JP2018023401A - 多能性幹細胞の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト骨髄間葉系幹細胞(Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow;hMSC-BM)、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(Human Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cell;hAT−MSC)(「ヒト脂肪細胞由来幹細胞[Human Adipose-derived Stem Cells;hADSC]」ともいう。)等の哺乳動物間葉系幹細胞や、ヒト接着性成熟細胞7種(ヒトヘパトサイト細胞[hHEP細胞]、ヒト臍帯静脈内皮細胞[HUVEC細胞]、ヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞[HMVEC細胞]、ヒト表皮角化細胞[NHEK細胞]、ヒト気管支上皮細胞[NHBE細胞]、ヒトメラノサイト細胞[NHEM細胞]、及びヒト平滑筋細胞[UASMC細胞])及びヒト接着性前駆細胞3種(ヒト皮膚線維芽細胞[NHDF細胞]、ヒト骨格筋筋芽細胞[HSMM細胞]、及びヒト骨芽細胞[NHOst細胞])を浮遊培養し、細胞塊(スフェロイド[Spheroid])を形成させると、多能性を有し、かつ腫瘍化リスクが極めて低い細胞を調製することができる。
【選択図】なし
Description
[参考例1]
1−1 方法
1−1−1 hMSC-BM細胞の培養とスフェロイド培養方法
〔1〕75cm2のフラスコに、間葉系幹細胞添加因子セット(Lonza社製、PT-4105)を加えたMSCBM(Mesenchymal Stem Cell Basal Medium)(Lonza社製、PT-3238)(以下、「MSCBM培養液」という)16mLを添加し、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で培養液の加温・平衡化を行った(30分以上)。
〔2〕hMSC-BM細胞(Lonza社製)を液体窒素から取り出し、37℃の湯浴器中で迅速に融解した。
〔3〕融解した細胞を、予め5mLMSCBM培養液を入れておいた15mL遠心管に移し混和した。
〔4〕500g、5分間、22℃で遠心処理を行った。
〔5〕上清を除き、1mLMSCBM培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔6〕さらに9mLMSCBM培養液を加えて撹拌した。
〔7〕細胞数をカウントし、75cm2フラスコに播種した(4.0×105細胞/フラスコ)。
〔8〕インキュベーター(37℃、5%CO2)内で細胞培養を行った。
〔9〕3日又は4日おきに培養液を交換した。
〔10〕80%コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、10mLPBSを加え細胞を洗浄した。
〔11〕PBSを除き、トリプシン/EDTA(Lonza社製)を3.75mL程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら室温で5分間トリプシン処理を行った後、90%以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに3〜10分間トリプシン処理を行った。
〔12〕室温のMSCBM培養液をトリプシン/EDTAと等量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、15mLチューブに回収した。
〔13〕600g、5分間、室温で遠心処理を行った。
〔14〕上清を除き、1mLMSCBM培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔15〕さらに9mLMSCBM培養液を加えて撹拌した。
〔16〕細胞数をカウントし、75cm2フラスコに播種した(3.75〜4.5×105細胞/フラスコ)。
〔17〕インキュベーター(37℃、5%CO2)内で細胞培養を行った。
〔18〕3日又は4日おきに培養液を交換した。
〔19〕解析に用いる上で十分な細胞数(0.3〜1×108細胞)となるまで、工程〔10〕〜[18]を繰り返した。
〔20〕80%コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、10mLPBSを加え細胞を洗浄した。
〔21〕PBSを除き、トリプシン/EDTA(Lonza社製)を3.75mL程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら室温で5分間トリプシン処理を行った後、90%以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに3〜10分間トリプシン処理を行った。
〔22〕室温のMSCBM培養液をトリプシン/EDTAと等量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、15mLチューブに回収した。
〔23〕600g、5分間、室温で遠心処理を行った。
〔24〕上清を除き、1mLMSCBM培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔25〕さらに9mLMSCBM培養液を加えて撹拌した。
〔26〕細胞数をカウントし、低接着性の100mmディッシュ(Corning社製)及び96ウェルプレート(Corning社製)に播種し(1.0×106細胞/ディッシュ及び1.0×104細胞/プレート)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間スフェロイド培養を行った。
〔1〕上記「1−1−1 hMSC-BM細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって96ウェルプレートでスフェロイド培養したhMSC-BM細胞を、1.5mLチューブに回収した。なお、コントロールとしてチャンバースライド(IWAKI社製)にて接着培養したhMSC-BM細胞は、剥離せずに以下同様の操作を行った。
