WO2018048104A1 - 세포 배양용 배지 조성물 - Google Patents

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WO2018048104A1
WO2018048104A1 PCT/KR2017/008603 KR2017008603W WO2018048104A1 WO 2018048104 A1 WO2018048104 A1 WO 2018048104A1 KR 2017008603 W KR2017008603 W KR 2017008603W WO 2018048104 A1 WO2018048104 A1 WO 2018048104A1
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cells
hgc
cell culture
cell
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PCT/KR2017/008603
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강선웅
허강무
조명옥
권보선
문성환
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충남대학교산학협력단
한국화학연구원
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    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture medium composition, and more particularly, to a cell culture medium composition for activating cell proliferation using hexanoyl glycol chitosan (HGC).
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • organ culture and tissue culture respectively.
  • cell culture In vitro proliferation, differentiation or maintenance of cells separated from organs and tissues is called cell culture.
  • Cell culture is a technique for proliferating, differentiating, or maintaining an isolated cell in a medium in vitro, and is indispensable for analyzing in detail the functions and structures of various organs, tissues, and cells in vivo.
  • cells and / or tissue cultured by the above-mentioned techniques are used for the evaluation of the efficacy and toxicity of chemicals and pharmaceuticals, the production of useful substances such as enzymes, cell proliferation factors, and antibodies, and organs lost due to diseases or defects, It is used in various fields such as regenerative medicine for replenishing tissues and cells, improving plant varieties, and producing recombinant crops.
  • glycol chitosan is one of the water-soluble chitosan derivatives, and exhibits water solubility at neutral pH according to the introduction of hydrophilic ethylene glycol groups. Previous studies have reported that glycol chitosan exhibits noncytotoxicity, biocompatibility and stimulates the growth of chondrocytes at low concentrations.
  • glycol chitosan are sites that can be modified to improve their use.
  • Glycol chitosan derivatives have been proposed in which various functional groups or molecules have been introduced into the glycol chitosan backbone in order to improve or impart new properties of glycol chitosan.
  • the present inventors have conducted various studies, The present invention was completed by confirming that the cell culture medium composition significantly improved the cell proliferation rate.
  • an object of the present invention is to provide a cell culture medium composition having high production efficiency and promoting cell proliferation.
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • x, y, z in the formula (1) is an integer of 10 to 10000, and their mole% is 0.1 ⁇ x ⁇ 0.5, 0.1 ⁇ y ⁇ 0.2, and 0.3 ⁇ z ⁇ 0.8)
  • the cell culture medium composition according to the present invention can effectively improve cell proliferation rate without affecting the morphology and viability of the cells, even by containing relatively low concentrations of hexanoyl glycol chitosan (HGC). have.
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • FIG. 1 is a morphology of fibroblasts cultured in HGC-containing medium and HGC-free medium according to the present invention.
  • FIG. 2 is a fluorescence microscope image of fibroblasts cultured in HGC-containing medium and HGC-free medium according to the present invention.
  • Figure 3 is a data showing the cell proliferation rate by concentration of HGC of A549 cells according to the present invention.
  • Figure 4 is a data showing the cell proliferation rate by concentration of HGC of corneal epithelial cells according to the present invention.
  • Figure 5 is a data showing the cell proliferation rate according to the concentration of HGC of the fibroblasts according to the present invention.
  • Figure 6 is a data showing the cell cycle of fibroblasts cultured in HGC-containing medium and HGC-free medium according to the present invention.
  • Figure 7 is a data showing the cell proliferation rate of fibroblasts cultured in GC containing medium not substituted with hexanoyl group according to the present invention.
  • FIG. 8 is data showing the cell proliferation rate of fibroblasts cultured in HGC 36 containing medium substituted with 36% hexanoyl group according to the present invention.
  • FIG. 9 is data showing the cell proliferation rate of fibroblasts cultured in HGC 40-containing medium substituted with 40% hexanoyl group according to the present invention.
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • x, y, z in the formula (1) is an integer of 10 to 10000, and their mole% is 0.1 ⁇ x ⁇ 0.5, 0.1 ⁇ y ⁇ 0.2, and 0.3 ⁇ z ⁇ 0.8)
  • the hexanoyl glycol chitosan has a glycol group, an amine group, an acetyl group and a hydrophobic group as substituents, as shown in formula (1).
