KR101991038B1 - 줄기세포 유래의 세포외 소포체 생산 방법 - Google Patents

Abstract

3차원 세포배양법을 이용한 줄기세포 유래의 세포외 소포체 (extracellular vesicle) 생산 방법, 줄기세포의 3차원 세포 응집체의 세포외 소포체 생산 용도, 세포외 소포체를 고농도로 포함하는 줄기세포의 3차원 세포 응집체의 배양물, 및 이를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

Description

줄기세포 유래의 세포외 소포체 생산 방법{Method of preparing stem cell-derived extracellular vesicles}

3차원 세포배양법을 이용한 줄기세포 유래의 세포외 소포체 (extracellular vesicle) 생산 방법, 줄기세포의 3차원 세포 응집체의 세포외 소포체 생산 용도, 세포외 소포체를 고농도로 포함하는 줄기세포의 3차원 세포 응집체의 배양물, 및 이를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

현재 불치/난치 질환을 치료하기 위한 새로운 paradigm으로 성체줄기세포 치료법이 다양하게 임상 적용되고 있으며, 성공적인 치료 사례들이 다수 보고되고 있다.

그러나, 환자 혹은 공여자로부터 추출, 선별된 줄기세포를 증식시키기 위해 체외 배양하는 과정 중 발생할 수 있는 이종 혈청 (xenogenic serum; e.g., fetal bovine/calf serum)의 internalization에 의한 인수전염 (zoonosis)의 문제, 줄기세포가 체내 이식되었을 때 왕성한 증식력과 상대적으로 큰 세포 사이즈 등의 줄기세포 특성으로 인해 발생할 수 있는 종양 형성(tumor formation) 문제, 혈관 폐쇄 유발 경색 (vascular occlusion causing infarcts) 등의 위험 요소가 존재하여, 성공적인 줄기세포 주입/이식 치료를 위해 그 해결 방안이 모색되어야 한다.

또한, 자가유래 줄기세포를 이용한 치료법 적용 시, 줄기세포의 체외 증식 능력, 병변으로의 이동 능력, 치료인자 분비 능력 등의 줄기세포의 재생 치료 효능이 환자마다 차이가 있어, 줄기세포 치료법의 범용성에 한계가 있다.

따라서, 앞서 언급한 살아있는 줄기세포를 직접 이용한 치료에서 발생할 수 있는 다양한 위험 요소 혹은 문제들을 회피하는 방안이 활발히 연구되고 있으며, 그 일환으로 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체가 (extracellular vesicle) 줄기세포 치료 기능을 대신할 수 있다는 연구 결과들이 나오고 있다 (Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68: 2667-2688).

살아있는 줄기세포의 직접 주입/이식 치료법을 대체하는, 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체를 이용한 치료법이 대두되어 많은 전임상 시험에서 효능을 보이고 있으며, 몇몇 질병치료에 있어 임상 단계에 진입한 사례도 보고되고 있다.

기존의 줄기세포 배양은 줄기세포를 환자 혹은 공여자로부터 추출, 선별하여 2차원 배양 플레이트에서의 증식에 의하여 수행된다. 이와 같이 성체줄기세포가 실험실의 2차원 배양 플레이트에서 배양되면서, 그 본래의 줄기세포능과 치료인자 분비능 등의 생물학적 물성이 현저히 감소된다고 알려져 있다.

줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체의 여러 전임상시험 결과가 그 치료 효능에 대해서 입증하고 있지만, 종래의 2차원 배양기법에서 실험실 배양된 줄기세포는 세포외 소포체의 분비능이 매우 낮아, 치료제로서 사용되기에는 수득되는 양이 매우 부족하다는 문제가 있다. 최근, hypoxic condition 상에서 중배엽줄기세포를 배양하여 줄기세포의 세포외 소포체 분비능을 어느 정도 높이는 데 성공한 보고가 있지만, 여전히 임상치료에서 적용되기에는 충분하지 않은 낮은 수득률을 보이고 있다.

치료용 줄기세포 유래 세포외 소포체를 연구단계를 넘어 실제 임상치료에 적용 범위를 확장시키기 위해서는, 환자에게 투여할 수 있는 충분한 양의 세포외 소포체 치료제 대량 생산 기술의 개발이 필요하다.

이와 같은 낮은 수득률의 문제를 해결하기 위하여, 줄기세포를 3차원 배양함으로써, 생체 내 환경과 유사한 조건이 형성되어 줄기세포의 활성 및 기능성이 증가되고 줄기세포 유래 세포외 소포체의 분비 임상 적용 가능한 규모의 대량 생산 공정을 제공한다.

일 예는 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 (extracellular vesicle) 생산 방법을 제공한다.

다른 예는 줄기세포의 3차원 배양에 의하여 형성된 줄기세포 응집체 (aggregate)을 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 줄기세포의 3차원 배양에 의하여 형성된 줄기세포 응집체 (aggregate)의 줄기세포 유래 세포외 소포체 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 상기 줄기세포의 세포 응집체를 배양하여 얻어진 배양물을 제공한다.

다른 예는 상기 줄기세포의 세포 응집체를 배양하여 얻어진 배양물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

줄기세포를 3차원 배양에 의하여 배양하면 세포들이 자발적으로 응집하여 세포 응집체 (cell aggregate)를 형성하여 줄기세포가 유래하는 생체 내의 3차원 조직에서의 세포 증식 환경 및/또는 조건과 유사한 환경 및/또는 조건이 조성됨과, 이로 인하여 줄기세포능과 치료인자들을 분비하는 기능 등을 포함하는 본래 줄기세포가 지니고 있는 생물학적 활성이 실험실 배양에 의해서도 회복 내지는 증대됨을 확인하였다. 예컨대, 중배엽줄기세포 (Mesenchymal stem cells; MSCs)의 경우 3차원 배양을 하면 세포들이 자가응집하여 mesenchymal condensation events라고 하는 생체 내 중배엽 유래 조직 발생에서 나타나는 현상과 유사한 상황이 되어 줄기세포 본래의 생물학적 활성을 회복 혹은 증진 시킬 수 있게 됨을 확인하였다. 이와 같이, 줄기세포의 3차원 배양을 통하여 세포 응집체가 형성되어 생체 내 조직과 유사한 환경(in vivo-like microenvironment)이 조성되고 줄기세포 본래의 활성이 회복 및/또는 증진됨에 따라서 줄기세포에서 분비되는 세포외 소포체의 대량 수득이 가능해짐을 제안한다.