〔2〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔3〕上清を除き、0.5〜1mL4%ホルムアルデヒド/PBSを加え、細胞の固定処理を行った(15分間、室温)。
〔4〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔5〕上清を除き、1〜1.5mLPBSを加え、細胞の洗浄処理を行った(5分間、室温)。
〔6〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔7〕工程〔5〕〜[6]を2回繰り返した。
〔8〕上清を除き、0.5〜1mLTriton/PBSを加え、細胞の透過処理を行った(5分間、室温)。
〔9〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔10〕上清を除き、1〜1.5mLPBSを加え、細胞の洗浄処理を行った(5分間、室温)。
〔11〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔12〕工程〔10〕〜[11]を1回繰り返した。
〔13〕上清を除き、1mLブロッキング溶液(5%正常血清/PBS又は3%BSA/PBS)を加え、細胞のブロッキング処理を行った(1〜2時間、室温)。
〔14〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔15〕上清を除き、4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質(Nanog、Oct3/4、Sox2、及びSSEA3)の発現を検出するために、0.5〜1mL1次抗体溶液(抗Nanog抗体[Cell signaling technology社製、#4903S、1/800倍希釈]、抗Oct4抗体[Cell signaling technology社製、#2750S、1/400倍希釈]、抗Sox2抗体[Cell signaling technology社製、#3579S、1/400倍希釈]、又は抗SSEA3抗体[Millipore社製、A488、1/200倍希釈])を加え、細胞の1次抗体反応処理を行った(一晩、4℃)。
〔16〕上清を除き、1〜1.5mLPBSを加え、細胞の洗浄処理を行った(5分間、室温)。
〔17〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔18〕工程〔16〕〜[17]を2回繰り返した。
〔19〕上清を除き、0.5〜1mL2次抗体溶液(Alexa Fluor 488抗ラビット抗体[Invitrogen社製、A21206、1/1000倍希釈]、Alexa Fluor 555抗ラビット抗体[Invitrogen社製、A21428、1/1000倍希釈]、又はAlexa Fluor 488抗マウス抗体[Invitrogen社製、A21202、1/1000倍希釈])を加え、細胞の2次抗体反応処理を行った(1〜2時間、室温)。
〔20〕上清を除き、1〜1.5mLPBSを加え、細胞の洗浄処理を行った(5分間、室温)。
〔21〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔22〕工程〔20〕〜[21]を2回繰り返した。
〔23〕上清を除き、1〜1.5mLPBSを加え、スライドグラス上に細胞塊を静置後、又は、接着培養のチャンバースライド上部の剥離後、Fluoromount(Diagnostic BioSystem社製)を滴下しカバーグラスをかけ封入し、免疫蛍光染色用の細胞試料を作製した。
〔24〕Axio Observer(Carl Zeiss社製)を用いて、細胞試料における蛍光画像と位相
差画像を取得した。解析ソフトには、Axio Vision(Carl Zeiss社製)を使用した。
〔1〕上記「1−1−1 hMSC-BM細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって100mmディッシュでスフェロイド培養したhMSC-BM細胞を、15mL遠心管に回収した。なお、コントロールとして接着培養したhMSC-BM細胞を回収し、以下同様の操作を行った。
〔2〕細胞における全RNAの抽出は、RNeasy Mini Kit(Qiagen社製)及びQIA shredder(Qiagen社製)を用いて製品付属のプロトコールにしたがって行った。
〔3〕抽出した全RNAの濃度は、NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて測定した。
〔4〕全RNAを20μg/mLに調整し、96ウェルプレート(Fast 96 well Reaction plate[Applied Biosystems社製、#4309169])に3μL/ウェルとなるように分注した。
〔5〕3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNAの発現量をRT−PCRにより検出するために、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit(Applied Biosystems社製、#4309169)を用いて以下の1)〜6)からなる反応液を調製し、全RNAを分注した96ウェルプレートへ滴下した。なお、内部標準としてGAPDH遺伝子を用いた。
1)Rnase-free water;0.5μL
2)2X Master Mix without UNG;10μL(1×)
3)40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix;0.5μL
4)Forward Primer;2.0μL(300nM)
5)Reverse Primer;2.0μL(900nM)
6)TaqMan Probe;2.0μL(200nM)
1)48℃、30分を1サイクル(mRNAからcDNAへの逆転写反応)