  • the glycol group and the amine group are hydrophilic
  • the acetyl group and the hydrophobic group are hydrophobic.
  • Hexanoyl glycol chitosan (HGC) according to the present invention may be referred to as an amphiphilic polymer.
  • the medium containing the cell culture composition according to the present invention is the growth of cells in vitro including elements essential for the growth and proliferation of cells such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, minerals, etc. And as a mixture for propagation, various media are commercially available in the art, and may be artificially prepared and used.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12, DMEM-F12, and ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential) Medium
  • G-MEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • MacCoy's 5A medium AmnioMax, AminoMaxII complete Medium
  • Chang's Medium MesemCult-XF Medium It can be used as a basal medium included in the medium composition of the present invention.
  • the hexanoyl glycol chitosan is contained as an active ingredient, in particular at a relatively low concentration.
  • the content was slightly different for each cell type, it contained 0.1 to 0.5% (w / v) based on the volume of the whole cell culture medium composition, and even at such low concentrations, it had no negative effect on the morphology and viability of the cells. In this way, the cell proliferation rate can be effectively improved.
  • growth factors included in the cell culture medium include, for example, transforming growth factor ( ⁇ , TGF), insulin-like growth factor (IGF), epidermal growth factor (epidermal growth factor). , EGF), nerve growth factor (NGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (hepatocyte growth factor, HGF), platelet-derived growth factor (PDGF) and bone morphogenetic protein (BMP) are possible.
  • Cells that can be cultured using the cell culture composition including the hexanoyl glycol chitosan (HGC) presented in the present invention are not particularly limited in the present invention, and the application of cells as known in the art is possible, and examples Epithelial cells, fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes, cardiomyocytes, hepatocytes, human umbilical cord blood cells and mesenchymal stem cells, endothelial progenitor cells, embryonic stem cells, myoblasts ( Myoblast), Cardiac stem cells and the like can be used, and more preferably, human lung cancer cell lines A549 cells, human corneal epithelial cells and human-derived fibroblasts.
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • Glycol chitosan as a starting material is prepared by using a known method or purchased commercially available.
  • Commercially available glycol chitosan can be purchased from WAKO, SIGMA, and Tokyo Kase.
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • Hexanoic anhydride The molar ratio of) can be varied, and for example, the amine group and hexanoic anhydride of glycol chitosan can be properly adjusted within a molar ratio of 1: 0.1 to 1:70.
  • the reaction is -10 to 60 °C, preferably 15 to 25 °C
  • the reaction time is 10 to 50 hours, preferably 40 to 50 hours.
  • the solvent which can be used is not specifically limited in this invention, Lower alcohols, such as water, methanol, ethanol, a propanol, isopropanol, butanol, dichloromethane, trichloromethane, tetrachloromethane, toluene, dimethylacetamide, N-methylpi
  • One selected from the group consisting of rolidone, dimethyl sulfoxide, xylene, benzene, n-butyl acetate, methylcyclohexane, dimethylcyclohexane, and a mixed solvent thereof is possible.
  • HGC hexanoyl glycol chitosan
  • HGC human lung fibroblasts
  • DMEM fetal calf serum
  • penicillin-streptomycin 1% penicillin-streptomycin during subculture.
  • Fibroblasts were cultured by dissolving HGC prepared in Example 1 at 0.25% (w / v), and cells cultured in HCG-free medium were used as a control.
  • the cultured fibroblasts were suspended in single cell form by treatment with 0.05% trypsin enzyme, and obtained using DMEM medium.
  • the obtained cells were counted and placed in 5.6 ⁇ 10 4 cells in a 35 mm cell culture plate and then cultured in a 37% 5% carbon dioxide incubator. After 24 hours, the medium was replaced with HGC-containing medium, and the morphology of fibroblasts was observed under the microscope on the 1st and 3rd day after the medium replacement.
  • the fibroblasts cultured in the medium containing HGC were found to maintain their natural form and grow well when compared to the fibroblasts cultured in the control medium without HGC. In other words, the presence or absence of HGC treatment did not significantly affect the morphology of fibroblasts.
  • the cultured fibroblasts were suspended in single cell form by treatment with 0.05% trypsin enzyme, and obtained using DMEM medium.
  • the obtained cells were passaged at 15,000 cells / well in 4-well cell culture plates and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After 24 hours, the medium was replaced with HGC-containing medium. After 48 hours of medium replacement, the cells were stained with a live / dead assay kit and observed by fluorescence microscopy.
