KR20200036964A

KR20200036964A - 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포 배양 방법

Info

Publication number: KR20200036964A
Application number: KR1020180115572A
Authority: KR
Inventors: 허강무; 주찬양; 멀릭 수딥타; 문성환; 정영훈
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-04-08
Also published as: KR102122084B1

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 헥사노일 글리콜 키토산을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 장기간의 배양기간에도 중간엽 줄기세포의 노화가 억제되고 다분화능이 유지될 수 있으며, 이렇게 배양된 중간엽 줄기세포는 치료자원으로서 유용하다.

Description

중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포 배양 방법{Composition for Preventing Aging of Mesenchymal Stem Cells and Method For Culturing Mesenchymal Stem Cells Using the Same}

본 발명은 헥사노일 글리콜 키토산을 유효성분으로 함유하는, 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포 배양 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자가복제가 가능하고, 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력이 있는 세포로서, 재생의학, 조직공학과 같은 세포 치료제로 유용하며, 최근에는 성형과 미용에 이르기까지 그 유용성과 이용 범위가 확대되고 있다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSCs)는 지방세포, 골세포 및 연골 세포로 분화하는 다분화능을 가지고 있다. 더욱이 중간엽 줄기세포 기반 치료법은 다양한 주변분비(paracrine) 효과, 낮은 면역 반응 조절 및 면역원성(immunogenicity)을 나타내 세포 치료의 효과적인 수단으로 각광받고 있다.

지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-derived mesenchymal stem cell, AD-MSCs)은 조직으로부터 쉽게 분리될 수 있고 지방 흡입술에 의해 얻어질 수 있고, 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 잘 증식하고, 윤리적 문제 소지가 가장 적으며, 기증된 것이 많아 다양한 실험에 이용되고 있다. 그러나 줄기세포는 스스로 재생할 수 있지만, 노화 후에는 그 특징이 바뀐다. 이러한 이유로, 다양한 용도로 충분한 세포를 얻는 것은 어렵고, 이러한 한계를 극복하여 중간엽 줄기세포의 증식을 증가시키기 위해 여러 가지 사이토카인, 배지, 생체재료 등이 사용되어 왔다.

세포 치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1X10⁹정도이며, 배양조건 및 기준을 확립하는 단계에서 필요한 세포들까지 고려하면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중간엽 줄기세포로 이 정도 수의 세포를 공급하려면 최소 in vitro에서 10번 이상의 계대가 필요하며, 이 과정에서 세포는 노화되고 변형되어 더이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다. 이는 지금의 중간엽 줄기세포의 배양시스템이 반드시 풀어야 할 문제점의 하나로서, 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 실용화하기 위해서는 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 대량생산 방법이 필요하다.

최근, 다양한 생체 재료가 세포 운명을 지원하거나 제어하기 위해 연구되어왔다. 그 중에서도 셀룰로오스 이후 자연계에서 발견되는 가장 풍부한 폴리머인 키틴의 탈아세틸화된 형태인 키토산은 생체 적합성, 생분해성 및 기타 생체 기능의 유망한 특성 때문에 광범위하게 연구되어왔다. 가장 중요한 것은, 다공성 구조 및 겔 형성 특성을 갖는 양이온성 다당류로서, 키토산은 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 원하는 성장 인자의 흡착에 의해 쉽게 화학적으로 변형될 수 있고 생체 내 거대 분자에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것이다. 또한, 세포 외 기질의 다당류 및 글리코사미노글리칸 부분을 모방하여 세포 접착, 이동 및 증식을 위한 기질로서 기능 할 수 있게 한다. 수용성 키토산 유도체인 글리콜 키토산 및 그 유도체는 물리 화학적 및 생물학적 특성의 특성이 거의 없더라도 다양한 약제 및 생물 의학 응용에 적합한 물질로 제안되어왔다.