2)95℃、10分を1サイクル(ポリメラーゼの活性化)
3)95℃、15秒と60℃、1分の往復を40サイクル(「Forward Primer」及び「Reverse Primer」によるcDNAの増幅)
〔7〕Baselineソフトウェア(Applied Biosystems社製)を用いてPCR産物が一定量になるPCRのサイクル数(threshold cycle;Ct値)を測定し、比較Ct法(delta delta Ct法)によりGAPDH遺伝子のcDNA増幅産物のCt値を基準とした上記3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のcDNA増幅産物のCt値の相対値を求め、かかるCt値の相対値から、上記3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のcDNAの相対量、すなわち上記3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のmRNAの相対量を算出した(図5及び10の縦軸参照)。
免疫蛍光染色法を用いて4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質(Nanog、Oct3/4、Sox2、及びSSEA3)の発現を検出したところ、コントロールの接着培養したhMSC-BM細胞においては、上記4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質の発現は検出されなかったのに対して、スフェロイド培養したhMSC-BM細胞においては、上記4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質が検出された(図1〜4参照)。
[参考例2]
2−1 方法
2−1−1 hADSC細胞の培養とスフェロイド培養方法
〔1〕75cm2のフラスコに、ヒト脂肪由来幹細胞添加因子セット(Lonza社製、PT-4503)を加えたADSC−BM(Adipose Derived Stem Cell Basal Medium)(Lonza社製、PT-3273)(以下、「ADSC−BM培養液」という)15mLを添加し、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で培養液の加温・平衡化を行った(20〜30分以上)。
〔2〕hADSC細胞(Lonza社製)を液体窒素から取り出し、37℃の湯浴器中で迅速に融解した。
〔3〕融解した細胞を、予め5mLADSC−BM培養液を入れておいた15mL遠心管に移し混和した。
〔4〕210g、5分間、22℃で遠心処理を行った。
〔5〕上清を除き、1mLADSC−BM培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔6〕さらに9mLADSC−BM培養液を加えて撹拌した。
〔7〕細胞数をカウントし、75cm2フラスコに播種した(3.75×105細胞/フラスコ)。
〔8〕インキュベーター(37℃、5%CO2)内で細胞培養を行った。
〔9〕3日又は4日おきに培養液を交換した。
〔10〕90%コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、5mLHEPES buffer(Lonza社製)を加え細胞を洗浄した。
〔11〕HEPES bufferを除き、トリプシン/EDTA(Lonza社製)を3.75mL程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら37℃で3〜5分間トリプシン処理を行った後、90%以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに2分間トリプシン処理を行った。
〔12〕室温のTNS(Trypsin Neutralization Solution)(Lonza社製)をトリプシン/EDTAの2倍量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、15mLチューブに回収した。
〔13〕210g、5分間、室温で遠心処理を行った。
〔14〕上清を除き、1mLADSC−BM培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔15〕さらに9mLADSC−BM培養液を加えて撹拌した。
〔16〕細胞数をカウントし、75cm2フラスコに播種した(3.75〜4.5×105細胞/フラスコ)。
〔17〕インキュベーター(37℃、5%CO2)内で細胞培養を行った。
〔18〕3日又は4日おきに培養液を交換した。
〔19〕解析に用いる上で十分な細胞数(0.3〜1×108細胞)となるまで、工程〔10〕〜[18]を繰り返した。
〔20〕90%コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、10mLPBSを加え細胞を洗浄した。
〔21〕PBSを除き、トリプシン/EDTA(Lonza社製)を3.75mL程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら37℃で3〜5分間トリプシン処理を行った後、90%以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに2分間トリプシン処理を行った。
〔22〕室温のTNS(Lonza社製)をトリプシン/EDTAの2倍量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、15mLチューブに回収した。
〔23〕210g、5分間、室温で遠心処理を行った。
〔24〕上清を除き、1mLADSC−BM培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔25〕さらに9mLADSC−BM培養液を加えて撹拌した。