  • fibroblasts cultured in the medium containing HGC after 48 hours showed mostly green fluorescence as cells cultured in the medium without HGC. This suggests that HGC has little effect on the survival rate of fibroblasts.
  • MTT (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • Cells were human lung cancer cell line A549, human corneal epithelial cells, human-derived fibroblasts. During passage, A549 cells used RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin, and 10% fetal calf serum and 1% penicillin for corneal epithelial and fibroblasts. DMEM medium containing streptomycin was used. In addition, the HGC prepared in Example 1 was dissolved in each cell culture medium at 0.1, 0.25, 0.5, 1% (w / v) concentrations and treated to the cells, and the cells cultured in the HCG addition medium did not control. ) was used.
  • the cultured A549 cells were suspended in single cell form by treatment with 0.05% trypsin enzyme, and then obtained using RPMI 1640 medium.
  • the obtained A549 cells were passaged at 1000 cells / well in 96-well cell culture plates for 24 hours in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C., and then exchanged with HGC-added medium. It was.
  • the day of the medium exchange was called day 0, and 20 ⁇ l of MTT solution dissolved in PBS at 5 mg / ml on day 0 to 5, respectively, was incubated for 2 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. After confirming that formazan crystal was formed, the supernatant was removed. After dissolving the crystals using DMSO, the absorbance was measured through a microplate reader at a wavelength of 540 nm to confirm cell proliferation.
  • A549 cells cultured in HGC-added medium showed a statistically significantly higher cell proliferation rate over time compared to A549 cells cultured in the control HGC-free medium. I could confirm it.
  • Cultured corneal epithelial cells were treated with 0.05% trypsin enzyme and suspended in single cell form, followed by DMEM medium.
  • the obtained cells were passaged in a unit of 2000 cells / well in a 96-well cell culture plate, followed by the same procedure as the A549 cells, and the absorbance was measured on day 0-7 of medium exchange to proliferate the cells. It was confirmed.
  • the corneal epithelial cells cultured in the HGC-added medium was confirmed that the cell proliferation at all concentrations is higher than the proliferation of the cells cultured in the HGC-free medium, in particular 0.5% (w / v It was confirmed that cells cultured in the medium of) concentration showed the highest growth rate.
  • Cultured fibroblasts were suspended in single cell form by treatment with 0.05% trypsin enzyme, and then obtained using DMEM medium. The obtained cells were passaged in a unit of 2000 cells / well in a 96-well cell culture plate, followed by the same procedure as the A549 cells, and the absorbance was measured on day 0-7 of medium exchange to proliferate the cells. It was confirmed.
  • the fibroblasts cultured in the HGC-added medium was found to be higher than the proliferation rate of the cells cultured in the HGC-free medium, among them cultured in a medium of 0.25% (w / v) concentration It was confirmed that the cells showed the highest proliferation rate.
  • Fluorescent activating cell sorting was used to analyze the effect of HGC on the cell cycle of fibroblasts.
  • Fibroblasts were first passaged in 5.6 x 10 4 cells in 35 mm cell culture plates. After 24 hours, the medium was exchanged with 0.25% (w / v) HGC. Fibroblasts were obtained by treatment with trypsin enzyme on Days 1, 3, 5, and 7, respectively, and fixed by adding 95% ethanol containing 0.5% of Tween 20. After the fixation solution was removed, propidium iodide was added to stain the DNA of the cells for 30 minutes at room temperature. After passing the cells through a cell strainer of 40 ⁇ m (Cell strainer), the DNA content of the cells was measured using a flow cytometry (FACS).
  • FACS flow cytometry
  • HGC Cell counting kit-8 (CCK-8) assay to compare the effects of two different types of HGC on the cell proliferation of different chemically modified glycol chitosan (GC) and hexanoyl groups (Degree of Substitution, DS) was carried out.
  • HGC was used for HGC 36 substitution degree of about 36% and HGC 40 of DS of about 40%, and dissolved in cell culture medium at 0.05, 0.1 and 0.25% (w / v), respectively.
  • Control is a cell cultured in GC and HGC-free medium, fibroblast cells were used.