본 발명의 일 예는 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 (extracellular vesicle) 생산 방법을 제공한다.

본 명세서에서 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 성체줄기세포 (adult stem cells), 유도만능줄기세포 (induced pluripotent step cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며, 예컨대, 줄기세포는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 동종 유래의 줄기세포 및/또는 자가 유래의 줄기세포일 수 있다.

배아줄기세포 (embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다.

유도만능줄기세포 (induced pluripotent step cells; iPS cells)는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다.

전발생세포 (progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화 되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중배엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한 '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다.

성체줄기세포 (adult stem cell)는 제대혈(탯줄혈액) 또는 성인의 골수, 혈액, 신경 등에서 추출해낸 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 중배엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 포유류, 예컨대 사람의 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.

일 예에서, 상기 성체줄기세포는 중배엽줄기세포, 예컨대 사람의 중배엽줄기세포일 수 있다. 중배엽(중간엽)줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 중배엽기질세포 (mesenchymal stromal cell; MSC)이라고도 불리며, 골모세포 (osteoblasts), 연골모세포 (chondrocytes), 근세포 (myocytes), 지방세포 (adipocytes) 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포 (multipotent stromal cell)를 의미한다. 중배엽줄기세포는 태반 (placenta), 제대혈 (umbilical cord blood), 지방 조직 (adipose tissue), 성체 근육 (adult muscle), 각막 기질 (corneal stroma), 젖니의 치아 속질 (dental pulp) 등과 같은 비골수 조직 (non-marrow tissues)으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있다

세포외 소포체 (extracellular vesicle)는 세포에서 세포외 환경으로 방출(분비)되는 다양한 기능의 단백질 (예컨대, 각종 성장인자(growth factors), 케모카인(chemokines), 사이토카인(cytokines), 전사인자(transcription factors) 등), RNAs(mRNA, miRNA 등), 지질 등의 다양한 생체 분자가 이것이 유래된 세포의 세포막과 동일한 지질 이중층의 세포막으로 봉입된 입자 형태의 구조체를 의미한다.

상기 세포외 소포체는 줄기세포로부터 유래한 세포외 소포체일 수 있다.

상기 줄기세포 유래의 세포외 소포체는 약 50nm 내지 약 1 um(micrometer)의 평균입경을 갖는 줄기세포가 분비하는 모든 소포체일 수 있으며, 구체적으로, 줄기세포에서 분비된 약 100 nm 내지 약 1 um의 평균입경을 갖는 소포체 (미세소포체 (microvesicles)이라고 칭함), 약 50 nm 내지 약 100 nm의 평균입경을 갖는 소포체 (엑소좀 (exosome)이라고도 칭함), 또는 이들의 혼합물을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한 세포외 소포체, 미세소포체, 및 엑소좀은 크기의 구별 없이 모두 세포외 소포체를 의미하는 것으로 혼용될 수 있다.

줄기세포 유래의 세포외 소포체는 이들이 유래하는 줄기세포의 세포막으로 봉입된 입자구조이다. 줄기세포 유래의 세포외 소포체는 단백질, 뉴클레오타이드 등의 유용한 생체 분자뿐 아니라, 이것이 유래한 줄기세포의 세포막에 위치하는 각종 수용체, 채널을 포함하는 모든 세포막 성분을 소포체막에 포함하므로, 줄기세포가 상기 세포막 성분을 통하여 수행하던 세포-세포 의사소통 (cell-to-cell communication) 및 주변의 미세환경과의 상호작용에 중요한 역할을 수행할 수 있다.

또한, 세포외 소포체의 막에 존재하는 다양한 수용체들은 다른 세포의 세포막 또는 세포외 기질에 존재하는 특정 리간드와 특이적으로 결합 가능하므로, 원하는 특정 세포, 조직, 또는 미세환경의 표적화가 가능하다.

또한, 상기 세포외 소포체는 다양한 기능의 단백질, RNAs, 지질 등의 다양한 생체 분자가 지질이중층 막에 봉입되어 있으므로 분해 효소 및/또는 분해 화학물질로부터 내부 봉입물을 보호하여 이의 저장수명을 연장시킬 수 있다.

따라서, 줄기세포에서 치료적 유용 생체 분자가 직접 세포외로 분비되는 것과 비교하여, 세포외 소포체에 봉입되어 분비되는 경우에 보다 안전하게 선택적으로 표적에 전달가능하고 세포간 의사소통에 관여할 수 있어서 보다 적절하고 효과적으로 기능을 발휘할 수 있다는 이점이 있다. 이러한 이점으로 인하여 줄기세포 유래의 세포외 소포체는 줄기세포를 이용한 각종 치료요법에 있어서 그 중요성이 증대되고 있다.

그러나, 줄기세포를 기존의 배양 방법에서와 같이 플레이트 상에서의 2차원 세포 배양으로 배양하면 단층의 2차원 평면 구조로 배양된다. 반면, 줄기세포가 유래한 생체 내 조직은 생체 내에서 2차원의 평면 구조가 아닌 3차원 구조를 갖는다. 기존의 2차원 세포 배양에 의하여 생성된 단층구조의 세포 배양체에서는 3차원 구조의 조직과 비교하여 세포간 접촉이 감소하기 때문에, 생체 내 3차원 구조의 조직에서와 같은 세포들 사이 또는 세포와 세포외 기질 (ECM) 사이의 상호작용이 일어날 수 없게 된다. 앞서 설명한 바와 같이, 기존의 배양 방법에 의한 줄기세포 배양시 세포외 소포체의 수득량이 매우 낮아서 치료제로서 사용하는데 장애가 되어왔는데, 2차원 세포 배양시 생체 내에서 줄기세포가 세포외 소포체를 분비하는 것과 관련된 세포 간 또는 세포-세포외 기질 간 상호전달이 파괴된 것과 무관하지 않을 것으로 판단된다.

