JP2024103800A - 歯髄由来細胞の製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒトに投与することのできる新規な歯髄由来の多能性幹細胞製剤を提供すること。【解決手段】多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞の製造方法であって，（ａ）歯髄をプロテアーゼで消化して歯髄の懸濁物を調製するステップと，（ｂ）該懸濁物を培養して，該懸濁物に含まれる多能性幹細胞を増殖させるステップと，（ｃ）該増殖させた多能性幹細胞を，第１の凍結保存液に懸濁させた状態にして凍結させるステップと，（ｄ）該凍結させた多能性幹細胞を解凍させるステップと，（ｅ）該解凍させた多能性幹細胞を，担体粒子の表面に接着させた状態で培養して，該担体粒子の表面で多能性幹細胞を増殖させるステップと，（ｆ）該担体粒子をプロテアーゼと接触させて，該担体粒子の表面に接着した多能性幹細胞を該担体粒子から分離させるステップと，（ｇ）分離させた多能性幹細胞の懸濁物を調製するステップと，を含んでなるものである，製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は，歯髄から得られる軟骨細胞分化能及び骨細胞分化能を有する多能性幹細胞に関し，例えば，かかる多能性幹細胞の製造方法に関する。
複数系統の細胞への分化能を有する幹細胞（多能性幹細胞）は，種々の組織から得られることが知られている。骨髄から単離される間葉系幹細胞はその一つであり，骨細胞，心筋細胞，軟骨細胞，脂肪細胞等，種々の細胞に分化する能力を有している（特許文献１～４）。この分化能を利用して，種々の組織における再生医療への間葉系幹細胞の応用が試みられている。例えば，心筋梗塞により壊死した心筋を再生させるために，間葉系幹細胞の心筋梗塞患者への投与が試みられ，それにより患者の心機能が改善したとの報告がなされている（非特許文献１）。
間葉系幹細胞は，上記のように，骨髄に限らず脂肪組織（特許文献５），胎盤組織及び臍帯組織（特許文献６）等，種々の組織から取得できることが知られている。
歯組織からも多能性幹細胞が取得できることは，例えば，多能性幹細胞が，歯髄（特許文献７～１１），歯小嚢（特許文献１２），歯嚢（特許文献１１，１３），歯乳頭（特許文献１４），歯根膜（特許文献１５）等から取得できることが報告されている。歯組織に由来する多能性幹細胞は，一般に脂肪細胞への分化能を有するとされている（非特許文献２～４）。
歯髄からの多能性幹細胞の取得は，概ね以下の手順で行われる（特許文献１６）。抜歯体を破砕して得られた組織をＩ型コラゲナーゼとディスパーゼ（登録商標）で処理し，フィルターに通して細胞塊を除去し，細胞の懸濁液を得る。次いで細胞を，２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて細胞培養プレート内で増殖させる。細胞培養プレートの内面に固着して増殖した細胞を，トリプシン処理して剥がし，これを回収する。こうして回収された細胞が歯髄由来の多能性幹細胞であるとされている。なお，ディスパーゼは，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ由来の中性プロテアーゼである。
歯髄は，歯の歯髄腔を満たす疎線維性結合組織であり，存在部位により冠部歯髄と根部歯髄に区分される。また，歯組織に由来する多能性幹細胞は，一般に脂肪細胞への分化能を有するとされる一方（非特許文献２～４），歯髄由来の幹細胞は，脂肪細胞に分化しないとの報告がある（特許文献８）。すなわち，歯髄から取得される幹細胞には，脂肪細胞への分化能の有無により区別される少なくとも２つのタイプが存在する可能性がある。また，乳歯の歯髄から取得される幹細胞は，永久歯の歯髄から取得されるものと比較して，高い増殖能を有し，ＦＧＦ２，ＴＧＦ－β，コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩを高発現する等，永久歯の歯髄に存在する幹細胞とは性状が異なることも報告されている（特許文献１６）。その他，歯髄由来の多能性幹細胞は，骨芽細胞への分化誘導に関し，骨髄由来の間葉系幹細胞と性質が異なることを示す報告もある（特許文献１１）。
歯髄由来の多能性幹細胞は，神経疾患治療剤としての使用等の臨床応用が期待されている（特許文献１７）。
米国特許第５４８６３５９号 米国特許第５８２７７４０号 米国特許第６８３５３７７号 米国特許第６３８７３６９号 特開２００４－１２９５４９ 特開２００４－２１０７１３ 特開２０１０－２５２７７８ ＷＯ２００２／００７６７９ 特表２００８－５０７９６２ ＷＯ２００９／０７２５２７ 特開２００４－２０１６１２ 特表２００９－５２７２２３ 特表２００５－５１６６１６ 特開２００６－２３８８７５ 特開２００８－２９５４２０ 特開２０１０－２６８７１５ 特開２０１１－２１９４３２
Ｋａｔｒｉｔｓｉｓ ＤＧ．ｅｔ． ａｌ．，Ｃａｔｈｅｔｅｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｉｎｔｅｒｖ．６５（３）：３２１－９（２００５） Ｇｒｏｎｔｈｏｓ Ｓ．ｅｔ． ａｌ．，Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ．８１（８）：５３１－５（２００２） Ｔｉｒｉｎｏ Ｖ．ｅｔ． ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．７（３）：６０８－１５（２０１１） Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ ＶＲ ｅｔ． ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｓｅｒｖ Ｄｅｎｔ．１６（５）：４２３－８（２０１３）
本発明の一目的は，脳梗塞の治療などに有用な，ヒトに投与することのできる新規な歯髄由来の多能性幹細胞製剤を提供することである。本発明の他の目的は，かかる多能性幹細胞を市場に十分な量で安定供給できるよう，歯髄由来の多能性幹細胞を効率よく製造するための方法を提供することである。また本発明の更なる目的は，当該細胞を，流通や保管に適した安定性が維持できる形で製造することである。
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，ヒトの抜歯体から取得した歯髄組織から多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞を効率よく製造する方法を見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞の製造方法であって，
（ａ）歯髄をプロテアーゼで消化して歯髄の懸濁物を調製するステップと，
（ｂ）該懸濁物を培養して，該懸濁物に含まれる多能性幹細胞を増殖させるステップと，
（ｃ）該増殖させた多能性幹細胞を，第１の凍結保存液に懸濁させた状態にして凍結させるステップと，
（ｄ）該凍結させた多能性幹細胞を解凍させるステップと，
（ｅ）該解凍させた多能性幹細胞を，担体粒子の表面に接着させた状態で培養して，該担体粒子の表面で多能性幹細胞を増殖させるステップと，
（ｆ）該担体粒子をプロテアーゼと接触させて，該担体粒子の表面に接着した多能性幹細胞を該担体粒子から分離させるステップと，
（ｇ）分離させた多能性幹細胞の懸濁物を調製するステップと，
を含んでなるものである，製造方法。
２．該ステップ（ｃ）又は（ｄ）において，該多能性幹細胞の品質検査が行われるものである，上記１に記載の製造方法。
３．該品質検査が，該第１の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取した細胞，該第１の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取し継代させた細胞，該第１の凍結保存液に懸濁させ分取した凍結前の細胞，分取し凍結させて解凍した直後の細胞，及び／又は分取し凍結させ解凍し更に培養して得られた細胞に対して，行われるものである，上記２に記載の製造方法。
４．該品質検査が，下記品質検査ａ～ｊの１又は２以上について行われるものである，上記３に記載の製造方法：
品質検査ａ：光学顕微鏡下で観察したとき，細胞全体に占める略紡錘形の形態を示す細胞数の割合が，９９％以上，９９．５％以上，９９．９％以上，又は９９．９５％以上であることの検証；
品質検査ｂ：細胞の生存率が，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，又は９５％以上であることの検証；
品質検査ｃ：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４が陰性であることの検証；
品質検査ｄ：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性であることの検証；
品質検査ｅ：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となることの検証，又は，
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０が陰性，ＣＤ８０が陰性，ＣＤ８６が陰性，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性であることのうち，少なくとも何れかの検証；
品質検査ｆ：細胞が，プロスタグランジンＥ２及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し，且つプロスタグランジンＥ２にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することによりその発現量が増加することの検証；
品質検査ｇ：軟骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量が増加することの検証；
品質検査ｈ：骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加することの検証；
品質検査ｉ：細胞培養プレート上で１０回以上，１４回以上，又は１５回以上の細胞分裂能を有することの検証；
品質検査ｊ：細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間が，該品質検査ｉの実施期間において，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であることの検証。
５．ステップ（ｇ）において，該懸濁物をろ過膜に負荷し，通過した細胞を回収することを更に含んでなる，上記１乃至４の何れかに記載の製造方法。
６．該ろ過膜が，２０μｍ～８０μｍの孔径を有するものである，上記５に記載の製造方法。
７．該歯髄がヒトの永久歯又は乳歯から得られたものである，上記１乃至６の何れかに記載の製造方法。
８．ステップ（ａ）において用いられるプロテアーゼが，セリンプロテアーゼ，メタロプロテアーゼ又はこれらの混合物を含むものである，上記１乃至７の何れかに記載の製造方法。
９．ステップ（ａ）において用いられるプロテアーゼが，メタロプロテアーゼを含むものである，上記１乃至７の何れかに記載の製造方法。
１０．ステップ（ａ）において用いられるプロテアーゼが，マトリックスメタロプロテアーゼ，中性メタロプロテアーゼ又はこれらの混合物を含むものである，上記１乃至７の何れかに記載の製造方法。
１１．ステップ（ａ）において用いられるプロテアーゼが，コラゲナーゼと中性メタロプロテアーゼを含むものである，上記１乃至７の何れかに記載の製造方法。
１２．該コラゲナーゼが，コラゲナーゼＩ，コラゲナーゼＩＩ，又はこれらの混合物を含むものである，上記１１に記載の製造方法。
１３．該中性メタロプロテアーゼが，テルモリシン，ディスパーゼ，又はこれらの混合物を含むものである，上記１０又は１１に記載の製造方法。
１４．ステップ（ｃ）において用いられる第１の凍結保存液が，重炭酸リンゲル液，ヒト血清アルブミン，及びＤＭＳＯを含んでなるものである，上記１乃至１３の何れかに記載の製造方法。
１５．ステップ（ｅ）において用いられる担体粒子が，膨潤状態において８０～３００μｍの直径を有する略球形の形状を有するものである，上記１乃至１４の何れかに記載の製造方法。
１６．該担体粒子が，膨潤状態において該担体粒子の表面に開口する孔径３～４０μｍの孔を有する多孔性のものである，上記１５に記載の製造方法。
１７．該担体粒子が，ゼラチンを含んでなるものである，上記１乃至１６の何れかに記載の製造方法。
１８．ステップ（ｆ）において用いられるプロテアーゼが，セリンプロテアーゼ，メタロプロテアーゼ，又はその混合物を含むものである，上記１乃至１７の何れかに記載の製造方法。
１９．ステップ（ｆ）において用いられるプロテアーゼが，トリプシンを含むものである，上記１乃至１７の何れかに記載の製造方法。
２０．（ｈ）ステップ（ｇ）で得られた該懸濁物を，第２の凍結保存液に懸濁させた状態にして凍結させるステップ，
を更に含んでなるものである，上記１乃至１９の何れかに記載の製造方法。
２１．ステップ（ｈ）において用いられる第２の凍結保存液が，重炭酸リンゲル液，ヒト血清アルブミン，及びＤＭＳＯを含んでなるものである，上記２０に記載の製造方法。
２２．ステップ（ｇ）において，該多能性幹細胞の品質検査が行われるものである，上記１乃至１９に記載の製造方法。
２３．ステップ（ｇ）又は（ｈ）において，該多能性幹細胞の品質検査が行われるものである，上記２０又は２１に記載の製造方法。
２４．該品質検査が，該第２の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取した細胞，該第２の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取し継代させた細胞，該第２の凍結保存液に懸濁させ分取した凍結前の細胞，分取し凍結させて解凍した直後の細胞，及び／又は分取し凍結させ解凍し更に培養して得られた細胞に対して，行われるものである，上記２２又は２３に記載の製造方法。
２５．該品質検査が，下記品質検査ａ’～ｊ’の１又は２以上について行われるものである，上記２２又は２４に記載の製造方法：
品質検査ａ’：光学顕微鏡下で観察したときに，細胞全体に占める略紡錘形の形態を示す細胞数の割合が，９９％以上，９９．５％以上，９９．９％以上，又は９９．９５％以上であることの検証；
品質検査ｂ’：細胞の生存率が，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，又は９５％以上であることの検証；
品質検査ｃ’：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５は陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４が陰性であることの検証；
品質検査ｄ’：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性であることの検証；
品質検査ｅ’：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となることの検証，
又は，細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０が陰性，ＣＤ８０が陰性，ＣＤ８６が陰性，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性であることのうち，少なくとも何れかの検証；
品質検査ｆ’：細胞が，プロスタグランジンＥ２及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し，且つプロスタグランジンＥ２にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することによりその発現量が増加することの検証；
