TWI637055B - 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 - Google Patents

多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI637055B
TWI637055B TW103130514A TW103130514A TWI637055B TW I637055 B TWI637055 B TW I637055B TW 103130514 A TW103130514 A TW 103130514A TW 103130514 A TW103130514 A TW 103130514A TW I637055 B TWI637055 B TW I637055B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
pluripotent stem
culture
stem cell
cell
Prior art date
Application number
TW103130514A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201522638A (zh
Inventor
岡入梨沙
西村益浩
和田圭樹
Original Assignee
大塚製薬工廠股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大塚製薬工廠股份有限公司 filed Critical 大塚製薬工廠股份有限公司
Publication of TW201522638A publication Critical patent/TW201522638A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI637055B publication Critical patent/TWI637055B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本發明的目的，在於提供一種低成本並能夠簡單製備具有多能性且腫瘤化風險極低的細胞的方法。將人類骨髓間質幹細胞、人類脂肪組織來源間質幹細胞（亦稱「人類脂肪細胞來源幹細胞」）等哺乳動物間質幹細胞、及7種人類貼附性成熟細胞（人類肝細胞、人類臍帶靜脈內皮細胞、人類皮膚微血管內皮細胞、人類表皮質形成細胞、人類支氣管上皮細胞、人類表皮黑色素細胞、及人類臍動脈平滑肌細胞）以及3種人類貼附性前驅細胞（人類真皮纖維母細胞、人類骨骼肌纖維母細胞、人類骨胚細胞）進行懸浮培養，使其形成細胞團，便可得到具有多能性且腫瘤化風險極低的細胞。

Description

多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法
本發明係關於一種包含將哺乳動物間質幹細胞懸浮培養，而形成多能性幹細胞的細胞團塊的步驟的多能性幹細胞的製備方法，以及使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法。
多能性幹細胞係為能夠分化為生物體中存在的所有細胞的細胞，其中又以胚胎幹細胞(ES細胞)為其代表。雖然人類ES細胞在利用其性質於再生醫療應用上備受期待，但具有會因移植該已使分化的ES細胞，而引發排斥反應的問題。
近年來，由山中等人的團隊報告了藉由4種因子(Oct3/4、Sox2、Klf4以及c-myc)的發現而揭示有作為誘導為去分化的接近ES細胞的多能性及增生能力的細胞(誘導多能性幹細胞)之開發，也就是iPS細胞(非專利文獻1)，之後，亦報告有能夠自人類的分化細胞製備iPS細胞(非專利文獻2)。其人類iPS細胞由於是能夠利用來自治療對象的患者細胞所製備，因此作為製備沒有排斥反應的人工器官的工具為備受期待。但是，解析了iPS細胞在活體內的行為後，結果指出了iPS細胞有並非必定與ES細胞具有相同性質的可能性。例如於使用iPS細 胞製備嵌合小鼠時，約有20%的個體中觀察到腫瘤形成，此數值明顯高於使用ES細胞進行同樣實驗的結果。
為了解決此高腫瘤形成風險的問題，報告有不使用已知為致癌基因的c-myc，而僅使用3因子(Oct 3/4、Sox 2以及Klf4)以製備iPS細胞，使用該iPS細胞製備嵌合小鼠，則能夠抑制腫瘤形成風險(非專利文獻3、4)。但是，人類iPS細胞等多能性幹細胞於臨床應用時，腫瘤形成的風險被要求要盡可能趨近於零。因此，iPS細胞於臨床應用時，腫瘤化的風險依然是一個問題。
另一方面，亦進行有將多能性幹細胞自生體組織直接分離出的研究。報告有將人類骨髓間質細胞藉由給予胰蛋白脢或低氧處理等壓力而篩選出耐壓力的多能性幹細胞，或者是將多能性幹細胞的表面抗原SSEA-3的表現作為指標而篩選幹細胞，並進一步重複懸浮培養而能夠分離出多能性幹細胞(專利文獻1、非專利文獻5)。但是，由於其方法必須要給予細胞壓力或是將SSEA-3的表現作為指標而篩選幹細胞的操作，在時間對效果或費用方面而言還有改善的餘地。
先前技術文獻
專利文獻
專利文獻1：日本特許第5185443號公報
非專利文獻
非專利文獻1：Takahashi, K. et al., Cell. 126: 663-676 (2006)
非專利文獻2：Takahashi, K. et al., Cell. 131: 861-872 (2007)
非專利文獻3：Nakagawa, M. et al., Nat Biotechnol 26: 101-106 (2008)
非專利文獻4：Wering, M. et al., Cell Stem Cell 2: 10-12 (2008)
非專利文獻5：Kuroda, Y. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 107: 8639-8643 (2010)
本發明的目的，在於提供一種低成本並能夠簡單製備具有多能性且腫瘤化風險極低的細胞的方法。
本發明的發明者們，在為達成上述目的的研究之中，發現了將人類骨髓間質幹細胞(Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow；hMSC-BM)、人類脂肪組織來源間質幹細胞(Human Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cell；hAT-MSC)(亦稱「人類脂肪細胞來源幹細胞〔Human Adipose-derived Stem Cells；hADSC〕」)、及7種人類貼附性成熟細胞(人類肝細胞〔hHEP細胞〕、人類臍帶靜脈內皮細胞〔HUVEC細胞〕、人類皮膚微血管內皮細胞〔HMVEC細胞〕、人類表皮質形成細胞〔NHEK細胞〕、人類支氣管上皮細胞〔NHBE細胞〕、人類表皮黑色素細胞〔NHEM細胞〕、及人類臍動脈平滑肌細胞〔USAMC細胞〕)以及3種人類貼附性前驅細胞(人類真皮纖維母細胞〔NHDF細胞〕、人類骨骼肌纖維母細胞〔HSMM細胞〕、人類骨胚細胞〔NHOst細胞〕)進行懸浮培養，以使其形成細胞團(Spheroid)時，能夠誘導(或分離)表現多能性幹細胞的標的蛋白質的多能性幹細胞。又確認了將hMSC-BM細胞培養於輸液(無血清培養液)中或含有結蘭膠或者葡聚醣的培養 液中，便能提高多能性的獲得效率。又分析經製備的hMSC-BM細胞之細胞團的多分化能力時，確認了hMSC-BM細胞的細胞團係具有分化為3種胚(外胚層、內胚層、中胚層)來源的細胞的能力。進一步確認了經製備的hMSC-BM細胞的細胞團或hADSC細胞的細胞團為腫瘤化風險極低的細胞。本發明基於這些發現而完成。
即本發明係關於(1)一種多能性幹細胞的製備方法，包含下列步驟：懸浮培養哺乳動物間質幹細胞，而形成多能性幹細胞的細胞團塊(以下亦稱為「本案配製方法1」)、(2)如前述(1)所述的製備方法，其中該哺乳動物間質幹細胞係為人類骨髓間質幹細胞或人類脂肪來源的間質幹細胞、(3)如前述(1)或(2)所述的製備方法，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2、(4)如前述(1)至(3)中任一項所述的製備方法，其中該懸浮培養係於含有(A)結蘭膠或者是其衍生物或其鹽的溶液，或含有(B)葡聚醣或者是其衍生物或其鹽的溶液中進行，以及(5)如(1)至(4)中任一項所述的製備方法，其中該懸浮培養係於不含血清或不含血清替代物的生理水溶液中進行。
又本發明係(6)關於一種多能性幹細胞，係經由(1)至(5)中任一項所述的製備方法所得。
又本發明係關於(7)一種多能性幹細胞，係經由懸浮培養哺乳動物間質幹細胞所得，(8)如前述(7)所述的多能性幹細胞，其中該哺乳動物間質幹細胞係為人類骨髓間質幹細胞或人類脂肪來源的間質幹細胞，(9)如前述(7)或(8)所述的多能性幹細胞，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4 或Sox2，(10)如前述(7)至(9)中任一項所述的製備方法，其中該懸浮培養係於含有(A)結蘭膠或者是其衍生物或其鹽的溶液，或含有(B)葡聚醣或者是其衍生物或其鹽的溶液中進行，以及(11)如前述(7)至(10)中任一項所述的製備方法，其中該懸浮培養係於不含血清或不含血清替代物的生理水溶液中進行(以上(6)至(11)的多能性幹細胞，以下亦稱「本案多能性幹細胞1」)。
又本發明係關於(12)一種器官或組織的功能低落或障礙的改善劑，包含如前述(6)至(11)中任一項所述的多能性幹細胞(以下亦稱「本案改善劑1」)。
又本發明係關於(13)一種多能性幹細胞的分化誘導法，其特徵在於，包含對如(1)至(5)中任一項所述的多能性幹細胞施以分化處理的步驟(以下亦稱「本案分化誘導法1」)。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉〔1〕一種多能性幹細胞的製備方法，包含下列步驟：懸浮培養哺乳動物貼附性前驅細胞，而形成多能性幹細胞的細胞團塊(以下亦稱為「本案配製方法2」)、〔2〕如前述〔1〕所述的製備方法，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2、〔3〕如前述〔1〕或〔2〕所述的製備方法，其中該懸浮培養係於含有〔A〕結蘭膠或者是其衍生物或其鹽的溶液，或含有(B)葡聚醣或者是其衍生物或其鹽的溶液中進行，以及〔4〕如〔1〕至〔3〕中任一項所述的製備方法，其中該懸浮培養係於不含血清或不含血清替代物的生理水溶液中進行。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉〔5〕一種多能性幹細胞，係經由〔1〕至〔4〕中任一項所述的製備方法所得。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉〔6〕一種多能性幹細胞，係經由懸浮培養哺乳動物貼附性成熟細胞或哺乳類貼附性前驅細胞所得，〔7〕如前述〔6〕所述的多能性幹細胞，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2，〔8〕如前述〔6〕或〔7〕所述的多能性幹細胞，其中該懸浮培養係於含有〔A〕結蘭膠或者是其衍生物或其鹽的溶液，或含有〔B〕葡聚醣或者是其衍生物或其鹽的溶液中進行，以及〔9〕如前述〔6〕至〔8〕中任一項所述的製備方法，其中該懸浮培養係於不含血清或不含血清替代物的生理水溶液中進行(以上(5)至(9)的多能性幹細胞，以下亦稱「本案多能性幹細胞2」)
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉〔10〕一種器官或組織的功能低落或障礙的改善劑，包含如前述〔5〕至〔9〕中任一項所述的多能性幹細胞(以下亦稱「本案改善劑2」)。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉〔11〕一種多能性幹細胞的分化誘導法，其特徵在於，包含對如〔1〕至〔4〕中任一項所述的多能性幹細胞施以分化處理的步驟(以下亦稱「本案分化誘導法2」)。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉一種用於具有器官或組織的功能低落或障礙的患者的治療法，其中包含將本案的多能性幹細胞1或本案的多能性幹細胞2投予該患者。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉一種多能性幹細胞的利用法，其中包含將哺乳動物間質幹細胞藉由懸浮培養所得的細胞作為多能性幹細胞利用的利用法，或是將哺乳動物貼附性成熟細胞或哺乳動物貼附性前驅細胞藉由懸浮培養所得的細胞作為多能性幹細胞利用的利用法。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉將本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2作為器官或組織功能低落或障礙的改善(治療)藥而使用。