본 명세서에서 제안된 바와 같이 줄기세포를 3차원 세포 배양법에 의하여 배양하면 세포의 자가 조립 (self-aggregation)에 의한 3차원 구조의 세포 응집체 (aggregate)가 생성된다. 이와 같이 생성된 3차원 구조의 세포 응집체는 줄기세포가 유래한 생체 내 조직과 유사한 환경을 제공할 수 있다. 이에 의하여 줄기세포의 세포간 의사소통에서의 역할이 생체 내에서와 유사하게 되어 생체 내에서와 비교적 유사한 환경에서 세포외 소포체를 생산할 수 있게 되며, 세포외 소포체 생산 수준을 증가시킬 수 있다.

따라서, 상기 줄기세포 유래 세포외 소포체 제조 방법은 줄기세포를 3차원 세포 배양에 의하여 배양하여 3차원 구조의 세포 응집체 (aggregate)를 생성하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 3차원 세포 배양에 의하여 생성된 3차원 구조의 세포 응집체는 예컨대 스페로이드(spheroid) 형태의 구조체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포 응집체는 생체 내 조직과 유사한 3차원 구조를 구현하기 위하여 평균 입경이 약 50 um(micrometer) 이상, 약 70 um 이상, 약 100 um 이상, 약 130 um 이상, 약 150 um 이상, 또는 약 170 um 이상일 수 있으며, 응집체 내부 세포의 산소 고갈에 의한 괴사를 막기 위하여, 평균 입경이 약 250 um, 약 230 um 이하, 또는 약 200 um 이하인 것일 수 있다. 예컨대, 상기 세포 응집체는 평균 입경이 약 50 um 내지 약 250 um, 약 50 um 내지 230 um, 약 50 um 내지 약 200 um, 약 70 um 내지 약 250 um, 약 70 um 내지 230 um, 약 70 um 내지 약 200 um, 약 100 um 내지 약 250 um, 약 100 um 내지 230 um, 약 100 um 내지 약 200 um, 약 130 um 내지 약 250 um, 약 130 um 내지 230 um, 약 130 um 내지 약 200 um, 약 150 um 내지 약 250 um, 약 150 um 내지 230 um, 약 150 um 내지 약 200 um, 약 170 um 내지 약 250 um, 약 170 um 내지 230 um, 또는 약 170 um 내지 약 200 um의 3차원 구조의 세포 응집체일 수 있다.

상기 3차원 구조의 세포 응집체 내에 포함된 줄기세포의 개수는 약 10개 내지 약 2500개, 약 15개 내지 약 2500개, 약 20개 내지 약 2500개, 약 100개 내지 약 2500개, 약 200개 내지 약 2500개, 약 300개 내지 약 2500개, 약 400개 내지 약 2500개, 약 10개 내지 약 2000개, 약 15개 내지 약 2000개, 약 20개 내지 약 2000개, 약 100개 내지 약 2000개, 약 200개 내지 약 2000개, 약 300개 내지 약 2000개, 약 400개 내지 약 2000개, 약 10개 내지 약 1500개, 약 15개 내지 약 1500개, 약 20개 내지 약 1500개, 약 100개 내지 약 1500개, 약 200개 내지 약 1500개, 약 300개 내지 약 1500개, 약 400개 내지 약 1500개, 약 10개 내지 약 1250개, 약 15개 내지 약 1250개, 약 20개 내지 약 1250개, 약 100개 내지 약 1250개, 약 200개 내지 약 1250개, 약 300개 내지 약 1250개, 약 400개 내지 약 1250개, 약 10개 내지 약 1000개, 약 15개 내지 약 1000개, 약 20개 내지 약 1000개, 약 100개 내지 약 1000개, 약 200개 내지 약 1000개, 약 300개 내지 약 1000개, 약 400개 내지 약 1000개, 약 10개 내지 약 800개, 약 15개 내지 약 800개, 약 20개 내지 약 800개, 약 100개 내지 약 800개, 약 200개 내지 약 800개, 약 300개 내지 약 800개, 또는 약 400개 내지 약 800개의 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 3차원 구조의 세포 응집체가 평균 입경이 약 150 um인 경우 약 400개 내지 약 500개의 줄기세포를, 약 200um인 경우 약 600개 내지 약800개 (예컨대, 약 700개)의 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.

상기 3차원 세포 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 3차원 세포 배양 기술에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 3차원 세포 배양은 마이크로웰 어레이 배양, 다공성 미립구 배양, hanging drop 배양, low attachment plate 배양, membrane 기반 cell-detachment 배양, thermal lifting 배양, 원심분리 배양, semi-solid medium 배양 등을 이용한 세포 배양일 수 있다 (참고문헌: Tissue Engineering: Part B, Volume 20, number 5, 2014). 상기 3차원 세포 배양에 사용되는 배양 용기 또는 배양 지지체는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등과 같은 생체적합성 물질로 표면 개질된 것일 수 있다. 이와 같이 표면 개질된 배양 용기 또는 배양 지지체는 크기 제어된 세포 응집체를 균일하게 형성시키는데 유리하다. 일 예에서, 상기 마이크로웰은 soft-lithography와 같이 잘 알려진 간단한 미세제작기술 (microfabrication)에 의하여 제작된 것일 수 있다.

3차원 세포 배양에 의하여 생성된 세포 응집체가 상기한 범위의 평균 입경을 갖도록 하기 위하여, 상기 마이크로웰 또는 다공성 미립구 등의 배양 용기 또는 배양 지지체의 세포 배양 공간 (용기 내부 공간 또는 기공)의 크기 (평균 지름)는 약 50 um 이상, 약 70 um 이상, 약 100 um 이상, 약 130 um 이상, 약 150 um 이상, 또는 약 170 um 이상 이거나, 약 250 um, 약 230 um 이하, 또는 약 200 um 이하일 수 있으며, 예컨대, 약 50 um 내지 약 250 um, 약 50 um 내지 230 um, 약 50 um 내지 약 200 um, 약 70 um 내지 약 250 um, 약 70 um 내지 230 um, 약 70 um 내지 약 200 um, 약 100 um 내지 약 250 um, 약 100 um 내지 230 um, 약 100 um 내지 약 200 um, 약 130 um 내지 약 250 um, 약 130 um 내지 230 um, 약 130 um 내지 약 200 um, 약 150 um 내지 약 250 um, 약 150 um 내지 230 um, 약 150 um 내지 약 200 um, 약 170 um 내지 약 250 um, 약 170 um 내지 230 um, 또는 약 170 um 내지 약 200 um 일 수 있다.

