KR102320800B1

KR102320800B1 - 효능이 증진된 줄기세포 유래 미세소포, 이의 용도 및 효능강화 방법

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Publication number: KR102320800B1
Application number: KR1020190127212A
Authority: KR
Inventors: 방오영; 김은희; 차재민
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2021-11-02
Also published as: KR20200047330A

Abstract

본 발명은 효능이 증진된 줄기세포 유래 미세소포, 이의 용도 및 효능강화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마이크로RNAs의 발현수준이 증진된, 줄기세포 유래 미세소포의 뇌졸중 예방 또는 치료 용도, 줄기세포 유래 미세소포의 마이크로RNAs의 생성 촉진 및 효능강화 방법에 관한 것으로, 줄기세포를 3차원 배양하거나 허혈 자극함으로써 줄기세포 유래 미세소포 및 상기 미세소포 내의 마이크로RNAs 생성을 촉진시키고, 또한 줄기세포 및 이의 미세소포 효능을 강화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 줄기세포 유래 미세소포 및 상기 미세소포 내 마이크로RNAs의 생성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포의 효능을 강화시킬 수 있는 우수한 효과를 가지고 있는바, 이를 통해 치료용 마이크로RNAs를 비롯한 물질들을 높은 수준으로 함유하는 줄기세포 유래 미세소포를 효율적이고 대량으로 수득할 수 있어 상기 미세소포는 관련 연구 분야 및 향후 임상에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

효능이 증진된 줄기세포 유래 미세소포, 이의 용도 및 효능강화 방법{Stem cell-derived microvesicles with enhanced efficacy, use thereof and method for enhancing efficacy}

본 발명은 효능이 증진된 줄기세포 유래 미세소포, 이의 용도 및 효능강화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마이크로RNA의 발현수준이 증진된, 줄기세포 유래 미세소포의 뇌졸중 예방 또는 치료 용도, 줄기세포 유래 미세소포의 마이크로RNA의 생성 촉진 및 효능강화 방법에 관한 것으로, 줄기세포를 3차원 배양하거나 허혈 자극함으로써 줄기세포 유래 미세소포 및 상기 미세소포 내의 마이크로RNA 생성을 촉진시키고, 또한 줄기세포 및 이의 미세소포 효능을 강화하는 방법에 관한 것이다.

최근 뇌졸중, 척수 손상, 다발성 경화증, 알츠하이머 병, 간 경화증, 심근 경색, 신장 질환 및 이식편대숙주병과 같은 난치성 질환들에 대하여 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)를 이용한 여러 임상 시험이 진행되고 있다. 지금까지 긍정적인 임상 결과들이 보고되어 왔지만, 줄기세포를 이용한 치료법은 아직까지 임상에 적용하는데 몇 가지 문제점이 존재한다. 첫째, 세포치료제의 경우 줄기세포가 조직에 생착한 다음 종양 형성의 위험성이 있고, 둘째, 줄기세포의 경우 큰 크기로 인해 동맥폐색을 유발하여 뇌경색을 초래할 가능성이 있으며, 셋째, 줄기세포의 경우 급성기와 같이 뇌-혈관장벽이 열린 상태에서는 뇌 내로 이동이 용이하나 만성기에서는 큰 크기로 인해 이동에 제한이 있다. 끝으로, 세포치료제의 경우 원하는 성향으로 특화된 세포로 그 성향을 유도하는데 한계가 있다.

최근에는, 중간엽 줄기세포의 임상적 효용성이 주로 근거리분비(paracrine) 효과에 기인한다는 보고들이 증가함에 따라, 재생 의학 분야에서 줄기세포로부터 분비되는 미세소포(microvesicles; MV)가 이의 근거리분비를 통한 다양한 효과를 매개한다는 점에서 주목 받고 있다. 미세소포란 직경 0.1~1μm 이하의 작은 소포로서 자극에 의해 내피세포, 혈소판 등의 세포막 일부가 혈중으로 떨어져 나온 것을 의미하는데, 줄기세포에서 유래된 미세소포는 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포간 커뮤니케이션을 매개하는 것으로 알려져 있다. 또한 줄기세포 유래 미세소포는 현재의 줄기세포 이식 치료법의 대안으로 다음과 같은 중요한 특성을 가지고 있다(Nephrol. Dial. Transplant. 27, 3037-3042 (2012)). 구체적으로, 나노 크기 및 지질로 이루어진 소포 구조는 MSC보다 장기간 혈액 순환과 장거리 치료 활성에 있어서 더욱 안전하고 유리하며, 미세소포 표면에 존재하는 줄기세포 막 단백질은 주입된 줄기세포와 같은 질병 표적화 능력을 부여할 수 있고, 줄기세포에 비해 동물혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배제할 수 있는 장점이 있다.