대한민국 등록특허공보 제1502579호 "소수성 치환기를 갖는 글리콜 키토산 유도체, 이의 제조방법 및 용도" 대한민국 등록특허공보 제1647793호 "온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법" 대한민국 등록특허공보 제181539호 "세포 배양용 배지 조성물"

본 발명의 과제는 장기간의 배양기간에도 줄기세포의 노화가 억제되고 다분화능이 유지되는, 중간엽 줄기세포의 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포 배양 방법을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은

하기 화학식 1의 헥사노일 글리콜 키토산을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, 상기 x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.1≤x≤0.5, 0.1≤y≤0.2, 및 0.3≤z≤0.8이다)

또한 본 발명은

중간엽 줄기세포에 상기한 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물을 처리한 후 계대 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 장기간의 배양기간에도 중간엽 줄기세포의 노화가 억제되고 다분화능이 유지될 수 있으며, 이렇게 배양된 중간엽 줄기세포는 치료자원으로서 유용하다.

도 1의 (A)는 헥사노일 글리콜 키토산의 합성과정을 나타낸 화학식, (B)는 ¹H-NMR 분석 스펙트럼, (C)는 FT-IR 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 실험예에서 사용된 지방 유리 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위해 세포표면 표식자 CD31, CD34, CD44, CD73, CD90 및 CD105의 발현 정도를 확인한 결과, (b)는 지방 유래 중간엽 줄기세포의 다분화 특성을 조사하기 위해 von kossa 염색, 오일 레드 O 염색 및 Alcian blue 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 5회 계대 배양 시부터 4일 동안 각각 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 1 mg/ml의 헥사노일 글리콜 키토산 처리한 시험에 대한 모식도, (b)는 4일 후 각 처리군의 세포수를 나타낸 그래프, (c)는 4일 후 대조군과 1 ㎍/ml HGC 처리군의 세포 형태를 나타낸 사진, (d)는 대조군과 1 ㎍/ml 처리군의 각각 5회 계대 배양과 10회 계대 배양시 집단 배가 시간을 나타낸 그래프이다.
도 4의 (a)는 1 ㎍/ml의 HGC와 함께 각각 5 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5 ng/ml의 염기성 섬유아세포 성장인자 처리한 시험에 대한 모식도, (b)는 1일, 2일, 3일, 4일 후 세포 형태를 나타낸 사진이다.
도 5의 (a)는 대조군 및 bFGF 단독 처리군, bFCF/HGC 처리군의 5회 계대 배양, 10회 계대 배양 시 집단 배가 시간(PDT)를 나타낸 그래프, (b)는 . 고농도의 bFGF 처리군과 비교할 때, bFGF 농도가 낮을지라도 HGC를 함께 처리하여 배양했을 때 확이다.
도 6은 10회 계대 배양 시 1 ㎍/ml의 HGC 단독 처리군의 세포 주기 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 각 처리군에서 10회 계대 배양시 산소 소비율(OCR) 분석 결과 (b)는 ATP 생성, (c)는 최대 호흡, (d)는 해당, (e) 해당 능력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시간 PCR을 이용하여 SIRT1, DNMT1, DNMT3B, DNMT3A, p21 및 p53 mRNA 발현 정도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 HGC 처리한 다음 5회 계대 배양한 후에 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)의 특성이 유지되는지를 확인하기 위해 10 회 계대 배양 시 각 군의 세포 표면 마커 발현 분석결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물은 하기 화학식 1의 헥사노일 글리콜 키토산을 유효성분으로 포함한다:

[화학식 1]

상기 헥사노일 글리콜 키토산(N-hexanoyl glycol chitosan, HGC)은 소수성 치환기를 갖는 글리콜 키토산 유도체로서, 5번 위치의 글리콜기(CH₂OC₂H₄-OH)가 존재하고, 2번 위치의 아민기(-NH₂)의 일부가 아세틸기와 소수성 기인 헥사노일기(-C(=O)C₅H₁₁)로 치환된 화합물이다. 바람직하기로, 상기 헥사노일 글리콜 키토산의 중량평균분자량(Mw)은 100 ~ 5,000,000 g/mol이다.

본 발명의 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)은 치환기로서 소수성기인 아세틸기와, 친수성기인 글리콜기, 아민기를 포함하는 양친성 고분자이다.