又作為本發明的實施例的其他形態，可列舉將本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2用於製造器官或組織功能低落或障礙的改善(治療)藥。
使用本案製備方法1及本案製備方法2，便能獲得本案多能性幹細胞1及本案多能性幹細胞2，即能夠得到具有多能性，且腫瘤化風險極低的細胞，對於安全治療心臟衰竭、1型糖尿病、帕金森氏症以及脊髓損傷等疾病十分有用。又由於本案多能性幹細胞1及本案多能性幹細胞2係能夠藉由懸浮培養而製備，相較於將基因轉殖至細胞以製備iPS細胞，在相對短時間能簡單且大量地製備細胞這一點上較優越。
第1圖係顯示分析貼附培養的hMSC-BM細胞(上半部)及球狀培養的hMSC-BM細胞(下半部)中多能性幹細胞標記蛋白質(Nanog)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第2圖係顯示分析貼附培養的hMSC-BM細胞(上半部)及球狀培養的hMSC-BM細胞(下半部)中多能性幹細胞標記蛋白質(Oct3/4)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第3圖係顯示分析貼附培養的hMSC-BM細胞(上半部)及球狀培養的hMSC-BM細胞(下半部)中多能性幹細胞標記蛋白質(Sox2)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第4圖係顯示分析貼附培養的hMSC-BM細胞(上半部)及球狀培養的hMSC-BM細胞(下半部)中多能性幹細胞標記蛋白質(SSEA3)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第5圖係顯示分析貼附培養的hMSC-BM細胞及球狀培養的hMSC-BM細胞中三種多能性幹細胞標記基因(Nanog〔左上部〕、Oct3/4〔右上部〕及Sox2〔左下部〕)的mRNA表現的結果圖。
第6圖係顯示分析貼附培養的hADSC細胞(上半部)及球狀培養的hADSC細胞(下半部)中多能性幹細胞標記蛋白質(Nanog)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第7圖係顯示貼附培養的hADSC細胞(上半部)及球狀培養的hADSC細胞(下半部)中分析多能性幹細胞標記蛋白質(Oct3/4)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第8圖係顯示貼附培養的hADSC細胞(上半部)及球狀培養的hADSC細胞(下半部)中分析多能性幹細胞標記蛋白質(Sox2)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第9圖係顯示貼附培養的hADSC細胞(上半部)及球狀培養的hADSC細胞(下半部)中分析多能性幹細胞標記蛋白質(SSFA3)的表現的結果圖。左圖顯示相位差影像，右圖顯示螢光影像。
第10圖係顯示貼附培養的hADSC細胞及球狀培養的hADSC細胞中分析三種多能性幹細胞標記基因(Nanog〔左上部〕、Oct3/4〔右上部〕及Sox2〔左下部〕)的mRNA表現的結果圖。
第11圖係顯示懸浮培養之細胞(hMSC-BM及7種貼附性成熟細胞〔HUVEC、HMVEC、NHEK、hHEP、NHBE、NHEM及UASMC細胞〕以及3種貼附性前驅細胞〔NHDF、HSMM及NHOst細胞〕)的顯微照相圖。圖中比例尺顯示為500μm。
第12圖貼係顯示附培養的細胞(hMSC-BM及上述7種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞)及球狀培養的細胞(hMSC-BM及上述7種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞)中分析多能性幹細胞標記基因(Oct3/4)的mRNA表現的結果圖。
第13圖係顯示貼附培養的細胞(hMSC-BM及上述7種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞)及球狀培養的細胞(hMSC-BM及上述7種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞)中分析多能性幹細胞標記基因(Nanog)的mRNA表現的結果圖。
第14圖係顯示貼附培養的細胞(hMSC-BM及上述7種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞)及球狀培養的細胞(hMSC-BM及上述7種貼附性成熟細胞以及3種上述貼附性前驅細胞)中分析多能性幹細胞標記基因(Sox2)的mRNA表現的結果圖。
第15圖係顯示於6種貼附性成熟細胞(HUVEC、HMVEC、NHEK、NHBE、NHEM及UASMC細胞)以及3種貼附性前驅細胞(NHDF、HSMM及NHOst細胞) 的專用培養液中進行球狀培養的上述6種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞，以及於MSCBM培養液中進行球狀培養的上述6種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞中分析多能性幹細胞基因(Oct3/4)的mRNA表現的結果圖。
第16圖係顯示於6種貼附性成熟細胞以及3種貼附性前驅細胞的專用培養液中進行球狀培養的上述6種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞，以及於MSCBM培養液中進行球狀培養的上述6種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞中分析多能性幹細胞基因(Nanog)的mRNA表現的結果圖。
第17圖係顯示於6種貼附性成熟細胞以及3種貼附性前驅細胞的專用培養液中進行球狀培養的上述6種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞，以及於MSCBM培養液中進行球狀培養的上述6種貼附性成熟細胞以及上述3種貼附性前驅細胞中分析多能性幹細胞基因(Sox2)的mRNA表現的結果圖。
第18圖係顯示於MSCBM培養液中進行球狀培養的hMSC-BM細胞，及輸液中進行球狀培養的hMSC-BM細胞中分析3種多能性幹細胞標記基因(Oct3/4、Nanog及Sox2)的mRNA表現的結果圖。
第19A圖係顯示於HUVEC培養用培養液中進行球狀培養的HUVEC細胞的相位差影像(左圖)，及於輸液中進行球狀培養的HUVEC細胞的相位差影像(右圖)。第19B圖係顯示於HUVEC培養用培養液中進行球狀培養的HUVEC細胞，及於輸液中進行球狀培養的HUVEC細胞中分析3種多能性幹 細胞標記基因(Oct3/4、Nanog及Sox2)的mRNA表現的結果圖(平均值±標準差，〔n=3〕)。
第20A圖係顯示於NHEK培養用培養液中進行球狀培養的NHEK細胞的相位差影像(左圖)，及於輸液中進行球狀培養的NHEK細胞的相位差影像(右圖)。第20B圖係顯示於NHEK培養用培養液中進行球狀培養的NHEK細胞，及於輸液中進行球狀培養的NHEK細胞中分析3種多能性幹細胞標記基因(Oct3/4、Nanog及Sox2)的mRNA表現的結果圖(平均值±標準差，〔n=3〕)。
第21A圖係顯示於含有結蘭膠的培養液中進行球狀培養的hMSC-BM細胞中分析多能性幹細胞標劑基因(Nanog)的mRNA表現的結果圖。第21B圖係為顯示將hMSC-BM細胞塊於含有結蘭膠、瓜爾膠、黃原膠或葡聚糖的培養液中進行球狀培養並分析多能性幹細胞標記基因(Nanog)的mRNA表現的結果圖。
第22圖係顯示將hMSC-BM細胞塊透過於添加了睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)的培養液中進行懸浮培養(以下稱為「神經分化誘導法1」)(參閱非專例文獻5及本實施例)的神經細胞(外胚層來源細胞)分化誘導處理後，分析神經細胞標記蛋白質(巢蛋白)的表現的結果圖(第22A圖)，及以顯微鏡觀察細胞形態的結果圖(第22B圖)。
第23圖係顯示將hMSC-BM細胞塊透過於添加了頭發生素(noggin)的培養液中進行貼附培養(以下稱為「神經分化誘導法2」)(參閱文獻「Wada,et al.,PLoS One.4(8)：e6722(2009)」及本實施例)的神經細胞分化誘導 處理後，分析神經細胞標記蛋白質(β-微管蛋白3)的表現的結果圖(第23A圖)，及以顯微鏡觀察細胞形態的結果圖(第23B圖)。
第24圖係顯示將hMSC-BM細胞塊進行神經細胞分化誘導處理後，分析2種神經細胞標記基因(Musashi〔第24A圖〕及MAP2〔第24B圖〕)的mRNA表現的結果圖。
第25A圖及第25B圖係顯示將hMSC-BM細胞塊分別進行透過懸浮培養及貼附培養的肝細胞(內胚層來源細胞)的分化誘導處理後，分析肝細胞標記蛋白質(AFP)的表現的結果圖。第25C圖係顯示將hMSC-BM細胞塊進行透過懸浮培養的肝細胞的分化誘導處理後，以顯微鏡觀察細胞形態的結果圖。
第26A圖係顯示將hMSC-BM的球體進行透過懸浮培養的心肌細胞(中胚層來源細胞)的分化誘導處理後，以顯微鏡觀察細胞形態的結果圖，第26B圖係將hMSC-BM的球體進行透過懸浮培養及貼附培養的心肌細胞分化誘導處理後，分析心肌細胞標記基因(GATA4)的mRNA表現的結果圖。
第27A圖係顯示將hMSC-BM的球體進行透過貼附培養的脂肪細胞(中胚層來源細胞)的分化誘導處理後，以顯微鏡觀察細胞形態的結果圖。第27B圖及第27C圖係顯示將hMSC-BM的球體進行分別透過懸浮培養及貼附培養的脂肪細胞的分化誘導處理後，以Oil Red染色法分析脂肪滴的結果圖。第27D圖係顯示將hMSC-BM的球體進行透過懸浮培養及貼附培養的脂肪細胞的分化誘導處理後，分析脂肪細胞標記基因(LPL)的mRNA表現結果圖。
第28圖的左側上端係顯示將NHEK細胞塊進行神經細胞分化誘導處理後，以顯微鏡察細胞形態的結果圖。第28圖的右側上端係顯示將HUVEC細胞塊進行 神經細胞分化誘導處理後，以顯微鏡察細胞形態的結果圖。第28圖的左側下端係顯示將NHEK細胞塊進行神經細胞分化誘導處理後，分析神經細胞標記蛋白質(TUJ1)的表現的結果圖。第28圖的右側下端係顯示將HUVEC細胞塊進行神經細胞分化誘導處理後，分析神經細胞標記蛋白質(TUJ1)的表現的結果圖
本案的多能性幹細胞1，係自哺乳動物間質幹細胞進行懸浮培養時所得的形成細胞塊(Spheroid)(以下稱為「本案多能性幹細胞塊1」)的細胞，通常作為多能性幹細胞而使用。又本案多能性幹細胞2係自哺乳動物貼附性成熟細胞或哺乳動物貼附性前驅細胞進行懸浮培養所得的形成細胞塊(Spheroid)(以下稱為「本案多能性幹細胞塊2」)的細胞，通常作為多能性幹細胞而使用。本發明中所謂「作為多能性幹細胞而使用」，意為除了以對於活體細胞的旁分泌(paracrine)為目的而使用(進行移殖)之外，以於活體內分化為來源自三胚層(外胚層、內胚層、中胚層)的細胞為目的而使用(進行移殖)，以及用於在體外使細胞分化為來源自上述三胚層的目標細胞。又本發明中，作為多能性幹細胞而使用的細胞，係指將用途限定為「作為多能性幹細胞而使用」的細胞。
以本發明的哺乳動物而言，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠等齧齒類，兔子等兔形目，豬、牛、山羊、馬及綿羊等有蹄目，狗及貓等食肉目、人類、猴子、獼猴、食蟹獼猴、狨猴、紅毛猩猩、黑猩猩等靈長類，其中又以小鼠、豬及人為佳，將本案多能性幹細胞1及本案多能性幹細胞2用於再生醫療時，特別適合以人類為例。
本案多能性幹細胞1及多能性幹細胞2，係雖然自身無法成為個體，但具有能分化為構成活體的所有組織或細胞的能力，且移殖至哺乳動物時沒有腫瘤化的風險，或是極低的細胞，與移殖至哺乳類時腫瘤化風險高的胚胎幹細胞(embryoic stem cells,ES細胞)、胚胎生殖細胞(embryoic germ cells,EG細胞)、生殖幹細胞(germline stem cells,GS細胞)、誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells,iPS細胞)等的多能性幹細胞，或是部分具有能夠分化為複數種組織或細胞之能力的複能性幹細胞及具有分化為特定組織或細胞之能力的單能性幹細胞(前驅細胞)不同。
本發明中所謂「懸浮培養」，係指使細胞或細胞塊(Spheroid)，即細胞群集而形成的具三次元構造(球狀或葡萄串狀)的細胞團塊在不接觸培養容器的條件下培養(球狀培養)。