그러나 아직까지 MSC 유래 미세소포를 연구 및 임상 목적으로 사용하기에는 대량 분리 및 수득방법 등이 확립되어 있지 않아 이는 줄기세포 유래 미세소포를 의약품으로 개발하는데 있어 주요 제한 요인으로 꼽히며, 이의 효능을 보다 강화시킬 수 있는 방법에 대한 연구성과도 부족하여 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구한 결과, PEG 하이드로겔 마이크로웰 어레이를 제조하여 줄기세포를 동적으로 3차원 배양하거나 줄기세포에 허혈 자극을 가하는 경우 마이크로RNAs를 비롯하여 다양한 치료용 물질들이 다량 함유되어 있고 신경 발생 및 혈관 형성 효과 등을 나타내는 줄기세포 유래 미세소포의 생성이 촉진되는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현수준이 증진된, 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs or miRNAs)의 생성 촉진 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 허혈 자극하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs)의 생성 촉진 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포(microvesicles)의 효능강화방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 허혈 자극하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포(microvesicles)의 효능강화방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현수준이 증진된, 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs)의 생성 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 허혈 자극하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs)의 생성 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 마이크로RNA는 miR-137, miR-184, 및 miR-210으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 성체 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 3차원 배양은 세포를 분주하고 배양기 내에서 6시간 내지 18시간 후 20 내지 40 rpm으로 회전 교반하면서 5일 내지 9일 동안 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 허혈 자극은 허혈 개체의 뇌조직 추출물 처리에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 허혈 자극은 12시간 내지 48시간 동안 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포(microvesicles)의 효능강화방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 허혈 자극하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포(microvesicles)의 효능강화방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 효능강화는 줄기세포 내 성장인자, 사이토카인, 또는 마이크로RNA(microRNA)의 발현이 증진되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 형질전환 성장인자(transforming growth factor beta; TGFβ) 및 골 형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein 2; BMP2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 사이토카인은 CH13L1, CD105, CD147, ICAM-1, IP-10, MIP-1β, IL-6, IL-8, GRO, TIMP-1 및 SerpineE1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 마이크로RNA는 miR-137, miR-184, 및 miR-210으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 줄기세포 유래 미세소포 및 상기 미세소포 내 마이크로RNAs의 생성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포의 효능을 강화시킬 수 있는 우수한 효과를 가지고 있는 바, 이를 통해 치료용 마이크로RNAs를 비롯한 물질들을 높은 수준으로 함유하는 줄기세포 유래 미세소포를 효율적이고 대량으로 수득할 수 있어 상기 미세소포는 관련 연구 분야 및 향후 임상에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 3차원 줄기세포 배양방법 및 효과에 대한 전체적인 내용을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 3차원(3D) 배양을 통해 중간엽 줄기세포(MSC)-스페로이드를 형성 및 배양한 결과를 나타낸 것으로, 도 2a는 본 발명에서 MSC의 3D 배양에 이용한 PEG 마이크로웰 어레이의 제조과정을 보여주는 그림이고, 도 2b는 상기 마이크로웰에 일정한 밀도로 MSC를 분주한 다음 12시간 이내에 구형의 세포 응집체가 형성된 것을 보여주는 결과이며, 도 2c는 동적 3D 배양 5일째에 MSC-스페로이드에 대하여 세포 생존을 확인한 결과이고, 도 2d 및 도 2e는 각각 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 메이슨 트리크롬(M&T) 염색을 실시한 결과이며, 도 2f는 MSC를 각각 정적 2D 배양, 연속적으로 교반시키는 동적 2D 배양(2D w/shaking), 정적 3D 배양, 및 동적 3D 배양(3D w/shaking)하면서 배양 3(D3), 5(D5), 및 7일(D7)째에 세포 수를 측정하여 MSC의 증식능을 비교한 결과이다.
도 3은 동적 3D 배양한 MSC-스페로이드의 유전자 발현 프로파일을 분석한 결과로서, 도 3a는 2D 배양 또는 동적 3D 배양 방법(1일 및 7일째)으로 배양한 MSC에 대하여 PCR을 통해 MSC의 특성과 관련된 84가지 주요 유전자의 발현 수준을 측정하여 클러스터 그램으로 제시한 결과이고, 도 3b는 각 실험군에서 MSC의 줄기세포능(stemness) 및 줄기세포 마커(MSC marker)와 관련된 유전자들의 발현수준을 비교하여 나타낸 것이고, 도 3c는 평균 Ct 값이 30 미만인 hMSCs의 특성을 나타내는 유전자들의 발현을 산점도(scatter plot)로 표현하여 실험군 간에 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 동적 3D-MSC 배양에 의한 미세소포 생성 증가를 확인한 결과로서, 도 4a는 각각 정적 2D 배양, 연속적으로 교반시키는 동적 2D 배양(2D w/shaking), 정적 3D 배양, 및 동적 3D 배양(3D w/shaking)한 MSC에서 배양 3(D3), 5(D5), 및 7일(D7)째에 미세소포를 분리하여 유세포 분석을 실시한 결과이고, 도 4b는 상기 각 배양 방법별로 배양 시간에 따른 미세소포의 생성량을 일정 세포 수로 보정하여 비교한 결과이며, 도 4c는 배양 7일째에 각 배양 방법에 따라 생성된 미세소포 내 총 단백질 농도를 일정 세포 수로 보정하여 비교한 결과이다.
도 5는 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포(IBE-MVs) 및 동적 3D 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs) 내 치료 물질들의 수준을 분석한 결과로서, 도 5a 및 도 5b는 상기 2가지 종류의 미세소포 내 다양한 사이토카인의 함유량을 측정한 결과이고, 도 5c는 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 rMSC 유래 미세소포(MSC-MV) 및 섬유아세포 유래 미세소포(Fibroblast-MV) 내 뇌졸중 치료와 관련된 성장인자들의 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 비교한 결과이다.
도 6은 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포(IBE-MVs) 및 동적 3D 배양 방법으로 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs) 내 신생혈관 형성 및/또는 신경발생 신호전달에 중요하다고 알려진 microRNAs의 수준을 분석한 결과로서, 도 6a는 상기 2가지 종류의 미세소포 내 상기 microRNAs의 발현수준을 측정하여 비교한 결과이고, 도 6b는 2D 배양법, exosome-free FBS를 사용한 동적 3D 배양법, 및 동적 3D 배양법을 통해 배양한 hMSC 유래 미세소포(각각 2D-MVs, Exo-free 3D-MVs, 3D-MVs) 내 상기 microRNAs의 발현수준을 측정하여 비교한 결과이며, 도 6c는 2D 배양법(2D-MVs) 또는 동적 3D 배양방법으로 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs) 내에 마이크로RNAs의 발현수준을 비교한 결과이며, 도 6d는 3D-MVs를 인간제대 정맥 내피세포(HUVECs) 또는 신경줄기세포(NSCs)에 처리한 후, 마이크로RNAs의 발현수준을 분석한 결과이며, 도 6e는 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 rMSC 유래 미세소포(MSC-MV) 및 섬유아세포 유래 미세소포(Fibroblast-MV) 내 상기 microRNAs의 발현수준을 측정하여 비교한 결과이다.
도 7은 MSC 유래 미세소포의 혈관 생성 자극 효과를 확인한 결과로서, 도 7a는 인간 제대 정맥 내피세포(HUVECs)에 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포(IBE-MVs) 및 동적 3D 배양 방법으로 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs)를 처리하고 혈관 생성 정도를 평가한 결과이고, 도 7b는 3D-MVs 및 miR-210 형질주입한 세포의 혈관 생성 정도를 평가한 결과이고, 도 7c는 2D 배양법, exosome-free FBS를 사용한 동적 3D 배양법으로 배양한 MSC 유래 미세소포(각각 2D-MVs, Exo-free 3D-MVs) 처리 후 혈관 생성 정도를 평가한 결과이다.
도 8은 MSC 유래 미세소포의 신경 발생 자극 능력을 확인한 결과로서, 도 8a 및 도 8b는 랫트 유래 신경줄기세포에 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포(IBE-MVs) 및 동적 3D 배양 방법으로 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs)를 처리하고 배양 4일째에 현미경 관찰(도 8a) 및 면역세포화학염색법(도 8b)을 통해 신경 발생 자극 능력을 평가한 결과이고, 도 8c 및 도 8d는 2D 배양법, exosome-free FBS를 사용한 동적 3D 배양법으로 배양한 MSC 유래 미세소포(각각 2D-MVs, Exo-free 3D-MVs) 처리 후 배양 4일 째에 현미경 관찰(도 8c) 및 면역세포화학염색법(도 8d)을 통해 신경 발생 자극 능력을 평가한 결과이고, 도 8e는 3D-MVs 및 miR-184를 형질주입한 세포의 신경줄기세포 증식 능력을 평가한 결과이다.
도 9a는 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 rMSC 유래 미세소포(rMSC-MV)를 microRNA-210 또는 microRNA-184를 형질주입한 경우와 비교하여 각각 혈관 생성 능력 및 신경줄기세포 증식 정도를 평가한 결과이고, 도 9b는 웨스턴 블롯을 통해 rMSC-MV가 처리된 세포 또는 각각 miR-210 및 miR-184를 형질주입한 세포에서 상기 microRNAs의 표적 단백질인 Ephrin A3 및 Numbl의 발현 억제를 확인한 결과이고, 도 9c는 웨스턴 블롯을 통해 3D-MVs가 처리된 세포 또는 각각 miR-210 및 miR-184를 형질주입한 세포에서 상기 microRNAs의 표적 단백질인 Ephrin A3 및 Numbl의 발현 억제를 확인한 결과이다.