상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수 유래, 제대혈 유래, 그 외 태반, 근육, 신경 조직 등 다양한 성체조직 유래의 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있고, 바람직하게는 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 골수, 조직, 지방 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 배양되어 연골세포, 골세포, 지방세포로의 분화가 유도된 중간엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다.

본 발명의 노화 억제용 조성물은 중간엽 줄기세포가 일정 횟수의 분열 이후에 자가재생(selfrenewal) 및 다분화능(multipotency)으로 대표되는 줄기성을 상실함으로써 개체수 및 재생능이 감소하는 현상인 노화를 억제한다.

본 발명의 실험예 2에서 확인한 바와 같이, 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)과 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 함께 처리한 처리군과 염기성 섬유아세포 성장인자 단독 처리군 모두 대조군에 비해 집단 배가 시간(PDT)이 감소하였으나, 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)의 특정 효능은 확인되지 않아 4일 동안 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리가 제4계대 지방 유래 줄기세포 세포 증식에 영향을 미치지 않았다(도 5 참조).

그러나 제10계대 줄기세포의 경우 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리군은 처리하지 않은 군에 비해 집단 배가 시간(PDT)이 감소하여 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 장기 배양시 증식능 및 세포 노화에 기여할 수 있음을 확인하였다. 또한, 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리군에서 상대적으로 풍부한 G2-M 단계는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리에 의해 증가된 줄기세포 증식능에 대한 결과를 뒷받침한다(도 5의 (b)).

신진 대사 분석에서 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리군에서의 비교적 높은 ATP 생성과 최대 호흡은 빠른 세포 증식으로 인한 것일 수 있다. 또한 생물학적 에너지는 주로 미토콘드리아 호흡에 의해 생성되기 때문에 해당 능력(glycolytic capacity)은 상대적으로 감소했다. 이러한 결과는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 장기간의 배양 동안 미토콘드리아 기능을 증가시킬 수 있음을 의미한다. 중간엽 줄기 세포가 다른 계통으로 분화되었는지 여부를 확인하기 위해 MSC의 표면 표식 발현을 분석한 결과, 5회 계대 배양 후 비처리군과 표현형이 일치하였다. 그리고 장기간 배양 후에 분화능이 억제된다고 보고되었기 때문에, 제10계대에서 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리군의 분화능 유지는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 지방 유래 줄기세포(AD-MSC)의 증식 능력을 촉진하고 장기 배양 후 그들의 분화능을 보존한다는 것을 입증할 수 있다.

SIRT1은 텔로미어 노화를 조절하고 DNA 손상으로부터 세포를 보호한다. 따라서, 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)의 SIRT1 상향 조절은 생물학적 노화 과정을 약화시켜 지방 유래 줄기세포(AD-MSC)의 증식을 증가시킨다. 또한, DNA 메틸화는 복제 노화와 밀접하게 관련되어 있기 때문에 DNA 메틸 전이 효소(DNMTs)의 유전자 발현을 분석했다. 복제 노화 동안 실질적으로 하향 조절되는 DNMT1과 DNMT3B의 증가는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 세포 노화를 억제할 수 있음을 보여 주었다. 또한, 새로운 메틸화에 관여하고 DNMT3B와 반대되는 역할을 하는 DNMT3a의 감소는 일관되게 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 줄기세포의 노화를 억제한다는 것을 뒷받침한다.

더욱이, 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 처리에 의한 p21 및 p53의 하향 조절은 세포 노화를 억제하고 HGC 처리군의 증가된 증식의 이유이다. 이러한 결과는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 세포 친화성을 통해 노화 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 시사한다.

추가적으로 본 발명의 노화 억제용 조성물은 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)를 함유할 수 있다. 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)과 함께 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 처리하는 경우 상대적으로 낮은 농도의 염기성 섬유아세포 성장인자를 사용하고도 중간엽 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다. 이는 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 세포 외 기질의 글리코사미노글리칸 그룹과의 상호 작용이 잘되어 세포에 더 잘 전달됨으로써 세포 증식에 영향을 줄 수 있기 때문이다.