本說明書中所謂「貼附性成熟細胞」，係指具有需接觸立足點才能夠進行生存、增生及生產物質的固著依賴性，且分化結束(完成)的細胞，在一般培養條件下具有不進行去分化，而維持安定的分化狀態的性質。即前述的貼附性成熟細胞包含有心肌細胞、血管內皮細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚纖維細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、肝細胞、臍帶靜脈內皮細胞、皮膚微淋巴管內皮細胞、表皮角質形成細胞、支氣管上皮細胞、黑色素細胞、平滑肌細胞及象牙細胞等成熟細胞，而不包括ES細胞、EG細胞、GS細胞、iPS細胞等多能性幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、神經系統幹細胞等複能性幹細胞、心肌前驅細胞、血管內皮前驅細胞、神經前驅細胞、脂肪前驅細胞、真皮纖維母細胞、骨骼肌成肌細 胞、骨胚細胞、牙本質細胞等單能性幹細胞(前驅細胞)等幹細胞及紅血球、白血球(嗜中性球、單核球、淋巴球及巨噬細胞)等浮游細胞。
於本發明說明說中所謂「貼附性前驅細胞」，係指具有需接觸立足點才能夠進行生存、增生及生產物質的固著依賴性，且會分化為特定的組織或細胞的細胞。即前述貼附性前驅細胞包含有前述單能性幹細胞(前驅細胞)，而不包含前述多能性幹細胞、前述複能性幹細胞、前述成熟細胞及前述浮游性細胞。
本案多能性幹細胞1及本案多能性幹細胞2係具有多能性(多分化潛力)，更有表現Nanog、Oct3/4、Sox2、SSEA3、TRA-1-60等多能性標記的特徵。由於當以哺乳動物間質幹細胞進行通常培養(貼附培養)時，多能性標記並不表現，因此相較於進行通常培養的哺乳動物間質幹細胞中的多能性標記表現量(以下稱「控制組表現量」)，本案多能性幹細胞1及本案多能性幹細胞2中多能性標記的表現量增加。例如本案多能性幹細胞1中Nanog基因的mRNA表現量相較於控制組表現量，通常增加了2倍以上，較佳為8倍以上，更佳為20倍以上，又更佳為30倍以上，進一步更佳為50倍以上。又本案多能性幹細胞1中Oct3/4基因的mRNA表現量相較於控制組表現量，通常增加了2倍以上，較佳為3倍以上，更佳為4倍以上，又更佳為4.5倍以上，進一步更佳為5倍以上，特佳為5.5倍以上，最佳為6倍以上。又本案多能性幹細胞1中Sox2基因的mRNA表現量相較於控制組表現量，通常增加了2倍以上，較佳為3倍以上，更佳為4倍以上，又更佳為4.5倍以上，進一步更佳為5倍以上，特佳為5.5倍以上，最佳為6倍以上。又本案多能性幹細胞2中Nanog基因的mRNA表現量相較於控制組表現量，通常增加了2倍以上，較佳為3倍以上，更佳為9倍以上，又更佳為15倍以上，進一步更佳為20倍以 上，特佳為100倍以上，最佳為1000倍以上。又本案多能性幹細胞2中Oct3/4基因的mRNA表現量相較於控制組表現量，通常增加了1.5倍以上，較佳為2倍以上，更佳為3倍以上，又更佳為4倍以上，進一步更佳為10倍以上，特佳為50倍以上，最佳為1000倍以上。又本案多能性幹細胞2中Sox2基因的mRNA表現量相較於控制組表現量，通常增加了1.5倍以上，較佳為2倍以上，更佳為3倍以上，又更佳為4倍以上，進一步更佳為10倍以上，特佳為50倍以上，最佳為1000倍以上。
以本發明哺乳動物間質幹細胞而言，雖然只要是源自於骨髓或骨膜、源自末梢血、源自於臍帶血或是脂肪組織，且能夠分化為間質組織係的組織(脂肪組織、軟骨組織、骨組織等)便無特別限制，但因為由生體組織採取細胞較簡單及已經確立了採取後的培養方法，因此以哺乳動物骨髓間質幹細胞為佳，又因為能簡單地作為剩餘組織而自生體採取及採取時的侵入性較低，以脂肪組織來源間質幹細胞為佳。
本案改善劑1及本案改善劑2分別為含有本案多能性幹細胞1及本案多能性幹細胞2，即含有具多能性，且腫瘤化風險極低的細胞作為有效成分者，具有改善(治療)器官或組織的功能低落或障礙的作用。
以前述器官或組織而言，可列舉腦、肺、肝、腎、心、腸(大腸、小腸及結腸等)胰臟、骨(骨髓)及皮膚等。
以前述器官或組織功能低落或障礙而言，具體而言可列舉腫瘤心臟衰竭、1型糖尿病、帕金森氏症、脊髓損傷及皮膚炎等。
以本案改善劑1或本案改善劑2所含有的本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞數而言，雖然因成為移殖對象的患部或器官或組織功能 低落等級或機能障礙等級而異，又因局部投予與全身投予的不同，無法一概而論，但通常為1×10至1×1011。
作為將本案改善劑1及本案改善劑2投予具有前述器官或組織的功能低落或障礙的患者的方法而言，可列舉使用導管插入、注入冠狀靜脈內或直接注入病因的器官、組織或靜脈注射等方法。
使用於本案製備方法1的哺乳動物骨髓間質幹細胞，雖能夠自存在有骨髓的肱骨、肋骨、大腿骨及脛骨等長骨、腕骨及跗骨等短骨、頭蓋骨、肩胛骨及骨盆(髂骨)等扁平骨採取，但由於能夠採取大量細胞，或是容易採取，以自大腿骨、脛骨或骨盆(髂骨)採取為佳。
使用於本案製備方法1的哺乳動物脂肪組織來源幹細胞，雖能夠自存在有脂肪組織的皮下組織或內臟組織採取，但由於能夠採取大量細胞，或是容易採取，以自皮下組織採取為佳。
自生體組織以既定方法採取的哺乳動物間質幹細胞，能夠以符合初代培養法的方法透過貼附培養而分離。
前述哺乳動物貼附性成熟細胞或哺乳動物貼附性前驅細胞，能夠自皮膚(表皮、真皮、皮下組織等)、肌肉、心肌、神經、骨、軟骨、血管、腦、心臟、腎、肝、胰臟、脾臟、口腔內、角膜、骨髓、臍帶血、羊膜及毛髮等器官或組織以既定方法採取，並能夠能夠以符合初代培養法的方法透過貼附培養而分離。
本案製備方法1或本案製備方法2中，哺乳動物間質幹細胞、哺乳動物貼附性成熟細胞及哺乳動物貼附性前驅細胞，通常是於含有0.1至30(v/v) %的血清(胎牛血清〔Fetal bovine serum；FBS〕、小牛血清〔Calf bovine serum；CS〕等)的動物細胞培養用培養液(DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等)中進行貼附培養，亦可以配合細胞的性質(特性)在最佳化的培養液中進行貼附培養，以該培養液而言，具體來說可列舉本實施例或本參考例所使用的培養液(MSCBM培養液、ADSC-BM培養液、hHEP培養用培養液、HUVEC培養用培養液、HMVEC培養用培養液、NHEK培養用培養液、NHDF培養用培養液、NHBE培養用培養液、HSMM培養用培養液、NHEM培養用培養液、UASMC培養用培養液及NHOst培養用培養液)。
前述貼附培養，可使用玻璃製或塑膠製多孔盤、培養皿(schale、dish)、細胞培養瓶等培養器以進行，此處所謂塑膠至培養器，為使細胞容易貼附，包含有經過聚丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚羥乙基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素及羧甲基纖維素等親水性聚合物或纖維黏蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、肌腱蛋白、血小板反應蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、玻尿酸、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸等細胞貼附因子進行表面處理的培養器。經過以親水性聚合物進行表面處理的培養器可以為市售品，也可為自製品。以經過以親水性聚合物進行表面處理的培養器而言，可列舉細胞培養細胞培養瓶(TPP)、培養皿(TPP)、Primaria culture ware(日本BD)等，以經過以細胞貼附因子進行表面處理的培養器的市售品而言，可列舉BD Bio Coat層粘連蛋白腹膜產品(日本BD)、Bio Coat聚-D-離胺酸/層粘連蛋白培養皿(Cosmo Bio)、Bio Coat聚-L-鳥胺酸/層粘連蛋白培養皿(Cosmo Bio)、Bio Coat層粘連蛋白/纖維蛋白原培養皿(Cosmo Bio)等。 又以玻璃製的培養皿市售品而言，可列舉腔室載玻片II(IWAKI)、BD Falcon培養載玻片(日本BD)、腔室載玻片(松波玻璃工業)等。哺乳動物間質幹細胞因具有貼附於培養器而增殖的性質，因此能夠與懸浮而增殖的造血幹細胞分離。
前述貼附培養可以適合哺乳動物間質幹細胞、哺乳動物貼附性成熟細胞及哺乳動物貼附性前驅細胞培養的條件以實施，培養所適合的培養溫度通常在於約30至40℃的範圍，而以37℃為佳。培養時的CO2濃度通常在於約1至10%的範圍，而以約5%為佳。培養時的濕度通常在於約70至100%的範圍，而以約95至100%為佳。又亦可應需要替換培養液。
分離哺乳動物間質幹細胞可以檢測CD106、CD166、CD29、CD105、CD73、CD44、CD90、CD71等間質幹細胞所表現的標記蛋白質(正標記)的表現，或檢測不到CD31、CD18、CD56、CD45、CD34、CD14、CD11、CD80、CD86、CD40等間質幹細胞所不表現的標記蛋白質(負標記)作為指標。又分離的哺乳動物間質幹細胞可使用慣用的方法冷凍保存。
哺乳動物間質幹細胞、哺乳動物貼附性成熟細胞及哺乳動物貼附性前驅細胞的懸浮培養可以透過在以聚羥乙基甲基丙烯酸酯(poly-HEMA)、水凝膠、2-甲基丙烯醯基磷酸膽鹼聚合物(2-Methacryloylethyl Phosphoryl Choline,MPC聚合物)等進行表面覆膜的低貼附性培養器，或沒有包覆前述細胞貼附因子的非貼附性培養器上以進行。
前述低貼附性培養器及非貼附性的培養基可為市售品亦可為自製品。以市售的低貼附性培養器而言，可列舉EZSPHERE(細胞塊的形成培養用容器)(IWAKI)、NanoCulture Plate(NCP)(SCIVAX Life Sciences)、超低貼 附表面(ULA)培養容器(CORNING)，以市售的非貼附性容器而言，可列舉懸浮培養用培養皿(Nunc)、懸浮細胞用培養皿(住友Bakelite)、未處理培養盤(BD Falcon)。
哺乳動物間質幹細胞、哺乳動物貼附性成熟細胞及哺乳動物貼附性前驅細胞的懸浮培養，係在能夠形成本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞塊的溶液中進行。以此些溶液而言，可列舉含有0.1至30(v/v)%血清(FBS、CS等)的動物細胞用培養液(DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10及M-199等)、添加適量(例如1至30%)血清替代物的前述動物細胞培養液、含有本實施例或本參考例所使用的培養液(MSCBM培養液、ADSC-BM培養液、hHEP用培養液、HUVEC用培養液、HMVEC用培養液、NHEK用培養液、NHDF用培養液、NHBE用培養液、HSMM用培養液、NHEM用培養液、UASMC培養液、NHOst用培養液、hMSC用培養液)等的血清或血清替代物(血清替代成分)的培養液、生理食鹽水、具緩衝效果的生理食鹽水(磷酸緩衝生理食鹽水〔Phosphate buffered saline,PBS〕、Tris緩衝生理食鹽水〔Tris Buffered Saline,TBS〕、HEPES緩衝生理食鹽水等)、林格氏液(乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、碳酸氫鹽林格氏液等)、5%葡萄糖水溶液、前述動物細胞用培養液、等滲劑(葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化鈉等)及本實施例所使用的輸液等不含血清或血清替代物(血清替代成分)的生理水溶液，以不含血清或血清替代物(血清替代成分)的生理水溶液為佳，具體而言，可舉本實施例所用的輸液為例。補充結蘭膠或葡聚醣時，為了提高獲得多能性的效率，以含有結蘭膠或其衍生物或 其鹽(以下亦稱葡聚醣類)及葡聚醣或其衍生物或其鹽(以下亦稱葡聚醣類)的任一種或兩者兼具的溶液為佳。
本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞塊在葡聚醣存在下進行懸浮培養時，為了提高獲得多能性的效率，以在本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞塊形成步驟之後，進一步具有將本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞塊於含有葡聚醣類的前述溶液中進行懸浮培養的步驟的本案製備方法1或本案製備方法2為佳。
前述結蘭膠類中以結蘭膠而言，為直鏈狀的異原多醣類，只要係為源自葡萄糖、葡萄醣醛酸、葡萄糖及鼠李糖的4種糖的重複單位所構成者則無特別限定，可舉脫醯結蘭膠及天然結蘭膠為例。以該脫醯結蘭膠而言，市售有KELCOGEL®等，以該天然結蘭膠而言，市售有KELCOGEL®LT100、KELCOGEL®HM及KELCOGEL®HT等。於本發明中，以脫醯形結蘭膠為佳。
前述結蘭膠類中以結蘭膠的衍生物而言，只要係透過對結蘭膠酯化、進行添加有機或無機酸的鹽類而進行的標準化學反應所得的生成物即可，具體而言可舉威蘭膠為例。