  • Cultured fibroblasts were suspended in single cell form by treatment with 0.05% trypsin enzyme, and then obtained using DMEM medium. The obtained cells were counted and passaged in 96-well cell culture plates at 2000 cells / well, and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. After 24 hours, GC, HGC 36, HGC 40 Exchange with this added medium. CCK-8 solution was treated with 10 ⁇ l of each well on day 1, 3 and 5 after medium exchange and incubated for 1 hour and 30 minutes in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. The proliferation of cells was confirmed by measuring the absorbance at 450 nm wavelength using a microplate reader.
  • the cells (HGC36, HGC40) cultured in the medium added with HGC showed a relatively high cell proliferation rate when compared to the cells cultured in the medium added with Control and GC there was.
  • the cell growth rate of cells cultured with HGC 40 medium with higher substitution rate was higher, and the concentration of 0.25% (w / v) was higher. It can be confirmed that the result shows the highest value.

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Abstract

본 발명은 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 온도 감응성 고분자인 글리콜 키토산 유도체를 이용하여 세포 증식을 활성화시키는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 배양용 배지 조성물은 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC)을 비교적 저농도로 함유하는 것만으로도, 세포의 모폴로지와 생존률에 영향을 미치지 않으면서, 효과적으로 세포 증식률을 향상시킬 수 있다.

Description

세포 배양용 배지 조성물
본 출원은 2016년 09월 08일자 한국 특허 출원 제10-2016-0115364호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함한다.
본 발명은 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)을 이용하여 세포 증식을 활성화시키는 세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
최근, 동물이나 식물 체내에서 상이한 역할을 하고 있는 다양한 기관, 조직, 및 세포를 생체 외에서 증식 혹은 유지시키기 위한 기술이 발전해 오고 있다. 이들 기관, 조직을 생체 외에서 증식 혹은 유지하는 것은 각각 기관 배양, 조직 배양으로 불리고 있고, 기관, 조직으로부터 분리된 세포를 생체 외에서 증식, 분화 혹은 유지하는 것은 세포 배양으로 불리고 있다.
세포 배양은, 분리한 세포를 배지 중에서 생체 외에서 증식, 분화 혹은 유지하는 기술이고, 생체 내의 각종 기관, 조직, 세포의 기능 및 구조를 상세하게 해석하기 위해서 불가결한 것이 되어 있다. 또, 당해 기술에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 화학 물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 상실된 기관, 조직, 세포를 보충하는 재생 의료, 식물의 품종 개량, 유전자 재조합 작물의 생산 등 다양한 분야에서 이용되고 있다.
최근 세포 배양은 그 기술 달성으로 생명 현상의 해명뿐만 아니라 바이러스 백신의 제조, 바이오 의약품의 생산, 유전자 치료나 재생 의료, 면역세포 치료법에 이용하는데 있어서도 검토, 실시되고 있다.
한편, 글리콜 키토산은 수용성 키토산 유도체 중 하나로, 친수성 에틸렌글리콜 기의 도입에 따라 중성 pH에서 수용성을 나타낸다. 이전의 연구에 따르면, 글리콜 키토산은 비세포 독성, 생체적합성을 나타내고, 낮은 농도에서 연골세포의 성장을 자극한다고 보고된 바 있다.
특히, 글리콜 키토산의 백본을 따라 존재하는 아민기는 용도를 개선하기 위해 변형이 가능한 부위이다. 글리콜 키토산의 특성을 개선하거나 새로운 특성을 부여하기 위해 다양한 관능기 또는 분자를 글리콜 키토산 백본에 도입한 글리콜 키토산 유도체가 제안된 바 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허공보 제1502579호 "소수성 치환기를 갖는 글리콜 키토산 유도체, 이의 제조방법 및 용도"
대한민국 공개특허공보 제2016-0027669호 "온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법"
상술한 바와 같이, 글리콜 키토산의 백본을 따라 존재하는 아민기의 치환을 통하여, 세포 배양 기술에 적합한 세포 배양용 배지 조성물에 적용하고자, 본 발명자들은 다각적으로 연구를 수행한 결과, 본 발명에서 제시하는 세포 배양용 배지 조성물이 세포 증식률이 유의적으로 향상시킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생산효율이 높고, 세포의 증식률을 촉진시키는 세포 배양용 배지 조성물을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC)을 0.1 ~ 0.5 %(w/v) 함유하고, 헥사노일기(Hexanoyl group, -C(=O)C5H11))의 치환도가 10 ~ 50%인 세포 배양용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017008603-appb-I000001
(단, 상기 화학식 1에서 x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.1≤x≤0.5, 0.1≤y≤0.2, 및 0.3≤z≤0.8임)
본 발명에 따른 세포 배양용 배지 조성물은 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC)을 비교적 저농도로 함유하는 것만으로도, 세포의 모폴로지와 생존률에 영향을 미치지 않으면서, 효과적으로 세포 증식률을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 HGC 포함 배지와 HGC 미포함 배지에서 배양된 섬유아세포의 모폴로지이다.