본 발명자들은 PEG 하이드로겔 마이크로웰 어레이를 제조하여 줄기세포를 동적 3차원 배양하거나 줄기세포에 허혈 자극을 가하는 경우 줄기세포 유래 미세소포 및 상기 미세소포 내 치료용 마이크로RNAs를 비롯한 다양한 치료용 물질들의 생성이 촉진되며, 실질적으로 상기 줄기세포 유래 미세소포에 의한 혈관 형성 및 신경 발생 자극 효과를 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs)의 생성 촉진 방법을 제공한다.

상기 마이크로RNA는 miR-137, miR-184, 및 miR-210으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명자들은 실시예를 통하여 본 발명에 따른 3차원 배양 방법 및 줄기세포의 허혈 자극을 통해 줄기세포 유래 미세소포 및 상기 미세소포 내 마이크로RNAs의 생성을 촉진시킬 수 있고 이에 따라 상기 줄기세포 및 이의 미세소포의 효능을 강화할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 3차원 배양을 위해 PEG 하이드로겔 마이크로웰 어레이를 제조하였으며, 일정한 밀도로 중간엽 줄기세포(MSC)를 상기 마이크로웰 각각에 분주하여 자발적 스페로이드 형성을 유도한 후 7일 동안 배양기 내에서 일정 속도로 회전 교반하면서 3D 배양을 실시하였다. 그 결과 상기 줄기세포들이 빽빽하게 밀집하여 스페로이드를 구성하며 세포외기질을 분비하고, 스페로이드를 구성하는 대부분의 세포가 생존하였음을 확인하였다. 또한 교반하거나 교반하지 않은 상태로 각각 2D 또는 3D 배양을 진행하면서 배양시간에 따른 세포 증식을 관찰한 결과 본 발명에 따른 3D 배양의 경우 배양 7일째 까지 세포 수가 증가하지 않고 초기 세포 수가 유지되는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, MSC를 정적 2D 배양하거나 또는 본 발명에 따른 방법으로 동적 3D 배양한 후 줄기세포의 특성과 관련된 84가지 유전자들의 발현 프로파일 변화를 분석한 결과, 다양한 유전자들의 발현이 상향 또는 하향 조절되는 것을 관찰하였고 이러한 분석을 통해 본 발명에 따른 3D 배양한 MSC에서 연골 형성 및 골 형성에 대한 분화 잠재력이 현저히 향상되는 것을 알 수 있었다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 동적 3D 배양을 실시하고 전술한 바와 같은 종래의 다른 배양 방법을 통해 MSC를 배양한 후 각 배양법으로 배양한 MSC에서 미세소포를 분리하여 생성량 및 미세소포의 총 단백질 양을 측정한 결과, 다른 방법에 비해 본 발명에 따른 방법으로 배양한 경우 현저히 높은 양의 미세소포가 생성된 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 동적 3D 배양방법으로 배양한 MSC 유래 미세소포 및 줄기세포에 허혈-뇌조직 추출물을 처리하여 허혈 자극한 MSC 유래 미세소포를 각각 수득한 후 상기 미세소포 내에 함유된 치료 물질들을 분석하였다. 그 결과 상기 2가지 종류의 미세소포 모두에서 발현수준에 차이는 있으나 대체적으로 면역 조절 및 혈관 신생과 관련된 사이토카인이 다량 함유되어 있는 것을 확인하였다. 또한 신경 발생 및 혈관 신생과 관련이 있다고 알려진 microRNAs도 다량 존재하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 동적 3D 배양 MSC 유래 미세소포 및 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포 각각의 혈관 형성 및 신경 발생 자극 효과를 검증하였다. 그 결과 상기 2가지 종류의 미세소포 모두 인간 제대 정맥 내피세포의 관 형성, 신경줄기세포의 증식 및 신경세포로의 분화를 유의한 수준으로 자극하는 것을 확인하였으며, 또한 3D 배양의 경우 2D 배양한 경우에 비해 유의한 효과가 있는 것을 확인하였다. 나아가 동적 3D 배양 MSC 유래 미세소포 및 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포의 경우 혈관 형성 및 신경 발생과 관련 있다고 알려진 miR-210 및 miR-184를 형질주입한 경우와 비교해 유사하거나 더 높은 수준으로 혈관 형성 및 신경 발생 자극 효과를 나타내었으며, 상기 miRNA 각각의 표적 단백질인 Ephrin A3 및 Numbl의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

상기와 같은 결과들은 줄기세포를 본 발명에 따른 방법으로 3D 배양하거나 허혈 자극함으로써 미세소포 및 상기 미세소포 내 microRNAs의 생성을 촉진시키고, 이에 따라 줄기세포 또는 상기 줄기세포 유래 미세소포의 효능을 강화시킬 수 있음을 입증하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 성체 줄기세포일 수 있고, 바람직하게 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 동적 3차원 중간엽 줄기세포 배양(dynamic 3D-MSC culture) 방법에 대한 전체적인 개념 및 효과에 대한 내용은 도 1에 그림으로 도시하였으며, 상기 방법을 통해 줄기세포 유래 미세소포를 단순하고 효율적인 방법으로 대량 수득할 수 있는 장점이 있다. 구체적으로 동적 3차원 배양은 본 발명에서 제조한 PEG 하이드로겔 마이크로웰에서 이루어지며, 보다 상세하게는 상기 마이크로웰에 일정량의 줄기세포를 분주하고 6시간 내지 18시간, 보다 바람직하게는 약 12시간 동안 자발적 스페로이드 형성을 유도한 후 배양기 내에서 20~40 rpm, 보다 바람직하게는 30 rpm으로 회전 교반하면서 5일 내지 9일 동안 배양하는 것일 수 있으며 보다 바람직하게는 약 6일 내지 7일 동안 배양하는 과정을 포함한다.