以前述結蘭膠類中結蘭膠或其衍生物的鹽類而言，例如可列舉鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、對甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甘醇酸鹽、甲磺酸鹽、酪酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽及蘋果酸鹽等的酸附加鹽類、鈉鹽及鈣鹽等金屬鹽類及氨鹽、烷基氨鹽等。另外，此些鹽於使用時作為溶液而使用， 其作用以與結蘭膠時同效者為佳。此些鹽類亦可形成為水化合物或溶媒化合物，又可將任一者單獨使用或將兩2種以上適當組合使用。
前述溶液中的結蘭膠類的濃度通常在0.001至1.0(w/v)%的範圍內，以0.005至0.2(w/v)%為佳，較佳為0.01至0.2(w/v)%。
以前述的葡聚醣類中的葡聚醣而言，只要是由D-葡萄糖所構成的多醣(C6H10O5)n，且以α 1→α 6結合為主鍊者並無特別限制，以葡聚醣的重量平均分子量(Mw)而言，可列舉葡聚醣40(Mw=40000)，葡聚醣70(Mw=70000)等。這些葡聚醣可以化學合成、微生物作用產生及酵素作用產生等任一種皆知的方法製造，亦可以使用市售品。可列舉低分子葡聚醣L注(大塚製藥工廠)、葡聚醣70(東京化成工業)等市售品。
以前述葡聚醣類中的葡聚醣衍生物而言，可列舉葡聚醣硫酸、羧基化葡聚醣及二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚醣等。
以前述葡聚醣類中的葡聚醣或其衍生物的鹽類而言，可列舉鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、對甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甘醇酸鹽、甲磺酸鹽、酪酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽及蘋果酸鹽等的酸附加鹽類、鈉鹽、鉀鹽及鈣鹽等金屬鹽類及氨鹽、烷基氨鹽等。另外，此些鹽於使用時作為溶液而使用，其作用以與葡聚醣時同效者為佳。此些鹽類亦可形成為水化合物或溶媒化合物，又可將任一者單獨使用或將2種以上適當組合使用。
前述溶液中葡聚醣類的濃度，通常在0.1(w/v)%以上，以0.5(w/v)%以上為佳，較佳為1.0(w/v)%以上。又自迴避帶給細胞生存率的不良影響的 觀點來看，前述溶液中的葡聚醣類的濃度，可列舉20(w/v)%以下，以15(w/v)%以下為佳，較佳為12(w/v)%以下，更佳為10(w/v)%以下。因此，前述溶液中的葡聚醣類的濃度，可列舉0.1至20(w/v)%，以0.5至15(w/v)%為佳，較佳為1.0至12(w/v)%，更佳為1.0至10(w/v)%。
含有前述血清或血清替代物的培養液，或不含前述血清或血清替代物的生理水溶液中，可以應需要補充安定劑(例如人類血清蛋白及聚乙二醇等)、緩沖液(例如磷酸鹽緩衝液、醋酸鈉緩衝液)、螯合劑(例如EDTA、EGTA、檸檬酸及水楊酸)、胺基酸(例如穀氨醯胺、丙氨酸、天冬醯胺、絲氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸及酪氨酸等非必需胺基酸)、維生素類(例如氯化膽鹼、泛酸、葉酸、煙醯胺、吡哆醛鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫胺素、抗壞血酸、生物素及肌醇等)、多糖類(例如瓜爾膠及黃原膠等)、助溶劑、保存劑及抗氧化劑等添加物。
本發明中所謂「血清替代物」，意指用於替代血清而使細胞培養增殖、具有與血清同樣效果之物(成份)。以血清替代物而言，具體可列舉市售的B27補充劑(-胰島素)(Life Technologies)、N2補充劑(Life Technologies)、B27補充劑(Life Technologies)及Knockout Serum Replacement(Invitrogen)等。
進行懸浮培養的培養條件，只要是本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2能夠形成細胞塊的培養條件(溫度、時間及細胞濃度等)即能夠適當選擇。例如，開始懸浮培養時的細胞濃度通常為1×10至1×108，以1×102至1×106為佳，較佳為1×103至1×105。培養時適用的培養溫度通常約在30℃至40℃，以37℃為佳。培養時的CO2濃度通常約在1%至10%的範圍，以約5%為佳。培養時的 濕度通常約在70%至100%的範圍，以約95%至100%為佳。又亦可應需要更換培養液。以培養時間而言，只要是能夠以充份的比例製備本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的期間即可，通常為5小時至4週，以1日至3週為佳，更佳為3日至2週。
可藉由檢測出Nanog、Oct3/4、Sox2、SSEA3、TRA-1-60等多能性標記的表現作為指標確認使用本案製備方法1或本案製備方法2所製備的細胞為多能性。以檢測多能性標記的表現的方法而言，可列舉抽出精製細胞的全RNA，使用與多能性基因的mRNA互補的鹼基序列所構成的探針的北方墨點法以檢測的方法，或是抽出精製細胞的全RNA，使用反轉錄酵素合成cDNA後，使用專一放大源自多能性標記基因mRNA的cDNA的起始因子的競爭性PCR法、實時定量PCR法等定量PCR法以檢測的方法、精製細胞的全RNA、使用反轉錄酵素合成cDNA後，以生物素(biotin)或地高辛(digoxigenin)等標示cDNA，以對標示有螢光物質的生物素有高親和性的抗生物素(avidin)或辨識地高辛的抗體等間接地標示cDNA後，以固定在玻璃、矽膠及塑膠等可用於雜交的支撐物上與多能性標記cDNA互補的鹼基序列所構成的雜合用微矩陣以檢測的方法及使用專一辨識多能性標記蛋白質的抗體的免疫測定法(免疫組織化學染色法，ELISA法、EIA法、RIA法及西方雜合法等)。
本案製備方法1或本案製備方法2中，製備高純度的本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞懸浮液時，將本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2的細胞塊使用細胞分散液(胰蛋白酶、賴氨醯內肽酶、鏈黴蛋白酶、胃蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶及透明質酸酶等)、或吸量管或微量吸管製備細 胞懸浮液，透過使用針對多能性幹細胞的表面標記(TRA-1-60、SSEA-3等)的抗體的螢光活化細胞分選儀(FACS)、或使用針對螢光物質或生物素、抗生物素等標示物質所標示的前述多能性幹細胞表面標記的抗體及結合該針對標示物的抗體與磁性片(MACS片)的共軛抗體的自動磁力細胞分離裝置(autoMACS)而施加分離處理。以前述螢光物質而言，可列舉別藻藍蛋白(APC)、藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸螢光素(FITC)、Alexa Fluor488、Alexa Fluor647、Alexa Fluor700、PE-德克薩斯紅、PE-Cy5及PE-Cy7等。
以本案分化誘導方法1或本案誘導方法2而言，只要是具有對使用本案製備方法1或本案製備方法2所製備的本案多能性幹細胞1或本案多能性幹細胞2施行分或處理的步驟的方法則沒有特別限制，但為了提高分化效率，以在對製備的細胞(本案多能性幹細胞塊1或本案多能性幹細胞塊2)施以分化處理前，進一步具有以前述細胞分散液處理、使用吸量管或微量吸管，將多能性幹細胞的細胞塊成為單一細胞的狀態而懸浮的步驟及將單一細胞懸浮培養，使形成細胞塊的步驟為佳。將單一細胞懸浮培養時的溶液或培養條件如前所述。於本說明書中所謂「單一細胞狀態」係指不與其他細胞集合而形成團塊(即不凝集的狀態)。多能性幹細胞中所含的單一細胞狀態的細胞的比例通常在70%以上，以90%為佳，較佳為95%以上，更佳為99%以上，特佳為100%。單一細胞狀態的細胞的比例，可以透過將懸浮液中的多能性幹細胞在顯微鏡下觀察，在隨機選擇的複數個(例如1000個)細胞中是否有凝集。
前述分化處理可參考於ES細胞、iPS細胞及胚體(EB)細胞等多能性幹細胞所報告的分化處理方法，適當使用分化為任意種細胞的誘導法，例如 神經幹細胞的分化誘導可依照文獻(日本特開2002-291469號公報)所述的方法進行，藉由神經分化誘導法1(參照非專利文獻5及本實施例)或神經分化誘導法2(參照文獻「Wada,et al.,PLoS One.4(8)：e6722(2009)」及本實施例)以進行，胰臟幹細胞的分化誘導可依照文獻(日本特開2004-121165號公報)所記載的方法進行，造血細胞的分化誘導可以依照文獻(日本特表2003-505006號公報、國際公開第99/064565號手冊)所述的方法進行，肌肉細胞的分化誘導可依照文獻(Boheler K.R,et al,Circ.Res.91,189-201,2002)所述的方法進行，肝細胞的分化誘導可藉由使用添加肝細胞增殖因子(HGF)的培養液的懸浮培養或貼附培養(參照本實施例)以進行，心肌細胞的分化誘導可依照文獻(Klug M.G,et al,J.Clin.Invest.98,216-224,1996、Muller M,et al,FASEB.J.14,2540-2548,2000)所述的方法進行，血管內皮細胞或血管平滑肌細胞的分化誘導可依照文獻(Vittet D,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,6273-6278,1997、Bloch W,et al,J.Cell Biol.139,265-278,1997、Yamashita J,et al,Nature 408,92-96,2000、Feraud O,et al,Lab.Invest.81,1669-1681,2001)所述的方法進行，脂肪細胞的分化誘導可透過使用脂肪細胞誘導用培養液(Lonza，PT-3004)的懸浮培養或貼附培養(參照本實施例)進行，視網膜細胞的分化誘導可依照文獻(Ikeda H,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102,11331-11336,2005、Osakada F,et al,Nat.Biotechnol.26,215-224,2008、Osakada F,et al,Nat.Protoc.4,811-824,2009、Hirami Y,et al,Neurosci.Lett.458,126-131,2009、Osakada F,et al,J Cell Sci 122,3169-3179,2009)所述的方法進行，樹突細胞的分化誘導可依照文獻(Senju S,Haruta M,Matsunaga Y,et al,Stem Cells 27,1021-1031,2009)所述的方法進行
以下透過實施例更具體地說明本發明，但本發明的技術範圍並非受到此些例示所限。
實施例1 1.確認將hMSC-BM細胞進行球狀培養，則可得到表現多能性幹細胞標記的細胞 1-1 方法 1-1-1 hMSC-BM細胞的培養與球狀培養方法
〔1〕於75cm2的細胞培養瓶中，加入添加有間質幹細胞添加因子套組(Lonza，PT-4105)的基質幹細胞基礎培養基(Mesenchymal Stem Cell Basal Medium,MSCBM)(Lonza，PT-3238)(以下稱MSCBM)16mL，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行培養液的加溫、平衡化(30分鐘以上)。
〔2〕自液態氮中取出hMSC-BM細胞(Lonza)，於37℃的熱水浴中快速融解。
〔3〕將融解的細胞移入預先放入5mL MSCBM的15mL離心管中混合。
〔4〕以500g，5分鐘，22℃進行離心。
〔5〕去除上清液，加入1mL MSBCM，透過以吸量管重複吸放，使細胞重新懸浮。
〔6〕進一步加入9mL MSCBM培養液並攪拌。
〔7〕計數細胞數，接種於75cm2細胞培養瓶(4.0×105個細胞/細胞培養瓶)。
〔8〕於培養箱(37℃，5%CO2)內進行細胞培養。
〔9〕每隔3至4天更換培養液。
〔10〕成為80%匯合程度時將培養液以吸氣器抽起，加入10mL PBS洗淨細胞。
〔11〕除去PBS，加入約3.75mL的胰蛋白酶/EDTA(Lonza)，一邊以顯微鏡確認細胞狀態一邊以胰蛋白酶在室溫處理5分鐘後，90%以下的細胞沒有脫落時，進一步以胰蛋白酶處理3至10分鐘。
〔12〕加入與胰蛋白酶/EDTA等量的室溫MSCBM培養液，停止胰蛋白酶處理後，以吸量管重複吸放沖起細胞以15mL管回收。
〔13〕以600g，5分鐘，室溫進行離心處理。
〔14〕去除上清液，加入1mL MSCBM培養液，透過以吸量管重複吸放，懸浮細胞。
〔15〕進一步加入9mL MSCBM培養液並攪拌。
〔16〕計數細胞數，接種於75cm2細胞培養瓶(3.75×105至4.5×105個細胞/細胞培養瓶)。
〔17〕於培養箱(37℃，5%CO2)內進行細胞培養。