이때 상기 헥사노일 글리콜 키토산 또는 상기 염기성 섬유아세포 성장인자는 중간엽 줄기세포 배양에 사용되는 배지에 첨가되어 사용될 수 있다.

상기 배지는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 중간엽 줄기세포 성장인자를 제외한 혼합물인 기본 배지를 이용할 수 있다. 이때 기본배지는 인위적으로 합성하여 사용하거나 상업적으로 구매 가능한 화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), a-MEM(a-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), 및 IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 가능하다.

본 발명의 줄기세포 노화 억제용 조성물 중 상기 헥사노일 글리콜 키토산은 10 ng/ml 내지 1 mg/ml 농도, 상기 염기성 섬유아세포 성장인자는 0.5 ng/ml 내지 5 ng/ml 농도로 함유될 수 있다. 만약 상기 범위 미만인 경우 줄기세포 증식 촉진, 노화 억제 효과가 미미하고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 중간엽 줄기세포에 독성으로 작용하거나 그 효과가 크게 증가하지 않는다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양 방법은,

중간엽 줄기세포에 상기한 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물을 처리한 후 계대 배양하는 단계를 포함한다.

상기 계대 배양은 중간엽 줄기세포가 동일성이 유지되면서 증식 배양되는 유지 배양으로, 이때 상기 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 보유한 중간엽 줄기세포이다.

바람직하기로, 상기 계대 배양은 제10계대 이상의 중간엽 줄기세포를 얻을 때까지 수행한다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 기재한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC) 합성

1-1. 헥사노일 글리콜 키토산(Hexanoyl glycol chitosan: HGC) 합성

3g의 글리콜 키토산(GC)를 375㎖의 증류수에 용해시킨 후 메탄올 375㎖로 희석하였다. 헥사노익산 무수물(hexanoic anhydride)를 1.119㎖을 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 교반 하였다. 얻어진 반응 생성물을 아세톤에서 24시간 동안 침전시키고 10000rpm에서 20분 동안 원심분리 하였다. 이어서 투석막(분자량 컷오프 : 10-12 kDa)을 이용하여 3일간 투석하였다. 불순물을 제거한 후 동결 건조하여 고형의 백색 분말의 헥사노일 글리콜 키토산(N-hexanoyl glycol chitosan,HGC)을 얻었다.(도 1의 (A))

1-2. ¹H-NMR spectra를 통한 특성 분석

글리콜 키토산(GC), 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)의 화학적 조성은 600MHz에서 작동하는 Avance Ⅲ 600 분광기를 사용하여 ¹H-NMR을 통해 분석하였다. 샘플은 1wt %의 농도로 D₂O에 용해시켰다. 글리콜 키토산(GC), 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 각각의 스펙트럼 모두 δ = 4.65 ppm에서 용매로 사용한 D₂O의 피크를 기준피크로 사용하였다. 그 결과는 도 1의 (B)에 나타내었다.

1-3. FT-IR spectra를 통한 특성 분석

글리콜 키토산(GC), 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)의 구조적 특성은 Nicolet iS5 분광기(Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 감쇠전반사-푸리에 변환적외선 분광법(ATR-FTIR)스펙트럼을 통해 분석하였다. 분석은 화학적 변형을 확인하기 위해 750~3800cm^-1의 주파수 범위에서 4cm^-1의 분해능으로 수집된 16회의 스캔으로 수행하였다. 그 결과는 도 1의 (C)에 나타내었다. 도 1의 (C)에서 보듯이, 글리콜 키토산(GC), 헥사노일 글리콜 키토산(HGC) 각각의 스펙트럼에서 카보닐 결합(C=O)의 신축 진동을 나타내는 파장(1655cm^-1)과 C-H의 신축 진동을 나타내는 파장(2880-2930cm^-1) 모두 확인하였고, 글리콜 키토산(GC)의 스펙트럼에서는 1차 아민 결합의 굽힘 진동을 나타내는 흡수 파장이 1596cm^-1에서 나타났다. 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)의 스펙트럼에서는 1596cm^-1에서의 피크가 사라지고, 1555cm^-1에서 아미드 Ⅱ 결합(N-H)의 굽힘 진동을 나타내는 흡수 파장을 확인하였다.