品質検査ｇ’：軟骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量が増加することの検証；
品質検査ｈ’：骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加することの検証；
品質検査ｉ’：細胞培養プレート上で細胞が，３回以上，４回以上，又は５回以上の細胞分裂能を有することの検証；
品質検査ｊ’：細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間が，該品質検査ｉ’の実施期間において，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であることの検証。
２６．ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＣＤ１０７ｂの陽性率が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する陽性率よりも高いものである，
上記２２乃至２５の何れかに記載の製造方法。
２７．ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＣＤ３９，ＣＤ４９ａ，ＣＤ６１，ＣＤ１０７ａ，ＣＤ１０７ｂ，及びＣＤ１４３のうち少なくとも一つの陽性率が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する陽性率よりも高く，且つ
ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＣＤ１４６の陽性率が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する陽性率よりも低いものである，
上記２２乃至２６の何れかに記載の製造方法。
２８．ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＩＬ－６，ＨＧＦ，ＩＧＦＢＰ－４，ＩＬ－１１，ＴＩＭＰ－３，及びＴＩＭＰ－２の少なくとも一つの発現量が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する発現量よりも高いものである，上記２２乃至２７の何れかに記載の製造方法。
２９．上記１乃至２８の何れかに記載の製造方法で得られる細胞。
３０．ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性である，上記２９に記載の細胞。
３１．ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である，上記３０に記載の細胞。
３２．インターフェロンγにより刺激されたときＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となるものである，上記３１に記載の細胞。
３３．以下の（１）～（４）の少なくとも一つで示される特徴を有する歯髄由来多能性幹細胞：
（１）ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であり，インターフェロンγにより刺激されたときＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となるものであり，プロスタグランジンＥ２及び／又は血管内皮増殖因子を発現し，プロスタグランジンＥ２にあっては，ＴＮＦαにより刺激されたとき発現量が増加すること；
（２）ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性であること；
（３）ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つが陽性であり，ＣＤ１９，ＣＤ３４，及びＣＤ２０６の少なくとも一つが陰性であること；
（４）ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つが陽性であり，ＣＤ１９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５，ＣＤ２０６，ＣＤ２３５ａ，及びＳＳＥＡ－１の少なくとも一つが陰性であること。
３４．骨細胞及び軟骨細胞への分化能を有する，上記３３に記載の細胞。
３５．細胞を培地中に浮遊させた状態でのその平均直径が１６～２０μｍである，上記３３又は３４に記載の細胞。
３６．ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，３回以上の細胞分裂能を有し，且つ，平均倍化時間が９６時間以内であるものである，上記３３乃至３５の何れかに記載の細胞。
３７．以下の特徴を有する上記３３乃至３５の何れかの歯髄由来多能性幹細胞：
ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，１０回以上，１５回以上，１６回以上，又は１７回以上の細胞分裂を経たものであり，且つ，その細胞分裂の平均時間が４８時間以内であるものであり；
ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，１０回以上，１４回以上，又は１５回以上の細胞分裂をする能力を有するものであり，且つ，その細胞分裂の平均時間が，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であること。
３８．以下の特徴を有する上記３３乃至３５の何れかの歯髄由来多能性幹細胞：
ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，１６回以上，２１回以上，２２回以上，又は２３回以上の細胞分裂を経たものであり；
ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，３回以上，４回以上，又は５回以上の細胞分裂をする能力を有するものであり，且つ，その細胞分裂の平均時間が，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であること。
３９．ＣＤ１９，ＣＤ２６，ＣＤ１０６，ＣＤ１１７，及びＣＤ２７１の少なくとも一つが陰性である，上記３３乃至３８の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４０．ＣＤ１４０ｂ及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つが陽性である，上記３３乃至３９の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４１．ＣＤ５６及びＣＤ１４６の少なくとも一つが陰性である，上記３３乃至４０の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４２．ＣＤ４９ｅ及びＣＤ９５の少なくとも一つが陽性である，上記３３乃至４１の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４３．ＣＤ１０，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５５，ＣＤ５８，及びＣＤ５９の少なくとも一つが陽性である，上記３３乃至４２の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４４．ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，シスタチンＣ，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＩＬ－８，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＴＩＭＰ－１，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－３の少なくとも一つを発現するものである，上記３３乃至４３の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４５．ＧＲＯα，ＶＣＡＭ－Ｉ，及びＩＰ－１０の少なくとも一つを発現するものである，上記３３乃至４４の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４６．ＩＬ－６を発現するものであり，且つその発現量がＴＮＦ－α刺激，及びインターフェロンγ刺激により増加するものである，上記３３乃至４５の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４７．ＩＬ－１１を発現するものであり，且つその発現量がＴＮＦ－α刺激，及びインターフェロンγ刺激により増加するものである，上記３３乃至４６の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４８．ＩＰ－１０を発現するものであり，且つその発現量がＴＮＦ－α刺激，及びインターフェロンγ刺激により増加するものである，上記３３乃至４７の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
４９．ＭＣＰ－１を発現するものであり，且つその発現量がＴＮＦ－α刺激，及びインターフェロンγ刺激により増加するものである，上記３３乃至４８の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
５０．ＴＮＦ－α刺激によりＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されるものである，上記３３乃至４９の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
５１．ＨＧＦを発現するものであり，且つその発現量がＴＮＦ－α刺激により減少し，及びインターフェロンγ刺激により増加するものである，上記３３乃至５０の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
５２．ＩＬ－８を発現するものであり，且つその発現量がＴＮＦ－α刺激により増加するものである，上記３３乃至５１の何れかの歯髄由来多能性幹細胞。
５３．該歯髄がヒトの永久歯又は乳歯から得られたものである，上記３３乃至５２の何れかに記載の歯髄由来多能性幹細胞。
５４．ヒト血清アルブミンとジメチルスルホキシドとを含有する重炭酸リンゲル液中に上記３３乃至５３の何れかの歯髄由来多能性幹細胞が懸濁された状態で含まれるものである，組成物。
５５．ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，マグネシウムイオン，炭酸水素イオン，クエン酸イオン，ヒト血清アルブミン，及びジメチルスルホキシドを含む溶液中に，上記３３乃至５３の何れかの歯髄由来多能性幹細胞が懸濁された状態で含まれるものである，組成物。
５６．ナトリウムイオンを９１～１１３ｍＭ，カリウムイオンを２．５２～３．０８ｍＭ，カルシウムイオンを０．９５～１．１６ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３１５～０．３８５ｍＭ，炭酸水素イオンを１５．６～１９．２ｍＭ，クエン酸イオンを１．０４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンを４６～５６ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを９～１１％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含むものである，上記５５の組成物。
５７．アセチルトリプトファン又はその塩及びカプリル酸又はその塩を更に含むものである，上記５４乃至５６の何れかの組成物。
５８．歯髄由来多能性幹細胞を，５×１０６～８×１０７個／ｍＬの密度で含むものである，上記５４乃至５７の何れかの組成物。
５９．容器に１～２０ｍＬの量で封入されたものである，上記５４乃至５８の何れかの組成物。
６０．該容器がガラス又はプラスチック製である，上記５９の組成物。
６１．凍結状態のものである，上記５４乃至６０の何れかの組成物。
６２．上記５４乃至６１の何れかの組成物を含むものである，医薬組成物。
６３．自己免疫疾患，炎症性疾患，間節リウマチ，クローン病，慢性炎症性腸疾患，心筋梗塞，脳梗塞（慢性期脳梗塞，急性期脳梗塞を含む），慢性炎症性脱髄性多発性神経炎，多発性硬化症，全身性エリテマトーデス，肝硬変（非代償性肝硬変を含む），敗血症，骨関節炎，乾癬，及び器官移植片拒絶からなる群より選択される疾患の治療剤である，上記６２の医薬組成物。
６４．自己免疫疾患，炎症性疾患，間節リウマチ，クローン病，慢性炎症性腸疾患，心筋梗塞，脳梗塞（慢性期脳梗塞，急性期脳梗塞を含む），慢性炎症性脱髄性多発性神経炎，多発性硬化症，全身性エリテマトーデス，肝硬変（非代償性肝硬変を含む），敗血症，骨関節炎，乾癬，及び器官移植片拒絶からなる群より選択される疾患の治療に使用するための，上記６２の医薬組成物。
本発明によれば，脳梗塞の治療などに有用な，ヒトに投与することのできる新規な歯髄由来の多能性幹細胞製剤が提供される。また本発明によれば，ヒトに投与し得る，かかる多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞（多能性幹細胞富化歯髄由来細胞）を効率よく製造できるため，これを有効成分として含有してなる医薬品を，需要に応じて安定供給することが可能となる。また安定な形で多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を提供できることから，流通や保管での品質劣化のおそれも回避できる。
