo therein, and in the present invention, the nano-ER may be a stem cell-derived nano-ER or an immune cell-derived nano-ER. have.
  • stem cell refers to cells having self-renewal ability that are pluripotent or totipotent capable of differentiating into cells of all tissues of an individual, and embryonic stem cells , including adult stem cells and dedifferentiated stem cells.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells, and mesenchymal stem cells (MSC) are cartilage, bone tissue, adipose tissue, bone marrow stroma, etc. differentiated from mesoderm formed by dividing a fertilized egg. stem cells that exist.
  • the mesenchymal stem cells may be those isolated from tissues selected from the group consisting of cartilage, bone tissue, adipose tissue, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid, placenta, and peripheral blood, but are not limited thereto.
  • immune cell refers to a cell capable of regulating immunity to resist and overcome pathogens or viruses invading from the outside, and generally includes natural killer cells (NK cells), T cells (T cells), B cells ( B cells), may be selected from the group consisting of macrophages and monocytes, but is not limited thereto.
  • NK cells natural killer cells
  • T cells T cells
  • B cells B cells
  • the high-pressure condition may be passing through a chamber of 30 to 300 microns ( ⁇ m) by applying a pressure of 2,000 psi or more.
  • the high pressure condition may be to apply a pressure of 2,000 psi or more, may be to apply a pressure of 3,000 psi or more, may be to apply a pressure of 4,000 psi or more, or may be to apply a pressure of 5,000 psi or more. It is not limited, and there is no technical meaning in limiting the upper limit of the high pressure condition.
  • the high pressure condition may be to apply a pressure of 2,000 to 30,000 psi, may be to apply a pressure of 3,000 to 30,000 psi, may be to apply a pressure of 4,000 to 30,000 psi, and may be to apply a pressure of 5,000 to 30,000 psi It may be to apply a pressure of 30,000 psi, it may be to apply a pressure of 2,000 to 20,000 psi, it may be to apply a pressure of 3,000 to 20,000 psi, it may be to apply a pressure of 4,000 to 20,000 psi, and it may be to apply a pressure of 5,000 to 20,000 psi It may be to apply a pressure of, may be to apply a pressure of 2,000 to 10,000 psi, may be to apply a pressure of 3,000 to 10,000 psi, but is not limited thereto.
  • the stem cells pass through a chamber containing a tube with a diameter of 30 to 300 microns ( ⁇ m), thereby mass-producing nano-ER of a more homogeneous size, nano It was confirmed that the endoplasmic reticulum contained intrinsic physiologically active factors and information transmitters.
  • the nano-endoplasmic reticulum comprises: (a) obtaining a cell pellet after proliferating cells; and (b) disrupting and dispersing the cells resuspended in the buffer under high-pressure conditions.
  • the cells may be mesenchymal stem cells, and the mesenchymal stem cells may be proliferated in a medium containing 1-10% human platelet lysate (hPL).
  • hPL human platelet lysate
  • Cell pellets may be obtained by centrifugation after obtaining a cell suspension in a well-known method in the field of the present invention. Afterwards, the cells can be resuspended in a buffer such as PBS.
  • the concentration of the cells may be 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 8 cells/mL, preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL. .
  • the present invention provides a cell-derived nano-ER prepared by the manufacturing method of the cell-derived nano-ER.
  • the average size of the nano-endoplasmic reticulum may be 100 to 150 nm, preferably may be 105 to 145 nm, may be 110 to 140 nm, may be 110 to 135 nm, but , but is not limited thereto.
  • the polydispersity index of the nano-ER particles may be from 0.01 to 0.2, may be from 0.02 to 0.2, may be from 0.03 to 0.2, may be from 0.04 to 0.2, may be from 0.05 to 0.2 0.06 to 0.2, 0.07 to 0.2, 0.08 to 0.2, 0.09 to 0.2, 0.01 to 0.15, 0.02 to 0.15 0.03 to 0.15, 0.04 to 0.15, 0.05 to 0.15, 0.06 to 0.15, 0.07 to 0.15, 0.08 to 0.15, It may be 0.09 to 0.15, but is not limited thereto.