이와 같은 ¹H-NMR spectra, FT-IR spectra를 통한 특성 분석을 통해 헥사노일 글리콜 키토산(HGC)이 잘 합성되었음을 확인하였다.

실험예 1: 헥사노일 글리콜 키토산을 이용한 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양

1-1. 세포 배양

hAD-MSCs(ATCC, Manassas, VA, USA)를 폴리스티렌 조직 배양 접시에 4500 세포/cm²의 밀도로 접종하고 GlutaMAX, 10 wt% 우태아 혈청 (FBS; Thermo Fisher Scientific), 1 wt% 페니실린-스트렙토 마이신(P/S; Thermo Fisher Scientific) 및 HGC 및 / 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자 세포를 포함하는 최소 필수 배지 a-modification(a-MEM, Thermo Fisher Scientific)에서 5 % CO₂를 함유한 가습 분위기에서 37 ℃로 유지시켰다. 배지는 2일마다 교체하였고, 세포를 상기와 같이 배양 배지에서 ~ 90 % 컨플루언스까지 배양하였다.

배양 4일 후 ≥90 %의 컨플루언스에 도달하면, 0.25 wt% 트립신-EDTA (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 증식된 세포를 분리하였다. 그런 다음, 수집된 세포를 1000 rpm, 5분 동안 원심 분리하고, 세포를 4500 세포 /cm²의 밀도로 접종하였다. 결과적으로, 모든 세포는 10회 계대 배양하여 ~ 90 %의 컨플루언스 정도 되었을 때까지 계대되었다.

1-2. 지방 유래 중간엽 줄기세포 특성 분석

~ 90 %의 컨플루언스정도 되었을 때 0.25 % 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 분리하고, 펠릿을 FACS 완충액(BSA 및 0.5 mM 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 용액)에 재현탁시키고, 미리 습윤된 40 ㎛ 셀 스트레이너를 이용하여 필터링하였다. 그 후 세포를 제조사의 지침에 따라 MSC 표면 마커의 각 항체를 사용하여 표지하였다. 항체의 종류는 다음과 같다:

CD44-APC, CD73-PE, CD90-APC 및 CD105-PE (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), APC 및 PE (BD Biosciences)에 컨쥬게이트된 음성 마커 CD31 및 CD34가 사용되었다. 또한, IgG 대조군을 동등하게 제조하고, Becton Dickinson FACS Calibur (BD Biosciences)를 사용하여 30,000개의 표지화된 세포를 수득하고 분석하였다.

도 2의 (a)는 실험예에서 사용된 지방 유리 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하기 위해 세포표면 표식자 CD31, CD34, CD44, CD73, CD90 및 CD105의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 (a)를 참조하면, 실험예에서 사용된 지방 유래 중간엽 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105 발현을 나타내는 일반적인 MSC 항원 프로파일뿐만 아니라 음성 마커 CD31 및 CD34의 음성을 나타내었다. 이러한 결과는 세포가 MSC의 모든 적절한 마커를 발현하고 다른 분화 지표를 나타내지 않았음을 나타낸다.

추가로 지방 유래 중간엽 줄기세포의 다분화 특성을 조사하기 위해 von kossa 염색, 오일 레드 O 염색 및 Alcian blue 염색에 의해 표현된 바와 같이, 지방 유래 중간엽 줄기세포를 조골 세포, 지방 세포 및 연골 세포로 분화시켰다(도 2의 (b)). 이 모든 결과를 종합해 보면, 실험예에서 사용된 지방 유래 중간엽 줄기세포는 정상 마커 발현 및 분화 가능성이 있음을 보여준다.

1-3. 다중 계통 분화 평가

조골 세포, 연골 모세포 및 지방 세포의 유도를 위해 시판되는 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용 하였다. 분화 조건 하에서 세포를 12- 웰 플레이트에서 유지시켰다. 골형성(Osteogenesis)와 연골 형성(chondrogenesis)는 21일 동안 배양되었고 지방 세포 계통은 14일 동안 유도되었다. 모든 실험 절차는 제조자의 지시에 따라 수행되었다. 각 분화 과정을 평가하기 위해, 적절한 염색이 수행되었다 : Oil Red O는 세포 내 지질 액적을, Von kossa는 세포 외 미네랄화 된 매트릭스를, Alcian blue는 proteclycans의 형성을 확인하기 위해 사용하였다. 이미지는 역상 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 분석하였다.