図１は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体及び歯髄由来細胞製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞（中間体細胞，及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞）における細胞粒子径の測定結果の平均を示すグラフである。縦軸は平均粒子径（μｍ）を示す。左から順に，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の平均粒子径を示す。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。 図２は，実施例７及び実施例１６で得られた歯髄由来細胞の骨細胞分化能試験の結果を示すグラフである。縦軸はカルシウム濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。中間体細胞（実施例７）及び歯髄由来細胞製剤中の細胞（実施例１６）のそれぞれについて，黒棒は骨細胞分化誘導群，白棒はコントロール群の細胞から遊離したカルシウム濃度を示す。 図３は，実施例７及び実施例１６で得られた歯髄由来細胞の軟骨細胞分化能試験の結果を示すグラフである。縦軸はアグリカン（ＡＣＡＮ）のＣｔ値を示す。中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤中の細胞のそれぞれについて，黒棒は軟骨細胞分化誘導群，白棒はコントロール群の細胞のアグリカン（ＡＣＡＮ）のＣｔ値を示す。 図４は，実施例７及び実施例１６で得られた歯髄由来細胞の表面抗原の測定結果を示すグラフである。縦軸は陽性細胞の比率（％）を示す。中間体細胞（黒棒）及び歯髄由来細胞製剤中の細胞（白棒）のそれぞれについて，左から順に，ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の陽性細胞の比率を示す。 図５は，実施例７で得られた中間体に含まれる歯髄由来細胞（中間体細胞）の表面抗原の測定結果を示すグラフである。縦軸は陽性細胞の比率（％）を示す。左から順に，ＣＤ９，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ５５，ＣＤ５８，ＣＤ５９，ＣＤ６３，ＣＤ７３，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ９８，ＣＤ１４０ｂ，ＣＤ１４７，ＣＤ１５１，ＣＤ１６４，ＣＤ１６６，ＥＧＦ－Ｒ（上皮成長因子受容体），及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ（ヒト白血球抗原－Ａ，Ｂ，Ｃ）の陽性細胞の比率をそれぞれ示す。値には平均値を用い，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝９）。 図６は，実施例１６で得られた歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の表面抗原の測定結果を示すグラフである。縦軸は陽性細胞の比率（％）を示す。左から順に，ＣＤ９，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ４９ｅ，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ５５，ＣＤ５８，ＣＤ５９，ＣＤ６３，ＣＤ７３，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ９５，ＣＤ９８，ＣＤ１４０ｂ，ＣＤ１４７，ＣＤ１５１，ＣＤ１６４，ＣＤ１６６，ＥＧＦ－Ｒ，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの陽性細胞の比率を示す。値には平均値を用い，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝７）。 図７は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤との間で，それらに含まれる歯髄由来細胞における陽性率の差が１０％以上であった表面抗原につき，それらの差（製剤での陽性率（％）－中間体での陽性率（％））を示すグラフである。左から順に，ＣＤ３９，ＣＤ４９ａ，ＣＤ６１，ＣＤ１０７ａ，ＣＤ１０７ｂ，ＣＤ１４３，及びＣＤ１４６での結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝７）。 図８は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体及び製剤中の歯髄由来細胞のＶＥＧＦ分泌能試験の結果を示すグラフである。縦軸は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌量（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。 図９は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体及び製剤中の歯髄由来細胞のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）分泌能試験の結果を示すグラフである。縦軸はＰＧＥ２の分泌量（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。黒棒はＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）刺激群，白棒はＴＮＦα無刺激群での結果をそれぞれ示す。 図１０は，実施例７及び実施例１６で得られた歯髄由来細胞のキヌレニン分泌能試験の結果を示すグラフである。縦軸は中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤中の細胞のそれぞれについてキヌレニンの分泌量（ｎｇ／１×１０５細胞）を示す。 図１１Ａは，実施例７で得られた中間体歯髄由来細胞の低免疫原性試験の結果を示すグラフである。縦軸は陽性細胞の比率（％）を示す。黒棒はＩＦＮγ（インターフェロンγ）無刺激群，白棒はＩＦＮγ刺激群での結果を示す。左から順に，ＭＨＣ（主要組織適合性）クラスＩ抗原，ＭＨＣ（主要組織適合性）クラスＩＩ抗原，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６の陽性細胞の比率を示す。 図１１Ｂは，実施例１６で得られた製剤中の歯髄由来細胞の低免疫原性試験の結果を示すグラフである。縦軸は陽性細胞の比率（％）を示す。黒棒はＩＦＮγ無刺激群，白棒はＩＦＮγ刺激群での結果を示す。左から順に，ＭＨＣ－クラスＩ抗原，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６の陽性細胞の比率を示す。 図１２は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体及び製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞の無刺激時における，培養上清中のサイトカイン等の各種因子の濃度の測定結果を示すグラフである。縦軸は各種因子の濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体細胞（黒棒）及び歯髄由来細胞製剤中の細胞（白棒）のそれぞれについて，左から順に，ＭＭＰ－２（マトリックスメタロプロテアーゼ－２），ＩＧＦＢＰ－４（インスリン様成長因子結合タンパク質－４），及びシスタチンＣ（ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ）の濃度を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１３は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞の無刺激時における培養上清中のサイトカイン等の各種因子の濃度の測定結果を示すグラフである。縦軸は各種因子の濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体細胞（黒棒）及び歯髄由来細胞製剤中の細胞（白棒）のそれぞれについて，左から順に，ＩＬ－６（インターロイキン－６），ＩＬ－１１（インターロイキン－１１），ＭＣＰ－１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ－１），ＩＬ－８（インターロイキン－８），ＧＲＯα（Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ），ＨＧＦ（肝細胞増殖因子），ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子），ＶＣＡＭ－１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１），ＴＩＭＰ－３（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３），ＴＩＭＰ－２（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２），及びＴＩＭＰ－１（Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）の濃度を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１４は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞の無刺激時における培養上清中のサイトカイン等の各種因子の濃度の測定結果を示す図である。縦軸は各種因子の濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，ＩＬ－２３（インターロイキン－２３），ＩＬ－２１（インターロイキン－２１），ＩＦＮ－α（インターフェロン－α），ＴＮＦ－α，ＩＬ－１８（インターロイキン－１８），ＩＬ－３３（インターロイキン－３３），ＩＬ－２７（インターロイキン－２７），ＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ―ｒｅｇｌｕａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ），ＥＮＡ－７８（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－７８），ＭＩＰ－３α（マクロファージ炎症性蛋白質－３α），ＭＩＰ－１β（マクロファージ炎症性蛋白質－１β），Ｅｏｔａｘｉｎ，ＩＰ－１０（インターフェロンγ誘導タンパク質－１０），ＭＩＰ－１α（マクロファージ炎症性蛋白質－１α），ＭＩＧ（Ｍｏｎｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇａｍｍａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ），Ｉ－ＴＡＣ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｌｐｈａ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ），ＳＣＦ（幹細胞因子），ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球単球コロニー刺激因子），及びＩＣＡＭ－１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｕｅ―１）の濃度を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１５は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤との間で，それらに含まれる歯髄由来細胞の無刺激時における培養上清中のサイトカイン等の各種因子のうち，製剤での濃度が中間体より高かったものについて，それらの比（製剤での濃度／中間体での濃度）を示すグラフである。左から順に，ＩＬ－６，ＩＬ－２３，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＥＮＡ－７８，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，シスタチンＣ，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１の濃度比を示す。値には平均値を用い，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１６は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＩＬ－６の濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群での濃度を示す。値には平均値を用い，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１７は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＩＬ－１１の濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群の結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１８は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＩＰ－１０の濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群の結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図１９は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＭＣＰ－１の濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群の結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図２０は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＧＭ－ＣＳＦの濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群での結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図２１は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＨＧＦの濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群での結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図２２は，実施例７及び実施例１６で得られた中間体と製剤のそれぞれに含まれる歯髄由来細胞について，無刺激，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激のそれぞれの群における培養上清中のＩＬ－８の濃度を示すグラフである。縦軸は濃度（ｐｇ／１×１０５細胞）を示す。中間体（黒棒）及び製剤（白棒）のそれぞれについて，左から順に，無刺激群，ＴＮＦ－α刺激群，及びＩＦＮ－γ刺激群での結果を示す。値は平均値であり，エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。
多能性幹細胞は，自己複製能と共に２種以上の細胞への分化能をも有する細胞をいう。本発明により得られるヒト歯髄由来の多能性幹細胞は，好ましくは，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を有するものであるが，これに特に限定されるものではない。
本発明により得られる多能性幹細胞が軟骨細胞への分化能を有することは，例えば，細胞を，細胞の軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したときの，アグリカン遺伝子の発現量を定量することにより確認できる。アグリカンは，軟骨の細胞外マトリクスを構成する主要な分子であり，細胞の軟骨細胞への分化が誘導されると，発現量が増加する。この測定法において，細胞の軟骨細胞への分化を誘導する物質（軟骨細胞分化誘導物質）としては，例えば，ＴＧＦ－ｂ３を用いることができる。実施例２０に記載の測定法は，軟骨細胞への分化能の測定法の好適な一例である。
本発明により得られる多能性幹細胞が骨細胞への分化能を有することは，例えば，細胞を，細胞の骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したときの，細胞におけるカルシウムの蓄積量を定量することにより確認できる。骨細胞への分化が誘導されると，細胞にカルシウムが蓄積する。この測定法において，骨細胞への分化を誘導する物質（骨細胞分化誘導物質）としては，例えば，デキサメタゾン，β－グリセロフォスフェート，グリコサミノグリカン，アスコルビン酸，骨形成因子２（ＢＭＰ－２），及びこれらの塩を，単独で又は組み合わせて用いることができる。例えば，デキサメタゾン，アスコルビン酸塩，及びβ－グリセロフォスフェートを組み合わせたものは，骨細胞分化誘導剤として好適に用いることができる。実施例１９に記載の測定法は，骨細胞への分化能の測定法の好適な一例である。