〔18〕每隔3至4天更換培養液。
〔19〕直到成為足以用於分析用的細胞數(0.3×108至1×108細胞)為止，重複步驟〔10〕至步驟〔18〕。
〔20〕成為80%匯合程度時將培養液以吸氣器抽起，加入10mL PBS洗淨細胞。
〔21〕除去PBS，加入約3.75mL的胰蛋白酶/EDTA(Lonza)，一邊以顯微鏡確認細胞狀態一邊以胰蛋白酶在室溫處理5分鐘後，90%以下的細胞沒有脫落時，進一步以胰蛋白酶處理3至10分鐘。
〔22〕加入與胰蛋白酶/EDTA等量的室溫MSCBM培養液，停止胰蛋白酶處理後，以吸量管重複吸放沖起細胞以15mL管回收。
〔23〕以600g，5分鐘，室溫進行離心處理。
〔24〕去除上清液，加入1mL MSCBM培養液，透過以吸量管重複吸放，懸浮細胞。
〔25〕進一步加入9mL MSCBM培養液並攪拌。
〔26〕計數細胞數，接種於低貼覆性的100mm盤(Corning)及96孔盤(Corning)(1.0×106個細胞/盤及1.0×104個細胞/盤)，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行7日的球狀培養。
1-1-2 免疫螢光染色法
〔1〕按照前述「1-1-1 hMSC-BM細胞的培養及球狀培養方法」所述的方法以96孔盤球狀培養的hMSC-BM細胞，以1.5mL管回收。另外，做為控制組在腔室載玻片(IWAKI)貼附培養的hMSC-BM細胞，不剝落而進行以下同樣的操作。
〔2〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔3〕去除上清液，加入0.5至1mL的4%甲醛/PBS，進行細胞的固定處理(15分鐘，室溫)。
〔4〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔5〕去除上清液，加入1至1.5mL的PBS，進行細胞的洗淨處理(5分鐘，室溫)。
〔6〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔7〕重複步驟〔5〕至〔6〕兩次。
〔8〕去除上清液，加入0.5至1mL的Triton/PBS，進行細胞的穿透處理(5分鐘，室溫)。
〔9〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔10〕去除上清液，加入1至1.5mL的PBS，進行細胞的洗淨處理(5分鐘，室溫)。
〔11〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔12〕重複步驟〔10〕至〔11〕一次。
〔13〕去除上清液，加入1mL的封閉溶液(5%的正常血清/PBS或3%的BSA/PBS)，進行細胞的封閉處理(1至2小時，室溫)。
〔14〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔15〕去除上清液，為了檢驗4種多能性幹細胞標記蛋白質(Nanog、Oct3/4、Sox2及SSEA3)，加入0.5mL至1mL的一次抗體溶液(抗Nanog抗體〔Cell signaling technology，#4903S，1/800倍稀釋〕，抗Oct4抗體〔Cell signaling technology，#2750S，1/400倍稀釋〕，抗Sox2抗體〔Cell signaling technology，#3579S，1/400倍稀釋〕或抗SSEA3抗體〔Millipore，A488，1/200倍稀釋〕)，進行細胞的一次抗體反應處理(一晚，4℃)。
〔16〕去除上清液，加入1mL至1.5mLPBS，進行細胞的洗淨處理(5分鐘，室溫)。
〔17〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔18〕重複步驟〔16〕至〔17〕兩次。
〔19〕去除上清液，加入0.5mL至1mL的二次抗體溶液(Alexa Fluor 488抗兔抗體〔Invitrogen，A21206，1/1000倍稀釋〕，Alexa Fluor 555抗兔抗體 〔Invitrogen，A21428，1/1000倍稀釋〕或Alexa Fluor 488抗小鼠抗體〔Invitrogen，A21202，1/1000倍稀釋〕)，進行細胞的二次抗體反應處理(1至2小時，室溫)。
〔20〕去除上清液，加入1mL至1.5mLPBS，進行細胞的洗淨處理(5分鐘，室溫)。
〔21〕將球狀培養的細胞塊靜置，直到細胞沉至管底。
〔22〕重複步驟〔20〕至〔21〕兩次。
〔23〕去除上清液，加入1mL至1.5mLPBS，於載玻片上靜置細胞塊後，或撥離貼附培養的腔室載玻片上部後，滴下Fluoromount(Diagnostic BioSystem)蓋上蓋玻片封閉，製成免疫螢光染色用的細胞樣本。
〔24〕使用Axio Observer(Carl Zeiss)，取得細胞樣本的螢光影像與相位差影像，分析軟體使用Axio Vision(Carl Zeiss)。
1-1-3 mRNA的表現分析
〔1〕將依照前述「1-1-1 hMSC-BM細胞的培養與球狀培養方法」所述的方法以100mm盤懸浮培養的hMSC-BM細胞，以15mL離心管回收。另外，將作為控制組培養的hMSC-BM細胞回收，進行以下的相同操作。
〔2〕細胞全RNA的萃取，係使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)及QIA shredder(Qiagen)並依照產品附屬的實驗計畫進行。
〔3〕萃取的全RNA濃度使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)以測定。
〔4〕全RNA製備為20μg/mL，於96孔盤(Fast 96 well Reaction plate〔Applied Biosystem，#4309169〕)分為3μL/孔。
〔5〕為了透過RT-PCR檢測3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA表現量，使用TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit(Applied Biosystems，#4309169)配置由以下1)至6)所構成的反應溶液，滴入分裝有全RNA的96孔盤。另外使用GAPDH基因作為內標物。
1)Rnase-free water；0.5μL
2)2X Master Mix without UNG；10μL(1X)
3)40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix；0.5μL
4)Forward Primer；2.0μL(300nM)
5)Reverse Primer；2.0μL(900nM)
6)TaqMan Probe；2.0μL(200nM)
用以放大前述3種多能性幹細胞標記基因的cDNA的起始因子套組(前述「Forward Primer」及「Reverse Primer」)的鹼基序列或雜合於其放大(PCR)產物的探針的(前述「TaqMan Probe」)鹼基序列顯示於表1。
【表1】
〔6〕使用步驟〔5〕中所製備的全RNA與反應溶液的混合液，於以下1)至3)所示的條件進行於ABI PRISM 7000 Sequence Detection system(Applied Biosystems)的實時RT-PCR。
1)以48℃，30分鐘進行1循環(mRNA至cDNA的反轉錄反應)
2)以95℃，10分鐘進行1循環(活化聚合脢)
3)以95℃，15秒及60℃，1分鐘為一循環，進行40循環(由「Forward Primer」及「Reverse Primer」造成的DNA放大)
〔7〕使用Baseline軟體(Applied Biosystems)測定PCR產物達到一定量的PCR循環數(threshold cycle；Ct值)，透過比較Ct法(delta delta Ct法)求出以GAPDH基因的cDNA放大產物的Ct值為基準的前述3種多能性幹細胞標記基因的cDNA放大產物的Ct值的相對值，自該Ct值的相對值算出前述3種多能性幹細胞標記基因的cDNA相對量，也就是前述3種類的多能性幹細胞標記基因的mRNA相對量(參照第5圖及第10圖的縱軸)。
1-2 結果
使用免疫螢光染色法檢測4種多能性幹細胞標記蛋白質(Nanog、Oct3/4、Sox2及SSEA3)的表現時，相對於控制組的貼附培養hMSC-BM細胞中沒有檢測出前述4種的多能性幹細胞標記蛋白質的表現，球狀培養的hMSC-BM細胞中檢測有前述4種類的多能性幹細胞標記蛋白質(參照第1至4圖)。
又使用RT-PCR法檢測、定量3種類的多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA表現量時，球狀培養的hMSC-BM細胞中Nanog、及Oct3/4的mRNA表現量與控制組的貼附培養的hMSC-BM細胞相比，分別大幅增加了57.8倍及43.3倍(參照第5圖)。又Sox2的mRNA表現量，相對於在控制組的貼附培養的hMSC-BM細胞中沒有檢測到，球狀培養的hMSC-BM細胞中則有檢測到(參照第5圖)。這些結果顯示hMSC-BM細胞經過球狀培養後，能夠誘導(或分離)表現多能系幹細胞標記的細胞。
實施例2 2.確認將hADSC細胞球狀培養，則可得到表現多能性幹細胞標記的細胞 2-1 方法 2-1-1 hADSC的細胞培養與球狀培養方法
〔1〕於75cm2的細胞培養瓶中，加入添加有入類脂肪來源細胞添加因子套組(Lonza，PT-4503)的ADSC-BM(Adipose Derived Stem Cell Basal Medium)(Lonza，PT-3273)(以下稱「ADSC-BM培養液」)15mL，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行培養液的加溫、平衡化(20至30分鐘以上)。
〔2〕自液態氮中取出hADSC-BM細胞(Lonza)，於37℃的熱水浴中快速融解。
〔3〕將融解的細胞移入預先放入5mL ADSC-BM的15mL離心管中混合。
〔4〕以210g，5分鐘，22℃進行離心。
〔5〕去除上清液，加入1mL ADSC-BM培養液，透過以吸量管重複吸放，使細胞懸浮。
〔6〕進一步加入9mL ADSC-BM培養液並攪拌。
〔7〕計數細胞數，接種於75cm2(3.75 x 105個細胞/細胞培養瓶)。
〔8〕於培養箱(37℃，5%CO2)內進行細胞培養。
〔9〕每隔3至4天更換培養液。
〔10〕成為90%匯合程度時將培養液以吸氣器抽起，加入5mL HEPES buffer(Lonza)洗淨細胞。
〔11〕除去HEPES buffer，加入約3.75mL的胰蛋白酶/EDTA(Lonza)，一邊以顯微鏡確認細胞狀態一邊以胰蛋白酶在37℃處理3至5分鐘後，90%以下的細胞沒有脫落時，進一步以胰蛋白酶處理2分鐘。
〔12〕加入胰蛋白酶/EDTA兩倍量的室溫胰蛋白脢中和溶液(Trypsin Neutralization Solution，TNS)(Lonza)，停止胰蛋白酶處理後，透過以吸量管重複吸放沖起細胞以15mL管回收。
〔13〕以210g，5分鐘，室溫進行離心處理。
〔14〕去除上清液，加入1mL ADSC-BM培養液，透過以吸量管重複吸放，懸浮細胞。
〔15〕進一步加入9mL ADSC-BM培養液並攪拌。
〔16〕計數細胞數，接種於75cm2細胞培養瓶(3.75×105至4.5×105個細胞/細胞培養瓶)。
〔17〕於培養箱(37℃，5%CO2)內進行細胞培養。
〔18〕每隔3至4天更換培養液。
〔19〕直到成為足以用於分析用的細胞數(0.3×108至1×108細胞)為止，重複步驟〔10〕至步驟〔18〕。
〔20〕成為90%匯合程度時將培養液以吸氣器抽起，加入10mL PBS洗淨細胞。
〔21〕除去PBS，加入約3.75mL的胰蛋白酶/EDTA(Lonza)，一邊以顯微鏡確認細胞狀態一邊以胰蛋白酶在37℃室溫處理3至5分鐘後，90%以下的細胞沒有脫落時，進一步以胰蛋白酶處理2分鐘。
〔22〕加入胰蛋白酶/EDTA兩倍量的室溫TNS(Lonza)，停止胰蛋白酶處理後，透過以吸量管重複吸放沖起細胞以15mL管回收。
〔23〕以210g，5分鐘，室溫進行離心處理。
〔24〕去除上清液，加入1mL ADSC-BM培養液，透過以吸量管重複吸放，懸浮細胞。
〔25〕進一步加入9mL ADSC-BM培養液並攪拌。
〔26〕計數細胞數，接種於低貼覆性的100mm盤(Corning)及96孔盤(Corning)(1.0×106個細胞/盤及1.0×104個細胞/盤)，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行7日的球狀培養。
2-1-2 免疫螢光染色法
將按照前述「2-1-1 hADSC細胞的培養及球狀培養方法」所述的方法以96孔盤球狀培養的hADSC細胞，以前述「1-1-2免疫螢光染色法」所述的方法分析，又作為控制組使用貼附培養的hADSC細胞。