  • the nano-ER size distribution may be 50 to 400 nm, preferably may be 50 to 300 nm, may be 60 to 300 nm, may be 70 to 300 nm , may be 80 to 300 nm, may be 90 to 300 nm, may be 100 to 300 nm, may be 50 to 250 nm, may be 60 to 250 nm, may be 70 to 250 nm , 80 to 250 nm, 90 to 250 nm, 100 to 250 nm, 50 to 200 nm, 60 to 200 nm, It may be 70 to 200 nm, it may be 80 to 200 nm, it may be 90 to 200 nm, it may be 100 to 200 nm, but it is not limited thereto.
  • the present invention provides a drug delivery composition comprising the cell-derived nano-ER.
  • the drug may be encapsulated or supported in the nano-endoplasmic reticulum, and the drug may be an immune cell activator, an anticancer agent, a therapeutic antibody, a bioactive factor including micro RNA (miRNA) and messenger RNA (mRNA).
  • miRNA micro RNA
  • mRNA messenger RNA
  • It may be selected from the group consisting of antibiotics, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, contrast agents, protein drugs, growth factors, cytokines, peptide drugs, hair growth agents, anesthetics, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells were used.
  • an adipose-derived mesenchymal stem cell line was cultured in a medium containing 1-10% human platelet lysate (hPL) at 37°C, 5% CO 2 in a cell culture medium for 4 to 5 days.
  • hPL human platelet lysate
  • Trypsin-EDTA was treated for 5 minutes, and neutralized with a solution containing 1% human platelet lysate.
  • Cells were collected in the cell suspension by centrifugation, and after removing the supernatant, they were suspended at 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 8 cells/mL using PBS buffer.
  • the concentration of the stem cell PBS suspension is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 8 cells/mL, more preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • the disrupted cells form nano-sized vesicles while being disrupted and dispersed by the self-assembly mechanism of the cells.
  • the suspended cells were sequentially equipped with an extruder equipped with polycarbonate (PCTE) membranes having pore sizes of 5 ⁇ m and 1 ⁇ m. (Extruder) was filtered three times at a rate of 50-200 mL/min.
  • PCTE polycarbonate
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the number of particles of the nano-ER prepared by the high-pressure disperser of Preparation Example 1 is the average value of about 2,000, 3,000, 5,000, 10,000 and 15,000 psi as the applied pressure increases, respectively 11.3 ⁇ 10 10 , 14.8 ⁇ 10 10 , 14.8 ⁇ 10 10 , 14.3 ⁇ 10 10 and 14.3 ⁇ 10 10 particles/mL.
  • the number of particles of the nano-ER prepared using the membrane filter of Comparative Example 1 was confirmed to be 2.95 ⁇ 10 10 particles/mL.
  • the number of particles of the nano-ER prepared using a high-pressure disperser was significantly increased by about 3.8 to 5.0 times compared to the case prepared using a membrane filter.
  • the number of particles of the nano-ER prepared under high-pressure conditions of 2,000 psi was significantly increased compared to the case using a membrane filter, and under high-pressure conditions of 3,000 psi or more, even if the pressure increased, it was confirmed that a certain number of particles of the nano-ER were produced. . Therefore, the high-pressure conditions for the production of cell-derived nano-endoplasmic reticulum is a pressure of 2,000 psi or more, and it was confirmed that there is no technical significance in the upper limit of the high-pressure conditions.
  • the present inventors performed an experiment comparing the size and dispersion of the nano-ER according to the preparation method of Preparation Example 1 and Comparative Example 1.
  • the mean value, mode value, size distribution, and polydispersity index (PDI) of cell-derived nanovesicles were measured and analyzed using a nanoparticle tracker.