本発明において，「多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞」又は「多能性幹細胞富化歯髄由来細胞」とは，歯髄由来であって，歯髄から直接採取される細胞に比して多能性幹細胞の占める割合（個数割合）が高められた細胞の集合をいい，歯髄から培養等による選択を経て最終的に単離された多能性幹細胞を包含する。歯髄から直接採取される細胞は，多能性幹細胞がそれ以外の細胞と混在したものである。これを培養すると，多能性幹細胞は，他の細胞と比較して増殖能が高いので，培養開始時と比較して，培養終了時には多能性幹細胞の比率が高められる。培養を繰り返すことにより，多能性幹細胞の比率はより高められることになるので，ほぼ多能性幹細胞のみを含む細胞を得ることもできる。つまり，「多能性幹細胞富化歯髄由来細胞」とは，細胞全体に占める多能性幹細胞の比率が，培養等する過程で多能性幹細胞が増殖することにより，歯髄から採取された直後におけるよりも高められた多能性幹細胞を包含する。歯髄がヒト由来のものであるものは，特に「多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞」という。
本発明において，歯髄から直接単離された多能性幹細胞，及び歯髄から培養を経て得られる多能性幹細胞富化歯髄由来細胞に含まれる多能性幹細胞は，「歯髄由来多能性幹細胞」と総称し，文脈によっては単に「歯髄由来幹細胞」又は「歯髄幹細胞」ということもある。歯髄がヒト由来のものであるものは，特に「ヒト歯髄由来多能性幹細胞」といい，単に「ヒト歯髄由来幹細胞」又は「ヒト歯髄幹細胞」ということもある。本明細書に記載の一実施形態である，「中間体に含まれる細胞（中間体細胞）」及び「歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞」は，実質的に多能性幹細胞のみを含むものであり，何れも歯髄由来多能性幹細胞である。
本発明において，検査対象の細胞集団につきその表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ある抗原が陽性であるというときは，細胞の集団を全体として観察したときに，観察した細胞のうち，好ましくは３０％以上，より好ましくは４０％以上，更に好ましくは５０％以上，より更に好ましくは６０％以上，より更に好ましくは７０％以上，より更に好ましくは８０％以上，より更に好ましくは９０％以上，特に好ましくは９５％以上が，その抗原が陽性であることを意味する。表面抗原の発現パターンは，例えば実施例２１又は２２に記載の方法で調べることができるが，これらに限られることはない。
本発明において，検査対象の細胞集団につきその表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ある抗原が陰性であるというときは，細胞の集団を全体として観察したときに，観察した細胞のうち，好ましくは２０％未満，より好ましくは１０％未満，更に好ましくは５％未満，より更に好ましくは２％未満，特に好ましくは１％未満が，その抗原が陽性であることを意味する。表面抗原の発現パターンは，例えば実施例２１又は２２に記載の方法で調べることができるが，これらに限られることはない。
本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量増加が全体として観察される。また，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加するのが全体として観察される。すなわち，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を備えている。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体（集団）として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性である。同様に，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，ＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。例えば，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３及びＣＤ９０が陽性であり，且つＣＤ３４が陰性である。また，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性である。この発現パターンは，間葉系幹細胞と共通する。
また，一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性である。例えば，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，例えば，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。これらの表面抗原マーカーが陽性の細胞は，同種異系の個体に移植したときに，抗原として認識されて生体内から排除される傾向にあることが知られている。これらの表面抗原マーカーの少なくとも一つが陰性であることは，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞が，それだけ低免疫原性の性質を有し，同種異型の個体に移植したときに生体内から排除され難い傾向を有することを示している。また，これら表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となってもよい。例えば，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６が陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となる。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。このとき，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，例えば，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となり得る。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞（歯髄由来多能性幹細胞）は，
（ａ－１）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ２９，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５９，ＣＤ７３，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ１４７，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは７０％以上，より好ましくは８０％以上，更に好ましくは９０％以上で陽性である。
また，一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ａ－２）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ９，ＣＤ４４，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ５５，ＣＤ９８，及びＥＧＦ－Ｒの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは６５％以上，より好ましくは７５％以上で陽性であり，更に好ましくは８０％以上で陽性である。
また，一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ａ－３）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ１４０ｂ，及びＣＤ１６６の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは７０％以上で陽性であり，更に好ましくは７５％以上で陽性である。
また，一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ａ－４）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ５８，ＣＤ６３，ＣＤ１０５，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６４の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは６５％以上で陽性であり，更に好ましくは７０％以上で陽性である。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，好ましくは，上記の（ａ－１），（ａ－２），（ａ－３），及び（ａ－４）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ａ－１）及び（ａ－２）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ａ－５）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１２０ｂ，ＣＤ１３２，ＣＤ１５８ａ，ＣＤ１６１，ＣＤ１８４，ＣＤ１９５，ＣＤ２０６，ＣＤ２１０，ＣＤ２１２，ＣＤ２２６，ＣＤ２４４，ＣＤ２６７，ＣＤ２７８，ＣＤ２７９，ＣＤ２８２，ＣＤ２９４，ＳＳＥＡ－１（ステージ特異的胎児抗原－１），ＴＲＡ－１－６０，ＳＳＥＡ－３（ステージ特異的胎児抗原－３），ＣＬＡ（皮膚リンパ球関連抗原），及びインテグリンβ７の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下，更に好ましくは２％以下，より更に好ましくは１％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞，
（ａ－６）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ８ｂ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２４，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６６ｆ，ＣＤ８６，ＣＤ８８，ＣＤ９４，ＣＤ１００，ＣＤ１０３，ＣＤ１１４，ＣＤ１１７，ＣＤ１１８，ＣＤ１２１ｂ，ＣＤ１２２，ＣＤ１２３，ＣＤ１２４，ＣＤ１２６，ＣＤ１２７，ＣＤ１２８ｂ，ＣＤ１３５，ＣＤ１３７，ＣＤ１３７リガンド，ＣＤ１５０，ＣＤ１６３，ＣＤ１７２ｂ，ＣＤ１７７，ＣＤ１７８，ＣＤ１８０，ＣＤ１９７，ＣＤ２２０，ＣＤ２２９，ＣＤ２３１，ＣＤ２５５，ＣＤ２６８，ＣＤ３０５，ＣＤ３１４，ＣＤ３２１，ＣＤｗ３２７，ＣＤｗ３２８，ＣＤ３２９，ＣＤ３３５，ＣＤ３３６，ＢＬＴＲ－１（ロイコトリエンＢ４受容体），ＣＬＩＰ，ＣＭＲＦ－４４，ＣＭＲＦ－５６，ｆＭＬＰ－Ｒ（Ｎ－ホルミルメチオニル－ロイシル－フェニルアラニン受容体），Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ，及びγδＴＣＲ（γδＴ細胞受容体）の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞，更に好ましくは２％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞，
（ａ－７）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｂ，ＣＤ１ｄ，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ５，ＣＤ６，ＣＤ７，ＣＤ８ａ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１５，ＣＤ１８，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２５，ＣＤ２６，ＣＤ２７，ＣＤ２８，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３５，ＣＤ３７，ＣＤ３８，ＣＤ４０，ＣＤ４１ａ，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ４８，ＣＤ５０，ＣＤ５３，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６４，ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ），ＣＤ６９，ＣＤ７０，ＣＤ７２，ＣＤ８０，ＣＤ８４，ＣＤ８５，ＣＤ８７，ＣＤ８９，ＣＤｗ９３，ＣＤ９７，ＣＤ１０６，ＣＤ１３４，ＣＤ１３８，ＣＤ１４４，ＣＤ１５４，ＣＤ１５８ｂ，ＣＤ１６２，ＣＤ１８３，ＣＤ２０５，ＣＤ２３５ａ，ＣＤ２７１，ＣＤ３０９，ＣＤ３２６，ＣＤ３３７，αβＴＣＲ（αβＴ細胞受容体），及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したとき，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞，好ましくは，上記の（ａ－１），（ａ－２），（ａ－３），（ａ－４），（ａ－５），（ａ－６），及び（ａ－７）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ａ－１）及び（ａ－５）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，例えば，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その発現量が増加する。ＶＥＧＦは，血管新生作用を有する物質であることから，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをヒトに投与することにより，ＶＥＧＦを介して体内で血管の形成を促進することができるので，血管新生作用を発揮させるべき疾患の治療剤として用いることができる。また，ＰＧＥ２は強力な抗炎症作用を有することから，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをヒトに投与することにより，ＰＧＥ２を介して体内で炎症部位に作用し，炎症に伴う組織破壊を抑制することができるので，炎症に伴う組織破壊の抑制剤として用いることができる。但し，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞の効果は，ＶＥＧＦとＰＧＥ２を介して発揮されるものに限定されるものではない。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，ＩＦＮ―γの存在下で培養したときに，キヌレニンの分泌量を増加させるものである。キヌレニンはＴ細胞の増殖を抑制するとともに，単球を抗炎症性のＭ２マクロファージに分化させることができる。従って，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをヒトに投与することにより，キヌレニンを介して抗炎症作用を発揮することができる。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３４，及びＣＤ２０６の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。また，本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５，ＣＤ２０６，ＣＤ２３５ａ，及びＳＳＥＡ－１の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１９，ＣＤ２６，ＣＤ１０６，ＣＤ１１７，及びＣＤ２７１の少なくとも一つ，例えばこれらの全てが陰性である。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１４０ｂ，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つ，例えばこれらの全てが陽性である。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５５，ＣＤ５８，及びＣＤ５９の少なくとも一つ，例えばこれらの全てが陽性である。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。