도 2는 본 발명에 따른 HGC 포함 배지와 HGC 미포함 배지에서 배양된 섬유아세포의 형광현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 A549 세포의 HGC의 농도별 세포 증식률을 나타내는 데이터이다.
도 4는 본 발명에 따른 각막상피세포의 HGC의 농도별 세포 증식률을 나타내는 데이터이다.
도 5는 본 발명에 따른 섬유아세포의 HGC의 농도별 세포 증식률을 나타내는 데이터이다.
도 6은 본 발명에 따른 HGC 포함 배지와 HGC 미포함 배지에서 배양된 섬유아세포의 세포주기를 나타내는 데이터이다.
도 7은 본 발명에 따른 헥사노일기로 치환되지 않은 GC 포함 배지에서 배양된 섬유아세포의 세포 증식률을 나타내는 데이터이다.
도 8은 본 발명에 따른 헥사노일기로 36% 치환된 HGC 36 포함 배지에서 배양된 섬유아세포의 세포 증식률을 나타내는 데이터이다.
도 9는 본 발명에 따른 헥사노일기로 40% 치환된 HGC 40 포함 배지에서 배양된 섬유아세포의 세포 증식률을 나타내는 데이터이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC)을 0.1 ~ 0.5 %(w/v) 함유하고, 헥사노일기(Hexanoyl group, -C(=O)C5H11))의 치환도가 10 ~ 50%인 세포 배양용 조성물을 제시한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017008603-appb-I000002
(단, 상기 화학식 1에서 x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.1≤x≤0.5, 0.1≤y≤0.2, 및 0.3≤z≤0.8임)
상기 화학식 1에서 제시하는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)은 소수성 치환기를 갖는 글리콜 키토산 유도체로서, 5번 위치의 글리콜기(CH2OC2H4-OH)가 존재하고, 2번 위치의 아민기(-NH2)의 일부가 아세틸기와 소수성 R기로 치환된 구조이며, 보다 구체적으로 헥사노일기(Hexanoyl group, -C(=O)C5H11))로 치환된 화합물이다.
상기 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)은 화학식 1에서 보는 바와 같이, 치환기로서 글리콜기, 아민기, 아세틸기 및 소수성기가 존재한다. 상기 글리콜기와 아민기는 친수성을, 아세틸기와 소수성기는 소수성을 나타내 본 발명에 따른 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)은 양친성 고분자라 할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양용 조성물을 포함하는 배지는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물로서, 당업계에는 다양한 배지가 시판되고 있으며, 인위적으로 제조하여 사용할 수도 있다. 시판 중인 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium등이 있으며, 인위적으로 제조할 수 있는 배지와 더불어 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 기본 배지로 사용할 수 있다.
후술하는 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)을 유효성분으로 함유하되, 특히 비교적 저농도로 함유한다. 그 함량이 세포의 종류마다 약간의 차이는 있었으나, 전체 세포 배양용 배지 조성물의 체적을 기준으로 0.1 ~ 0.5 %(w/v) 함유되고, 이러한 저농도에서도 세포의 모폴로지와 생존률에 부정적인 영향을 미치지 않으면서, 효과적으로 세포 증식률을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 실험예 1 내지 4에 따르면, 헥사노일기(Hexanoyl group, -C(=O)C5H11))의 치환도가 10 ~ 50%인 세포 배양용 배지 조성물에서 세포 증식이 촉진되는 것을 확인하였다.
또한 상기 세포 배양용 배지에 포함되는 성장인자로는, 예컨대 변환성장인자(transforming growth factor-β, TGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 신경세포 성장인자(nerve growth factor, NGF), 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 및 골형성단백질(bone morphogenetic protein, BMP)이 가능하다.