1-4. 세포 증식 분석

세포는 각 계대의 시작과 끝에서 혈구계를 사용하여 계수되었다. 집단 배가 시간(Population doubling time)은 PDT = ln2·T / ln (N_T / N₀) 식 (NT는 계대의 끝에서의 세포 수, N0는 접종 밀도에서의 세포수, T는 배양 시간)을 이용하여 계산하였다.

장기 배양 후 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)의 증식률을 알아보기 위해 5회 계대 배양된 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)를 접종하여 5회 계대 배양 시 각각 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 1 mg/ml의 농도로 HGC를 처리하였다(도 3의 (a)).

도 3의 (b)와 (c)를 참조하면, HGC를 1 μg/mL로 4일 동안 처리하였을 때 세포가 대조군보다 빠르게 증식하는 것을 관찰하였다. 또한 HGC 투여군의 집단 배가 시간(Population doubling time)는 10회 계대 배양 후 대조군에 비해 감소하였으며(도 3의 (d)), 이는 최적 처리 농도 1㎍ / mL로 HGC를 처리하는 경우 세포 증식을 촉진시키고, 집단 배가 시간(PDT)을 줄일 수 있음을 나타낸다.

실험예 2: 헥사노일 글리콜 키토산과 염기성 섬유아세포 성장인자를 이용한 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양

2-1. 세포 증식 분석

염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)는 중간엽 줄기세포의 성장을 촉진하기 위해 널리 사용되어 왔기 때문에 bFGF와 함께 HGC를 사용하는 경우 줄기세포 성장에 미치는 영향을 확인하였다. 사용된 bFGF의 농도는 순차적인 희석하여 5 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5 ng/ml으로 하였으며, 1 ㎍/ml의 HGC와 함께 처리하였다(도 4의 (a)). 모든 bFGF 처리군은 HGC 처리에 관계없이 4일 후 5회 계대 배양시 대조군보다 세포 수가 유의하게 증가함을 보였다. 그러나 다양한 농도의 bFGF를 사용한 HGC/bFGF 처리군과 bFGF만을 처리한 처리군은 5회 계대 배양시 세포 밀도에 유의한 차이가 없었다(도 4의 (b)).

더욱이, bFGF 처리군은 5회 계대 배양시 유사한 집단 배가 시간(PDT)를 보였지만, HGC/bFGF 처리군의 PDT는 대조군 및 bFGF 단독 처리군의 PDT보다 5회 계대 배양 후 훨씬 더 감소하였다(도 5의 (a)). 고농도의 bFGF 처리군과 비교할 때, bFGF 농도가 낮을지라도 HGC를 함께 처리하여 배양했을 때 확장 가능한 세포 수를 얻을 수 있었다.

2-2. 세포주기 분석

5회 계대 후 표시된 농도의 HGC로 처리된 AD-MSC를 분리하고 4 ℃에서 밤새 70 % 에탄올에 고정시켰다. PBS(Thermo Fisher Scientific)로 세척한 후, 세포를 FxCycle PI/RNase 염색 용액(Thermo Fisher Scientific)에 재현탁하고 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 항온 배양하였다. 세포는 Becton Dickinson FACS Calibur(BD Biosciences)를 사용하여 샘플당 30,000개 이상의 세포를 유동 세포 계측법으로 분석하였다.

세포주기 분석 결과, G2-M 기가 HGC 처리군에서 비 처치군보다 유의하게 더 상향 조절되었다(도 5의 (b)). 특히, G2-M 기는 HGF와 함께 0.5 ng/mL의 bFGF 처리군에서 유의하게 증가하였다. 또한 1 ug/mL의 HGC 만 처리한 세포는 대조군에 비해 G2-M 단계에서 HGC 단독 처리군이 약간 더 높은 세포 집단을 보였지만 bFGF 단독 군보다 낮은 세포 집단을 보였다. 이와 같은 결과를 통해, 최소한의 bFGF를 HGC와 함께 사용시 지방 유래 중간엽 줄기세포의 증식을 효율적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다.