〔26〕細胞数をカウントし、低接着性の100mmディッシュ(Corning社製)及び96ウェルプレート(Corning社製)に播種し(1.0×106細胞/ディッシュ及び1.0×104細胞/プレート)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間スフェロイド培養を行った。
上記「2−1−1 hADSC細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって96ウェルプレートでスフェロイド培養したhADSC細胞を、上記「1−1−2 免疫蛍光染色法」に記載の方法にしたがって解析した。なお、コントロールとして接着培養したhADSC細胞を用いた。
上記「1−1−1 hMSC-BM細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって100mmディッシュでスフェロイド培養したhMSC-BM細胞を、上記「1−1−3 mRNAの発現解析」に記載の方法にしたがって解析した。なお、コントロールとして接着培養したhADSC細胞を用いた。
免疫蛍光染色法を用いて4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質(Nanog、Oct3/4、Sox2、及びSSEA3)の発現を検出したところ、コントロールの接着培養したhADSC細胞においては、上記4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質の発現は検出されなかったのに対して、スフェロイド培養したhADSC細胞においては、上記4種類の多能性幹細胞マーカータンパク質が検出された(図6〜9参照)。
3−1 方法
3−1−1 スフェロイド培養方法
[hHEP細胞(接着性成熟細胞1種)]
〔1〕hHEP細胞(In Vitro Technologies, Inc社製)を液体窒素から取り出し、37℃の湯浴器中で迅速に融解した。
〔2〕細胞を50mLの遠心管に移した。
〔3〕hHEP細胞の専用培養液(hHEP培養用培養液)(表2参照)25mL(氷冷)をゆっくりと滴下した。
〔4〕4℃で遠心した(50×g、3分)。
〔5〕上清を捨て、氷冷したhHEP培養用培養液を5mL添加した。
〔6〕細胞数をカウントし、低接着性の96ウェルプレート(Corning社製)に播種し(1.0×104細胞/ウェル)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間スフェロイド培養した(図11の「hHEP」参照)。なお、コントロールとして、接着性の24ウェルプレート(旭テクノグラス社製)に播種し(1.0×105細胞/ウェル)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間接着培養を行った。
〔1〕75cm2のフラスコのそれぞれに、上記接着性成熟細胞6種及び接着性前駆細胞3種の専用培養液(HUVEC、HMVEC、NHEK、NHDF、NHBE、HSMM、NHEM、UASMC、及びNHOst培養用培養液)(表2参照)16mLを添加し、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で培養液の加温・平衡化を行った(30分以上)。
〔2〕上記接着性成熟細胞6種及び接着性前駆細胞3種(すべてLonza社製)を液体窒素から取り出し、37℃の湯浴器中で迅速に融解し、上記9種類の細胞専用の培養液を添加した75cm2フラスコに播種した(2500〜10000細胞/cm2)。
〔3〕播種後24時間以内に培養液を交換し、以後1日〜3日おきに培養液を交換した。〔4〕培養液を取り除き、15mLのHBSS(Lonza社製)を加えた。細胞をリンス後、HBSSを取り除いた。なお、HSMM細胞については、HBSSの代わりにDPBS(−)を、また、NHEM細胞については、HBSSの代わりにPBS(−)を用いた。〔5〕トリプシン/EDTA(Lonza社製)を6mL加え,5分間処理した。
〔6〕TNS(Lonza社製)を12mL加え、中和した。
〔7〕50mLの遠心管に入れた。
〔8〕各フラスコそれぞれにHBSSを5mL加え,洗い込んだ。なお、HSMM細胞については、HBSSの代わりにDPBS(−)を、また、NHEM細胞については、HBSSの代わりにPBS(−)を用いた。
〔9〕220×g、5分、室温で遠心処理し、上清を捨て、氷冷培地(フラスコ1枚から回収した細胞につき4〜6mL)を添加した。なお、NHEM細胞については、推奨プロトコールに従い、工程〔9〕は行わなかった。
〔10〕細胞数をカウントし、75cm2フラスコに播種した(2500〜10000細胞/cm2)。
〔11〕1日〜3日おきに培養液を交換した。
〔12〕解析に用いるまで、工程〔4〕〜[11]を繰り返した。
〔13〕工程〔4〕〜〔9〕と同じ作業を行った。
〔14〕細胞数をカウントし、低接着性の96ウェルプレート(Corning社製)に播種し(1.0×104細胞/ウェル)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間スフェロイド培養を行った(図11の「HUVEC」、「HMVEC」、「NHEK」、「NHDF」、「NHBE」、「HSMM」、「NHEM」、「UASMC」、及び「NHOst」参照)。なお、コントロールとして、接着性の24ウェルプレート(Corning社製)に播種し(1.0×105細胞/ウェル)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間接着培養を行った。
hMSC-BM細胞のスフェロイド培養は、上記「1−1−1 hMSC-BM細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって、低接着性の96ウェルプレート(Corning社製)中で行った(図11の「hMSC-BM」参照)。なお、コントロールとして、接着性の24ウェルプレート(Corning社製)に播種し(1.0×105細胞/ウェル)、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間接着培養を行った。