2-1-3 mRNA的表現分析
將按照前述「2-1-1 hADSC細胞的培養及球狀培養方法」所述的方法以100mm培養皿球狀培養的hADSC細胞，以前述「1-1-3 mRNA的表現分析」所述的方法分析，又作為控制組使用貼附培養的hADSC細胞。
2-2 結果
使用免疫螢光染色法檢測4種多能性幹細胞標記蛋白質(Nanog、Oct3/4、Sox2及SSEA3)的表現時，相對於控制組的貼附培養hADSC細胞中沒有檢測出前述4種的多能性幹細胞標記蛋白質的表現，球狀培養的hADSC細胞中檢測有前述4種類的多能性幹細胞標記蛋白質(參照第6至9圖)。
又使用RT-PCR法檢測、定量3種類的多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA表現量時，球狀培養的hADSC細胞中Nanog、及Oct3/4的mRNA表現量與控制組的貼附培養的hADSC細胞相比，分別大幅增加了23.6倍及24.0倍(參照第10圖)。又Sox2的mRNA表現量，相對於在控制組的貼附培養的hADSC細胞中沒有檢測到，球狀培養的hADSC細胞中則有檢測到(參照第10圖)。這些結果顯示hADSC-BM細胞經過球狀培養後，能夠誘導(或分離)表現多能系幹細胞標記的細胞。
〔參考例1〕 3.確認將貼附性成熟細胞及前驅細胞球狀培養，則可得到表現多能性幹細胞標記的細胞 3-1 方法 3-1-1 球狀培養方法 〔hHEP細胞(貼附性成熟細胞1種)〕
〔1〕自液態氮中取出hHEP細胞(In Vitro Technologies,Inc.)，於37℃的熱水浴中快速融解。
〔2〕將細胞移至50mL離心管。
〔3〕緩慢滴入hHEP細胞專用培養液(hHEP培養用培養液)(參照表2)25mL(冰冷)。
〔4〕以4℃進行離心(50×g，3分鐘)。
〔5〕去除上清液，加入5mL冰冷的hHEP培養用培養液。
〔6〕計數細胞數，接種於低貼附性96孔盤(Corning)(1.0×104個細胞/孔)，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行球狀培養7天(參照第11圖的「hHEP」)。另外，作為控制組，接種(1.0×105個細胞/孔)於24孔盤(旭TechnoGlass)，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行貼附培養7天。
〔HUVEC、HMVEC、NHEK、NHBE、NHEM及UASMC細胞(6種貼附性成熟細胞)，以及NHDF、HSMM及NHOst細胞(3種貼附性前驅細胞)〕
〔1〕於75cm2細胞培養瓶中分別添加16mL的前述6種貼附性成熟細胞及3種貼附性前驅細胞的專用培養液(〔HUVEC、HMVEC、NHEK、NHBE、NHEM、UASMC、NHDF、HSMM以及NHOst培養用培養液)(參照表2)，於培養箱(37℃，5%CO2)內進行培養液的加溫、平衡化(30分鐘以上)。
〔2〕自液態氮中取出前述6種貼附性成熟細胞及3種貼附性前驅細胞(全部為Lonza)，於37℃的熱水浴中快速融解，接種於添加有前述9種細胞專用培養液的75cm2細胞培養瓶中(2500至10000個細胞/cm2)。
〔3〕接種後24小時以內更換培養液，之後每隔1至3日更換培養液。
〔4〕除去培養液，加入15mL的HBSS(Lonza)。潤洗細胞後，除去HBSS。另外，關於HSMM細胞，以DPBS(-)代替HBSS，又關於NHEM細胞，以PBS(-)代替HBSS。
〔5〕加入6mL胰蛋白脢/EDTA(Lonza)，進行處理5分鐘。
〔6〕加入12mL TNS(Lonza)，進行中和。
〔7〕置入50mL離心管。
〔8〕於各細胞培養瓶分別加入5mL HBSS，徹底清洗。另外，關於HSMM細胞，使用DPBS(-)代替HBSS，又關於NHEM細胞，使用PBS(-)代替HBSS。
〔9〕以200×g，5分鐘，室溫進行離心處理，捨去上清液，加入冰冷培養液(自每個細胞培養瓶所回收的細胞各4至6mL)。另外，關於NHEM細胞，依照推薦實驗計畫，不進行步驟〔9〕。
〔10〕計數細胞數，接種於75cm2細胞培養瓶(2500至10000個細胞/cm2)。
〔11〕每隔1至3日交換培養液。
〔12〕重複進行步驟〔4〕至〔11〕直到用於分析。
〔13〕進行與步驟〔4〕至〔9〕相同的作業。
〔14〕計數細胞數，接種於低貼附性的96孔盤(Corning)(1.0×104個細胞/孔)，於培養箱(37℃，5%cO2)內進行7日的球狀培養(參照第11圖的「HUVEC」、「HMVEC」、「NHEK」、「NHDF」、「NHBE」、「HSMM」、「NHEM」、「UASMC」及「NHOst」)。另外作為控制組，接種於低貼附性的24孔盤(Corning)(1.0×105個細胞/孔)，於培養箱(37℃，5%cO2)內進行7日的貼附培養。
〔hMSC-BM細胞〕
hMSC-BM細胞的球狀培養，依照前述「1-1-1 hMSC-BM細胞的培養及球狀培養方法」，於低貼附性的96孔盤(Corning)中進行(參照第11圖的「hMSC-BM」)。另外，作為控制組，接種於貼附性的24孔盤(Corning)(1.0×105細胞)，於培養箱(37℃，5%cO2)內進行7日的貼附培養。
3-1-2 mRNA表現的分析
〔1〕將依照前述「3-1-1球狀培養方法」所述的方法所培養的細胞(關於7種貼附性成熟細胞〔HUVEC、HMVEC、NHEK、hHEP、NHBE、NHEM及UASMC細胞〕及3種貼附性前驅細胞〔NHDF、HSMM及NHOst細胞〕係16孔的量，關於hMSC-BM細胞係為24孔的量)及作為控制組貼附培養的細胞(關於前述7種貼附性成熟細胞及3種貼附性前驅細胞係為4孔的量，關於hMSC-BM係為12孔的量)分別回收於1.5mL試管。
〔2〕細胞全RNA的抽取，係使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)及QIA sherdder(Qiagen)，依照產品附屬的實驗計劃進行。
〔3〕抽取的全RNA的濃度，係使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)以測定。
〔4〕將全RNA調整至20μg/mL，以3μL/孔(60ngRNA)分裝至96孔盤(Fast 96 well Reaction plate〔Applied Biosystems，#4309169〕)。
〔5〕為了以RT-PCR檢測3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA表現，使用TaqMan RNA-to-CTTM 1-Step Kit(Applied Biosystems，#4392938)製備由以下1)至6)所構成的反應溶液，滴至分裝有全RNA的96孔盤中。另外使用GAPDH基因作為內標物。
1)Rnase-free water；0.5μL
2)2X TaqMan RT-PCR Mix；10μL(1X)
3)40X TaqMan RT Enzyme Mix；0.5μL
4)Forward Primer；2.0μL(900nM)
5)Reverse Primer；2.0μL(900nM)
6)TaqMan Probe；2.0μL(200nM)
用以放大前述4種標記基因及GAPDH基因的cDNA的起始因子套組(前述「Forward Primer」及「Reverse Primer」)的鹼基序列或與其放大(PCR)產物雜合的探針(前述「TaqMan Probe」)的鹼基序列顯示於表1。
〔6〕使用步驟〔5〕所製備的全RNA反應溶液，將ABI PRISM 7000 Sequence Detection system(Applied Biosystems)的實時RT-PCR以以下1)至3)的條件進行。
1)以48℃，15分鐘進行1循環(mRNA至cDNA的反轉錄反應)
2)以95℃，10分鐘進行1循環(活化聚合脢)
3)以95℃，15秒及60℃，1分鐘為一循環，進行40循環(由「Forward Primer」及「Reverse Primer」造成的DNA放大)
〔7〕使用Baseline軟體(Applied Biosystems)測定PCR產物達到一定量的PCR循環數(threshold cycle；Ct值)，透過比較Ct法(delta delta Ct法)求出以GAPDH基因的cDNA放大產物的Ct值為基準的前述4種多能性幹細胞標記基因的cDNA放大產物的Ct值的相對值，自該Ct值的相對值算出前述4種多能性幹細胞標記基因的cDNA(mRNA)相對量(參照第12至14圖的縱軸及表3至表5)。
【表3】
【表5】
3-2 結果
使用RT-PCR分析、定量3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA表現量時，以球狀培養的所有細胞(hMSC-BM細胞及7種貼附性成熟細胞及3種貼附性前驅細胞)中Nanog及Oct3/4的mRNA表現量，與控制組的貼附培養的細胞的表現量相比，有大幅度的增加(參照第12至14圖及表3至表5)。此些結果顯示，hMSC-BM細胞等間質幹細胞自不消說，即使是完成分化的貼附性成熟細胞或分化為特定組織或細胞的貼附性前驅細胞，只要進行球狀培養，便能夠誘導(或是分離)表現多能性幹細胞標記的細胞。
〔參考例2〕 4.將貼附性成熟細胞及前驅細胞進行球狀培養時的培養液的討論1
將6種貼附性成熟細胞(HUVEC、HMVEC、NHEK、NHBE、NHEM及UASMC細胞)及3種貼附性前驅細胞(NHDF、HSMM及NHOst細胞)於MSCBM培養液等MSC培養用培養液中培養時，分析多能性幹細胞標記基因的表現水準是否能觀察到變化。當將培養液自各細胞專用的培養液變更為MSCBM培養液，且以前述參考例1所述的方法將前述6種貼附性成熟細胞及3種貼附性前驅細胞進行球狀培養時，在所有貼附性成熟細胞中，相較於在各種細胞專用的培養液中進行球狀培養，顯示於MSCBM培養液中進行球狀培養時3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA的表現水準較高(參照第15至17圖及表6至表8)。此些結果顯示將貼附性成熟細胞或貼附性前驅細胞於MSCBM培養液中進行球狀培養，較於各細胞專用的培養液中進行球狀培養更能夠提升獲得多能性的效率。
實施例3 5.將hMSC-BM細胞進行球狀培養時的培養液的討論1
將hMSC-BM於無血清的生理水溶液中培養時，分析多能性幹細胞標記基因的表現水準是否能觀察到變化。當將hMSC-BM於代替MSCBM培養用培養液的輸液(將ELNEOPA2號輸液〔大塚製藥工廠〕於BICANATE輸液〔大塚製藥工廠製〕稀釋100倍者)中進行球狀培養時，顯示3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA的表現水準增加(參照第18圖及表9)。此些結果顯示將hMSC-BM細胞等間質幹細胞於輸液等無血清的生理水溶液中進行球狀培養，較於MSCBM培養液等間質幹細胞專用的培養液中進行球狀培養更能夠提升獲得多能性的效率。
〔參考例3〕 6.將貼附性成熟細胞進行球狀培養時的培養液的討論2
將貼附性成熟細胞於無血清的生理水溶液中培養時，分析多能性幹細胞標記基因的表現水準是否能觀察到變化。當將HUVEC細胞於代替HUVEC培養用培養液的輸液(將ELNEOPA2號輸液〔大塚製藥工廠製〕於BICANATE輸液〔大塚製藥工 廠製〕稀釋100倍者)中進行6天的球狀培養時(參照第19A圖)，顯示3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA的表現水準增加(參照第19B圖及表10)。又將NHEK細胞於代替NHEK培養用培養液的輸液中進行6天的球狀培養時(參照第20A圖)，同樣顯示3種多能性幹細胞標記基因(Nanog、Oct3/4及Sox2)的mRNA的表現水準增加(參照第20B圖及表11)。此些結果顯示將貼附性成熟細胞於輸液等無血清的生理水溶液中進行球狀培養，較於細胞專用培養液中進行球狀培養更能夠提升獲得多能性的效率。
實施例4 7.將hMSC-BM細胞進行球狀培養時的培養液的討論2
分析將hMSC-BM細胞於透過使用多醣類提升培養液的黏度而得的完全懸浮狀態進行培養時，是否能觀察到多能性幹細胞標記基因的表現水準改變。將hMSC-BM細胞於含有結蘭膠(0.02%脫醯化結蘭膠〔三晶製，CG-LA〕)的MSCBM培養液中進行7日的球狀培養時，顯示與於不含結蘭膠的MSCB培養液中進行球狀培養時相比，多能性幹細胞標記基因(Nanog)的mRNA表現水準增加(參照第21A圖)。由此結果，推測透過將hMSC-BM細胞於含有結蘭膠的培養液中進行球狀培養，將提升細胞團的懸浮狀態，而提高獲得多能性的效率。