  • the average size of the nano-ER prepared under high-pressure conditions of 2,000 psi was measured to be about 153 nm, 3,000, 5,000, 10,000 and 15,000 of the average size of the nano-ER prepared under high pressure conditions was measured to be about 113 to 134 nm.
  • the size of the nano-ER prepared using the membrane filter of Comparative Example 1 was confirmed as an average of 165 nm.
  • the mode of the nano-ER prepared using the high-pressure disperser of Preparation Example 1 was confirmed to be 97 nm to 109 nm in size
  • Comparative Example 1 The mode of the nano-ER prepared using a membrane filter was measured at about 104 nm in size, and there was no significant difference between the nano-ER and the nano-ER prepared using a membrane filter prepared using a high-pressure disperser. Confirmed.
  • the polydispersity index of the nano-ER particles prepared using the high pressure disperser of Preparation Example 1 was measured as 0.09 to 0.14
  • the polydispersity index of the nano-ER particles prepared using the membrane filter of Comparative Example 1 was measured to be about 0.30.
  • the polydispersity index can be calculated by the (standard deviation/average size) 2 formula of the particles, and the closer the polydispersity index is to 0, the more homogeneous the particle distribution is.
  • the nanovesicles prepared using the high-pressure disperser of Preparation Example 1 had a lower polydispersity index than when using a membrane filter, indicating a homogeneous particle distribution.
  • nano-ER prepared using the high-pressure disperser of Preparation Example 1 nano-ER has a more homogeneous size distribution compared to the case using a membrane filter particles were produced.
  • high-pressure conditions for the production of cell-derived nano-ER is a pressure of 2,000 psi or more, and it was confirmed that there is no technical significance in the upper limit of the high-pressure conditions.
  • the nano-ER prepared by the method according to the present invention is more homogeneous than the method using a conventional membrane filter, and can produce a larger number of nano-ER per unit cell volume, anti-inflammatory drugs, anti-cancer drugs and drugs It was confirmed that various applications in the field of medicine and pharmacology, such as a drug delivery system for delivery, could be possible.
  • the present inventors performed an experiment comparing the size and shape of the nano-ER prepared using the high-pressure disperser (5,000 psi) of Preparation Example 1 using a transmission electron microscope (TEM, Transmission Electron Microscope). As a result, it was confirmed that the size of the nanovesicles prepared by the preparation method of Preparation Example 1 was homogeneous in size, as in the results measured using a nanoparticle tracker, and the shape of the particles maintained a spherical shape (FIG. 6).

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Abstract

본 발명은 고압 조건에서 세포를 파쇄 및 분산시키는 단계를 포함하는 세포 유래 나노소포체의 제조 방법; 및 이의 방법으로 제조된 나노소포체에 관한 것으로서, 상기 방법을 통해 균일한 크기의 세포 유래 나노소포체를 제조할 수 있고, 기존 방법에 비해 대량 생산이 가능하여, 의약학 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고압 유체 분산 방법을 이용한 세포 유래 나노소포체의 제조 방법
본 발명은 고압 유체 분산 방법을 이용한 세포 유래 나노소포체의 제조 방법에 관한 것이다.
세포외소포체(extracellular vesicles, EV)는 진핵세포에서 분비되는 이중 지질막 구조의 물질로서 통상 엑소좀(exosomes), 미세소포(microvesicles), 세포사멸체(apoptotic bodies) 등을 포함한다. 이중, 엑소좀은 나노 크기(70~150 nm)의 정보 전달체로서 세포간 신호전달 역할을 하며, 그 내부에 다양한 생리활성인자 및 신호전달요소 들을 포함하고 있어, 2010년대 이후 여러가지 질환에 대한 진단 치료제로서의 응용에 각광을 받아왔다. 엑소좀을 포함한 세포외소포체 내 신호전달 요소들은 세포 타입과 세포 환경에 따라 특이적으로 조절되어, 그 요소들의 역할에 따라 표적세포의 여러 활동들(활성화, 성장, 분화, 괴사 등)이 제어될 수 있도록 한다. 하지만, 엑소좀은 매우 소량 생산되기 때문에 의약품으로의 상용화를 위하여 다량의 세포 배양 공정을 필요로 하며, 세포 배양액의 정제과정과 배양액에서 엑소좀을 분리하는 번거로운 과정을 거쳐야 한다.