본 발명에서 제시하는 상기 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)을 포함하는 세포 배양용 조성물을 이용하여 배양 가능한 세포는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 바의 세포의 적용이 가능하고, 일례로 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포 및 중간엽 줄기세포, 혈관내피전구세포(Endothelial Progenitor cell), 배아줄기세포(Embryonic stem cell), 근모세포(Myoblast), 심장줄기세포(Cardiac stem cell) 등이 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 사람 폐암 세포주인 A549 세포, 사람 각막상피세포 및 사람 유래 섬유아세포이다.
본 발명에서 제시하는 화학식 1의 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)의 제조방법에는 제한이 없으나, 예컨대 다음의 방법에 의해 제조 가능하다.
출발물질로서 글리콜 키토산 공지된 방법을 이용하여 직접 제조하거나 시판되는 것을 구입하여 사용한다. 이때 시판의 글리콜 키토산으로서는 WAKO사, SIGMA사, 도쿄카세사로부터 판매되고 있는 것을 구입하여 사용이 가능하다.
상기한 반응은 최종 얻고자 하는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 내 헥사노일기(Hexanoyl group, -C(=O)C5H11))의 치환도에 따라 글리콜 키토산과 헥사노익 안하이드라이드(Hexanoic anhydride)의 몰비를 달리할 수 있으며, 일례로 글리콜 키토산의 아민기와 헥사노익 안하이드라이드가 1 : 0.1 ~ 1 : 70의 몰비 내에서 적절히 조절할 수 있다.
이때 반응은 -10 내지 60 ℃이며, 바람직하기로는 15 내지 25 ℃이고, 반응시간은 10 내지 50 시간이며, 바람직하기로는 40 내지 50 시간 동안 수행한다. 또한, 필요한 경우 반응 용매, 촉매, 반응 종결제 등의 사용이 가능하다. 사용 가능한 용매는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올과, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 테트라클로로메탄, 톨루엔, 디메틸아세트아마이드, N-메틸피롤리돈, 디메틸술폭사이드, 자이렌, 벤젠, n-부틸아세테이트, 메틸시클로헥산, 디메틸시클로헥산 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 기재한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC) 합성
글리콜 키토산(GC) 3g을 3차 증류수 375mL에 충분히 용해시킨 뒤, 증류수와 동일한 양의 메탄올(Methanol)을 첨가하여 균일하게 교반시켰다. 글리콜 키토산의 글루코사민 잔기에 대하여 1 : 0.45의 몰비(Molar ratio)로 헥사노익 안하이드라이드(Hexanoic anhydride)를 한 방울씩 적하한 뒤, 48시간 반응시켰다. 이후 반응 용액을 아세톤(Acetone)에 침전하고, 원심분리를 통해 고분자를 수득하였다. 합성된 고분자를 투석막(Molecular weight cut off = 12,000 ~ 14,000)을 이용하여 3일간 3차 증류수에 투석하였고, 동결건조를 통해 최종 파우더 형태로 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC)을 수득하였다.
<실험예 1> HGC의 세포 적합성 평가
HGC의 세포 적합성을 평가하기 위하여, 세포는 사람의 폐로부터 분리한 섬유아세포(Human lung fibroblast)를 사용하였고, 계대 배양하는 동안 10%의 우태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지를 사용하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 HGC를 0.25 %(w/v)로 용해하여 섬유아세포를 배양하였으며, HCG 미첨가 배지로 배양한 세포를 대조군(Control)으로 사용하였다.
A) HGC가 섬유아세포의 모폴로지에 미치는 영향
HGC가 포함된 DMEM 배지에서 섬유아세포를 배양한 뒤, 배양한 섬유아세포를 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일세포 형태로 부유시키고, DMEM 배지를 이용하여 수득하였다. 상기 수득한 세포를 계수하여 5.6 x 104개씩 35mm 세포배양 플레이트에 깔아준 후 37℃의 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤, HGC가 포함된 배지로 교체하였으며, 배지 교체 후 1일차, 3일차에 현미경으로 섬유아세포의 모폴로지를 관찰하였다.