又將hMSC-BM細胞藉由上述實施例1所述的方法於96孔盤中進行1日的球狀培養，使細胞團型成後，於含有結蘭膠(0.02%脫醯化結蘭膠〔KELCOGEL；註冊商標〕〔三晶製，CG-LA〕)、瓜爾膠(0.02%瓜爾膠〔三榮源F.F.I.製，D-2029〕)、黃源膠(0.02%黃源膠〔三榮源F.F.I.製，NXG-C〕)或是葡聚醣(10%葡聚醣40〔名糖產業製〕)的MSCBM培養液中進行7日的球狀培養(參照第21B圖)，顯示於含葡聚醣的MSCBM培養液中進行球狀培養時，相較於在不含葡聚醣的MSCBM培養液中進行球狀培養的狀況，多能性幹細胞標記基因(Nanog)的mRNA表現水準增加(參照第21B圖)。自此結果，可以推測hMSC-BM細胞的細胞團透過於含葡聚醣的培養液中進行球狀培養，提升細胞團的懸浮狀態，提高獲得多能性的效率。
實施例5 8.hMSC-BM細胞多分化能的分析
為分析關於hMSC-BM細胞的細胞團的多分化能，將hMSC-BM細胞的細胞團，依照以下「8-1-1細胞團培養後的繼代培養方法」所述的方法進行繼代培養(球狀培養)後，依照以下的「8-1-2透過懸浮培養的分化誘導方法」，或是「8-1-3透過貼附培養的分化誘導方法」所述的方法進行分化為4種器官、組織(神經、肝臟、心肌及脂肪)細胞的分化誘導處理。
8-1 方法 8-1-1 球狀培養後的繼代培養方法
〔1〕將依照前述「1-1-1 hMSC-BM細胞的培養及球狀培養方法」所述的方法製備的hMSC-BM細胞的細胞團(96孔盤1片的份量)回收於50mL試管。
〔2〕於室溫下靜置5分鐘後，在不吸入細胞團且留下1mL培養液下緩慢去除上清液(培養液)。
〔3〕加入30mL PBS(-)(Life Technologies製，14190144)，靜置5分鐘後，同樣緩慢去除上清液(培養液)。
〔4〕加入2mL胰蛋白脢/EDTA(Lonza製)，於37℃水浴槽中靜置10分鐘。
〔5〕加入2mL hMSC-BM培養液(Lonza製，PT-3001)，停止胰蛋白脢處理後，以P1000微量吸管緩慢處理3至5次以使細胞團分散。
〔6〕以600g、5分鐘、室溫進行離心處理，去除上清液，加入10mL添加有5ng/mL bFGF(ReproCELL製，RCHEOT002)的ReproFF(ReproCELL製，RCHEMD004)(以下稱為「FF+bFGF培養液」)，使細胞懸浮。
〔7〕接種於96孔盤(Corning製)，於培養箱(37℃，5%CO2)中進行繼代培養(球狀培養)。
〔8〕4日後，每孔除去70μL的FF+bFGF培養液，透過加入100μL的FF+bFGF培養液以交換培養液，進一步進行7日的繼代培養(球狀培養)。
8-1-2 透過懸浮培養的分化誘導方法
〔1〕將依照前述「8-1-1球狀培養後的繼代培養方法」所述的方法所製備的hMSC-BM細胞的細胞團，每孔除去70μL的FF+bFGF培養液，加入100μL新的5種分化誘導用培養液(參照表12至16)。
〔2〕於培養箱(37℃，5%CO2)中進行7日的懸浮培養。
〔3〕每孔除去80μL的培養液，加入100μL新的5種分化誘導用培養液(參照表12至16)後，進一步懸浮培養7日。另外，關於之後透過免疫染色法及Oil Red染色法分析的樣品，係將經過懸浮培養7日後，將細胞接種於96孔盤(TPP製，92096)，於培養箱(37℃，5%CO2)中進行1日的貼附培養。
8-1-3 透過貼附培養的分化誘導方法
〔1〕將依照前述「8-1-1球狀培養後的繼代培養方法」所述的方法所製備的hMSC-BM細胞的細胞塊(96孔盤1片的份量)，回收於50mL試管。
〔2〕於室溫下靜置5分鐘後，在不吸入細胞團且留下1mL培養液下緩慢去除上清液(培養液)。
〔3〕加入30mL新的5種分化誘導用培養液(參照表12至16)，接種於6孔盤(TPP，92006)，於培養箱(37℃，5%CO2)中貼附培養7日。另外，以1片96孔盤的量分為2片6孔盤為準。
〔4〕將培養液的約8成換為新的培養液，進一步貼附培養7日。
【表16】
8-1-4 免疫螢光染色法
關於依照前述「8-1-2透過懸浮培養的分化誘導方法」及「8-1-3透過貼附培養的分化誘導方法」所述的方法所分化誘導的細胞，依照前述「1-1-2免疫螢光染色法」所述的方法分析3種分化標記蛋白質(β微管蛋白3〔神經細胞標記〕、巢蛋白〔神經細胞標記〕及AFP〔肝細胞標記〕)的表現。另外，使用分化誘導前的細胞(hMSC-BM細胞的細胞團)作為控制組。用於前述3種的分化標記蛋白質的檢測的1次抗體及2次抗體顯示於以下的表17。
8-1-5 Oil Red染色法
〔1〕關於依照前述「8-1-2透過懸浮培養的分化誘導方法」及「8-1-3透過貼附培養的分化誘導方法」所分化誘導為脂肪細胞的細胞，自孔中除去培養液。
〔2〕於PBS中加入10%(v/v)的甲醛，調整為pH7.4後(10%甲醛〔和光純藥工業/PBS〔pH7.4〕〕)，保管於4℃。
〔3〕於異丙醇(和光純藥工業)中，加入0.5%(v/v)的Oil red 0(和光純藥工業)，使用攪拌子均勻攪拌，製成0.5% Oil red 0/Isopropanol溶液。
〔4〕於加入培養液的狀態下以2：1的比例加入冷的10%甲醛/PBS(約250μL/孔)，於室溫培養20分鐘。
〔5〕將0.5% Oil red 0/Isopropanol溶液與蒸餾水以3：2的比例混合，於室溫培養10分鐘。
〔6〕除去培養液，重新加入400μL的冷10%甲醛/PBS，於室溫培養1小時。
〔7〕除去甲醛溶液，以2次蒸餾水(大塚製藥工廠)清洗同時注意不使細胞剝落。使用吸量管除去孔內殘留的蒸餾水。
〔8〕染色後以蒸餾水清洗2次。
〔9〕使用Olympus IX-70(Olympus)取得細胞影像。
8-1-6 分析mRNA的表現
關於依照前述「8-1-2透過懸浮培養的分化誘導方法」及「8-1-3透過貼附培養的分化誘導方法」所述的方法所分化誘導的細胞，依照前述「3-1-2分 析mRNA的表現」所述的方法分析4種分化標記基因(Musashi〔神經前驅細胞標記〕、MAP2〔神經細胞標記〕、GATA4〔心肌細胞標記〕及LPL〔脂肪細胞標記〕)的mRNA表現。另外，使用分化誘導前的細胞(繼代培養前即繼代培養後的hMSC-BM細胞的細胞團)做為控制組。用以放大前述5種分化標記基因的cDNA的起始因子套組(前述「Forward Primer」及「Reverse Primer」)的鹼基序列或與其放大(PCR)產物雜合的探針(前述「TaqMan Probe」)的鹼基序列顯示於表18。又相對於GAPDH的cDNA放大產物的前述5種分化標記基因的cDNA(mRNA)的相對量顯示於第24圖、第26B圖及第27D圖以及表19至21。
【表18】
【表20】
8-2 結果
將hMSC-BM細胞的細胞塊，進行使用神經分化誘導法1的透過懸浮培養而分化為神經細胞(外胚層來源細胞)的分化誘導處理的結果，顯示了神經細胞標記蛋白質(巢蛋白)的表現(參照第22A圖)，顯示了其分化為表現神經前驅細胞標記基因(Musashi)(參照第24A圖的「神經分化誘導法1懸浮」及表19)及神經細胞標記基因(MAP2)(參照第24B圖的「神經分化誘導法1懸浮」及表19)的mRNA的神經細胞(參照第22B圖)。又將hMSC-BM細胞的細胞團，進行使用神經分化誘導法2的透過貼附培養而分化為神經細胞的分化誘導處理的結果，同樣顯示了神經細胞標記蛋白質(β微管蛋白3)的表現(參照第23A圖)，顯示了其分化為表現表現神經前驅細胞標記基因(Musashi)(參照第24A圖的「神經分化誘導法2貼附」)及神經細胞標記基因(MAP2)(參照第24B圖的「神經分化誘導法2貼附」)的mRNA的神經細胞(參照第23B圖)。
又將hMSC-BM細胞的細胞團，進行透過懸浮培養及貼附培養而分化為肝細胞(內胚層來源細胞)的分化誘導處理的結果，顯示了其分化為表現肝細胞標記蛋白質(AFP)(參照第25A圖)的肝細胞(參照第25C圖)。
又將hMSC-BM細胞的細胞團，進行透過懸浮培養及貼附培養而分化為心肌細胞(中胚層來源細胞)的分化誘導處理的結果，顯示了其分化為表現心肌細胞標記蛋白質(GATA4)的mRNA(參照第26B圖及表20)的心肌細胞(參照第26A圖)。
又將hMSC-BM細胞的細胞團，進行透過懸浮培養及貼附培養而分化為脂肪細胞(中胚層來源細胞)的分化誘導處理的結果，顯示了其分化為表現脂肪滴中檢測出的(參照第27B圖及第27C圖)脂肪細胞標記蛋白質(LPL)的mRNA(參照第27D圖及表21)的脂肪細胞(參照第27A圖)。
以上結果顯示hMSC-BM的細胞團，係為具有分化為3個胚層(外胚層、內胚層及中胚層)來源的細胞的能力(多分化能)的細胞。
〔參考例4〕 9.分析貼附性成熟細胞的細胞團的多分化能
為了分析關於貼附性成熟細胞的細胞團的多分化能，將2種貼附性成熟細胞(NHEK及HUVEC細胞)接種於96孔盤，透過於MSCBM培養液中進行球狀培養7日而製備貼附性成熟細胞的細胞團，將製備而得的貼附性成熟細胞的細胞團於FF+bFGF培養液中進行球狀培養一週後，以腔室載玻片(TPP，92006)藉由神經分化誘導法1的分化為神經細胞的分化誘導處理進行貼附培養3週後，使用1次 抗體(抗TUJ1抗體〔Millipore，MAB1637，100倍稀釋〕)及2次抗體(Alexa Fluor 555抗兔抗體〔Invitrogen，A21422，1/1000倍稀釋〕)，依照前述「1-1-2免疫螢光染色法」所述的方法分析神經細胞標記(TUJ1)的表現。結果顯示，進行神經細胞的分化誘導處理的NHEK及HUVEC細胞的細胞塊，係分化為表現神經細胞標記蛋白直(TUJ1)的神經細胞(參照第28圖)。其結果顯示NHEK細胞、HUVEC細胞等貼附性成熟細胞的細胞團，係為具有至少能夠分化為外胚層來源細胞的能力的細胞。
10.分析hMSC-BM或hADSC細胞的細胞團的畸胎瘤形成能力的有無
已知ES細胞及iPS細胞因具有無限增殖的能力及全能性，將ES細胞或iPS細胞以未分化狀態移殖則會形成畸胎瘤(teratoma)(參照文獻「Gropp,et al.,PLoS One 7(9)：(2012)」)。在此，分析hMSC-BM或hADSC細胞的細胞團在移殖時是否會形成畸胎瘤。
10-1 方法
將依照前述實施例1所述的方法所製備的hMSC-BM細胞(1×106個細胞)的細胞團，及依照前述實施例2所述的方法所製備的hADSC細胞(1×106個細胞)的細胞團分別以0.2mL PBS以懸浮，於母的大鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J)(日本Charles River)的腹側皮下以針筒移殖(分別為「MSC Spheroid群」及「ADSC Spheroid群」)。另外，作為控制組，將大鼠ES細胞(1×106個細胞)(Millipore，CMSCC050-2A〔SCC050〕)、貼附培養的hMSC-BM細胞(1×106個細胞)及貼附培養的hADSC細胞(1×106個細胞)分別以0.2mL PBS以懸浮，於母的大鼠 (NOD.CB17-Prkdcscid/J)(日本Charles River)的腹側皮下以針筒移殖(分別為「Positive Control群」「MSC Normal群」及「ADSC Normal群」)。又亦進行移殖PBS而未移殖細胞的控制實驗(Sham群)。於移殖後的第12週，將老鼠透過頸椎脫臼法以安樂死，於形成畸胎瘤時摘出畸胎瘤，於未形成畸胎瘤時將移殖部位摘出，摘出後的組織於10%中性緩衝甲醛溶液中浸漬固定，進行石蠟包埋。將經石蠟包埋的組織作切片，使用2種染色法(蘇木精、伊紅染色〔HE〕法及波形蛋白染色法)以染色，透過使用電子卡尺的顯微鏡觀察測量腫瘤的長徑(L)及短徑(W)。將所得的腫瘤的長徑(L)及短徑(W)的值，輸入數式「腫瘤體積(mm3)=L×W2×1/2」以算出腫瘤體積(參照表22)。
10-2 結果
相對於移殖大鼠ES細胞時，於所有的移殖鼠(n=8)皆在移殖後第3週形成了畸胎瘤，移殖hMSC-BM細胞的細胞團或hADSC細胞的細胞團時，並無確認到畸胎瘤的形成。又病理分析的結果，相對於移殖了大鼠ES細胞而形成的畸胎瘤全部為未分化的神經組織、消化管、肌肉等自3胚層所構成(「Teratoma immature」)，移殖了hMSC-BM細胞的細胞團或hADSC細胞的細胞團的大鼠中，並無確認到腫瘤細胞塊等(參照表22)。另外雖然在ADSC Normal群的Animal No.27大鼠(參照表22)中確認到腫塊，但結剖觀察時未確認到腫瘤的形成，而是檢測到其腹膜及脂肪相較於其他大鼠較為多。自以上結果顯示hMSC-BM細胞及hADSC細胞等間質幹細胞的細胞團，係為腫瘤化風險極低的細胞。
【表22】
產業利用的可能性
由於依據本發明，可以低成本且簡單地提供腫瘤化風險極低而安全性高的移殖用細胞，對再生醫療安全性的提升及費用的減輕具有貢獻。又能夠將藉由本案製備方法1或本案製備方法2所得的多能性幹細胞分化為各組織或細胞，以用於醫藥品、化妝品、農藥及食品等的安全性評估或效果評估、功能評估。進一步透過於不含血清或不含血清替代物而能夠投予人體內的溶液的單獨或者是混和液(醫藥品，醫療機器等)所構成的生理水溶液中進行懸浮培養，可以省略為了將移殖用細胞保持懸浮於培養用的生理水溶液中而投予人體而必須的生理水溶液的安全性評估(前臨床實驗、臨床實驗等)。
<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL FACTORY,INC.