〔1〕上記「3−1−1 スフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがってスフェロイド培養した細胞(接着性成熟細胞7種[HUVEC、HMVEC、NHEK、hHEP、NHBE、NHEM、及びUASMC細胞]及び接着性前駆細胞3種[NHDF、HSMM、及びNHOst細胞]については16ウェル分、hMSC-BM細胞については24ウェル分)と、コントロールとして接着培養した細胞(上記接着性成熟細胞7種及び接着性前駆細胞3種については4ウェル分、hMSC-BM細胞については12ウェル分)を、それぞれ1.5mLチューブに回収した。
〔2〕細胞における全RNAの抽出は、RNeasy Mini Kit(Qiagen社製)及びQIA shredder(Qiagen社製)を用いて製品付属のプロトコールにしたがって行った。
〔3〕抽出した全RNAの濃度は、NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて測定した。
〔4〕全RNAを20μg/mLに調整し、96ウェルプレート(Fast 96 well Reaction plate[Applied Biosystems社製、#4309169])に3μL/ウェル(60ngRNA)となるように分注した。
〔5〕多能性幹細胞マーカー遺伝子3種(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNA発現をRT−PCRにより検出するために、TaqMan RNA-to-CTTM 1-Step Kit(Applied Biosystems社製、#4392938)を用いて以下の1)〜6)からなる反応液を調製し、全RNAを分注した96ウェルプレートへ滴下した。なお、内部標準としてGAPDH遺伝子を用いた。
1)Rnase-free water;0.5μL
2)2X TaqMan RT-PCR Mix;10μL(1×)
3)40X TaqMan RT Enzyme Mix;0.5μL
4)Forward Primer;2.0μL(900nM)
5)Reverse Primer;2.0μL(900nM)
6)TaqMan Probe;2.0μL(200nM)
1)48℃、15分を1サイクル(mRNAからcDNAへの逆転写反応)
2)95℃、10分を1サイクル(ポリメラーゼの活性化)
3)95℃、15秒と60℃、1分の往復を40サイクル(「Forward Primer」及び「Reverse Primer」によるcDNAの増幅)
〔7〕Baselineソフトウェア(Applied Biosystems社製)を用いてPCR産物が一定量になるPCRのサイクル数(threshold cycle;Ct値)を測定し、比較Ct法(delta delta Ct法)によりGAPDH遺伝子のcDNA増幅産物のCt値を基準とした上記マーカー遺伝子4種のcDNA増幅産物のCt値の相対値を求め、かかるCt値の相対値から、上記マーカー遺伝子4種のcDNA(mRNA)の相対量を算出した(図12〜14の縦軸、表3〜5参照)。
RT−PCR法を用いて3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNAの発現量を検出・定量したところ、スフェロイド培養したすべての細胞(hMSC-BM細胞及び接着性成熟細胞7種及び接着性前駆細胞3種)におけるNanog及びOct3/4のmRNAの発現量は、コントロールの接着培養した細胞の発現量と比べ、大幅に増加していた(図12〜14、表3〜5参照)。これらの結果は、hMSC-BM細胞等の間葉系幹細胞はもちろんのこと、分化が完了した接着性成熟細胞や特定の組織や細胞へ分化する接着性前駆細胞であっても、スフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を誘導(あるいは単離)できることを示している。
接着性成熟細胞6種(HUVEC、HMVEC、NHEK、NHBE、NHEM、及びUASMC細胞)及び接着性前駆細胞3種(NHDF、HSMM、及びNHOst細胞)をMSCBM培養液等のMSC培養用培養液中で培養した場合に、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。培養液を各細胞専用の培養液からMSCBM培養液へ変更し、上記実施例1記載の方法により上記接着性成熟細胞6種及び接着性前駆細胞3種をスフェロイド培養したところ、すべての接着性成熟細胞において、各種細胞専用の培養液中でスフェロイド培養するよりも、MSCBM培養液中でスフェロイド培養をした方が、3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNAの発現レベルが高いことが示された(図15〜17、表6〜8参照)。これらの結果は、接着性成熟細胞や接着性前駆細胞をMSCBM培養液中でスフェロイド培養した方が、各細胞専用の培養液中でスフェロイド培養するよりも、より多能性獲得の効率が高まることを示している。
[参考例3]
hMSC-BM細胞を無血清の生理的水溶液で培養した場合に、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。hMSC-BM細胞を、MSCBM培養液に代えて輸液(エルネオパ2号輸液[大塚製薬工場社製]をビカネイト輸液[大塚製薬工場社製]にて100倍希釈したもの)中でスフェロイド培養したところ、3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNAの発現レベルが増加することが示された(図18、表9参照)。これらの結果は、hMSC-BM細胞等の間葉系幹細胞を輸液等の無血清の生理的水溶液中でスフェロイド培養した方が、MSCBM培養液等の間葉系幹細胞培養用培養液中でスフェロイド培養するよりも、多能性獲得の効率が高まることを示している。