本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。このとき，ＩＦＮ―γで細胞を刺激したときに，例えば，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。そして，プロスタグランジンＥ２及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，プロスタグランジンＥ２にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その分泌量が増加する。更に，ＩＦＮ―γで刺激することにより，キヌレニンの分泌量が増加する。
本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを培養したときに，種々の液性因子を分泌するものである。
（ａ－８）一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを培養したときに，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，及びシスタチンＣの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ａ－９）一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＩＬ－８，ＧＲＯα，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＶＣＡＭ－Ｉ，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ａ－１０）また，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－２３，ＴＮＦ－α，ＩＬ－１８，ＩＬ－３３，ＩＬ－２７，ＴＡＲＣ，ＥＮＡ－７８，ＭＩＰ－３α，ＭＩＰ－１β，ＩＰ－１０，ＳＣＦ，及びＩＣＡＭ－１の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ａ－１１）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－２１，エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ），ＭＩＰ－１α，ＭＩＧ，Ｉ－ＴＡＣ，及びＧＭ－ＣＳＦの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現しないか，ほとんど発現しないものである。
（ａ－１２）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－６の発現量が増加するものである。
（ａ－１３）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－１１の発現量が増加するものである。
（ａ－１４）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＰ－１０の発現量が増加するものである。
（ａ－１５）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＭＣＰ－１の発現量が増加するものである。
（ａ－１６）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，ＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されるが，ＩＦＮ－γ存在下で培養したときには，ＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されないものである。
（ａ－１７）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＨＧＦの発現量が減少する一方，これをＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＨＧＦの発現量が増加するものである。
（ａ－１８）また，一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－８の発現量が増加するものである。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞，好ましくは，上記の（ａ－８）乃至（ａ－１８）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくは４以上，なおも更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ａ－８）及び（ａ－１４）で示される特徴を有する細胞，上記の（ａ－８），（ａ－１３）及び（ａ－１４）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，ほとんどが歯髄由来多能性幹細胞で占められているものであってよい。平面培養中の歯髄由来多能性幹細胞は，光学顕微鏡下で，多くの場合，細胞培養プレート上で略紡錘形の固着細胞として観察される。但し，培養条件によっては，必ずしも紡錘形の固着細胞として観察されるものとは限らない。
本発明において「歯髄」というときは，血管，神経及びリンパ管を含む結合組織と，辺縁部において，象牙質の内側からの沈積と修復を行う能力のある象牙芽細胞層からなる，歯の歯髄腔を満たす疎線維性結合組織のことをいう。また歯髄は，存在部位により冠部歯髄と根部歯髄に区分することができるが，本発明において歯髄というときは，少なくとも冠部歯髄又は根部歯髄いずれか一方を含むものをいう。また，本発明において用いられる歯髄の由来する動物種に特に制限はないが，動物種は，好ましくは哺乳動物であり，より好ましくは霊長類であり，更に好ましくはヒトである。
歯髄を取得するための歯は，永久歯でも乳歯でもよく，また，切歯，犬歯，小臼歯，及び大臼歯のいずれであってもよい。かかる歯は，虫歯等に罹患していない健康な歯であることが好ましい。例えば，施術により抜歯された健康な抜歯体は，本発明において好適に用いることができる。特に第３大臼歯は，１個当たりの歯から得られる歯髄の量が多く，又，歯の矯正等の理由により，健康な状態のものが抜歯体として入手容易なことから，特に好適に使用できる。ここで，歯が取得されたヒトの年齢に特に限定はないが，１０歳から５０歳までのヒトから取得された歯であることが好ましく，１５歳から４５歳までのヒトから取得された歯であることがより好ましい。また，歯が取得されるヒトの性別にも特に制限はない。
歯髄を取得するための歯は，好ましくは抜歯後７２時間以内，より好ましくは抜歯後２４時間以内のもの，更に好ましくは抜歯後１２時間以内のものが用いられる。抜歯体は，重炭酸リンゲル液等で洗浄された後，殺菌剤で殺菌処理される。このとき用いられる殺菌剤に特に限定はないが，グラム陽性菌とグラム陰性菌の何れにも抗菌作用を示すものが好ましく，例えば，１％クロルヘキシジングルコン酸塩溶液が用いられる。
歯髄は，抜歯体を機械的に破砕することにより歯髄を露出させることにより，抜歯体から取得することができる。抜歯体から取り出した歯髄は，好ましくはハサミ等の器具を用いて細断された後，プロテアーゼにより消化される。
プロテアーゼで消化することにより，抜歯体から取得された歯髄から，歯髄を構成する個々の細胞が遊離する。このとき用いられるプロテアーゼは，セリンプロテアーゼ，メタロプロテアーゼ，又はこれらの混合物を含むものが好ましいが，これらに特に限定されるものではなく，歯髄を構成する個々の細胞を遊離させることのできるプロテアーゼ，すなわち蛋白質性の細胞接着分子を分解できるものであればよい。
このとき好適に用いられるメタロプロテアーゼとしては，マトリックスメタロプロテアーゼ，中性メタロプロテアーゼ，又はこれらの混合物が挙げられる。マトリックスメタロプロテアーゼとしては，コラゲナーゼ，ゼラチナーゼ，又はこれらの混合物が好適に使用できる。また，コラゲナーゼとしては，コラゲナーゼＩ，コラゲナーゼＩＩ，又はこれらの混合物が好ましい。中性メタロプロテアーゼとしては，テルモリシン（サーモリシン），ディスパーゼ，又はこれらの混合物が好適に使用できる。
好ましいプロテアーゼの組み合わせの一例として，コラゲナーゼＩ，コラゲナーゼＩＩ，及びテルモリシンの混合物が挙げられる。この混合物をプロテアーゼとして使用する場合，反応液中のプロテアーゼの活性は，好ましくは０．１７～１．３３単位／ｍＬに調整される。コラゲナーゼＩ，コラゲナーゼＩＩ及びテルモリシンを含有するリベラーゼ（登録商標）（ロッシュ社）は，プロテアーゼとして好適に使用できる。
コラゲナーゼタイプＩＩとディスパーゼの混合液を用いる場合，コラゲナーゼタイプＩＩとディスパーゼの濃度はそれぞれ，好ましくは１～２ｍｇ／ｍＬと３０００～７０００単位／ｍＬ，より好ましくは約１．５ｍｇ／ｍＬと約５０００単位／ｍＬである。
抜歯体から取得された歯髄をプロテアーゼにより消化する際の好適な反応温度は，３５～３７．５℃であり，また好適な反応時間は３０分～３時間である。例えば，歯髄はプロテアーゼにより３７℃で２時間処理される。但し，反応温度及び反応時間は，プロテアーゼの種類，濃度等によって適宜調整されるべきものである。
プロテアーゼにより消化させた歯髄は，歯髄を構成する個々の細胞を歯髄から遊離させるため，ピペッティング等の機械的な手段により解体することができる。このとき，機械的な手段により歯髄を解体する前に，プロテアーゼを不活化させておくことが好ましい。これは反応溶液にプロテアーゼを不活化させる成分を添加することにより行うことができ，そのような成分としては，ＥＤＴＡ等のキレート剤，ＦＢＳを含有する細胞培養用培地等がある。歯髄を解体することにより，溶液中に歯髄を構成する細胞等が浮遊状態で存在する懸濁物が得られる。この懸濁物には，歯髄から遊離した多能性幹細胞が含まれる。プロテアーゼを上清とともに除去するため，この懸濁物を一旦遠心して細胞等の不溶物を沈殿させることが好ましい。沈殿させた細胞等は，上清を除去した後，再び懸濁される。再懸濁に用いる溶液としては，例えば，ＦＢＳを含有する細胞培養用培地を用いることができる。このようにして得られる歯髄の懸濁物には，歯髄から遊離した細胞に加え，歯髄の組織片も含まれる。
歯髄の解体物を細胞培養用培地に懸濁させた歯髄懸濁物は，細胞培養プレートに添加して，該プレート上で培養される。これに用いられる細胞培養用培地は，好ましくは，ウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地である。培地に添加されるウシ胎児血清の濃度（ｖ／ｖ％）は，好ましくは８～２５％であり，より好ましくは１０～２５％であり，例えば，２０％である。ダルベッコの修飾イーグル培地（ウシ胎児血清添加前）の詳細な組成の一例を表１に示す。適宜，３～５ｍＭ，例えば４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを培地に添加することもできる。また，所望により，ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。ストレプトマイシンを培地に添加する場合，培地中でその濃度が，１０ｍｇ／Ｌ～２５０ｍｇ／Ｌとなるように，例えば１００ｍｇ／Ｌとなるように行われる。また，各成分は，その同等物，例えばその塩に，置換することが可能である。
１個の抜歯体，例えば１個の成人の第３大臼歯，から得られた歯髄の懸濁物を細胞培養プレート上で培養する場合，当該プレートの培養面積は，好ましくは０．３～４ｃｍ２であり，より好ましくは０．６～２ｃｍ２であり，例えば，１ｃｍ２である。細胞培養プレートに添加される培地の量は，培養面積１ｃｍ２当たり，好ましくは２５０μＬ～１ｍＬであり，例えば，５００μＬである。例えば，１本の成人の第３大臼歯から得られた歯髄の懸濁物を５００μＬの培地で懸濁させたものを，培養面積が１ｃｍ２の細胞培養プレート上に添加して細胞を培養する。
Figure 2024103800000001
歯髄懸濁物を細胞培養プレート上で培養するときの温度は，好ましくは３５～３７．５℃であり，例えば３７℃である。歯髄懸濁物の培養は，例えば，細胞が増殖することにより目視可能な大きさのコロニーが該プレート上に形成されるまで行われる。このときのコロニーは上方から見たときに略円形をなし，その直径は１～３ｍｍ程度であるが，これらに特に限定されることはなく，例えば，コロニーは不定型の場合もある。歯髄懸濁物の培養中，培地は，成分がある一定の範囲内に保たれるように新たなものと交換される。培地の交換は，例えば，１～６日毎，２～４日毎，１日毎，２日毎，３日毎，４日毎に行われる。培地の交換は，培地の全量を新しい培地に交換してもよく，一部を交換してもよい。培地の一部を新しい培地に交換する場合，古い培地の，例えば，１／４～４／５，１／４，１／３，１／２，又は４／５量を除去し，次いで等量の新しい培地が添加される。この培地交換の過程で，歯髄の懸濁物に含まれていた浮遊細胞，組織片等を取り除くこともできる。
歯髄の懸濁物を培養することにより細胞培養プレート上にコロニーを形成した細胞は，これをプロテアーゼで処理することにより該プレートから剥離させて回収することができる。このとき用いられるプロテアーゼに，蛋白質性の細胞接着分子を分解できるものである限り特に限定はないが，セリンプロテアーゼが好ましく，トリプシンがより好ましい。トリプシンを用いる場合，その濃度は，好ましくは０．１～０．５％（ｗ／ｖ）であり，より好ましくは０．２５％（ｗ／ｖ）である。
上記プレートより回収された細胞は，細胞培養用培地に懸濁させてから細胞培養プレートに添加され，該プレート上で培養が開始される。これを初回の細胞培養という。このとき用いられる培地は，好ましくは，ウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地である。培地に添加されるウシ胎児血清の濃度（ｖ／ｖ％）は，好ましくは８～２５％であり，より好ましくは８～２０％であり，例えば，１０％である。ダルベッコの修飾イーグル培地（ウシ胎児血清添加前）の詳細な組成の一例を表１に示す。適宜，３～５ｍＭ，例えば４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを培地に添加することもできる。また，所望により，ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよいが，通常は，培地に抗生物質は添加しない。ストレプトマイシンを培地に添加する場合，濃度が，１０ｍｇ／Ｌ～２５０ｍｇ／Ｌとなるように，例えば１００ｍｇ／Ｌとなるように添加する。また，各成分は，その同等物，例えばその塩に，置換することが可能である。
上記の初回の細胞培養の開始に際し，細胞は，細胞培養プレート上での生細胞密度が，好ましくは２０００～３００００細胞／ｃｍ２となるように，より好ましくは３０００～２００００細胞／ｃｍ２となるように，例えば，３０００細胞／ｃｍ２，５０００細胞／ｃｍ２，１００００細胞／ｃｍ２，２００００細胞／ｃｍ２となるように添加される。細胞の培養中，培地は，成分がある一定の範囲内に保たれるように，交換される。このとき，培地の交換は，例えば，１～６日毎，２～４日毎，１日毎，２日毎，３日毎，又は４日毎に行われる。培地の交換は，培地の全量を新しい培地に交換してもよく，一部を交換してもよい。培地の一部を新しい培地に交換する場合，古い培地の，例えば，１／４～４／５，１／４，１／３，１／２，又は４／５量を除去し，次いで等量の新しい培地が添加される。この培地交換の過程で，元の細胞に含まれていた浮遊細胞等が取り除かれる結果，細胞培養プレートに固着した細胞が選択される。