<120> Method for preparing pluripotent stem cells
<130> P213PCT
<150> JP2013-182945
<151> 2013-09-04
<150> JP2014-102539
<151> 2014-05-16
<160> 24
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Inventor：Okairi,Risa Inventor：Nishimura,Masuhiro Inventor：Wada,Tamaki
<223> Human Nanog Forward Primer
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Nanog Reverse Primer
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Nanog TaqMan Probe
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Oct3/4 Forward Primer
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Oct3/4 Reverse Primer
<400> 5
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Oct3/4 TaqMan Probe
<400> 6
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Sox2 Forward Primer
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Sox2 Reverse Primer
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Sox2 TaqMan Probe
<400> 9
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human GAPDH Forward Primer
<400> 10
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human GAPDH Reverse Primer
<400> 11
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human GAPDH TaqMan Probe
<400> 12
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Musashi Forward Primer
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Musashi Reverse Primer
<400> 14
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human Musashi TaqMan Probe
<400> 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human MAP2 Forward Primer
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human MAP2 Reverse Primer
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human MAP2 Reverse Primer
<400> 18
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human GATA4 Forward Primer
<400> 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human GATA4 Reverse Primer
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human GATA4 TaqMan Probe
<400> 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human LPL Forward Primer
<400> 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human LPL Reverse Primer
<400> 23
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Human LPL TaqMan Probe
<400> 24

Claims (15)

  1. 一種多能性幹細胞的製備方法，包含下列步驟：球狀培養哺乳動物間質幹細胞，而形成多能性幹細胞的細胞團，其中，球狀培養係於含有下列(A)或(B)的溶液中進行：(A)結蘭膠或者是其衍生物或其鹽；(B)葡聚醣或者是其衍生物或其鹽。
  2. 如請求項1所述的製備方法，其中該哺乳動物間質幹細胞係為人類骨髓間質幹細胞或人類脂肪來源的間質幹細胞。
  3. 如請求項1或2所述的製備方法，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2。
  4. 一種多能性幹細胞的製備方法，包含下列步驟：球狀培養哺乳動物間質幹細胞，而形成多能性幹細胞的細胞團，其中球狀培養係於不含血清或不含血清替代物的生理水溶液中進行。
  5. 如請求項4所述的製備方法，其中該哺乳動物間質幹細胞係為人類骨髓間質幹細胞或人類脂肪來源的間質幹細胞。
  6. 如請求項4或5所述的製備方法，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2。
  7. 一種多能性幹細胞，係經由如請求項1至6中任一項所述的製備方法所得。
  8. 一種多能性幹細胞，係經由球狀培養哺乳動物間質幹細胞所得，其中，球狀培養係於含有下列(A)或(B)的溶液中進行：(A)結蘭膠或者是其衍生物或其鹽；(B)葡聚醣或者是其衍生物或其鹽。
  9. 如請求項8所述的多能性幹細胞，其中該哺乳動物間質幹細胞係為人類骨髓間質幹細胞或人類脂肪來源的間質幹細胞。
  10. 如請求項8或9所述的多能性幹細胞，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2。
  11. 一種多能性幹細胞，係經由球狀培養哺乳動物間質幹細胞所得，其中球狀培養係於不含血清或不含血清替代物的生理水溶液中進行。
  12. 如請求項11所述的多能性幹細胞，其中該哺乳動物間質幹細胞係為人類骨髓間質幹細胞或人類脂肪來源的間質幹細胞。
  13. 如請求項11或12所述的多能性幹細胞，其中該多能性幹細胞表現有Nanog、Oct3/4或Sox2。
  14. 一種器官或組織的功能低落或障礙的改善劑，包含如請求項7至13中任一項所述的多能性幹細胞。
  15. 一種多能性幹細胞的分化誘導法，其特徵在於，包含下列步驟：對如請求項1至6中任一項所述的多能性幹細胞施以分化處理。
TW103130514A 2013-09-04 2014-09-04 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 TWI637055B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013182945 2013-09-04
JP2013-182945 2013-09-04
JP2014102539 2014-05-16
JP2014-102539 2014-05-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201522638A TW201522638A (zh) 2015-06-16
TWI637055B true TWI637055B (zh) 2018-10-01

Family

ID=52628054

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107129236A TWI720333B (zh) 2013-09-04 2014-09-04 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法
TW103130514A TWI637055B (zh) 2013-09-04 2014-09-04 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107129236A TWI720333B (zh) 2013-09-04 2014-09-04 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US9765296B2 (zh)
EP (2) EP3569699A1 (zh)
JP (2) JP6353452B2 (zh)
CA (1) CA2921948C (zh)
HK (1) HK1222200A1 (zh)
TW (2) TWI720333B (zh)
WO (1) WO2015033558A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3177612T3 (pl) 2014-08-04 2022-08-08 Nuevolution A/S Opcjonalnie skondensowane pochodne pirymidyny podstawione heterocyklilem, użyteczne w leczeniu chorób zapalnych, metabolicznych, onkologicznych i autoimmunologicznych
CA2996582A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 I Peace, Inc. Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells
CN108699518A (zh) * 2015-12-29 2018-10-23 株式会社可乐丽 干细胞聚集体的群体的制备方法
WO2017150294A1 (ja) * 2016-03-04 2017-09-08 良考 山口 多能性幹細胞様スフェロイドの製造方法および多能性幹細胞様スフェロイド
JP2020099202A (ja) * 2017-04-12 2020-07-02 Ａｇｃ株式会社 分化細胞スフェロイドの製造方法
EP3865566A4 (en) * 2018-10-12 2022-08-03 Nikon Corporation SUB CULTURE LEVEL CALCULATION DEVICE AND SUB CULTURE LEVEL CALCULATION METHOD AND PROGRAM
JPWO2021006346A1 (zh) 2019-07-10 2021-01-14
MX2022007265A (es) 2019-12-20 2022-09-09 Nuevolution As Compuestos activos frente a receptores nucleares.
WO2021198956A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Nuevolution A/S Compounds active towards nuclear receptors
WO2021198955A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Nuevolution A/S Compounds active towards nuclear receptors
US20230285353A1 (en) * 2020-07-29 2023-09-14 The Regents Of The University Of California A chemical cocktail driving expansion of myogenic stem cells
CN117377753A (zh) * 2021-05-31 2024-01-09 奥普迪细胞株式会社 用于制作干细胞的细胞培养辅助剂以及干细胞的制作方法
WO2023053220A1 (ja) 2021-09-28 2023-04-06 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 多能性幹細胞の製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100093053A1 (en) * 2008-03-17 2010-04-15 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for Stem Cell Culture

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
DK1084230T3 (da) 1998-06-08 2008-03-03 Osiris Therapeutics Inc Regulering af hæmatopoietisk stamcelledifferentiering ved anvendelse af humane mesenkymstamceller
JP3660601B2 (ja) 2001-03-30 2005-06-15 独立行政法人科学技術振興機構 胚性幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びｇａｂａ作動性ニューロンの製造法
JP2004121165A (ja) 2002-10-07 2004-04-22 Asahi Kasei Corp 膵幹様細胞の分化誘導方法
WO2006085612A1 (ja) * 2005-02-10 2006-08-17 The New Industry Research Organization 神経幹細胞の調製法
WO2006093276A1 (ja) 2005-03-04 2006-09-08 Kyoto University 心臓組織由来の多能性幹細胞
WO2008150001A1 (ja) * 2007-06-08 2008-12-11 Biomaster, Inc. アディポクラスタ－
EP2245141B1 (en) 2008-01-18 2018-03-14 Regents of the University of Minnesota Stem cell aggregates and methods for making and using
US9399758B2 (en) 2009-07-15 2016-07-26 Mari Dezawa SSEA3(+) pluripotent stem cell that can be isolated from body tissue
JP2014132830A (ja) 2011-03-30 2014-07-24 Clio Inc 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞
US9550975B2 (en) 2009-07-15 2017-01-24 Mari Dezawa SSEA-3 pluripotent stem cell isolated from body tissue
JP5800712B2 (ja) 2009-09-15 2015-10-28 株式会社 資生堂 真皮幹細胞の単離方法
JP2011139691A (ja) 2010-01-09 2011-07-21 Bio Regenerations:Kk 羊膜由来多能性幹細胞の製造方法
JP5341059B2 (ja) 2010-11-09 2013-11-13 株式会社大塚製薬工場 幹細胞懸濁液
EP3409761A1 (en) 2012-07-24 2018-12-05 Nissan Chemical Corporation Culture medium composition, and method for culturing cell or tissue using said composition

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100093053A1 (en) * 2008-03-17 2010-04-15 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for Stem Cell Culture

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kuroda, Y., et al. (2010). "Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations." Proc Natl Acad Sci U S A 107(19): 8639-8643. *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201522638A (zh) 2015-06-16
EP3048169B1 (en) 2019-07-10
US11155782B2 (en) 2021-10-26
US20180016549A1 (en) 2018-01-18
CA2921948A1 (en) 2015-03-12
US9765296B2 (en) 2017-09-19
EP3569699A1 (en) 2019-11-20
WO2015033558A1 (ja) 2015-03-12
JP2018023401A (ja) 2018-02-15
US20190382721A1 (en) 2019-12-19
JP6478428B2 (ja) 2019-03-06
US10370639B2 (en) 2019-08-06
TWI720333B (zh) 2021-03-01
HK1222200A1 (zh) 2017-06-23
EP3048169A1 (en) 2016-07-27
EP3048169A4 (en) 2017-03-15
JPWO2015033558A1 (ja) 2017-03-02
US20160215258A1 (en) 2016-07-28
TW201900871A (zh) 2019-01-01
JP6353452B2 (ja) 2018-07-04
CA2921948C (en) 2019-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI637055B (zh) 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法
Cheng et al. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities
Huang et al. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes
Caseiro et al. Mesenchymal Stem/Stromal Cells metabolomic and bioactive factors profiles: A comparative analysis on the umbilical cord and dental pulp derived Stem/Stromal Cells secretome
CN106459922B (zh) Cd82阳性心肌前体细胞
US20100239540A1 (en) Peptide Linked Cell Matrix Materials for Stem Cells and Methods of Using the Same
Abdullah et al. Induction of mice adult bone marrow mesenchymal stem cells into functional motor neuron-like cells
JP6909154B2 (ja) 幹細胞組成物および療法適用のための幹細胞を産生する方法
RU2433172C2 (ru) Способ получения гомогенной популяции стволовых клеток и ее применение
US11913020B2 (en) Method for improving stem cell migration using ethionamide
CN103620023B (zh) 睾丸体细胞来源的多能干细胞、其制备方法以及包含其的治疗勃起功能障碍的药物组合物
CN103459590A (zh) 可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞
Shi et al. The effect of extended passaging on the phenotype and osteogenic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells
KR20120006386A (ko) 1기 태반조직 유래 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제
Kim et al. A fibrin-supported myocardial organ culture for isolation of cardiac stem cells via the recapitulation of cardiac homeostasis
WO2014044857A1 (en) Adipose tissue cells
Nor et al. Growth Factor Cocktail to Facilitate Epithelial Differentiation of Exfoliated Deciduous Teeth Stem Cells
Sigurðardóttir Influence of Biomaterials on Mesenchymal Stem Cell Properties in a 3D Cell Culture Model
JP2024024550A (ja) 未分化幹細胞の細胞死誘導剤、及び分化細胞の純化方法
WO2023172225A1 (en) A method and culture medium formulation which can be used for the derivation of mesenchymal stem cells from pluripotent stem cells
Ho Studies on the Gene Expression of Human Hair Follicle Bulge Stem Cells and Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells under Different Culture Conditions
Caremoli PURIFICATION, CHARACTERIZATION AND CULTURE OF ENSHEATHING CELLS FROM HUMAN OLFACTORY MUCOSA BIOPSIES
Somuncu et al. Myogenic Differentiation Potential of Human Newborn Foreskin Stem Cells Combined with Polycaprolactone-Based Nanofiber
Thwaites Methods affecting neuronal differentiation of human adult and pluripotent stem cells
WO2016057649A1 (en) Mesenchymal stem cell diagnostic testing