接着性成熟細胞を無血清の生理的水溶液で培養した場合に、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。HUVEC細胞を、HUVEC培養用培養液に代えて輸液(エルネオパ2号輸液[大塚製薬工場社製]をビカネイト輸液[大塚製薬工場社製]にて100倍希釈したもの)中で6日間スフェロイド培養したところ(図19A参照)、3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNAの発現レベルが増加することが示された(図19B、表10参照)。また、NHEK細胞を、NHEK培養用培養液に代えて上記輸液中で6日間スフェロイド培養した場合(図20A参照)も同様に、3種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog、Oct3/4、及びSox2)のmRNAの発現レベルが増加することが示された(図20B、表11参照)。これらの結果は、接着性成熟細胞を輸液等の無血清の生理的水溶液中でスフェロイド培養した方が、細胞専用培養液中でスフェロイド培養するよりも、多能性獲得の効率が高まることを示している。
[参考例4]
hMSC-BM細胞を、多糖類を用いて培養液の粘性を向上させることにより完全浮遊状態で培養させたときに、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。hMSC-BM細胞を、ジェランガム(0.02%脱アシル化ジェランガム[三晶社製、CG-LA])を含むMSCBM培養液中で7日間スフェロイド培養した場合、ジェランガムを含まないMSCBM培養液中でスフェロイド培養した場合と比べ、多能性幹細胞マーカー遺伝子(Nanog)のmRNAの発現レベルが増加することが示された(図21A参照)。この結果は、hMSC-BM細胞を、ジェランガムを含む培養液中でスフェロイド培養することにより、スフェロイドの浮遊状態を向上させ、多能性獲得の効率が高まったと推測される。
[参考例5]
hMSC-BM細胞のスフェロイドの多分化能について解析するために、hMSC-BM細胞のスフェロイドを、以下の「8−1−1 スフェロイド培養後の継代培養方法」に記載の方法にしたがって継代培養(スフェロイド培養)した後、以下の「8−1−2 浮遊培養による分化誘導方法」、又は「8−1−3 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって4種類の臓器・組織(神経、肝臓、心筋、及び脂肪)細胞への分化誘導処理を行った。
8−1−1 スフェロイド培養後の継代培養方法
〔1〕上記「1−1−1 hMSC-BM細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって調製したhMSC-BM細胞のスフェロイド(96ウェルプレート1枚分)を、50mLチューブに回収した。
〔2〕5分間室温で静置した後、スフェロイドを吸わないようにかつ培養液の残量が1mL以下になるようにゆっくりと上清(培養液)を除いた。
〔3〕30mLPBS(-)(Life Technologies社製、14190144)を加え、5分間静置した後、同様にゆっくりと上清(培養液)を除いた。
〔4〕2mLトリプシン/EDTA(Lonza社製)を加え、37℃ウォーターバス中で10分間静置した。
〔5〕2mLhMSC-BM培養液(Lonza社製、PT-3001)を加え、トリプシン処理を止めた後、P1000ピペットで3〜5回ゆっくりとスフェロイドを分散させた。
〔6〕600g、5分間、室温で遠心処理し、上清の除き、5ng/mLbFGF(ReproCELL社製、RCHEOT002)を加えたReproFF(ReproCELL社製、RCHEMD004)(以下、「FF+bFGF培養液」という)10mLを添加し、細胞を懸濁した。
〔7〕96ウェルプレート(Corning社製)に播種し、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で継代培養(スフェロイド培養)を行った。
〔8〕4日後に、1ウェルあたり70μLのFF+bFGF培養液を除き、新しいFF+bFGF培養液100μLを加えることにより培養液を交換し、さらに7日間継代培養(スフェロイド培養)を行った。
〔1〕上記「8−1−1 スフェロイド培養後の継代培養方法」に記載の方法にしたがって調製したhMSC-BM細胞のスフェロイドを、1ウェルあたり70μLのFF+bFGF培養液を除き、新しい5種類の分化誘導用培養液(表12〜16参照)100μLを加えた。
〔2〕インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間浮遊培養した。
〔3〕1ウェルあたり80μLの培養液を除き、新しい5種類の分化誘導用培養液(表12〜16参照)100μLを加えた後、さらに7日間浮遊培養した。なお、その後、免疫染色法及びOil Red染色法による解析を行うサンプルについては、7日間浮遊培養後、細胞を96ウェルプレート(TPP社製、92096)に播種し、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で1日間接着培養した。
〔1〕上記「8−1−1 スフェロイド培養後の継代培養方法」に記載の方法にしたがって調製したhMSC-BM細胞のスフェロイド(96ウェルプレート1枚分)を、50mLチューブに回収した。
〔2〕5分間室温で静置した後、スフェロイドを吸わないようにかつ培養液の残量が1mL以下になるようにゆっくりと上清(培養液)を除いた。
〔3〕新しい5種類の分化誘導用培養液(表12〜16参照)30mLを加え、6ウェルプレート(TPP社製、92006)に播種し、インキュベーター(37℃、5%CO2)内で7日間接着培養した。なお、96ウェルプレート1枚から6ウェルプレートで2ウェル分程度を目安とした。
〔4〕培養液の8割相当を新しい培養液と交換し、さらに7日間接着培養した。
上記「8−1−2 浮遊培養による分化誘導方法」及び「8−1−3 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって分化誘導した細胞について、上記「1−1−2 免疫蛍光染色法」に記載の方法にしたがって3種類の分化マーカータンパク質(βチューブリン3[神経細胞マーカー]、ネスチン[神経細胞マーカー]、及びAFP[肝細胞マーカー])の発現を解析した。なお、コントロールとして分化誘導前の細胞(hMSC-BM細胞のスフェロイド)を用いた。上記3種類の分化マーカータンパク質の検出に用いた1次抗体及び2次抗体を以下の表17に示す。