본 발명에 따른 줄기세포의 허혈 자극은 뇌 허혈이 유발된 개체의 뇌조직 추출물을 처리하는 과정을 통해 이루어지며, 중간엽 줄기세포에 허혈 뇌조직 추출물을 처리하고 12시간 내지 48시간, 보다 바람직하게는 24시간 동안 배양하여 허혈 자극을 유발하였다.

본 발명에 있어서, 상기 효능강화는 줄기세포 내 성장인자, 사이토카인, 또는 마이크로RNAs(microRNAs)의 발현이 증진되는 것을 포함할 수 있는데, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 형질전환 성장인자(transforming growth factor beta; TGFβ) 및 골 형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein 2; BMP2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있고, 상기 사이토카인은 상기 사이토카인은 CH13L1, CD105, CD147, ICAM-1, IP-10, MIP-1β, IL-6, IL-8, GRO, TIMP-1 및 SerpineE1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 상기 microRNA는 miR-137, miR-184, 및 miR-210으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 중간엽 줄기세포의 3차원 배양

1-1. 크기가 제한된 hMSC - 스페로이드 형성 및 배양

중간엽 줄기세포의 3차원 세포 배양을 위하여, 도 2a에 나타낸 바와 같이 폴리(디메틸실록산)(Poly(dimethylsiloxane); PDMS) 몰드(mold)를 이용하여 소프트-리소그래피(Soft-lithography) 공정을 통해 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol; PEG) 마이크로웰 어레이를 제작하였고, 이후 70% 에탄올로 소독하고 PBS를 첨가하여 20분 동안 UV 멸균을 진행하였다. 본 발명자들이 제조한 맞춤형 마이크로웰 어레이는 역 피라미드형 개구가 있는 원통형 마이크로웰로 구성하여 hMSC-스페로이드를 대량으로 배양하는 경우 세포 손실이 없도록 하였으며, 최적화된 PEG 하이드로 겔 소프트-리소그래피 기술을 통해 마이크로웰 기판에 세포가 부착되는 것을 방지하였다. 또한, hMSC-스페로이드의 크기와 세포 수를 일정하게 제어하기 위하여, 직경이 각각 200 μm 인 1,225개 마이크로웰을 포함하는 마이크로웰 어레이의 크기를 상업용 6-well 플레이트의 각 웰에 맞도록 20 x 20 mm 크기로 제작되었다. 이후, 상기 마이크로웰에 세포를 분주하기 위해, 10% 소태아혈청(FBS) 또는 엑소좀이 포함되어 있지 않은 FBS(exosome-free FBS) 및 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에서 배양한 인간 유래 중간엽 줄기세포(hMSCs, PT2501, Lonza, Basel, Switzerland)에 트립신을 처리하여 세포를 모으고 계수하여 hMSCs를 5 × 10⁵ 세포/어레이(~400개 세포/마이크로웰)의 밀도로 분주한 후 CO₂ 인큐베이터(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이 분주 후 12시간 이내에 구형의 세포 응집체가 자발적으로 형성되는 것을 확인하였다. h-MSC-스페로이드는 마이크로웰의 크기보다 작은 약 150 μm의 직경으로 균일하게 형성되었으며, 이후 CO₂ 인큐베이터 내에 회전 교반기(orbital shaker)에서 30 rpm으로 7일 동안 추가로 배양(3D w/shaking)하였다.

1-2. 동적 3D 배양(3D w/shaking)을 통한 스페로이드 관찰 및 세포 증식능 분석

상기 실시예 1-1의 방법으로 배양한 hMSCs에 대하여, 먼저 스페로이드를 구성하는 세포들의 생존여부를 검증하기 위해 배양 5일째에 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 대부분의 세포가 생존(녹색 형광)하고 있는 것을 확인하였다.

이에 더하여, 배양 5일째에 hMSC-스페로이드에 대하여 헤마톡실린 및 에오신(haematoxylin & eosin; H&E)과 메이슨 트리크롬(Masson trichrome; M&T) 염색을 진행한 결과, 도 2d 및 2e에서 볼 수 있는 바와 같이 hMSCs가 빽빽하게 응집되어 스페로이드를 이루고 있으며 세포외기질(ECM)을 분비하는 것을 알 수 있었다.

나아가 hMSCs의 증식능을 알아보기 위해 상기 동적 3D 배양법과 함께 각각 교반시키거나 시키지 않는 2D 배양법(2D 또는 2D w/shaking) 또는 교반시키지 않는 정적 3D 배양법으로 hMSCs를 배양하면서 3일(D3), 5일(D5) 및 7일(D7)에 DNA quantifcation assay kit(CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Kit, Invitrogen)를 이용해 세포 수를 측정하였다. 그 결과, 도 2f에 나타낸 바와 같이 교반시키지 않은 정적 2D 배양법(2D)으로 배양한 경우 배양 시간에 따라 hMSCs 수가 증가하는 것으로 나타났고, 동적 2D 배양법(2D w/shaking)으로 배양한 경우 연속적으로 가해진 전단 응력에 대한 부착 세포의 취약성으로 인해 약 5일 후 세포 수가 감소하였다. 한편, 정적 3D 배양법의 경우에는 마이크로웰에서 hMSCs이 스페로이드를 형성하도록 한 후 페트리 디쉬로 옮긴 후 교반 없이 배양하였는데, 흥미롭게도 hMSC-스페로이드가 배양 1일 후부터 디쉬 바닥에 부착하여 주변 지역으로 증식하는 것을 관찰하였다. 이러한 현상은 초기에 hMSCs에서 분비된 ECM이 페트리 디쉬 상에 확산되고 이후 스페로이드를 구성하는 hMSCs가 그들 위에 부착되는 것으로 추측하였다. 따라서 정적 3D 배양(3D)한 경우에는 hMSCs가 배양 5일 째(D5)에 처음 세포 수의 거의 두배가 되고 배양 7일째까지 유지되는 것으로 나타났다. 이에 반해, 본 발명에 따른 동적 3D 배양(3D w/shaking)한 경우에는 배양 기간 동안 세포 수가 증가하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 함유 배지를 사용하여 부유 배양한 MSC-스페로이드가 줄기 세포와 같은 생물학적 특성은 유지하면서 초기 세포 수를 유지했다는 이전의 연구 결과와 일치하였다.