初回の細胞培養は，細胞培養プレート上の細胞が，好ましくは，ほぼコンフルエントとなるまで行われる。例えば，培養は，細胞培養プレートの細胞が固着できる面の８５％以上，９０％以上，又は９５％以上が細胞で占められる状態になるまで行われる。細胞培養プレート上でほぼコンフルエントとなるまで培養された細胞は，これをプロテアーゼで処理することにより該プレートから剥離させて回収することができる。このとき用いられるプロテアーゼには蛋白質性の細胞接着分子を分解できるものである限り特に限定はないが，セリンプロテアーゼが好ましく，トリプシンがより好ましい。トリプシンを用いる場合，その濃度は，好ましくは０．１～０．５％（ｗ／ｖ）であり，より好ましくは０．２５％（ｗ／ｖ）である。
上記プレートより回収した細胞は，再度，細胞培養用培地に懸濁させてから細胞培養プレートに添加され，そうして該プレート上で培養される。このとき用いられる培地は，好ましくは，ウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地である。培地に添加されるウシ胎児血清の濃度（ｖ／ｖ％）は，好ましくは８～２５％であり，より好ましくは８～２０％であり，例えば，１０％である。ダルベッコの修飾イーグル培地（ウシ胎児血清添加前）の詳細な組成の一例を表１に示す。適宜，３～５ｍＭ，例えば４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを培地に添加してもよい。また，所望により，ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよいが，通常は，培地に抗生物質は添加しない。ストレプトマイシンを培地に添加する場合，ストレプトマイシンの培地中での濃度が，１０ｍｇ／Ｌ～２５０ｍｇ／Ｌとなるように，例えば１００ｍｇ／Ｌとなるように添加する。また，各成分は，その同等物，例えばその塩に，置換することが可能である。そして，細胞の培養は，細胞培養プレート上の細胞が，ほぼコンフルエントとなるまで行われる。例えば，培養は，細胞培養プレートの細胞が固着できる面の８５％以上，９０％以上，又は９５％以上が細胞で占められる状態になるまで行われる。
このようにして細胞の細胞培養プレートからの回収と細胞培養プレート上での培養を繰り返すことにより，歯髄由来細胞の細胞数を増加させることができる。また，培養中の培地交換により，浮遊細胞が取り除かれて，細胞培養プレートに固着する細胞が優先的に回収される（その結果，選択される）。歯髄由来多能性幹細胞は，細胞培養プレートに固着する性質を有するので，この過程を繰り返すことにより，多能性幹細胞が富化されることになる。すなわち，歯髄懸濁物を細胞培養プレート上で培養する工程，そして培養後に該プレートから回収する工程を経た細胞は，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞である。そうして，細胞の細胞培養プレートからの回収と培養を繰り返すことにより，より一層，多能性幹細胞が富化されることになる。
細胞の細胞培養プレートからの回収と培養は，初回の細胞培養も含めて，好ましくは３～２０回，より好ましくは３～８回，更に好ましくは４～８回，例えば，４回，５回，６回，７回又は８回繰り返される。細胞培養プレート上で増殖して得られる細胞は，初回の細胞培養終了時点で光学顕微鏡で観察したときには，その多くが略紡錘形の形態を示す多能性歯髄由来細胞であるものの，それ以外の細胞も含まれる。細胞の細胞培養プレートからの回収と培養を３回繰り返すことにより，多能性歯髄由来細胞でほぼ占められるようになるまで，歯髄由来多能性幹細胞が富化される。細胞培養プレートからの細胞の回収と培養を５回以上繰り返すと，益々，歯髄由来多能性幹細胞が富化されて，光学顕微鏡下で観察したときに略紡錘形の形態を示す多能性歯髄由来細胞以外の細胞は，ほとんど観察されなくなる。つまり，細胞の細胞培養プレートからの回収と培養を５回以上繰り返すことにより，歯髄由来多能性幹細胞が実質的に単離されることになる。
こうして得られる多能性幹細胞富化歯髄由来細胞に含まれる細胞全体に占める歯髄由来多能性幹細胞の比率は，好ましくは９９％以上であり，より好ましくは９９．５％以上であり，更に好ましくは９９．９％以上であり，より更に好ましくは９９．９５％以上である。歯髄由来多能性幹細胞の比率は，例えば，光学顕微鏡下で観察したときに略紡錘形の形態を示す細胞数を，全細胞数で除することにより求めることができる。
こうして得られる多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，凍結保存液に懸濁させた状態で凍結保存することができる。凍結保存の対象とするためには，細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間が，９６時間以内であることが好ましく，８４時間以内であることがより好ましく，７２時間以内であることが更に好ましく，４８時間以内であることが更により好ましく，例えば３６時間以内，２４時間以内であることが特に好ましい。平均倍化時間に基準を設け，平均倍化時間がある一定の時間以内のものを凍結保存し，その後の利用に供するようにしてもよい。かかる基準としては，例えば，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内と適宜に設定することができる。この基準値を満たさない細胞は，凍結保存することなく破棄することにより，ある一定以上の細胞分裂能を有する細胞のみを選択的に保存することができる。平均倍化時間が短いほど細胞分裂能が高い細胞といえる。
このときに用いられる凍結保存液の組成は，哺乳動物細胞，特にヒトの多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を死滅させることなく凍結，解凍できるものである限り特に制限はない。凍結保存液は細胞保護剤を含む。細胞保護剤は，例えば，細胞を凍結させるときに細胞内に氷の結晶が形成されて細胞が破壊されることを抑制する機能を有するものである。細胞保護剤として好適なものとして，ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），エチレングリコール，プロピレングリコール，セリシン，グリセロールが挙げられる。これらのうち２以上を組み合わせて細胞保護剤として使用することもできる。細胞保護剤としてジメチルスルホキシドを用いる場合，その濃度は好ましくは５～１５％（ｖ／ｖ）であり，より好ましくは９～１１％（ｖ／ｖ）であり，例えば１０％（ｖ／ｖ）である。凍結保存液は緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は，水溶液のｐＨを６～８，例えば６．８～７．８に調整することのできるものが好ましい。かかる緩衝剤としては，例えば，炭酸イオン，クエン酸イオン及びナトリウムイオンを含有するものが挙げられる。凍結保存液は更にヒト血清アルブミンを含んでもよい。ヒト血清アルブミンを用いる場合，その濃度は好ましくは４０～１００ｇ／Ｌであり，より好ましくは４６～５６ｇ／Ｌであり，例えば５１ｇ／Ｌである。後述する重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミン溶液とジメチルスルホキシドを添加したものは，凍結保存液として好適なものの一例である。なお，後述する中間体細胞用凍結保存液と製剤細胞用凍結保存液は，何れも凍結保存液である。製造工程で中間体細胞を凍結させるステップを設ける場合，便宜上，前者を第１の凍結保存液（中間体細胞用凍結保存液），後者を第２の凍結保存液（製剤細胞用凍結保存液）という。
凍結保存した多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，後述する歯髄由来細胞製剤として用いることもでき，また，（後に更に増殖させるために保存される）中間体細胞として用いることもできる。中間体細胞として多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を凍結保存する場合について，以下に詳述する。
多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を中間体細胞として凍結保存する場合（以下，「中間体細胞として細胞を凍結する場合」という。）にあっては，細胞の細胞培養プレートからの回収と培養は，初回の細胞培養も含めて，好ましくは３～８回，更に好ましくは４～８回，例えば，４回，５回，６回，７回又は８回繰り返される。
また，中間体細胞として細胞を凍結する場合にあっては，歯髄懸濁物を培養することにより細胞培養プレート上に形成されたコロニーから回収した細胞は，細胞を凍結するまでに細胞培養プレート上で培養して，１０回以上分裂させることが好ましく，１５回以上分裂させることがより好ましい。例えば，１３～２０回，１３～２３回，１４～２０回分裂させた細胞が凍結保存される。理論上，１５回分裂させることにより，細胞数は３×１０４倍以上にまで増加する。
また，中間体細胞として細胞を凍結する場合にあっては，１個の抜歯体（例えば１個の第三大臼歯）から得られる細胞の数が，通常，好ましくは，３×１０５個以上となるまで，より好ましくは１×１０６個以上となるまで，更に好ましくは１×１０９個以上となるまで，細胞を増殖させる。
また，中間体細胞としての凍結保存の対象となるには，細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間は，９６時間以内であることが好ましく，８４時間以内であることがより好ましく，７２時間以内であることが更に好ましく，４８時間以内であることが更により好ましく，例えば２４時間以内，３６時間以内であることが特に好ましい。平均倍化時間に基準を設け，平均倍化時間がある一定の時間以内のものを凍結保存し，その後の利用に供するようにしてもよい。かかる基準としては，例えば，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内と適宜設定することができる。この基準値を満たさない細胞は，凍結保存することなく破棄することにより，ある一定以上の細胞分裂能を有する細胞のみを選択的に保存することができる。平均倍化時間が短いほど細胞分裂能が高い細胞といえる。
中間体細胞として細胞を凍結する場合，凍結保存前に，プロテアーゼで処理することにより細胞培養プレートから剥離させて回収した多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，洗浄溶液で洗浄される。このとき用いられる洗浄溶液は，培地とプロテアーゼを十分に除くためのものであり，その組成に特に限定はなく，生理食塩水，リン酸緩衝生理食塩水，酢酸リンゲル液，重炭酸リンゲル液等を用いることができるが，好ましくは，重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミンを添加した溶液である。酢酸リンゲル液及び重炭酸リンゲル液は市販のものを使用することができる。例えば，酢酸リンゲル液としてはＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（登録商標）Ａ（バクスター社），フィジオ（登録商標）１４０（大塚製薬社）を用いることができ，重炭酸リンゲル液としては，ビカーボン（登録商標）注（味の素社）を用いることができる。好適な重炭酸リンゲル液の成分組成及び電解質濃度の一例を表２及び表３にそれぞれ示す。
Figure 2024103800000002
Figure 2024103800000003
また，重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミンを添加した洗浄溶液の成分組成として好適な一例を表４に示す。また，重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミンを添加した洗浄溶液に含まれる電解質濃度として好適な一例を表５に示す。なお，表４及び表５に示される洗浄溶液の成分のうち，アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムは省くことができる。
Figure 2024103800000004
Figure 2024103800000005
中間体細胞として細胞を凍結する場合，洗浄溶液で洗浄後の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，一旦，遠心分離等の方法により回収される。回収された細胞は，懸濁液とした状態（中間体細胞懸濁液）で，凍結して保存される。但し，細胞を回収することなく，細胞が懸濁されている溶液の組成を，限外ろ過膜等を用いて置き換えることにより，中間体細胞懸濁液を調整し，これを凍結して保存することもできる。中間体細胞懸濁液の溶液部分（中間体細胞用凍結保存液）の組成は，哺乳動物細胞，特にヒトの多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を死滅させることなく凍結，解凍できるものである限り特に制限はない。中間体細胞用凍結保存液は細胞保護剤を含む。細胞保護剤は，例えば，細胞を凍結させるときに細胞内に氷の結晶が形成されて細胞が破壊されることを抑制する機能を有するものである。細胞保護剤として好適なものとして，ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），エチレングリコール，プロピレングリコール，セリシン，グリセロールが挙げられる。これらの２以上を組み合わせて細胞保護剤として使用することもできる。細胞保護剤としてジメチルスルホキシドを用いる場合，その濃度は好ましくは５～１５％（ｖ／ｖ）であり，より好ましくは９～１１％（ｖ／ｖ）であり，例えば１０％（ｖ／ｖ）である。凍結保存液は緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は，水溶液のｐＨを６～８，例えば６．８～７．８に調整することのできるものが好ましい。かかる緩衝剤としては，例えば，炭酸イオン，重炭酸イオン，クエン酸イオン及びナトリウムイオンを含有するものが挙げられる。中間体細胞用凍結保存液は更にヒト血清アルブミンを含んでもよい。ヒト血清アルブミンを用いる場合，その濃度は好ましくは４０～１００ｇ／Ｌであり，より好ましくは４６～５６ｇ／Ｌであり，例えば５１ｇ／Ｌである。
重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミン溶液とジメチルスルホキシドを添加したものは，中間体細胞用凍結保存液として好適なものの一例である。中間体細胞用凍結保存液は，好ましくは，塩化ナトリウムが５９～８０．４ｍＭ，塩化カリウムが２．３～３．０８ｍＭ，塩化カルシウム二水和物が０．８５～１．１６ｍＭ，塩化マグネシウム六水和物が０．２８～０．３８５ｍＭ，炭酸水素ナトリウムが１４～１９．２ｍＭ，クエン酸ナトリウムニ水和物が０．９４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンが４６～５６ｇ／Ｌ，アセチルトリプトファンナトリウムが３．７３～４．５５ｍＭ，カプリル酸ナトリウムが３．７４～４．５８ｍＭ，ＤＭＳＯが９～１１％（ｖ／ｖ）である。中間体細胞用凍結保存液の組成の好適な一例を表６に示す。すなわち，中間体細胞用凍結保存液の組成は，概ね，塩化ナトリウムが６５．８～８０．４ｍＭ，塩化カリウムが２．５２～３．０８ｍＭ，塩化カルシウム二水和物が０．９５～１．１６ｍＭ，塩化マグネシウム六水和物が０．３１５～０．３８５ｍＭ，炭酸水素ナトリウムが１５．７～１９．２ｍＭ，クエン酸ナトリウムニ水和物が１．０４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンが４６～５６ｇ／Ｌ，アセチルトリプトファンナトリウムが３．７３～４．５５ｍＭ，カプリル酸ナトリウムが３．７４～４．５８ｍＭ，ＤＭＳＯが９～１１％（ｖ／ｖ）である。この中で，アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムは省くことができる。中間体細胞用凍結保存液の生理食塩水に対する浸透圧比は，好ましくは０．９～１．１である。