도 1을 참고하면, HGC가 포함된 배지로 배양된 섬유아세포는 대조군인 HGC 미포함 배지에서 배양된 섬유아세포와 비교했을 때, 본연의 형태를 유지하며 잘 자라는 것을 확인할 수 있었다. 즉, HGC 처리의 유무는 섬유아세포의 모폴로지에 큰 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
B) HGC가 세포의 생존율에 미치는 영향
HGC가 포함된 DMEM 배지에서 섬유아세포를 배양한 뒤, 배양한 섬유아세포를 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일세포 형태로 부유시키고, DMEM 배지를 이용하여 수득하였다. 상기 수득한 세포를 4-well 세포배양 플레이트에 15,000개/웰(cells/well) 단위로 계대하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤에 HGC가 포함된 배지로 교체하였으며, 배지 교체 48시간 후, 생존/사멸(live/dead) 분석 키트로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.
도 2를 참고하면, 48시간 후 HGC가 포함된 배지에서 배양된 섬유아세포들이 대조군인 HGC 미포함 배지에서 배양된 세포와 마찬가지로 대부분 녹색 형광을 띄고 있는 것을 확인하였다. 이를 통해 HGC는 섬유아세포의 생존율에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
<실험예 2> HGC가 세포 증식에 미치는 영향
HGC가 세포의 증식활성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 실시하였다.
세포는 사람 폐암 세포주인 A549, 사람 각막상피세포(Human corneal epithelial cell), 사람 유래 섬유아세포를 사용하였다. 계대 배양하는 동안 A549 세포는 10%의 우태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였고, 각막상피세포와 섬유아세포의 경우 10%의 우태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 또한 상기 실시예 1에서 제조한 HGC를 0.1, 0.25, 0.5, 1 %(w/v) 농도로 각각의 세포배양 배지에 용해하여 세포에 처리하였으며, HCG 미첨가 배지로 배양한 세포를 대조군(Control)으로 사용하였다.
A) MTT assay를 이용한 A549 세포 증식 평가
배양한 A549 세포는 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일세포 형태로 부유시킨 뒤, RPMI 1640 배지를 이용하여 수득하였다. 상기 수득한 A549 세포를 96-well 세포배양 플레이트에 1000개/웰(cells/well) 단위로 계대 배양하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 뒤, HGC가 첨가된 배지로 교환하였다. 배지 교환 일을 0일차라 하고, 각각 0 ~ 5일차에 5mg/ml로 PBS에 용해된 MTT 용액을 각 웰당 20㎕씩 처리하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 포르마잔 결정이 형성된 것을 확인한 후, 상등액을 제거하였다. DMSO을 이용하여 결정을 녹인 뒤 540nm의 파장 대에서 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 통해 흡광도를 측정하여 세포의 증식을 확인하였다.
도 3에서 알 수 있듯이, HGC가 첨가된 배지에서 배양된 A549 세포는 대조군인 HGC 미첨가 배지에서 배양된 A549 세포와 비교하였을 때 시간의 흐름에 따라 통계상 유의적으로 더 높은 세포 증식률을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
B) MTT assay를 이용한 각막상피세포 증식 평가
배양한 각막상피세포는 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일세포 형태로 부유시킨 뒤, DMEM 배지를 이용하여 수득하였다. 상기 수득한 세포를 96-well 세포배양 플레이트에 2000개/웰(cells/well) 단위로 계대 배양한 뒤, 상기 A549 세포와 동일한 과정을 거쳐 배지 교환 0 ~ 7일차에 흡광도를 측정하여 세포의 증식을 확인하였다.
도 4에서 알 수 있듯이, HGC가 첨가된 배지에서 배양된 각막상피세포는 모든 농도에서의 세포 증식률이 HGC 미첨가 배지에서 배양한 세포의 증식률보다 높은 것을 확인할 수 있었고, 특히 0.5%(w/v) 농도의 배지에서 배양된 세포가 가장 높은 증식률을 보이는 것을 확인하였다.
C) MTT assay를 이용한 섬유아세포 증식 평가
배양한 섬유아세포는 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일세포 형태로 부유시킨 뒤, DMEM 배지를 이용하여 수득하였다. 상기 수득한 세포를 96-well 세포배양 플레이트에 2000개/웰(cells/well) 단위로 계대 배양한 뒤, 상기 A549 세포와 동일한 과정을 거쳐 배지 교환 0 ~ 7일차에 흡광도를 측정하여 세포의 증식을 확인하였다.
도 5에서 알 수 있듯이, HGC가 첨가된 배지에서 배양된 섬유아세포는 HGC 미첨가 배지에서 배양한 세포의 증식률보다 높게 나타난 것을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 0.25%(w/v) 농도의 배지에서 배양된 세포가 가장 높은 증식률을 보이는 것을 확인하였다.