실시예 2. 동적 3D 배양한 MSC - 스페로이드의 유전자 발현 프로파일 분석

다음으로, 본 발명자들은 2D 또는 동적 3D 배양한 hMSCs의 줄기세포 특성간 차이를 검증하기 위하여, PCR을 통해 hMSCs의 일반적 특성과 관련된 84가지 주요 유전자의 발현 프로파일링을 실시하였으며, 도 3a에 PCR 어레이의 클러스터 그램(cluster gram)을 이용하여 2D 또는 동적 3D 배양한 MSC 사이에 상대적으로 다른 유전자 발현을 나타내었다. 3D 배양의 경우 배양 1일째의 hMSC(3D-MSC D1)는 이들 세포가 배양 7일 동안 3D-스페로이드를 형성하는 과정에 있었기 때문에, 유전자 발현 프로파일이 일시적으로 변화하는 것으로 보였다. 또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이 FGF2, LIF 및 POU5F1과 같은 줄기세포능(stemness)과 관련된 유전자들은 모든 배양 방법(2D, 3D-D1, 3D-D7)의 경우에 높게 발현되는 것으로 나타났고, 이 중 FGF2 및 LIF는 일반적으로 hMSC-스페로이드 형성 동안(3D-D1)에는 다소 감소하였다가 이후 3D 배양(3D-D7)으로 다시 증가하였다. 더욱이 다양한 hMSCs 마커 유전자가 2D-MSC와 비교하여 동적 3D-MSC에서 높게 발현되는 것으로 나타났다.

나아가 평균 Ct 값이 30 미만인 hMSCs의 특성을 나타내는 유전자들의 발현을 산점도(scatter plot)로 표현하고 그룹 간 비교를 실시하였다. 이때, 과대 평가하는 것을 피하기 위해, 상대적인 비교에서 30배 이하로 상향 조절 또는 하향 조절된 경우는 유의미한 차이로 간주하지 않았다. 분석 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 hMSC-스페로이드 형성 1일째(3D-MSC D1)에 GDF15와 TGFB3는 2D 배양한 대조군(2D-MSC)에 비해 약 40배 상향 조절된 것으로 나타났으며, 이에 반해 BMP4는 약 60배 정도 하향 조절된 것으로 나타났다. 동적 3D 배양한 hMSCs 간에 비교하는 경우에는 도 배양 7일 째(3D-MSC D7)에 IL1B, BDNF 및 BMP2는 30배 이상 상향 조절되었고 COL1A1은 배양 1일째(3D-MSC D1)인 초기 단계에 비해 약 50배 정도 하향 조절된 것으로 나타났다. D1에서 D7로 진행됨에 따라 COL1A1이 현저히 감소한 것은 배양 초기 ECM 분비의 증가가 3D hMSCs 응집체의 구조적 구성에만 필요하다는 것을 의미하는 것이다. 다음으로, 3D-MSCs D7을 2D-MSCs와 비교할 때 IL1B 및 GDF15가 각각 약 40배 및 90배만큼 상향 조절되었고, 특히 BMP2는 약 230배까지 매우 높게 상향 조절된 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 3D 배양한 MSC에서 연골 형성(TGFB3 상향 조절) 및 골 형성(BMP2 상향 조절)에 대한 분화 잠재력이 현저한 향상됨을 알 수 있었으며, 이는 이전 연구의 결과와 일치하는 것이다.

실시예 3. 동적 3D- MSC 배양에 의한 미세소포 생성량 분석

3-1. MSC로부터 미세소포 분리

MSCs에서 미세소포를 분리하기 위해, 각 방법으로 배양한 MSCs의 배양액을 모은 다음 저속으로 원심분리(2,500 x g, 10℃, 10분)하여 배양 상층액으로부터 불순물을 제거한 후 다시 고속 원심분리(14,000 x g, 10℃, 45분)하여 줄기세포로부터 유래된 미세소포를 수득하였다.

3-2. MSC 유래 미세소포 생성 증가 확인

본 발명자들은 유세포 분석법을 이용하여 정적 2D 배양(2D), 동적 2D 배양(2D w/shaking), 정적 3D 배양(3D) 및 동적 3D 배양(3D w/shaking) 방법으로 각각 배양한 MSCs로부터 분리된 미세소포의 표현형과 양을 측정하고자 하였다. 이를 위해, 도 4a에 나타낸 바와 같이 배양 3일(D3), 5일(D5) 및 7일(D7)에 표준 크기의 비드를 사용하여 측정된 1.0 μm 이하 크기의 입자(빨간색 실선 사각형) 및 anti-CD105(hMSC 표면 마커) 및 anti-annexin V(지질 표면 마커)에 대한 이중으로 양성 염색된 것(파란색 점선 사각형)을 MSC 유래 미세소포로 계수하였다. 계수된 점(보라색 실선 사각형)은 미세소포의 절대적인 갯수를 계산하는데 사용되었으며, 최종 미세소포 갯수는 해당 배양 그룹의 세포 수로 보정하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 동적 3D 배양(3D w/shaking)한 경우 hMSC 유래 미세소포의 수가 가장 높게 측정되었으며, 이는 매우 적은 수의 미세소포가 측정된 정적 2D 배양 대조군 보다 약 100배 더 높은 수치인 것으로 나타났다. 동적 2D 배양(2D w/shaking)한 경우 수집된 미세소포 수는 유의한 정도는 아니지만 정적 2D 배양한 경우 보다는 높게 나타났으며, 또한 정적 배양에서, hMSC-스페로이드의 형성은 3D 배양(3D)한 경우에 관찰된 바와 같이, 상당한 양은 아니지만 미세소포 생성을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이 배양 7일 째 각 배양 그룹의 세포 수로 보정한 단백질 분석 결과는 상기 결과를 뒷받침하였으며, 다른 그룹에 비해 동적 3D 배양의 경우 수득된 미세소포의 총 단백질 농도가 다른 그룹보다 유의적으로 높은 것을 확인하였다. 더욱이 exosome-free FBS(Exo-free 3D-MVs)를 사용하여 얻은 결과를 통해 본 실험에서 확인한 MSC 유래 미세소포의 생성 증가가 FBS에 포함된 입자에 의해 영향을 받지 않았음을 확인하였다.