엑소좀 생산의 단점을 극복하기 위하여, 근래에 줄기세포나 면역세포 등을 파쇄하면서 세포막의 자가조립(self-assembly)기작을 이용한 세포 유래 나노소포체(또는 나노베지클, 인공엑소좀)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포 유래 나노소포체는 외부에 이중 지질막 구조를 가져 엑소좀과 구조적으로 유사한 형태를 띄나, 세포의 파쇄를 통해 제조되는 점에서 엑소좀과는 일반적으로 구별되며, 상대적으로 효율적인 정제가 용이하고 대량생산이 가능하여 GMP(good manufacturing practice) 환경내 제조에 적합하다고 알려져 있다. 또한, 엑소좀의 경우 그 유효기능을 증대시키기 위해 인위적인 유전자 발현 조절이 필요하지만, 세포 유래 나노소포체는 제조시 내부에 유전자를 포함한 약물 및 단백질을 용이하게 담지할 수 있을 뿐만 아니라, 수용성 및 지용성 물질 모두 표면에 전시시킬 수 있다는 장점이 있다.
최근 여러 연구에서 배양된 세포 배지에서 추출된 엑소좀 및 세포 유래 나노소포체를 이용한 연구 결과들이 다양한 질환에서 진단 및 치료 효능을 입증하고 있지만, 세포 유래 나노소포체를 균일한 크기로 대량생산하는 데에 한계가 있다. 일반적인 경우, 한국등록특허 제10-2236372호에 개시된 바와 같이 폴리카보네이트(polycarbonate)등과 같은 재질의 멤브레인 필터가 포함된 시린지(syringe) 타입 혹은 고압의 질소가스를 이용하는 방법으로 세포 유래 나노소포체를 멤브레인 필터에 순차적으로 여과하여 제조한다. 하지만, 이러한 멤브레인 필터를 이용하여 대량의 세포를 압출할 경우 멤브레인 표면에 파쇄된 세포의 파쇄물(cell debris)이 침착되어 많은 양의 세포가 여과되지 않고, 국부적인 필터 영역에서만 세포 파쇄 및 자가조립의 효과를 볼 수 있어, 상업화 수준의 scale-up에는 한계가 있으며 압출된 나노소포체 또한 균일한 크기로 제조하기에 어려움이 있다. 따라서, 세포 유래 나노소포체를 대량 생산시 보다 연속적이며 균일한 크기의 입자를 제조할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 고압 조건에서 세포를 파쇄 및 분산시키는 단계를 포함하는 세포 유래 나노소포체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조 방법으로 제조된 세포 유래 나노소포체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 유래 나노소포체를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고압 조건에서 세포를 파쇄 및 분산시키는 단계를 포함하는 세포 유래 나노소포체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포는 줄기세포 또는 면역세포인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 면역세포는 자연살해세포(NK cells), T 세포(T cells), B 세포(B cells), 대식세포(macrophages) 및 단핵구(monocytes)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 고압 조건은 2,000 psi 이상의 압력을 가하여 30 내지 300 마이크론(μm)의 챔버를 통과시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포의 농도는 1×105 내지 1×107 cells/mL 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 세포 유래 나노소포체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 유래 나노소포체를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 고압 조건에서 세포를 파쇄 및 분산시켜 제조하는 방법인 것으로서, (i) 나노소포체의 수득율을 높여 나노소포체의 대량생산이 가능하게 하고, (ii) 작은 크기의 균일한 분포를 가진 나노소포체를 제조할 수 있으며, (iii) 기존 멤브레인 필터의 교체작업이 필요하지 않아 단일 배치당 연속적인 나노소포체 생산 공정이 가능하여 무균 환경을 요구하는 GMP 공정 및 의약품 생산 공정에 더 적합하다는 효과가 있어, 세포 유래 나노소포체를 이용한 의약품 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 나노소포체의 나노입자추적기(NTA, Nanoparticle Tracking Analysis, Malvern Panalytical, Netherlands)로 측정한 입자 수를 비교한 결과이다 (Membrane filtration: 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; High-pressure dispersion(Psi): 고압 분산기를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; 데이터 = 평균 ± 표준편차; 및 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
도 2는 나노소포체의 평균 크기를 측정한 결과이다 (Membrane filtration: 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; High-pressure dispersion(Psi): 고압 분산기를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; 데이터 = 평균 ± 표준편차; 및 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