상기 3차원 세포 배양은 각 배양 용기 또는 배양 지지체, 예컨대, 마이크로웰 또는 다공성 미립구의 각 기공에 세포를 접종하고 줄기세포 배양에 사용되는 통상의 배지를 사용하여 통상의 배양조건 (예컨대, 37℃ 5% CO₂)에서 세포 응집체의 크기가 상기한 범위가 될 때까지 배양할 수 있다.

예컨대, 마이크로웰을 사용하는 3차원 세포 배양에 있어서, 각 마이크로웰에 접종되는 세포 접종량은, 마이크로웰 하나 당, 약 1개 내지 약 1000개, 약 10개 내지 약 1000개, 약 100개 내지 약 1000개, 약 200개 내지 약 1000개, 약 300개 내지 약 1000개, 약 400개 내지 약 1000개, 약 500개 내지 약 1000개, 약 600개 내지 약 1000개, 약 1개 내지 약 900개, 약 10개 내지 약 900개, 약 100개 내지 약 900개, 약 200개 내지 약 900개, 약 300개 내지 약 900개, 약 400개 내지 약 900개, 약 500개 내지 약 900개, 약 600개 내지 약 900개, 약 1개 내지 약 800개, 약 10개 내지 약 800개, 약 100개 내지 약 800개, 약 200개 내지 약 800개, 약 300개 내지 약 800개, 약 400개 내지 약 800개, 약 500개 내지 약 800개, 약 600개 내지 약 800개, 약 1개 내지 약 700개, 약 10개 내지 약 700개, 약 100개 내지 약 700개, 약 200개 내지 약 700개, 약 300개 내지 약 700개, 약 400개 내지 약 700개, 약 500개 내지 약 700개, 또는 약 600개 내지 약 700개로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 마이크로웰을 사용하는 3차원 세포 배양법 이외의 방법의 경우에도 상기와 유사한 세포 접종량이 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 통상적으로 인지되는 각 방법에 적합한 양으로 수행할 수 있다.

3차원 세포 배양에 의하여 세포 응집체를 얻는 경우, 세포 증식이 크게 일어나지 않으므로, 상기 접종된 세포 수 범위와 3차원 세포 응집체에 포함된 세포수 범위는 동등하게 해석되어도 무방하다.

상기 3차원 세포 배양에 의하여 얻어진 세포 응집체를 배양하여, 세포의 세포외 소포체를 유도할 수 있다.

따라서, 일 예에서, 상기 줄기세포 유래 세포외 소포체 제조 방법은 세포 응집체를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

구체예에서, 상기 성체줄기세포 유래 세포외 소포체 제조 방법은,

(1) 줄기세포를 3차원 세포 배양에 의하여 배양하여 3차원 구조의 세포 응집체 (aggregate)를 생성하는 단계; 및

(2) 상기 세포 응집체를 배양하는 단계

를 포함하는 것일 수 있다.

상기 세포 응집체를 배양하는 단계는 통상의 배양 조건 (예컨대, 37℃ 5% CO₂)에 의하여 수행될 수 있다. 이 때, 세포 응집체의 배양은 세포외 소포체의 생산을 증가시키기 위하여, 흔들거나 회전 및/또는 진동을 가하는 진탕 배양에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 흔들거나, 회전 및/또는 진동을 가하는 진탕 배양은 3차원 세포 응집체에 영양분과 산소 등을 보다 원활하게 공급할 수 있다는 이점을 가질 수 있다.

일 예에서, 상기 세포 응집체의 배양은 세포에 가해지는 스트레스를 고려하여 약 40rpm 이하 또는 약 35rpm 이하의 속도로 회전시키면서 수행하는 것일 수 있으며, 예컨대, 약 10 내지 약 35rpm, 약 15 내지 약 35rpm, 약 20 내지 약 35rpm, 약 25 내지 약 35rpm, 또는 약 30 내지 약 35rpm의 속도로 회전시키면서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 진탕 배양은 orbital shaking, lateral shaking, circular shaking 등에 의한 것일 수 있고, orbital shaker, rotary wall vessel bioreactor, spinner flask 등의 3차원 배양 기구를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 세포 응집체의 배양은 1일 내지 30일, 1일 내지 25일, 1일 내지 20일, 1일 내지 17일, 1일 내지 15일, 1일 내지 13일, 1일 내지 10일, 1일 내지 7일, 1일 내지 5일, 2일 내지 30일, 2일 내지 25일, 2일 내지 20일, 2일 내지 17일, 2일 내지 15일, 2일 내지 13일, 2일 내지 10일, 2일 내지 7일, 2일 내지 5일, 3일 내지 30일, 3일 내지 25일, 3일 내지 20일, 3일 내지 17일, 3일 내지 15일, 3일 내지 13일, 3일 내지 10일, 3일 내지 7일, 3일 내지 5일, 4일 내지 30일, 4일 내지 25일, 4일 내지 20일, 4일 내지 17일, 4일 내지 15일, 4일 내지 13일, 4일 내지 10일, 4일 내지 7일, 또는 4일 내지 5일 동안 수행될 수 있다.