실시예 4. MSC 유래 미세소포 내 치료용 물질 발현 분석

본 발명자들은 동적 3D 배양 방법으로 대량 배양한 hMSCs에서 분리한 미세소포를 분석하여 이의 치료적 특성을 검증하고자 하였다. 이와 함께, 본 발명자들이 이전 연구를 통해 허혈-뇌조직 추출물을 MSCs에 전 처리한 경우 MSCs의 효능이 향상될 수 있음을 확인하였는바, 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포를 분리하여 이의 치료적 특성도 함께 분석하고자 하였다.

4-1. 허혈-뇌조직 추출물 준비 및 처리

흰쥐에 일시적인 중뇌동맥 경색(transient middle cerebral artery occlusion; tMCAo)을 90분 동안 유발시키고 3일 후 손상된 뇌반구 조직을 150 mg/ml의 농도로 DMEM 배지와 함께 분쇄하였다. 다음으로 분쇄한 조직 용액을 10,000 x g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 허혈 뇌조직 추출물(ischemic brain extract; IBE)을 수득하였으며, 상기 수득한 허혈 뇌조직 추출물은 동량으로 분주하여 사용 전 까지 -70℃에서 보관하였다. 이후 MSC에 허혈 자극을 가하기 위하여, 보관했던 허혈 뇌조직 추출물을 2,500 x g에서 10분 동안 원심분리하여 불순물을 제거한 다음 DMEM에 5배로 희석한 다음, 14,000 x g에서 다시 45분 동안 원심분리하고 0.2 um 필터로 여과하였다. 상기 방법으로 준비한 허혈-뇌조직 추출물을 220-250 g의 Sprague-Dawley(SD) 수컷 쥐의 대퇴골과 경골에서 채취한 골수 유래 성체줄기세포(rMSCs) 또는 hMSCs에 24시간 동안 처리하였다.

4-2. IBE - MVs 및 3D- MVs 내 치료용 물질 수준 확인

동적 3D 배양 방법으로 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs) 및 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포(IBE-MVs)에 치료적 물질이 포함되어 있는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 먼저 다양한 사이토카인 어레이 키트를 이용하여 상기 미세소포들에 포함된 대표적인 사이토카인들을 분석하였다. 그 결과 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이 IBE-MVs에 면역 조절 및 혈관 신생과 관련된 다양한 사이토카인이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 또한 일반적으로, IBE-MV에서 검출된 사이토카인은 3D-MVs에도 포함되어 있는 것으로 나타났다. 특히 IP-10, MIP-1, βIL-8, GRO 및 TIMP-1이 IBE-MVs 및 3D-MVs 모두에서 약간의 차이는 있으나 높은 수준으로 나타났다. 또한 일부 사이토카인의 경우에는 두 가지 군에서 다르게 나타났는데, 3D-MVs에는 ICAM-1, bFGF, CHI3L1, CD147 및 CD105가 다량 함유된 것으로 나타난 반면, IBE-MVs에는 IL-6 및 SerpineE1가 다량 함유된 것으로 나타났다.

이에 더하여, 상기 실시예 4-1의 방법에 따라 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 미세소포를 분리하여 섬유아세포 유래 미세소포와 함께 뇌졸중에 영향을 미치는 성장인자들의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 비교하였다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 상기 두 세포 유래 미세소포 모두에서 미세소포 마커인 Flotillin-1 및 HSP70 단백질이 발현되는 것을 확인하였으며, 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 섬유아세포 유래 미세소포(Fibroblast-MV)에 비해 중간엽 줄기세포 유래 미세소포(MSC-MV)에서 뇌졸중 치료와 관련된 단백질들의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다.

4-3. IBE - MVs 및 3D- MVs 내 치료용 microRNA 수준 확인

상기 실시예 4-2의 결과에 더하여, 본 발명자들은 qPCR을 수행함으로써 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포 및 동적 3D 배양한 hMSC 유래 미세소포 내에 신경발생 및/또는 혈관 신생 신호전달에 중요하다고 알려진 microRNAs의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 신경 발생과 관련이 있다고 보고된 miR-137, 및 miR-184가 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포(IBE-MVs)에 다량 존재하는 것을 확인하였으며, 신경발생 및 혈관 신생 모두와 관련이 있다고 알려진 miR-210의 경우에는 IBE-MVs와 3D-MVs에서 모두 높게 발현되는 것으로 나타났으며 상대적으로 IBE-MVs에 비해 3D-MVs에 더 많이 포함되어 있는 것을 확인하였다.

상기 결과에 더하여, 동적 3D 배양법이 MSC 유래 미세소포 내 치료용 microRNAs의 발현을 증가시키는데 효과적인지 검증하기 위해, 각각 2D 배양법, exosome-free FBS를 사용한 동적 3D 배양법, 및 동적 3D 배양법을 통해 배양한 hMSC 유래 미세소포(각각 2D-MVs, Exo-free 3D-MVs, 3D-MVs) 내 microRNA 함유량을 비교하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 2D 배양법의 경우 상기 치료용 microRNAs 모두 약하게 발현되는 반면, 동적 3D 배양한 2가지 경우에는 miR-134 및 miR-137이 높은 수준으로 발현되는 것으로 나타났고, miR-210의 경우 3D-MVs에서 높게 발현되는 것을 확인하였다.

이에 더하여, 2D 배양법(2D-MVs) 또는 동적 3D 배양방법으로 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MVs) 내에 신생혈관 형성 및/또는 신경발생 신호전달에 중요하다고 알려져 있는 miR137, miR-184 및 miR-210의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 2D-MVs에 비해 3D-MVs에서 miR137, miR-184 및 miR-210이 높게 발현되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 동적 3D 배양을 통해 MSC에서 특이적으로 상기 치료용 microRNAs의 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다.

이에 더하여, 3D-MVs를 인간제대 정맥 내피세포(HUVECs) 또는 신경줄기세포(NSCs)에 처리한 후, microRNAs의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 3D-MVs를 인간제대 정맥 내피세포(HUVECs)에 처리한 경우 대조군(CTRL)에 비해 miR-210이 높게 발현된 것을 확인하였으며, 3D-MVs를 신경줄기세포(NSCs)에 처리한 경우 대조군(CTRL)에 비해 miR-137 및 miR-184 이 높게 발현된 것을 확인하였다.