도 3은 나노소포체의 최빈값을 측정한 결과이다 (Membrane filtration: 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; High-pressure dispersion(Psi): 고압 분산기를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; 데이터 = 평균 ± 표준편차; 및 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
도 4는 나노소포체의 다분산지수(PDI, polydispersity index)를 측정한 결과이다 (Membrane filtration: 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; High-pressure dispersion(Psi): 고압 분산기를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; 데이터 = 평균 ± 표준편차; 및 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
도 5는 나노입자추적기로 측정한 나노소포체 입자들의 크기에 따른 분포도이다 (Membrane filtration: 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체; 및 High-pressure dispersion: 고압 분산기를 이용하여 제조된 줄기세포 유래 나노소포체).
도 6은 고압 분산기를 이용하여 제조된 나노소포체를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 고압 조건에서 세포를 파쇄 및 분산시키는 단계를 포함하는 세포 유래 나노소포체의 제조 방법을 포함한다.
상기 용어, "나노소포체(nanovesicle)"는 내부에 cargo를 지닌 nm 사이즈의 이중 지질막 구조의 소포체를 의미하며, 본 발명에서, 상기 나노소포체는 줄기세포 유래 나노소포체 또는 면역세포 유래 나노소포체인 것일 수 있다.
상기 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 역분화 줄기세포를 포함한다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있고, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 용어, "면역세포"는 외부에서 침입한 병원균이나 바이러스 등에 저항하여 이겨낼 수 있도록 면역력 조절을 가능하게 하는 세포로서, 일반적으로 자연살해세포(NK cells), T 세포(T cells), B 세포(B cells), 대식세포(macrophages) 및 단핵구(monocytes)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 고압 조건은 2,000 psi 이상의 압력을 가하여 30 내지 300 마이크론(μm)의 챔버를 통과시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고압 조건은 2,000 psi 이상의 압력을 가하는 것일 수 있고, 3,000 psi 이상의 압력을 가하는 것일 수 있고, 4,000 psi 이상의 압력을 가하는 것일 수 있고, 5,000 psi 이상의 압력을 가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니며, 고압 조건의 상한을 한정하는 것에는 기술적 의미가 없다.
다만, 상한을 한정할 경우, 상기 고압 조건은 2,000 내지 30,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 3,000 내지 30,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 4,000 내지 30,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 5,000 내지 30,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 2,000 내지 20,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 3,000 내지 20,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 4,000 내지 20,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 5,000 내지 20,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 2,000 내지 10,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있고, 3,000 내지 10,000 psi의 압력을 가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.
본 발명에서는 고압 유체 분산 방법을 통해 줄기세포를 2,000 psi 이상의 압력을 가하여 30 내지 300 마이크론(μm) 구경의 관이 포함된 챔버를 통과시켜, 보다 균질한 크기의 나노소포체를 대량 생산할 수 있고, 나노소포체 내에 고유의 생리활성인자 및 정보전달물질을 함유하고 있음을 확인하였다.