상기 3차원 세포 배양을 통하여 얻어진 세포 응집체를 배양하여 얻어진 배양물에는 줄기세포에서 분비된 세포외 소포체가 포함되어 있다. 상기 세포 응집체의 배양물에 포함된 줄기세포 유래 세포외 소포체의 함량은 2차원 세포 배양에 의하여 얻어지는 단일층 배양체를 배양하여 얻어진 배양물과 비교하여 현저하게 증가된 것을 특징으로 한다. 일 예에서, 3차원 세포 배양을 통하여 얻어진 세포 응집체를 배양하여 얻어진 배양물에 포함된 줄기세포 유래 세포외 소포체의 함량은, 동일한 줄기세포를 2차원 세포 배양(예컨대, 실시예 1에 기재된 2D 방법; 일반적인 웰 플레이트에서 비진탕 조건에서 배양)으로 배양하여 얻어지는 단일층 배양체를 배양하여 얻어진 배양물 내의 줄기세포 유래 세포외 소포체 함량과 비교하여, 줄기세포 100개 당 줄기세포 유래 세포외 소포체 개수 기준으로, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 25배 이상, 약 30배 이상, 약 35배 이상, 또는 약 40배 이상, 약 45배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 또는 약 100배 이상 증가된 것이 수 있으며, 예컨대, 최대 약 1000배, 약 700배, 약 500배, 약 200배, 약 150배, 약 120배 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 3차원 세포 배양에 의하여 생성된 세포 응집체를 배양한 배양물은, 예컨대, fluorescence-activated cell sorting (FACS) 방법에 의하여 측정하는 경우 (예컨대, (FACSVerse Flow Cytometer, BD bioscience) 사용), 세포 100개 당, 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 5개 이상, 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 또는 약 25개 이상의 줄기세포 유래의 세포외 소포체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포 유래 세포외 소포체 제조 방법은 상기 세포 응집체를 배양하는 단계 이후에 생산된 세포외 소포체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포외 소포체의 분리 및/또는 정제는 알려진 통상적인 모든 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대 원심분리, 필터링 (Filtering), 컬럼(size exclusion column), exoquick 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 줄기세포의 세포 응집체를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생산용 조성물을 제공한다. 다른 예는 줄기세포의 3차원 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생산 방법을 제공한다. 다른 예는 줄기세포의 세포 응집체의 줄기세포 유래 세포외 소포체 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 줄기세포는 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 배양은 생체외에서 진행되는 것일 수 있다.

상기 세포 응집체의 배양은 진탕 배양에 의한 것일 수 있으며, 예컨대, 약 10 내지 약 35rpm, 약 15 내지 약 35rpm, 약 20 내지 약 35rpm, 약 25 내지 약 35rpm, 또는 약 30 내지 약 35 rpm의 속도로 회전시키면서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포는 성체줄기세포, 예컨대, 중간엽줄기세포, 보다 구체적으로 인간 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 세포 응집체는 줄기세포의 3차원 세포 배양에 의하여 생성된 3차원 구조체이다. 상기 3차원 세포 배양은 앞서 설명한 바와 같다. 상기 세포 응집체는 예컨대 스페로이드(spheroid) 형태의 구조체일 수 있다. 상기 세포 응집체는 생체 내 조직과 유사한 3차원 구조를 구현하기 위하여 평균 입경이 약 약 50 um 이상, 약 70 um 이상, 약 100 um 이상, 약 130 um 이상, 약 150 um 이상, 또는 약 170 um 이상일 수 있으며, 응집체 내부 세포의 산소 고갈에 의한 괴사를 막기 위하여, 평균 입경이 약 250 um, 약 230 um 이하, 또는 약 200 um 이하인 것일 수 있다. 예컨대, 상기 세포 응집체는 평균 입경이 약 약 50 um 내지 약 250 um, 약 50 um 내지 230 um, 약 50 um 내지 약 200 um, 약 70 um 내지 약 250 um, 약 70 um 내지 230 um, 약 70 um 내지 약 200 um, 약 100 um 내지 약 250 um, 약 100 um 내지 230 um, 약 100 um 내지 약 200 um, 약 130 um 내지 약 250 um, 약 130 um 내지 230 um, 약 130 um 내지 약 200 um, 약 150 um 내지 약 250 um, 약 150 um 내지 230 um, 약 150 um 내지 약 200 um, 약 170 um 내지 약 250 um, 약 170 um 내지 230 um, 또는 약 170 um 내지 약 200 um인 것일 수 있다.

다른 예는 상기 줄기세포의 세포 응집체를 배양하여 얻어진 배양물을 제공한다. 상기 줄기세포의 세포 응집체의 배양물은, 예컨대, fluorescence-activated cell sorting (FACS) 방법에 의하여 측정하는 경우 (예컨대, (FACSVerse Flow Cytometer, BD bioscience) 사용하여 측정), 세포 100개 당, 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 5개 이상, 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 또는 약 25개 이상, 예컨대, 약 1개 내지 약 50개, 약 2개 내지 약 50개, 약 3개 내지 약 50개, 약 5개 내지 약 50개, 약 10개 내지 약 50개, 약 15개 내지 약 50개, 약 20개 내지 약 50개, 또는 약 25개 내지 내지 약 50개의 줄기세포 유래 세포외 소포체를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 줄기세포의 세포 응집체를 배양하여 얻어진 배양물에 포함된 줄기세포 유래 세포외 소포체의 수는, 동일한 줄기세포를 기존의 통상적인 2차 배양법 (예컨대, 실시예 1에 기재된 2D 방법; 일반적인 웰 플레이트에서 비진탕 조건에서 배양)으로 배양하여 얻어진 배양물과 비교하여, 약 2배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 9배 이상일 수 있으며, 예컨대, 약 2배 내지 약 200배, 약 5배 내지 약 200배, 약 9배 내지 약 200배, 약 2배 내지 약 150배, 약 5배 내지 약 1500배, 약 9배 내지 약 150배, 약 2배 내지 약 120배, 약 5배 내지 약 120배, 약 9배 내지 약 120배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 100배, 또는 약 9배 내지 약 100배 증가된 것일 수 있으나 (도 5a 내지 도 9 참조), 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포 유래 세포외 소포체는 혈관신생 (angiogenesis), 면역 조절 (immuno-modulation), 세포 이동 (cell migration), 항-세포자멸사 (anti-apoptosis) 등과 관련된 다양한 치료 인자들을 포함한다. 예컨대, 줄기세포 유래 세포외 소포체는 단백질 (예컨대, 각종 성장인자(growth factors), 케모카인(chemokines), 사이토카인(cytokines), 전사인자(transcription factors) 등), 유전자, RNAs (각종 microRNA 등) 등의 다양한 생체 활성분자를 포함한다.