〔1〕上記「8−1−2 浮遊培養による分化誘導方法」及び「8−1−3 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって脂肪細胞へ分化誘導した細胞について、ウェルから培養液を除いた。
〔2〕PBSに10%(v/v)量のホルマリンを添加し、pH7.4に調整した後(10%ホルマリン[和光純薬工業社製]/PBS[pH7.4])、4℃保管した。
〔3〕イソプロパノール(和光純薬工業社製)に、0.5%(v/v)量のOil red O(和光純薬工業社製)を添加し、スターラーを用いてよく攪拌して0.5%Oil red O/Isopropanol溶液を作製した。
〔4〕培養液が入った状態で2:1の割合になるように冷10%ホルマリン/PBS(250μL/ウェル程度)を添加し、室温で20分間インキュベートした。
〔5〕0.5%Oil red O/Isopropanol溶液と蒸留水を3:2の割合で混合し、室温で10分間インキュベートした。
〔6〕培養液を除き、新たに冷10%ホルマリン/PBSを400μL添加し、室温で1時間インキュベートした。
〔7〕ホルマリン溶液を除去し、細胞が剥離しないように気をつけながら2回蒸留水(大塚製薬工場社製)で洗った。ウェル内に残った蒸留水はピペットを用いて除去した。
〔8〕染色後、蒸留水で2回洗った。
〔9〕Olympus IX-70(オリンパス社製)を用いて細胞画像を取得した。
上記「8−1−2 浮遊培養による分化誘導方法」及び「8−1−3 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって分化誘導した細胞について、上記「3−1−2 mRNAの発現解析」に記載の方法にしたがって4種類の分化マーカー遺伝子(Musashi[神経前駆細胞マーカー]、MAP2[神経細胞マーカー]、GATA4[心筋細胞マーカー]、及びLPL[脂肪細胞マーカー])のmRNAの発現解析を行った。なお、コントロールとして分化誘導前の細胞(継代培養前及び継代培養後のhMSC-BM細胞のスフェロイド)を用いた。上記5種類の分化マーカー遺伝子のcDNAを増幅するためのプライマーセット(「Forward Primer」及び「Reverse Primer」)の塩基配列や、その増幅(PCR)産物にハイブリダイズするプローブ(「TaqMan Probe」)の塩基配列は、表18に示す。また、GAPDH遺伝子のcDNA増幅産物に対する上記5種類の分化マーカー遺伝子のcDNA(mRNA)の相対量は、図24、26B、及び27D、並びに表19〜21に示す。
hMSC-BM細胞のスフェロイドを、神経分化誘導法1を用いた浮遊培養による神経細胞(外胚葉由来細胞)への分化誘導処理を行った結果、神経細胞マーカータンパク質(ネスチン)を発現し(図22A参照)、神経前駆細胞マーカー遺伝子(Musashi)(図24Aの「神経分化誘導法1 浮遊」、表19参照)及び神経細胞マーカー遺伝子(MAP2)(図24Bの「神経分化誘導法1 浮遊」、表19参照)のmRNAを発現する神経細胞(図22B参照)へ分化することが示された。また、hMSC-BM細胞のスフェロイドを、神経分化誘導法2を用いた接着培養による神経細胞への分化誘導処理を行った場合も同様に、神経細胞マーカータンパク質(βチューブリン3)を発現し(図23A参照)、神経前駆細胞マーカー遺伝子(Musashi)(図24Aの「神経分化誘導法2 接着」参照)及び神経細胞マーカー遺伝子(MAP2)(図24Bの「神経分化誘導法2 接着」参照)のmRNAを発現する神経細胞(図23B参照)へ分化することが示された。
また、hMSC-BM細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による肝細胞(内胚葉由来細胞)への分化誘導処理を行った結果、肝細胞マーカータンパク質(AFP)を発現する(図25A参照)肝細胞(図25C参照)へ分化することが示された。
また、hMSC-BM細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による心筋細胞(中胚葉由来細胞)への分化誘導処理を行った結果、心筋細胞マーカー遺伝子(GATA4)のmRNAを発現する(図26B、表20参照)心筋細胞(図26A参照)へ分化することが示された。
さらに、hMSC-BM細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による脂肪細胞(中胚葉由来細胞)への分化誘導処理を行った結果、脂肪滴が検出され(図27B及びC参照)、脂肪細胞マーカー遺伝子(LPL)のmRNAを発現する(図27D、表21参照)脂肪細胞(図27A参照)へ分化することが示された。
以上の結果は、hMSC-BM細胞のスフェロイドは、3つの胚(外胚葉、内胚葉、中胚葉)由来の細胞へ分化する能力(多分化能)を有する細胞であることを示している。
接着性成熟細胞のスフェロイドの多分化能について解析するために、接着性成熟細胞2種(NHEK及びHUVEC細胞)を96ウェルプレートに播種し、MSCBM培養液中で7日間スフェロイド培養することにより接着性成熟細胞のスフェロイドを調製し、調製した接着性成熟細胞のスフェロイドをFF+bFGF培養液中で1週間スフェロイド培養した後、チャンバースライド(TPP社製、92006)で神経分化誘導法1により神経細胞への分化誘導処理を3週間接着培養を行った後、1次抗体(抗TUJ1抗体[Millipore社製、MAB1637、100倍希釈])及び2次抗体(Alexa Fluor 555抗ラビット抗体[Invitrogen社製、A21422、1/1000倍希釈])を用い、上記「1−1−2 免疫蛍光染色法」に記載の方法にしたがって神経細胞マーカー(TUJ1)の発現解析を行った。その結果、神経細胞への分化誘導処理を行ったNHEK及びHUVEC細胞のスフェロイドは、神経細胞マーカータンパク質(TUJ1)を発現する神経細胞へ分化することが示された(図28参照)。この結果は、NHEK細胞、HUVEC細胞等の接着性成熟細胞のスフェロイドは、少なくとも外胚葉由来の細胞へ分化する能力を有する細胞であることを示している。