나아가, 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 rMSC 유래 미세소포와 섬유아세포 유래 미세소포의 microRNA 함유량을 비교한 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이 rMSC 유래 미세소포(MSC-derived MVs) 내에 miR-210, miR-184, 및 miR-137의 발현이 유의하게 증가되어 있는 것을 확인하였으며, 이를 통해 허혈-뇌조직 추출물 처리에 의해 MSC에서 특이적으로 상기 치료용 microRNAs의 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다.

상기 결과들로부터, 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 MSC 유래 미세소포 및 동적 3D 배양한 MSC 유래 미세소포에는 면역조절, 혈관 신생 및 신경 발생과 관련된 다양한 치료적 사이토카인 및 마이크로 RNA가 풍부하게 존재하는 것을 확인하였다.

실시예 5. MSC 유래 미세소포의 신생혈관 생성 효과 및 신경발생 자극 효과 검증

5-1. IBE -MV 및 3D-MV의 혈관 생성 능력 확인

본 발명자들은 신생혈관 생성 및 신경 발생에 대한 in vitro 모델을 이용하여 수집된 미세소포의 치료 효과를 조사하였다. 먼저, 각각 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포(IBE-MV) 및 동적 3D 배양한 hMSC 유래 미세소포의 혈관 생성 능력을 평가하기 위해, 마트리겔 상에 접종된 인간 제대 정맥 내피세포(HUVECs)에 IBE-MV 및 3D-MV를 각각 3 μg/mL씩 처리한 다음, 기본 배지만 첨가한 대조군(control) 또는 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 처리군과 함께 생성된 고리 수(loop numbers), 가지 수(branch numbers), 및 가지 길이(branch length)를 통해 혈관 생성 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 VEGF를 처리한 경우 대조군에 비해 관 형성 정도가 유의하게 증가하였으며, IBE-MV를 처리한 경우 VEGF 처리군과 유사한 수준으로 유도된 것으로 나타났다. 또한 3D-MV를 처리한 경우에는 더 높은 수준으로 관 형성이 유도된 것을 확인하였다.

이에 더하여, 신생혈관 생성에 대한 in vitro 모델을 이용하여 수집된 3D-MVs와 miR-210의 치료 효과를 조사하였다. 먼저 3D-MVs 및 miR-210 혈관 생성 능력을 평가하기 위해, 마트리겔 상에 접종된 인간 제대 정맥 내피세포(HUVECs)에 비특이적 miRNA 및/또는 miR-210을 형질주입한 다음, 3D-MV를 각각 3 μg/mL씩 처리한 후, 기본 배지만 첨가한 대조군(CTRL) 또는 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 처리군과 함께 생성된 고리 수(loop numbers), 가지 수(branch numbers), 및 가지 길이(branch length)를 통해 혈관 생성 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, VEGF를 처리한 경우 대조군에 비해 관 형성 정도가 유의하게 증가하였으며, 3D-MVs를 처리한 경우 VEGF 처리군과 유사한 수준으로 유도된 것으로 나타났다. 또한 miR-210를 형질주입한 경우에도 높은 수준으로 관 형성이 유도된 것을 확인하였다.

나아가 동적 3D 배양법에 따른 MSC 유래 미세소포의 혈관 생성 능력 향상을 다시 한 번 검증하기 위해, 각각 2D 배양법 및 exosome-free FBS를 사용한 동적 3D 배양법을 통해 배양한 hMSC 유래 미세소포(각각 2D-MVs, Exo-free 3D-MVs)를 이용해 상기 방법과 동일하게 HUVECs 세포에 처리한 후 결과를 비교하였다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이 Exo-free 3D-MVs를 처리한 경우 VEGF 또는 2D-MVs를 처리한 경우보다 유의한 수준으로 혈관 생성이 유도된 것을 확인하였다.

5-2. IBE -MV 및 3D-MV의 신경 발생 자극 능력 확인

다음으로, 각각 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포(IBE-MV) 및 동적 3D 배양한 hMSC 유래 미세소포의 신경 발생을 자극하는 능력을 조사하기 위해, 14.5일째의 SD 랫트(rat) 배아에서 분리한 대뇌피질로부터 1차 배양된 신경 줄기 세포(NSCs)에 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포(IBE-MV) 또는 동적 3D 배양한 hMSC 유래 미세소포(3D-MV)를 3 μg/mL씩 처리한 다음, 기본 배지만 첨가한 대조군(control) 또는 신경성장인자(nerve growth factor; NGF) 처리군과 함께 신경 발생 능력을 비교하였다.

먼저 도 8a에 나타낸 바와 같이 상기 방법으로 미세소포를 처리하고 배양 4일 째에 현미경으로 관찰한 결과, 대조군에 비해 NGF, IBE-MV 및 3D-MV 처리군에서 신경세포로의 분화가 유도된 것을 발견하였다. 또한 도 8b에 나타낸 바와 같이 면역세포화학염색법을 통해 배양 4일째에 NSC에서의 Tuj1 발현을 정량화함으로써 결과적인 신경세포로의 분화 정도를 평가하였고 Ki67 발현 정도를 정량화하여 신경줄기세포의 증식률을 평가한 결과, IBE-MV의 경우 신경줄기세포의 신경발생 자극 능력이 가장 높게 나타난 것을 확인하였고, 또한 3D-MV의 경우 NGF-처리 군과 유사한 정도로 NSC의 신경 분화 및 증식을 유도하는 것을 확인하였다.

상기 결과에 더하여 동적 3D 배양법에 의한 MSC 유래 미세소포의 신경 발생 자극 능력을 다시 한 번 검증하기 위해, 각각 2D 배양법 및 exosome-free FBS를 사용한 동적 3D 배양법을 통해 배양한 hMSC 유래 미세소포(각각 2D-MVs, Exo-free 3D-MVs)를 상기 1차 배양된 신경 줄기 세포(NSCs)에 3 μg/mL씩 처리한 다음, 대조군(control) 또는 NGF 처리군과 비교하였다. 그 결과, 상기 방법으로 미세소포를 처리하고 배양 4일 째에 현미경으로 관찰한 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 NGF, 2D-MVs 및 Exo-free 3D-MV 처리군에서 신경세포로의 분화가 유도된 것을 발견하였다. 또한 도 8d에 나타낸 바와 같이 면역세포화학염색법을 실시한 결과, Ki67 발현을 통한 신경줄기세포의 증식에는 유의한 차이가 나타나지 않은 반면, Tuj1 발현을 정량화한 결과 NGF 및 2D-MVs 처리군에서 신경세포로의 분화가 유의한 수준으로 증가한 것으로 나타났고 Exo-free 3D-MVs 처리군에서는 신경세포로의 분화가 더욱 높은 수준으로 유도된 것을 확인하였다.