따라서, 줄기세포 유래 세포외 소포체를 포함하는 줄기세포의 세포 응집체의 배양물은 각종 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 다른 예는 상기 줄기세포의 세포 응집체의 배양물 및/또는 이로부터 분리된 세포외 소포체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 기존의 줄기세포 주입/이식 치료가 적용되던 질병들, 예컨대 중추신경계질환 (예컨대, 뇌졸중, 치매, 척수손상, 파킨슨병 등), 관절염. 신장질환, 암 등의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 다양한 투여 경로로 투여 대상에게 투여될 수 있으며, 예컨대, 투여 대상의 병변부위에 주입 또는 이식되거나, 혈관투여 (정맥투여 또는 동맥투여), 피하투여 등의 비경구 투여 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물, 또는 조류 (Aves) 등에서 선택된 동물 및/또는 상기 동물에서 유래한 (분리된) 조직, 세포 또는 이들의 배양물일 수 있다.

상기 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 줄기세포의 세포 응집체의 배양물이 얻어지는 줄기세포는 투여 대상과 동종 유래의 줄기세포, 자가 유래의 자가줄기세포, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

현재 다양한 불치/난치 질환 (뇌졸중, 관절염, 치매, 각종 신장질환, 각종 신경질환, 암 등) 치료에 성체줄기세포 주입/이식 치료가 활발하게 임상 적용되고 있으며, 본 발명은 살아있는 줄기세포를 이식/주입하는 치료법에서 오는 위험요소들을 경감시키는 대체 치료법으로 적용될 수 있다.

도 1은 soft lithography microfabrication 공법을 이용하여 polyethylene glycol (PEG) hydrogel microwell array를 제작하는 과정을 모식적으로 보여준다.
도 2는 3차원 세포배양 및 2차원 세포 배양에 의하여 3일간 배양한 배양물을 현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 3차원 세포배양에 의하여 3일간 배양한 배양물의 live and dead assay 결과를 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 4d는 3일 동안 2차원 배양 (2D), 2차원 진탕 배양 (2D w/shaking), 3차원 배양 (3D), 및 3차원 진탕 배양 (3D w/shaking)한 경우에 얻어진 세포외 소포체를 보여주는 FACS 그래프이다 (4a: 3일 & 2D 배양, 4b: 3일 & 2D w/shaking 배양, 4c: 3일 & 3D 배양, 4d: 3일 & 3D w/shaking 배양).
도 5a 내지 5d는 5일 동안 2차원 배양 (2D), 2차원 진탕 배양 (2D w/shaking), 3차원 배양 (3D), 및 3차원 진탕 배양 (3D w/shaking)한 경우에 얻어진 세포외 소포체를 보여주는 FACS 그래프이다 (5a: 5일 & 2D 배양, 5b: 5일 & 2D w/shaking 배양, 5c: 5일 & 3D 배양, 5d: 5일 & 3D w/shaking 배양).
도 6a 내지 6d는 7일 동안 2차원 배양 (2D), 2차원 진탕 배양 (2D w/shaking), 3차원 배양 (3D), 및 3차원 진탕 배양 (3D w/shaking)한 경우에 얻어진 세포외 소포체를 보여주는 FACS 그래프이다 (6a: 7일 & 2D 배양, 6b: 7일 & 2D w/shaking 배양, 6c: 7일 & 3D 배양, 6d: 7일 & 3D w/shaking 배양).
도 7은 3일 동안 2차원 배양 (2D), 2차원 진탕 배양 (2D w/shaking), 3차원 배양 (3D), 및 3차원 진탕 배양 (3D w/shaking)한 경우에 얻어진 세포외 소포체 수를 보여주는 그래프이다.
도 8은 5일 동안 2차원 배양 (2D), 2차원 진탕 배양 (2D w/shaking), 3차원 배양 (3D), 및 3차원 진탕 배양 (3D w/shaking)한 경우에 얻어진 세포외 소포체 수를 보여주는 그래프이다.
도 9는 7일 동안 2차원 배양 (2D), 2차원 진탕 배양 (2D w/shaking), 3차원 배양 (3D), 및 3차원 진탕 배양 (3D w/shaking)한 경우에 얻어진 세포외 소포체 수를 보여주는 그래프이다.
도 10은 줄기세포 유래 세포외 소포체에 포함된 치료 인자들을 cytokine array 방법으로 확인한 이미지이다.
도 11은 상기 도 10의 이미지를 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 중배엽줄기세포의 3차원 세포 배양

중배엽줄기세포의 3차원 세포 배양을 위하여, soft lithography microfabrication 공법을 이용하여 제작된 polyethylene glycol (PEG) hydrogel microwell array 를 준비하였다 (array 당 1225개의 200 um 크기 microwell이 포함됨) (도 1 참조). PEG microwell array 위에 실험실 배양된 인간 골수유래 중배엽줄기세포를 접종하였다 (600~700 cells/microwell). 중배엽줄기세포들이 microwell 안에서 자발적으로 응집하여 12시간 안에 균일한 크기의 cellular aggregate (평균 직경 약 200 um의 spheroid 구조)를 형성하였다. 그 결과, 각 array 당 1225개의 spheroid 구조(평균 직경 약 200 um)의 중배엽줄기세포 응집체를 배양하였다. 다수의 microwell array로부터 균일한 크기의 중배엽줄기세포 spheroid를 대량 형성한 후, microwell array에 중배엽줄기세포 spheroid가 담긴 채로, 약 35 rpm 정도의 속도로 orbital shaking 하며 배양하였다 (배양 조건: 37℃; 5% CO₂, 총 배양 기간 3, 5, 또는 7일; 배지: low glucose DMEM (Invitrogen) + 10% FBS + 1% antibiotics).

상기 배양에 의하여 얻어진 균일한 크기의 3차원 중배엽줄기세포 스페로이드 구조체를 orbital shaker (Multi shaker 3D-200, FINE PCR, Korea) 에서 35rpm의 속도로 회전시키며 spheroid 생성 시간까지 포함하여 총 3일, 5일, 또는 7일 동안 진탕 배양하였다.

비교를 위하여 2차원 배양 (2D & 2D with shaking)을 수행하였다. 구체적으로, 2차원 배양 그룹 (2D)는 일반 6 well plate에서 shaking 없이 상기와 같은 방법으로 총 3일, 5일 또는 7일 동안 배양하였으며, 2차원 배양 shaking 그룹 (2D with shaking)은 35 rpm으로 shaking 하여 상기와 같은 방법으로 총 3일, 5일 또는 7일 동안 배양하였다.