また，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，マグネシウムイオン，炭酸水素イオン，クエン酸イオン，ヒト血清アルブミン，及びジメチルスルホキシドを含む溶液は，中間体細胞用凍結保存液として好適に用いることができる。例えば，ナトリウムイオンを９１～１１３ｍＭ，カリウムイオンを２．５２～３．０８ｍＭ，カルシウムイオンを０．９５～１．１６ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３１５～０．３８５ｍＭ，炭酸水素イオンを１５．６～１９．ｍＭ，クエン酸イオンを１．０４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンを４６～５６ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを９～１１％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。また例えば，ナトリウムイオンを１００～１０２ｍＭ，カリウムイオンを２．７１～２．７７ｍＭ，カルシウムイオンを１．０１～１．０３ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３３５～０．３４５ｍＭ，炭酸水素イオンを１６．９～１７．２ｍＭ，クエン酸イオンを１．１３～１．１５ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５２．２～５４．３ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０．３～１０．９％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。更に例えば，ナトリウムイオンを１０２ｍＭ，カリウムイオンを２．８０ｍＭ，カルシウムイオンを１．０５ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３５ｍＭ，炭酸水素イオンを１７．４ｍＭ，クエン酸イオンを１．１６ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５１ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０％ （ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。更に例えば，ナトリウムイオンを１０１ｍＭ，カリウムイオンを２．７７ｍＭ，カルシウムイオンを１．０３ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３４ｍＭ，炭酸水素イオンを１７．２ｍＭ，クエン酸イオンを１．１５ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５２ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。アセチルトリプトファン又はその塩を更に含む場合，その濃度は好ましくは３．７３～４．５５ｍＭ，４．２４～４．４１ｍＭであり，例えば，４．１４ｍＭ，４．２４ｍＭである。カプリル酸又はその塩を更に含む場合，その濃度は好ましくは３．７４～４．５８ｍＭ，４．２５～４．４３ｍＭであり，例えば，４．１６ｍＭ，４．２５ｍＭである。
Figure 2024103800000006
中間体細胞として細胞を凍結する場合，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を，中間体細胞用凍結保存液に懸濁させた状態の，懸濁液中における細胞密度に特に制限はないが，好ましくは２×１０６～８×１０７個／ｍＬであり，より好ましくは４×１０６～３×１０７個／ｍＬであり，更に好ましくは８×１０６～２×１０７個／ｍＬであり，例えば１．１×１０７個／ｍＬである。中間体細胞用凍結保存液に懸濁させた多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，細胞凍結保存用容器に分注した後，凍結保存される。
このとき，１つの細胞凍結保存用容器に分注される細胞懸濁液の量は，用途等によって適宜調整されるべきものであるが，好ましくは，１～２０ｍＬである。また，１つの細胞凍結保存用容器に分注される細胞数は，好ましくは５×１０６～９．２×１０８個である。
細胞凍結保存用容器として用いられる容器については，その素材が低温での耐久性を示し，且つ内容物を凍結解凍しても破損しないものである限り特に限定はない。細胞の凍結保存用容器として市販されるものを使用することもできる。例えば，ガラス製及びプラスチック製（例えば，ポリオレフィン樹脂製）のクライオチュ―ブは，細胞凍結保存用容器として好適に用いることができる。ここでガラス製のものとしては，特に素材がほう珪酸ガラスであるバイアルが好適に使用できる。また，ここでポリオレフィン樹脂には，ポリエチレン，高密度ポリエチレン，低密度ポリエチレン，ポリプロピレン，エチレンとプロピレンからなるコポリマー，熱可塑性エラストマーが含まれる。細胞の凍結は，細胞懸濁液を細胞凍結保存用容器に分注して封入した後，段階的に温度を低下させることにより行うことが好ましい。例えば，細胞の凍結方法として，－６℃までは１分あたり１℃の速度で温度を低下させて，その後は急速冷凍する方法を採用することができる。細胞は凍結状態で保存されるが，細胞を凍結保存する温度は，好ましくは－１３０℃以下であり，より好ましくは－１７０℃以下であり，更に好ましくは－１８０℃以下である。例えば，細胞は液体窒素（沸点：－１９６℃）に細胞凍結保存用容器を浸した状態で保存することができる。
このように中間体細胞として凍結保存した細胞は，用時解凍して，歯髄由来細胞製剤の製造のための次の工程に供される。
多能性幹細胞富化歯髄由来細胞の製造工程において，増殖した細胞を中間体細胞として一旦保存する工程を設けることは，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞の工程管理上，極めて意義のあることである。例えば，所望量の抜歯体が一度に入手できない場合，入手した抜歯体を原材料として歯髄由来細胞の培養を随時開始して最終製品まで製造すると，最終製品のロットサイズが小さくなり，ロット管理が煩雑になる。ところが，中間体細胞を製造して保存しておくことにより，一定量の中間体細胞が蓄積したところで，これを１バッチとして次の製造工程を開始することができるので，最終製品のロットサイズを大きくすることができ，ロット管理が容易になる。
また，中間体細胞として保存するステップを設けることにより，製造工程の中間段階で，細胞の性状等につき品質検査が可能となる。従って，中間体細胞として得られた細胞が，所望の品質基準を満たすものである場合のみ，これを次の製造工程に供することが可能になる。つまり，中間体細胞の製造工程終了時又はその前後で，所望の品質基準を満たさない細胞を除くことができる。これにより，所望の品質基準を満たさない細胞が，以降の工程に持ち込まれることがなくなるので，所望の品質基準を満たす最終製品が製造される確率を高めることができる。つまり製造時の歩留まりを上昇させることができ，製造コストを削減することができる。
製造工程において細胞を凍結保存することは，一般には細胞の前後で，細胞の性状が変化する危険性を伴う。また，細胞によっては，凍結保存後の細胞増殖能が劣化するものもある。これに対し，本発明において中間体細胞として得られる細胞は，凍結の前後で細胞の性状の変化が認められず，また，凍結保存後の細胞増殖能の劣化も認められない。
中間体細胞として保存するための多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これに含まれる細胞中の生細胞の比率が高いことが好ましい。凍結保存前の生細胞の比率（細胞の生存率）は，５０％以上であることが好ましく，６０％以上であることがより好ましく，７０％以上であることが更に好ましく，例えば，８０％以上，９０％以上，９５％以上であることが好ましい。適宜設けた基準により，凍結保存前の細胞の生存率が，ある一定の数値以上のもののみを中間体細胞として保存するようにすることもできる。
中間体細胞として保存するための多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，好ましくは１０回以上の細胞分裂を経たものであり，例えば１５回以上，１６回以上，又は１７回以上の細胞分裂を経たものであり，そして，好ましくは，該細胞分裂期間における平均細胞分裂時間が４８時間以内であるものである。
なお，本発明において，ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で細胞分裂させるとは，例えば，細胞を，細胞培養用の培地とともに細胞培養用フラスコ等の培養容器に加えた状態で，細胞分裂させることをいう。このときの培養温度は，好ましくは３４～３８℃であり，より好ましくは３６～３８℃であり，例えば３７℃である。また，細胞は，好ましくは５％ＣＯ２の存在下の湿潤環境で培養される。このとき用いられる細胞培養用の培地は，哺乳動物細胞の培養に用いることのできるものであれば特に限定はなく，例えば，ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。培地に含まれるＦＢＳの濃度は，好ましくは２～２０％であり，より好ましくは５～２０％であり，更に好ましくは８～１５％であり，例えば１０％である。また，ＤＭＥＭに含まれるグルコースの濃度は，５～２０ｍＭであり，例えば５ｍＭである。好適な培養条件として，培養温度が３７℃であり，５％ＣＯ２の存在下の湿潤環境であり，培地が約５ｍＭのグルコースと１０％ＦＢＳを含有すＤＭＥＭであるものが挙げられる。実施例５に記載の歯髄由来細胞の培養法（即ち，細胞培養プレート上，１０％ＦＢＳ添加した５．５６ｍＭグルコース含有のＤＭＥＭ培地，５％ＣＯ２存在下，３７℃）は，ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で細胞分裂させるための好適な方法の一例である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で細胞分裂させる場合の細胞の継代は，培養容器から細胞を剥離させ，次いで，この細胞を培養容器の底面積の１／２０～１／３が細胞で覆われるように新たな培養容器に播種して行う。細胞が分裂することにより培養容器の底面積の７０％以上，８０％以上，又は９０％以上が細胞で覆われる状態になった場合には，継代を繰り返す。
一実施形態において，中間体細胞として保存するための多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量増加が全体として観察される。また，中間体細胞として保存するための多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加するのが全体として観察される。すなわち，当該多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を備えている。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，ＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。例えば，当該細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０が陽性であり，且つＣＤ３４が陰性である。また例えば，当該細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５は陰性である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，例えば，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性である。例えば，当該細胞は，これを全体として観察したとき，例えば，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。これらの表面抗原マーカーが陽性の細胞は，同種異型の個体に移植したときに，抗原として認識されて生体内から排除される傾向にあることが知られている。これらの表面抗原マーカーの少なくとも一つが陰性であることは，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞が，それだけ低免疫原性の性質を有し，同種異型の個体に移植したときに，生体内から排除され難い傾向を有することを示している。また，これら表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となってもよい。例えば，これら表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。また，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－１）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ１４７，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは８０％以上，より好ましくは９０％以上，更に好ましくは９５％以上で陽性である。
また，一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－２）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ２９，ＣＤ４６，ＣＤ５５，ＣＤ５９，ＣＤ７３，及びＣＤ１４０ｂの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは７０％以上，より好ましくは８０％以上，更に好ましくは９０％以上で陽性である。
また，一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－３）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ９，ＣＤ４４，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ９８，及びＥＧＦ－Ｒの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６５％以上，より好ましくは７５％以上，更に好ましくは８０％以上で陽性である。
また，一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－４）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４９ｆ，及びＣＤ１６６の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは７０％以上，更に好ましくは７５％以上で陽性である。