나아가, 3D-MVs 및 miR-184의 신경줄기세포 증식 능력을 평가하기 위해, 신경줄기세포(NSCs)에 비특이적 miRNA 및/또는 miR-184를 형질주입한 다음, 3D-MV를 각각 3 μg/mL씩 처리한 후, 기본 배지만 첨가한 대조군(CTRL) 과 함께 Ki67/DAPI 발현 정도를 정량화하여 신경줄기세포의 증식율 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 8e에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 miR-184를 형질주입하거나 3D-MVs를 처리한 군에서 신경줄기세포의 증식이 유의하게 증가한 것을 확인하였다.

상기 결과들로부터, 2D 배양법과 비교해 본 발명에 따른 동적 3D 배양법에 의해 줄기세포 유래 미세소포의 혈관 신생 및 신경 발생 자극 능력이 향상되는 것을 알 수 있었다.

5-3. IBE -MV 내 치료용 microRNAs에 의한 효과 검증

본 발명자들은 상기 실시예 결과들로부터 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 hMSC 유래 미세소포 및 동적 3D 배양한 hMSC 유래 미세소포에 치료용 microRNAs가 높은 수준으로 함유되어 있으며, 상기 각 미세소포 처리에 의한 신생혈관 형성 및 신경 발생 자극 능력을 확인하였는바, 상기 미세소포 내 함유된 치료용 microRNAs가 상기와 같은 미세소포의 능력에 영향을 미치는지 검증하고자 하였다.

이를 위해, 먼저 HUVEC 세포에 miR-210을 형질주입하거나 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 rMSC 유래 미세소포(rMSC-MV)를 처리하고 혈관 생성 정도를 비교하였으며, 또한 신경줄기세포주(ReN cell)에 신경 발생과 관련된 miR-184를 형질주입하거나 허혈-뇌조직 추출물이 처리된 rMSC 유래 미세소포(rMSC-MV)를 처리하고 48시간 동안 배양한 후 신경 발생 능력을 비교하였다. 그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이 miR-210을 형질주입한 경우 음성대조군에 비해 혈관생성이 유의하게 증가하였고, rMSC-MV를 처리한 경우에는 miR-210을 형질주입한 경우보다도 혈관 생성이 더 높은 수준으로 유도된 것으로 나타났으며, 또한 miR-184 대신 비특이적 miRNA를 형질주입한 음성대조군(CTRL)에 비해 miR-184를 도입한 경우 신경줄기세포의 증식이 유의하게 증가하였으며, 이와 유사하게 상기 미세소포를 처리한 경우에도 신경줄기세포의 증식이 증가한 것을 확인하였다.

이에 더하여, 상기 microRNAs의 표적 단백질 발현억제 여부를 분석하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다. 보다 상세하게 상기 대조군 및 형질주입한 세포들을 PBS 완충액으로 세척한 후 Lysis buffer로 용균시키고 일정량의 용균액을 이용해 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하여 단백질을 크기 별로 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)로 이동시키고 각각 miR-210 및 miR-184의 표적 단백질인 Ephrin A3 및 Numbl의 발현수준을 관찰하였다. 그 결과, 도 9b 및 9c에 나타낸 바와 같이 miR-210 및 miR-184을 형질주입한 경우 각각 Ephrin A3 및 Numbl의 발현수준이 감소한 것으로 나타났으며, rMSC-MV를 처리한 세포 또는 3D-MV를 처리한 세포에서 각각 Ephrin A3 및 Numbl의 발현이 현저히 억제된 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 rMSC-MV가 처리된 각 세포 또는 3D-MV가 처리된 각 세포에서 상기 미세소포 내에 함유된 miR-210 및 miR-184가 각각 Ephrin A3 및 Numbl의 발현을 억제하여 혈관 생성 및 신경 발생 자극을 매개함을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)의 발현수준이 증진된, 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
줄기세포를 동적 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs)의 생성 촉진 방법으로서, 상기 마이크로RNAs(microRNAs)는 마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)인 것을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
줄기세포에 허혈 자극하는 단계를 포함하는, 생체 외 줄기세포 유래 미세소포 내 마이크로RNAs(microRNAs)의 생성 촉진 방법으로서, 상기 마이크로RNAs(microRNAs)는 마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)인 것을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
삭제
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
제5항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
제2항에 있어서,
상기 동적 3차원 배양은 세포를 분주하고 배양기 내에서 6시간 내지 18시간 후 20 내지 40 rpm으로 회전 교반하면서 5일 내지 9일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
제3항에 있어서,
상기 허혈 자극은 허혈 개체의 뇌조직 추출물 처리에 의한 것임을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
제3항에 있어서,
상기 허혈 자극은 12시간 내지 48시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 생성 촉진 방법.
줄기세포를 동적 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포(microvesicles)의 효능강화방법으로서, 상기 효능강화는 마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)의 발현이 증진되는 것을 특징으로 하는, 효능강화방법.
줄기세포를 허혈 자극하는 단계를 포함하는, 생체 외 줄기세포 또는 이로부터 분리된 미세소포(microvesicles)의 효능강화방법으로서, 상기 효능강화는 마이크로RNA-137(miR-137), 마이크로RNA-184(miR-184) 및 마이크로RNA-210(miR-210)의 발현이 증진되는 것을 특징으로 하는, 효능강화방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 효능강화는 줄기세포 내 성장인자 또는 사이토카인(cytokine)의 발현이 증진되는 것임을 특징으로 하는, 효능강화방법.
제12항에 있어서,
상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 형질전환 성장인자(transforming growth factor beta; TGFβ) 및 골 형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein 2; BMP2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 효능강화방법.
제12항에 있어서,
상기 사이토카인은 CH13L1, CD105, CD147, ICAM-1, IP-10, MIP-1β, IL-6, IL-8, GRO, TIMP-1 및 SerpineE1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 효능강화방법.
삭제
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 효능강화방법.
제16항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 효능강화방법.