상기 얻어진 중배엽줄기세포 배양물의 형상을 관찰하여 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 가장 위의 사진은 세포농도 1x10⁵cells/cm²인 2차원 배양군의 현미경 사진이다 (hMSCs on 2D). 가운데 사진은 2D 배양한 중간엽줄기세포 5x10⁵cells를 1225개의 microwell이 있는 microwell array에 seeding 하여 12시간 후 1225개의 spheroid 형성이 된 후 얻어진 현미경 사진이다 (D0 MSC spheroid in microwells). 가장 아래의 사진은 상기 형성된 1225개의 spheroid들을 bacterial grade (cell non-adhesive) petri-dish로 옮긴 후 35 rpm로 shaking하며 3일간 배양한 후 얻어진 사진이다 (D3 MSC spheroid in suspension with shaking (35 rpm)). 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 2차 세포 배양에서와는 달리, 3차원 세포 배양시에는 균일한 크기의 중배엽줄기세포 spheroid가 각 마이크로웰당 하나씩 형성되어 있음을 확인할 수 있다.

배양된 세포의 활성을 확인하기 위하여, 3차원 세포 배양 (3일 진탕 배양)에 의하여 얻어진 배양물에 대하여 Invitrogen사의 live and dead assay kit을 사용하여 manufacturer의 manual에 따라서 진행하여 Live & Dead assay를 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 중배엽줄기세포 spheroid 내부의 대부분의 세포가 살아있음을 확인할 수 있다.

실시예 2: 세포외 소포체 정량

상기 실시예 1에서 3차원 세포 배양 (총 3일, 5일 또는 7일 간 진탕배양 포함)에 의하여 얻어진 배양액을 수거하였다. 상기 수거된 배양액을 2,500g 1회, 14,000g 2회의 원심분리하여 배양액에 포함된 줄기세포로부터 분비된 세포외 소포체들을 수득한 후, 인간 중배엽줄기세포의 세포막에 특이적인 항 CD105 항체 (Becton Dickinson, MCA1557F) 및 phospholipid membrane에 특이적인 항 annexin V 항체 (Becton Dickinson, 550474)를 사용하는 fluorescence-activated cell sorting (FACS) 방법을 이용하여 배양액 속에 포함된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포체의 양을 정량 분석하였다. 비교를 위하여, 상기 실시예 1에 기재된 2차원 배양 그룹 (2D) 및 2차원 배양 shaking 그룹 (2D with shaking)에 대하여도 동일한 방법으로 배양액 속에 포함된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포체의 양을 정량 분석하였다.

구체적으로 상기 FACS 방법은 아래의 과정으로 수행하였다: 상기 수득한 세포외 소포체를 멸균된 PBS 20 ul에 동부피 만큼 넣고 현탁시켰다. APC 형광이 결합된 annexin V(lipid membrane marker)와 FITC 형광이 결합된 CD105 (human MSC marker) positive 마커 (annexin V 및 CD105 각각의 항체들)를 각 5 ul씩 첨가하였다. 이 과정을 통하여 본 실시예에서 측정된 microvesicle이 human MSC로부터 유래한 것임을 증명할 수 있다. 여기에 counting beads 10 ul를 넣고 vortexing한 후, annexin V와 CD105이 binding 할 수 있도록 10xCa2⁺ binding buffer (Sigma) 5 ul를 넣어주었다. PBS 5 ul 를 첨가하여 희석시킨 후, 1xCa^{2 +} binding buffer 400 ul을 넣고 다시 희석시켰다. Flow cytometry verse 장비(FACSVerse Flow Cytometer, BD bioscience)를 이용하여 준비된 샘플을 측정하였다.

상기 얻어진 측정값에 대하여 BD FACSuite 소프트웨어(BD bioscience)를 통해 순수한 세포외 소포체 영역을 설정하였다. 180 초 동안 이 영역 내에 포함된 총 세포외 소포체, Annexin V와 CD105 마커에 positive한 세포외 소포체, 및 counting beads를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4a (3일 & 2D 배양), 도 4b (3일 & 2D w/shaking 배양), 도 4c (3일 & 3D 배양), 도 4d (3일 & 3D w/shaking 배양), 도 5a (5일 & 2D 배양), 도 5b (5일 & 2D w/shaking 배양), 도 5c (5일 & 3D 배양), 도 5d (5일 & 3D w/shaking 배양), 도 6a (7일 & 2D 배양), 도 6b (7일 & 2D w/shaking 배양), 도 6c (7일 & 3D 배양), 및 도 6d (7일 & 3D w/shaking 배양)에 각각 나타내었다. 각 도면의 왼쪽 그래프에 있어서, P1은 1um 이내의 particle을 제한한 것이고, P2는 P1의 size 제한의 신뢰도를 위해 알고 있는 사이즈의 microbeads를 FACS counting 한 것이다. P2에서 count된 값과 실제 넣어준 microbeads의 개수의 비가 P1에서 count 된 소포체 개수의 신뢰도가 된다. 오른쪽 그래프에 나타난 점들은 P1에서 붉은 상자로 선택된 영역의 점들이고, 파란색 상자 안에 있는 것이 annexin V와 CD105 모두 양성으로 마킹된 소포체들이고, 그 개수를 소포체의 정량 데이터로 사용하였다.

상기 도 4a 내지 도 6d 각각의 오른쪽 그래프의 파란색 점선 박스가 나타내는 Annexin V와 CD105 마커에 positive한 세포외 소포체의 수를 측정하고 normalization하여 얻어진 그래프를 도 7 (3일 배양; 도 4a 내지 도 4d 해당), 도 8 (5일 배양; 도 5a 내지 도 5d 해당), 및 도 9 (7일 배양; 도 6a 내지 도 6d 해당)에 각각 나타내었다.