2-3. 산소 소비율 (OCR)과 세포 외 산성화율 (ECAR) 분석

산소 소비율(OCR)과 세포 외 산성화율(ECAR)은 Seahorse Biosciences 키트를 사용하여 분석했다. 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSCs)는 XF96 세포 배양 마이크로 플레이트 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA)에 파종하고 분석 전에 70 % 컨플루언스까지 성장시켰다. 세포가 ~ 70 % 컨플루언스에 도달했을 때, OCR 분석을 위한 2mM 나트륨 피루베이트 및 2.5mM 글루코스를 포함하는 XF 분석 배지(Seahorse Bioscience)로 배양 배지를 교체하였다.

산소 소비율(OCR)을 정량화하기 위해, 먼저 기초 산소 소비율(OCR)을 측정했다. 다음으로, 세포가 1μM 올리고 마이신, 1μM FCCP 및 1μM 항 마이신 A와 로테논의 조합으로 연속적으로 처리되었을 때 OCR의 일련의 변화를 측정하였다. 전체 산소 소비율(OCR)을 분석했다. 세포외 산성화율(ECAR)의 측정을 위해 염기성 산성화율을 측정한 후 10 mM 포도당, 2 μM 올리고 마이신, 100 mM 2-디옥시-글루코오스(2-DG)를 순차적으로 처리 한 후 산성화 속도의 연속적인 변화를 측정하였다. 이를 위해 배양 배지 pH의 변화를 매 20초 마다 모니터링하고 전체 세포 외 산성화 속도(ECAR)를 계산하는 데 사용했다.

장기간의 HGC 처리 후 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSCs)의 대사 변화를 측정하기 위해 10회 계대 배양 시 Extracellular Flux Analyzer를 이용하여 산소 소비율(OCR)과 세포 외 산성화율(ECAR)을 분석하였다.

산소 소비율(OCR) 분석에서 올리고마이신 처리 후 HGC 처리 군, 특히 0.5 ng/mL bFGF를 함께 처리한 처리군의 산소 소비율은 미처리 군에 비해 더 많이 저해되어 미토콘드리아에서 ATP 생산이 증가함을 나타내었다(도 7의 (a))).

다음으로, 미토콘드리아에서 산화적 인산화의 강력한 차단제인 FCCP 존재하에, HGC와 함께 0.5ng/mL의 bFGF 처리군은 미처리군에 비해 보다 훨씬 많은 OCR을 나타내었으며(도 7의 (c)), 이는 미토콘드리아의 최대 호흡 기능이 증가하였음을 의미한다. 반면에, 세포 외 산성화율(ECAR) 분석에서, 글루코스가 존재하는 경우, HGC 처리군의 당화 산성화(glycolytic acidification)는 비처리된 군보다 낮았다(도 7의 (e)). 또한, HGC 처리군은 해당 능력(glycolytic capacity)이 감소하여, 이러한 결과는 HGC 비처리군은 미토콘드리아 호흡보다는 해당과정(glycolysis)를 사용하여 에너지를 생성함을 나타내었다(도 7의 (f)).

이와 같은 결과는, 상대적으로 낮은 농도의 bFGF를 처리하여도 미토콘드리아 기능을 증가시키기 때문에 AD-MSC의 장기 배양 시 HGC와 함께 bFGF 처리하는 것이 효과적이라는 것을 보여준다.

2-4. 실시간 PCR

TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 각 샘플의 총 RNA를 추출했다. 고용량 cDNA 역전 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 1㎍의 전체 RNA를 상보적 데옥시 리보 핵산(cDNA)으로 전사시켰다. LightCycler 96 기기(Roche)에서 FastStart Essential DNA Green Master (Roche, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 실시간 PCR을 수행했다.