더욱 바람직하게는, 상기 나노소포체는 (a) 세포를 증식시킨 후 세포 펠릿을 수득하는 단계; 및 (b) 버퍼로 재부유된 세포를 고압 조건에서 파쇄 및 분산시키는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있고, 중간엽 줄기세포는 1-10%의 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate; hPL)이 함유된 배지에서 증식될 수 있다. 증식된 배지는 본 발명 분야에서 잘 알려진 공지된 방법으로 세포현탁액을 수득한 후, 원심분리를 통해 세포 펠릿이 수득될 수 있다. 이후, PBS와 같은 버퍼로 세포를 재부유시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 고압 분산 시, 상기 세포의 농도는 1×103 내지 1×108 cells/mL 인 것일 수 있고, 바람직하게는 1×105 내지 1×107 cells/mL 인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포 유래 나노소포체의 제조 방법으로 제조된 세포 유래 나노소포체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 나노소포체의 평균 크기는 100 내지 150 nm 인 것일 수 있고, 바람직하게는 105 내지 145 nm 인 것일 수 있고, 110 내지 140 nm 인 것일 수 있고, 110 내지 135 nm 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 나노소포체 입자들의 다분산지수는 0.01 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.02 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.03 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.04 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.05 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.06 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.07 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.08 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.09 내지 0.2 인 것일 수 있고, 0.01 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.02 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.03 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.04 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.05 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.06 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.07 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.08 내지 0.15 인 것일 수 있고, 0.09 내지 0.15 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 나노소포체는 크기 분포는 50 내지 400 nm 인 것일 수 있고, 바람직하게는 50 내지 300 nm 인 것일 수 있고, 60 내지 300 nm 인 것일 수 있고, 70 내지 300 nm 인 것일 수 있고, 80 내지 300 nm 인 것일 수 있고, 90 내지 300 nm 인 것일 수 있고, 100 내지 300 nm 인 것일 수 있고, 50 내지 250 nm 인 것일 수 있고, 60 내지 250 nm 인 것일 수 있고, 70 내지 250 nm 인 것일 수 있고, 80 내지 250 nm 인 것일 수 있고, 90 내지 250 nm 인 것일 수 있고, 100 내지 250 nm 인 것일 수 있고, 50 내지 200 nm 인 것일 수 있고, 60 내지 200 nm 인 것일 수 있고, 70 내지 200 nm 인 것일 수 있고, 80 내지 200 nm 인 것일 수 있고, 90 내지 200 nm 인 것일 수 있고, 100 내지 200 nm 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 세포 유래 나노소포체를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 나노소포체 내에 봉입 또는 담지되는 것일 수 있고, 상기 약물은 면역세포 활성화제, 항암제, 치료용 항체, 마이크로 RNA(miRNA) 및 전령 RNA(mRNA)가 포함된 생리활성인자, 항생제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항염증제, 조영제, 단백질 의약품, 성장인자, 사이토카인, 펩티드 약물, 발모제, 마취제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 고압 유체 분산방법을 이용한 줄기세포-유래 나노소포체의 제조
1.1. 줄기세포의 배양과 줄기세포가 포함된 현탁액의 제조
본 발명에서는 세포 유래 나노소포체를 제조하기 위하여, 지방유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSC)를 사용하였다. 먼저, 1-10%의 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate; hPL) 함유 배지에 지방유래 중간엽 줄기세포 세포주를 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 4 내지 5일간 배양하였다. 이후, 세포가 포함된 현탁액을 만들기 위해, 0.05-0.25%의 Trypsin-EDTA를 5분간 처리하고, 1%의 인간 혈소판 용해물이 포함된 용액으로 중화시켰다. 상기 세포현탁액은 원심분리(centrifugation)를 통해 세포를 모았고, 상층액을 제거한 후 PBS 버퍼를 이용하여 1×103 내지 1×108 cells/mL 로 부유시켰다.