도 5a 내지 도 9에서 나타낸 바와 같이 인간 중배엽줄기세포로부터 유래되었음을 나타내는 Annexin V 양성 및 CD105 양성의 세포외 소포체의 수 (Total MVs)는 3일 배양의 경우 (D3), 2차 배양 (2D 또는 2D w/shaking)과 비교하여, 3차 배양(3D)시에 약 9배 내지 약 12배 증가하고, 3차 진탕배양(3D w/shaking)시에 약 77배 내지 약 100배 증가하였으며; 5일 배양의 경우 (D5), 2차 배양 (2D 또는 2D w/shaking)과 비교하여, 3차 배양(3D)시에 약 5배 증가하고, 3차 진탕배양(3D w/shaking)시에 약 51배 증가하였으며; 7일 배양의 경우 (D7), 2차 배양 (2D 또는 2D w/shaking)과 비교하여, 3차 배양(3D)시에 약 2배 내지 약 6배 증가하고, 3차 진탕배양(3D w/shaking)시에 약 12배 내지 약 43배 증가하였다. 상기 결과로부터, 3차 배양 (with or without shaking)에 의하여 2차 배양시보다 현저하게 증가된 인간 중배엽줄기세포 유래의 세포외 소포체가 얻어짐을 확인할 수 있다.

실시예 3: 3차원 세포 배양에 의하여 생산된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포체에 함유된 치료 인자 분석

cytokine array 방법에 의하여 3차원 세포 배양에 의하여 생산된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포체에 함유된 치료 인자들을 분석하였으며, 하기의 모든 과정은 R&D systems에서 구입한 Proteome Profiler™ Human XL Cytokine Array Kit 및 여기에 포함된 구성물(버퍼, 멤브레인, 항체 등)을 사용하여 제조자 매뉴얼에 따라서 진행하였다.

상기 실시예 2에서 얻어진 중간엽줄기세포 스페로이드로부터 분비된 세포외 소포체 (3D w/shaking 배양에 의하여 얻어짐)에 lysis buffer를 이용하여 protein을 용해시켰다. 다양한 항체가 코팅된 membrane를 tray에 담고 blocking buffer를 넣어 blocking시켰다. blocking 한 후, 각각의 샘플을 200 ug의 양으로 넣고 4 ℃에서 overnight 반응시켰다. 1 x wash buffer로 3회 세척한 후, detection antibody를 넣고 반응 시킨 후 1 x wash buffer로 3회 세척하였다. streptavidin-HRP를 넣고 반응시킨 후 1 x wash buffer로 3회 wash하였다. 암실에서 x-ray 필름에 membrane을 10 분간 노출시켜 현상하였다.

비교를 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 종류의 줄기세포(인간 골수유래 중배엽줄기세포)를 2차원 배양하고 (실시예 1의 2D 배양 참조; 3일 배양) 여기에 IBE (Ischemic brain extract)를 처리하여 24시간 배양한 배양물로부터 얻어진 배양 배지에 대하여 상기와 동일한 시험을 실시하였다. 2차원 배양된 줄기세포에 IBE를 처리하면 다량의 치료인자를 포함한 소포체 분비를 유도시킬 수 있는 것으로 알려져 있으므로, 본 실험에서 치료인자를 함유하는 양성 대조군으로 사용하였다.

IBE의 준비 및 처리 과정은 아래와 같이 수행하였다:

transient middle cerebral artery occlusion 동물모델 (rat; "Kutluay　Uluc, et al.; Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat; Journal of Visualized Experiments (2011)" 참조하여 자체 제작함)의 brain을 채취하여 150mg/ml으로 Knock-out DMEM (invitrogen)에 aliquot해서 homogenizer로 분쇄한 후, 분쇄한 brain을 모아 10,000gx10min로 centrifugation 후 supernatant를 취하여 tube에 옮긴 후, syringe filter 0.2um를 이용하여 filtering하였다. filtering 후 1 ml씩 aliquot하여 10℃에서 14,000g x 45 min로 centrifugation 후 supernatant를 취하여 tube에 수집하였다. knock out media로 20% IBE-medium을 제조 (knock out media 16 ml+IBE 4 ml)한 후, 제조한 IBE-medium을 bottle top filter (0.2um)으로 filtering하여 오염인자 및 잔여 microparticle을 제거하였다. 상기 3일 배양한 2D 중배엽줄기세포 배양 dish 내의 medium을 제거하고, PBS washing을 3회 진행한 후, 20%(v/v) IBE를 처리하였다. 24시간 뒤 medium을 수집하여 세포외 소포체를 수득하고 상기와 동일한 방법으로 분석하였다.

상기 현상된 이미지를 도 10에 나타내고, 이를 정량한 결과를 도 11에 나타내었다. 도 10 및 도 11에서 확인되는 바와 같이, 중간엽줄기세포 스페로이드로부터 분비된 세포외 소포체의 경우 (hMSC-aggregates 또는 aggregates로 표시), IBE 처리된 경우와 비교하여, 동등 이상의 정도로 다양한 종류의 치료 인자를 다량 포함하고 있음을 알 수 있다.

Claims (18)

1. 줄기세포를 3차원 세포 배양에 의하여 배양하여 3차원 구조의 줄기세포 스페로이드를 생성하는 단계; 및
   상기 생성된 줄기세포 스페로이드를 진탕 배양하는 단계를 포함하고,
   상기 3차원 세포 배양은 마이크로웰 어레이 배양에 의해 수행되며,
   상기 진탕 배양하는 단계는 줄기세포 유래 세포외 소포체의 생산을 증가시키는 것인, 줄기세포 유래 세포외 소포체 (extracellular vesicle) 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 만능유도줄기세포, 및 전발생세포(progenitor cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 생산 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 50nm 내지 1 um의 평균입경을 갖는 것인, 생산 방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 스페로이드는 평균 입경이 50 um 내지 250 um인 3차원 구조의 세포 배양체인, 생산 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포 스페로이드는 평균 입경이 100 um 내지 200 um인 3차원 구조의 세포 배양체인, 생산 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 진탕 배양하는 단계는 10 내지 35rpm의 속도로 회전시키면서 수행되는 것인, 생산 방법.
9. 삭제
10. 제1항에 있어서, 상기 마이크로웰의 세포 배양 공간은 50 um 내지 250 um인, 생산 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 방법은 줄기세포 100개당 2개 내지 50개의 줄기세포 스페로이드를 생산하는 것인, 생산 방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제

Images