[参考例6]
ES細胞やiPS細胞は無限の増殖能と全能性を有しているため、ES細胞やiPS細胞を未分化状態で移植するとテラトーマ(奇形腫)が形成されることが知られている(文献「Gropp, et al., PLoS One 7(9):(2012)」参照)。そこで、hMSC-BMやhADSC細胞のスフェロイドを移植したときに、テラトーマが形成されるかどうか解析を行った。
上記参考例1記載の方法にしたがって調製したhMSC-BM細胞(1×106細胞)のスフェロイド、及び上記参考例2記載の方法にしたがって調製したhADSC細胞(1×106細胞)のスフェロイドのそれぞれを、0.2mLPBSに懸濁し、メスのマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J)(日本チャールス・リバー社製)の脇腹皮下に注射筒を用いて移植した(それぞれ、「MSC Spheroid群」、及び「ADSC Spheroid群」)。なお、コントロールとして、マウスES細胞(1×106細胞)(Millipore社製、CMSCC050-2A[SCC050])、接着培養したhMSC-BM細胞(1×106細胞)、及び接着培養したhADSC細胞(1×106細胞)のそれぞれを、0.2mLPBSに懸濁し、メスのマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J)(日本チャールス・リバー社製)の脇腹皮下に注射筒を用いて移植した(それぞれ、「Positive Control群」、「MSC Normal群」、及び「ADSC Normal群」)。また、PBSを移植し、細胞未移植のコントロール実験(Sham群)も行った。移植後、12週間目にマウスを頚椎脱臼法により安楽致死させ、テラトーマが形成された場合はテラトーマを摘出し、テラトーマが形成されなかった場合には移植部位を摘出した。摘出した組織は、10%中性緩衝ホルマリン液で浸漬固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン包埋した組織をスライスし、2種類の染色法(ヘマトキシリン・エオジン染色[HE]法、及びビメンチン染色法)を用いて染色し、電子キャリパーを用いた顕微鏡観察により腫瘍の長径(L)と短径(W)を測定した。得られた腫瘍の長径(L)と短径(W)の値を、式「腫瘍体積(mm3)=L×W2×1/2」に入力することにより腫瘍体積を算出した(表22参照)。
マウスES細胞を移植した場合、全ての移植マウス(n=8)において移植後3週間目でテラトーマが形成されていたのに対し、hMSC-BM細胞のスフェロイドやhADSC細胞のスフェロイドを移植した場合、テラトーマ形成は認められなかった。また、病理解析の結果、マウスES細胞を移植して形成されたテラトーマは、全て未分化な神経組織、消化管、筋肉等の3胚葉成分から構成されていた(「Teratoma、immature」)のに対し、hMSC-BM細胞のスフェロイドやhADSC細胞のスフェロイドを移植したマウスにおいては、腫瘍、細胞塊等は認められなかった(表22参照)。なお、ADSC Normal群のAnimal No.27マウス(表22参照)において腫れが確認されたが、解剖してみると腫瘍形成は認められず、腹膜と脂肪が他のマウスよりも多く検出された。以上の結果から、hMSC-BM細胞やhADSC細胞等の間葉系幹細胞のスフェロイドは、腫瘍化リスクが極めて低い細胞であることを示している。
Claims (11)
- 哺乳動物接着性成熟細胞又は哺乳動物接着性前駆細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞塊を形成させる工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の調製方法。
- 多能性幹細胞がNanog、Oct3/4、又はSox2を発現していることを特徴とする請求項1に記載の調製方法。
- 浮遊培養を、以下の(A)又は(B)を含む溶液中で行うことを特徴とする請求項1又は2に記載の調製方法。
(A)ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩;
(B)デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩; - 浮遊培養を、血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の調製方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の調製方法により得られる多能性幹細胞。
- 哺乳動物接着性成熟細胞又は哺乳動物接着性前駆細胞を浮遊培養することにより得られた多能性幹細胞。
- Nanog、Oct3/4、又はSox2を発現していることを特徴とする請求項6に記載の多能性幹細胞。
- 浮遊培養を、以下の(A)又は(B)を含む溶液中で行うことを特徴とする請求項6又は7に記載の多能性幹細胞。
(A)ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩;
(B)デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩; - 浮遊培養を、血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする請求項6〜8のいずれかに記載の多能性幹細胞。
- 請求項5〜9のいずれかに記載の多能性幹細胞を含む、臓器又は組織の機能低下若しくは障害の改善剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の調製方法で得られた多能性幹細胞に分化処理を施す工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。
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