1.2. 고압 유체 분산방법을 이용한 줄기세포-유래 나노소포체의 제조
고압 분산고압 분산기를 이용하여 2,000, 3,000, 5,000, 10,000 또는 15,000psi의 압력을 가하여 30~300 마이크론의 구경을 가지는 챔버를 통과시켜 전단응력을 가함으로써 세포를 파쇄하였다. 이때, 줄기세포 PBS 현탁액의 농도는 1×103 내지 1×108 cells/mL 이고, 보다 바람직하게는 1×105 내지 1×107 cells/mL 이다. 파쇄된 세포는 세포의 자가조립기작에 의하여 파쇄, 분산됨과 동시에 나노 크기의 소포를 형성하게 된다.
비교예 1. 멤브레인 필터를 이용한 줄기세포-유래 나노소포체의 제조
상기 제조예 1.1.과 동일한 방법으로 지방유래 중간엽 줄기세포가 포함된 현탁액을 제조한 후, 부유된 세포를 공극의 크기가 5 μm 및 1 μm의 폴리카보네이트(PCTE) 멤브레인이 순차적으로 장착된 압출기(Extruder)에 50-200 mL/min의 속도로 3회 여과하였다.
실시예 1. 제조 방법에 따른 나노소포체 수율 비교
본 발명자들은 상기 제조예 1 및 비교예 1의 제조 방법에 따른 세포 유래 나노소포체의 입자수를 나노입자추적기(NTA, Nanoparticle Tracking Analysis)를 이용하여 비교하였다 (n=3). 그 결과, 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 고압 분산기로 제조된 나노소포체의 파티클 수는 가한 압력이 2,000, 3,000, 5,000, 10,000 및 15,000 psi로 증가함에 따라 그 평균값이 각각 약 11.3×1010, 14.8×1010, 14.8×1010, 14.3×1010 및 14.3×1010 particles/mL 로 확인되었다. 반면, 비교예 1의 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 나노소포체의 파티클 수는 2.95×1010 particles/mL 로 확인되었다. 이로써, 고압 분산기를 이용하여 제조된 나노소포체의 파티클 수는 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 경우에 비해 약 3.8 내지 5.0 배로 유의하게 증가하였음을 확인하였다.
특히, 2,000 psi의 고압 조건에서 제조된 나노소포체의 파티클 수는 멤브레인 필터를 이용한 경우에 비해 현저하게 증가하였고, 3,000 psi 이상의 고압 조건에서는 압력이 증가하더라도 일정한 수의 나노소포체의 파티클이 제조되었음을 확인하였다. 따라서, 세포 유래 나노소포체의 제조를 위한 고압 조건은 2,000 psi 이상의 압력이며, 고압 조건의 상한에는 기술적 의미가 없음을 확인하였다.
Figure PCTKR2022007162-appb-img-000001
실시예 2. 제조 방법에 따른 나노소포체의 크기 및 분산도 비교
본 발명자들은 상기 제조예 1 및 비교예 1의 제조 방법에 따른 나노소포체의 크기와 분산도를 비교하는 실험을 수행하였다. 세포 유래 나노소포체의 평균 크기(mean value), 최빈값(mode value), 크기 분포도 및 다분산지수(PDI, polydispersity index)는 나노입자 추적기를 통해 측정 및 분석하였다.
그 결과, 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 고압 분산기를 이용하여 나노소포체를 제조한 경우, 2,000 psi의 고압 조건에서 제조된 나노소포체의 평균 크기는 약 153 nm로 측정되었고, 3,000, 5,000, 10,000 및 15,000의 고압 조건에서 제조된 나노소포체의 평균 크기는 약 113 내지 134 nm로 측정되었다. 반면, 비교예 1의 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 나노소포체의 크기는 평균 165 nm로 확인되었다.