표적 유전자와 연관된 프라이머는 다음과 같다:

SIRT1 센 5'- GATAAC CTTCTGTTCGGTGA, SIRT1 안티센스 5'- GAATTGTTCGAGGATCTGTG, DNMT1 센스 5'- GCT ACCTGGCTAAAGTCAAA, DNMT1 안티센스 5'- ATTCACTTCCCGGTTGTAAG, DNMT3A 센스 5'- CAGAAGAAGAGAAGAATCCCTAC, DNMT3A 안티센스 5' CTCATCAATAATCTCCTTGACC, DNMT3B 센스 5'--GCAGGCAGTAGGAAATTAGA, DNMT3B 안티센스 5'-GGTCTTTGCCGTTGTTATAG, p21 센스 5'-AGAAGAGGCTGGTGGCTATTT, p21 안티센스 5'-CCCGCCATTAGCGCATCAC, p53 센스 5'-AGATAGCGATGGTCTGGC, p53 안티센스 5'-TTGGGCAGTGCTCGCTTAGT.

HGC/bFGF 복합 처리에 의한 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC) 성장 자극이 세포 노화의 유전자 발현과 관련이 있는지를 확인하기 위해 정량 실시간 PCR을 이용하여 SIRT1, DNMT1, DNMT3B, DNMT3A, p21 및 p53 mRNA 수준을 평가 하였다(도 8 참조). Sirtuin 1(SIRT1)의 발현은 HGC로 처리한 세포, 특히 0.5 ng/ mL bFGF 처리군에서 유의하게 증가되었다. DNA 메틸 전이 효소(DNMTs)의 발현을 분석한 결과 DNMT1과 DNMT3B는 대조군보다 모든 bFGF 처리 군에서 더 많이 증가하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 새로운 메틸화에 관여하는 DNMT3A는 HGC 처리군에서 하향 조절되었다. 또한, p21 및 p53은 모두 대조군보다 bFGF로 처리한 모든 그룹에서 하향 조절되었다. 특히, HGC와 함께 0.5ng/mL의 bFGF 처리군에서 가장 유의적인 하향 조절을 보였다. 전체적으로, 이러한 결과는 HGC/bFGF 조합 처리가 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)의 세포 노화 조절에 기여할 수 있음을 나타낸다.

시험 관내에서 HGC 처리로 5 회 계대 배양한 후에 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)의 특성이 유지되는지를 확인하기 위해 10 회 계대 배양 시 각 군에 대해 유세포 분석기로 세포 표면 마커 발현을 분석하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9를 참조하면, 모든 군에서는 CD44, CD73, CD90 및 CD105가 양성 표지자에 대해 평균 95 % 이상, 음성 마커에 대해 CD31 및 CD34가 부족한 것으로 나타났다. 이는 HGC와의 장기간 배양 후 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC) CD 프로파일의 안정성을 입증한다. 또한, 10회 계대 배양에서 각 군의 다중 선별 분화능을 조사 하였으며, von kossa, Oil Red O 및 Alcian blue 염색에서 확인한 바에 따라 모든 그룹이 골아 세포, 지방 세포 및 연골 세포로 잘 분화된다는 것을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1의 헥사노일 글리콜 키토산을 유효성분으로 함유하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, 상기 x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.1≤x≤0.5, 0.1≤y≤0.2, 및 0.3≤z≤0.8이다)
제1항에 있어서, 상기 조성물은
염기성 섬유아세포 성장인자를 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은
중간엽 줄기세포의 SIRT1 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은
중간엽 줄기세포의 DNMT1 및 DNMT3B 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은
중간엽 줄기세포의 p21 및 p53 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 헥사노일 글리콜 키토산은 10 ng/ml 내지 1 mg/ml 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 염기성 섬유아세포 성장인자는 0.5 ng/ml 내지 5 ng/ml 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물.
중간엽 줄기세포에 제1항에 따른 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물을 처리한 후 계대 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 방법.
제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 노화 억제용 조성물은 4일 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양 방법.
제8항에 있어서, 상기 계대 배양은 제10계대 이상의 중간엽 줄기세포를 얻을 때까지 수행하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양 방법.