<실험예 3> HGC 처리에 따른 DNA 함량 비교
유세포 분리 측정기(Fluorescent activating cell sorting, FACS)를 이용하여 HGC가 섬유아세포의 세포주기에 미치는 영향을 분석하였다.
먼저 섬유아세포를 35mm 세포배양 플레이트에 5.6 x 104개씩 계대 배양하였다. 24시간 후, HGC가 0.25%(w/v) 첨가된 배지로 교환하였다. 각각 1, 3, 5, 7일차에 트립신 효소를 처리하여 섬유아세포를 수득하였고, 0.5%의 Tween 20이 포함된 95% 에탄올을 첨가하여 고정하였다. 고정 용액을 제거한 뒤, 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide)를 첨가하여 상온에서 30분간 세포의 DNA를 염색하였다. 40㎛의 세포여과기(Cell strainer)로 세포를 통과시킨 뒤, 유세포 분리 측정기(FACS)를 이용하여 세포의 DNA 함량을 측정하였다.
도 6에서 알 수 있듯이, HGC가 첨가된 배지에서 배양된 섬유아세포에서 G2/M 주기를 갖는 세포가 차지하는 비율이 HGC를 처리하지 않은 세포군보다 높은 비율을 나타내는 것을 확인하였다. G2/M기에 해당하는 세포의 비율이 높다는 것은 세포의 증식이 비교적 활발하게 진행된다는 의미로 해석되므로, 앞선 결과들과 마찬가지로 HGC가 세포의 증식을 유도한다는 결과를 확인할 수 있었다.
<실험예 4> HGC의 치환도가 세포 증식에 미치는 영향 비교
화학적 개질을 하지 않은 글리콜 키토산(GC)과 헥사노일기의 치환도(Degree of Substitution, DS)가 다른 두 종류의 HGC가 세포 증식에 미치는 영향을 비교하기 위하여 CCK-8(Cell counting kit-8) assay를 실시하였다. HGC는 치환도가 약 36%인 HGC 36과 DS가 약 40%인 HGC 40은 사용하였고, 각각 0.05, 0.1, 0.25%(w/v)으로 세포배양 배지에 용해하여 세포에 처리하였다. Control은 GC 및 HGC 미첨가 배지로 배양한 세포이며, 세포는 섬유아세포를 사용하였다.
배양한 섬유아세포는 0.05%의 트립신 효소를 처리하여 단일세포 형태로 부유시킨 뒤, DMEM 배지를 이용하여 수득하였다. 상기 수득한 세포를 계수하여 96-well 세포배양 플레이트에 2000개/웰 (cells/well)단위로 계대 배양하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 24시간 뒤에 GC, HGC 36, HGC 40이 첨가된 배지로 교환하였다. 배지 교환 후 1, 3, 5일차에 CCK-8 용액을 각 웰당 10㎕씩 처리하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 1시간 30분 동안 배양하였다. Microplate reader를 사용하여 450nm의 파장 대에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식을 확인하였다.
도 7 내지 도 9에서 알 수 있듯이, HGC를 첨가한 배지로 배양한 세포(HGC36, HGC40)의 경우 Control과 GC를 첨가한 배지로 배양한 세포와 비교하였을 때 비교적 높은 세포 증식률을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 HGC 36과 HGC 40 배지로 배양한 세포를 비교하였을 때, 치환도가 더 높은 HGC 40 배지로 배양한 세포의 세포 증식률이 더 높은 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 0.25%(w/v)의 농도가 가장 높은 값을 보인다는 결과를 확인할 수 있었다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC)을 0.1 ~ 0.5 %(w/v) 함유하고, 헥사노일기(Hexanoyl group, -C(=O)C5H11))의 치환도가 10 ~ 50%인 세포 배양용 배지 조성물.
    Figure PCTKR2017008603-appb-I000003
    (단, 상기 화학식 1에서 x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.1≤x≤0.5, 0.1≤y≤0.2, 및 0.3≤z≤0.8임)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지 조성물은 사람 폐암 세포주인 A549 세포, 사람 각막상피세포 및 사람 유래 섬유아세포를 배양하기 위한 배지 조성물인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 헥사노일 글리콜 키토산은 중량평균분자량(Mw)이 100 ~ 5,000,000인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양용 배지 조성물은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMax complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지용 조성물인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물.
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