이로써, 2,000 psi의 고압 조건에서는 나노소포체의 평균 크기에 있어 멤브레인 필터를 이용한 경우와 유의적인 차이가 없었으나, 3,000 psi 이상의 고압 조건에서 제조된 나노소포체의 평균 크기는 멤브레인 필터를 이용한 경우보다 작은 것으로 나타났다. 다만, 3,000 psi 이상의 고압 조건에서는 압력이 증가하더라도 나노소포체의 평균 크기에 큰 영향을 미치지 않았음을 확인하였다.
또한, 나노소포체 크기의 최빈값과 관련하여, 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 고압 분산기를 이용하여 제조된 나노소포체의 최빈값은 97 nm 내지 109 nm 크기로 확인되었고, 비교예 1의 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 나노소포체의 최빈값이 약 104 nm 크기로 측정되어, 고압분산기를 이용하여 제조된 나노소포체와 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 나노소포체 사이에 유의적인 차이가는 나타나지 않았음을 확인하였다.
또한, 나노소포체의 다분산지수를 측정한 결과, 표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 고압분산기를 이용하여 제조된 나노소포체 입자들의 다분산지수는 0.09 내지 0.14로 측정된 반면, 비교예 1의 멤브레인 필터를 이용하여 제조된 나노소포체 입자들의 다분산지수는 약 0.30으로 측정되었다. 다분산지수는 입자들의 (표준편차/평균 크기)2 수식으로 계산할 수 있으며, 다분산지수가 0에 가까울수록 균질한 입자 분포를 나타낸다. 이로써, 제조예 1의 고압분산기를 이용하여 제조된 나노소포체는 멤브레인 필터를 이용한 경우보다 다분산지수가 낮으므로, 균질한 입자 분포를 나타내고 있음을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 나노소포체의 크기 분포도를 측정한 결과에서도, 제조예 1의 고압 분산기를 이용하여 제조된 나노소포체는 멤브레인 필터를 이용한 경우에 비해 더욱 균질한 크기 분포를 가지는 나노소포체 입자가 제조되었다. 특히, 세포 유래 나노소포체의 제조를 위한 고압 조건은 2,000 psi 이상의 압력이며, 고압 조건의 상한에는 기술적 의미가 없음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 나노소포체는 기존 멤브레인 필터를 이용한 방법에 비해 더욱 균질하고, 단위 세포의 체적당 더 많은 수의 나노소포체를 제조할 수 있어, 염증치료제, 항암제 및 약물전달용 약물전달체 등의 의약학 분야에서 다양한 활용이 가능할 수 있음을 확인하였다.
Figure PCTKR2022007162-appb-img-000002
실시예 3. 고압 조건에서 제조된 나노소포체의 형상 분석
본 발명자들은 상기 제조예 1의 고압 분산기(5,000 psi)를 이용하여 제조된 나노소포체의 크기 및 형상을 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope)을 이용하여 비교하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 제조예 1의 제조 방법으로 제조된 나노소포체의 크기는 나노입자추적기를 이용하여 측된 결과에서와 같이, 크기가 균질하고, 입자의 형상이 구형을 유지하였음을 확인하였다 (도 6).

Claims (9)

  1. 고압 조건에서 세포를 파쇄 및 분산시키는 단계를 포함하는 세포 유래 나노소포체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기세포 또는 면역세포인 것인, 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 제조 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인, 제조 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 면역세포는 자연살해세포(NK cells), T 세포(T cells), B 세포(B cells), 대식세포(macrophages) 및 단핵구(monocytes)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 고압 조건은 2,000 psi 이상의 압력을 가하여 30 내지 300 마이크론(μm)의 챔버를 통과시키는 것인, 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포의 농도는 1×105 내지 1×107 cells/mL 인 것인, 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법으로 제조된 세포 유래 나노소포체.
  9. 제 8 항의 세포 유래 나노소포체를 포함하는 약물전달용 조성물.
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