また，一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－５）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ５８，ＣＤ６３，ＣＤ１０５，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６４の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは６５％以上で陽性であり，更に好ましくは７０％以上で陽性である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，好ましくは，上記の（ｂ－１），（ｂ－２），（ｂ－３），（ｂ－４），及び（ｂ－５）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｂ－１）及び（ｂ－２）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－６）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１２０ｂ，ＣＤ１３２，ＣＤ１５８ａ，ＣＤ１６１，ＣＤ１８４，ＣＤ１９５，ＣＤ２０６，ＣＤ２１０，ＣＤ２１２，ＣＤ２２６，ＣＤ２４４，ＣＤ２６７，ＣＤ２７８，ＣＤ２７９，ＣＤ２８２，ＣＤ２９４，ＮＫＢ１，ＳＳＥＡ－１，ＴＲＡ－１－６０，ＴＲＡ－１－８１，Ｖβ２３，ＳＳＥＡ－３，ＣＬＡ，及びインテグリンβ７の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下，更に好ましくは２％以下，なおも更に好ましくは１％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－７）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ８ｂ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２４，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６６ｆ，ＣＤ８６，ＣＤ８８，ＣＤ９４，ＣＤ１００，ＣＤ１０３，ＣＤ１０４，ＣＤ１１４，ＣＤ１１７，ＣＤ１１８，ＣＤ１２１ｂ，ＣＤ１２２，ＣＤ１２３，ＣＤ１２４，ＣＤ１２６，ＣＤ１２７，ＣＤ１２８ｂ，ＣＤ１３５，ＣＤ１３７，ＣＤ１３７リガンド，ＣＤ１５０，ＣＤ１６３，ＣＤ１７２ｂ，ＣＤ１７７，ＣＤ１７８，ＣＤ１８０，ＣＤ１９７，ＣＤ２２０，ＣＤ２２９，ＣＤ２３１，ＣＤ２５５，ＣＤ２６８，ＣＤ３０５，ＣＤ３１４，ＣＤ３２１，ＣＤｗ３２７，ＣＤｗ３２８，ＣＤ３２９，ＣＤ３３５，ＣＤ３３６，ＢＬＴＲ－１，ＣＬＩＰ，ＣＭＲＦ－４４，ＣＭＲＦ－５６，ｆＭＬＰ－Ｒ，Ｖβ８，Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ，及びγδＴＣＲの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞，更に好ましくは２％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｂ－８）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｂ，ＣＤ１ｄ，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ５，ＣＤ６，ＣＤ７，ＣＤ８ａ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１５，ＣＤ１８，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２５，ＣＤ２６，ＣＤ２７，ＣＤ２８，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３５，ＣＤ３７，ＣＤ３８，ＣＤ４０，ＣＤ４１ａ，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ４８，ＣＤ５０，ＣＤ５３，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６４，ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ），ＣＤ６９，ＣＤ７０，ＣＤ７２，ＣＤ７４，ＣＤ８０，ＣＤ８４，ＣＤ８５，ＣＤ８７，ＣＤ８９，ＣＤｗ９３，ＣＤ９７，ＣＤ１０６，ＣＤ１３４，ＣＤ１３８，ＣＤ１４１，ＣＤ１４４，ＣＤ１５４，ＣＤ１５８ｂ，ＣＤ１６２，ＣＤ１８３，ＣＤ２０５，ＣＤ２３５ａ，ＣＤ２７１，ＣＤ３０９，ＣＤ３２６，ＣＤ３３７，αβＴＣＲ，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，好ましくは，上記の（ｂ－１），（ｂ－２），（ｂ－３），（ｂ－４），（ｂ－５），（ｂ－６），（ｂ－７），及び（ｂ－８）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｂ－１）及び（ｂ－６）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，例えば，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その発現量が増加する。
本発明の一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，ＩＦＮ―γ存在下で培養したときに，キヌレニンの分泌量を増加させるものである。
本発明の一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３４，及びＣＤ２０６の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。また別の一実施形態において，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５，ＣＤ２０６，ＣＤ２３５ａ，及びＳＳＥＡ－１の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。
本発明の一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。このとき，ＩＦＮ―γで細胞を刺激したときに，例えば，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となる。また，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その分泌量が増加する。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合に，アグリカンの発現量が増加する。また，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合には，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加する。すなわち，当該多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したとき，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を有する。
本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞が示す上記の表面抗原マーカー発現パターン及び／又は他の遺伝子発現パターンに基づき，適宜設けた基準により特定の発現パターンを示す細胞のみを中間体細胞として保存する，という方式を製造工程の管理で用いることもできる。
中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，ほとんどが歯髄由来の多能性幹細胞（歯髄由来多能性幹細胞）で占められている。それらは平面培養中の光学顕微鏡下で，略紡錘形の固着細胞として観察され，細胞全体に占める略紡錘形の細胞の比率は，好ましくは９９％以上であり，より好ましくは９９．５％以上であり，更に好ましくは９９．９％以上であり，更により好ましくは９９．９５％以上である。歯髄由来多能性幹細胞の比率は，光学顕微鏡下で観察したときに略紡錘形の形態を示す細胞数を，全細胞数で除することにより求めることができる。上記に基づき適宜設けた基準により，略紡錘形の細胞の比率が，ある一定以上である細胞群のみを中間体細胞として保存する，という方式を製造工程の管理で用いることもできる。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，全体として観察したときに，好ましくは軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能とを有するものである。つまり，中間体細胞は，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合，アグリカンの発現量が増加する。また，中間体細胞は，全体として観察したときに，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加する。中間体細胞が軟骨細胞への分化能及び骨細胞への分化能を有することは，それぞれ実施例２０及び実施例１９に記載の方法で調べることができる。これらの方法により軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能を有することが示された細胞群のみを，保存すべき中間体細胞とすることができる。但し，分化能を調べるための方法は，実施例２０及び１９に記載の方法に限定されるものではない。他の適切な手法により軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能を有することが示された細胞群のみを，保存すべき中間体細胞とすることもできる。
一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，以下に詳述する更なる培養工程に供される中間体細胞と同一であるか，又は実質的に同一の性質を有するものであってもよい。
中間体細胞として凍結保存された細胞は，解凍前と解凍後で，その性状が保持されることが好ましい。つまり，中間体細胞として凍結保存した多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを解凍したときに，生存率，表面抗原マーカーの発現パターン，細胞の形態，分化能等が，解凍前の細胞と実質的に同じであることが好ましい。解凍後若しくは解凍して培養したときの中間体細胞の性状を確認することにより，解凍の前後でその性状が保持されている細胞のみを，中間体細胞として，その後の培養工程に供することができる。
更なる培養工程に供される中間体細胞は，解凍後の生存率が５０％以上であることが好ましく，６０％以上であることがより好ましく，７０％以上であることが更に好ましく，例えば，生存率が８０％以上，９０％以上，９５％以上であることが好ましい。適宜設けた基準により，解凍後の生存率がある一定の数値以上である中間体細胞のみを，その後の培養工程に供するようにすることができる。解凍後の細胞の生存率は，概ね，８０％～９８％，８５％～９５％である。
中間体細胞として凍結保存された細胞は，解凍後に培養したとき，１０回以上の細胞分裂能を有することが好ましく，１５回以上の細胞分裂能を有することがより好ましく，例えば，１４回以上の細胞分裂能を有するものである。また，中間体細胞として凍結保存された細胞は，解凍後に培養したとき，細胞培養プレート上での平均倍化時間が，９６時間以内であることが好ましく，８４時間以内であることがより好ましく，７２時間以内であることが更に好ましく，４８時間以内であることが更に好ましく，３６時間以内のものであることが更に好ましい。例えば，細胞分裂能及び平均倍化時間に基準を設け，細胞分裂能が一定以上であり且つ平均倍化時間がある一定の時間以内のもののみを，その後の利用に供するようにすることもできる。かかる基準は，例えば，１０回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が９６時間以内であるもの，１４回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるもの，１５回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるもの等と，適宜設定することができる。この基準を満たさない細胞を使用しないことにより，ある一定以上の細胞分裂能を有する中間体細胞のみを，その後の培養工程に供することができる。当該工程での培養条件は，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞について上記したそれまでの培養条件と同一又は同等のものであってよい。
中間体細胞として凍結保存される細胞は，ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，好ましくは１０回以上の細胞分裂を経たものであり，例えば１５回以上，１６回以上，又は１７回以上の細胞分裂を経たものであり，且つ好ましくは，該細胞分裂期間における平均細胞分裂時間が４８時間以内であるものである。
更なる培養工程に供される中間体細胞は，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量増加が全体として観察される。また，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加するのが全体として観察される。当該細胞は，全体として観察したとき，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を備えている。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，全体として観察したときに，解凍後若しくは解凍して培養したときの表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，ＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。例えば，当該細胞は，ＣＤ７３，ＣＤ９０が陽性であり，且つＣＤ３４が陰性である。また例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０が陽性であり，且つＣＤ３４が陰性である。当該細胞は，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性である。
また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，全体として観察したとき，解凍直後又は解凍して培養したときの表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性である。例えば，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。これらの表面抗原マーカーが陽性の細胞は，同種異型の個体に移植したときに，抗原として認識されて生体内から排除される傾向にあることが知られている。これらの表面抗原マーカーが陰性であることは，更なる培養工程に供される中間体細胞が，それだけ低免疫原性で，同種異型の個体に移植したとき生体内から排除され難い傾向を有することを示している。また，これら表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となってもよい。例えば，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したとき，これら表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となる。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，解凍直後若しくは解凍して培養したときにおいて全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。また，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－１）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ１４７，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは８０％以上，より好ましくは９０％以上，更に好ましくは９５％以上で陽性である。
また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－２）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいてＣＤ２９，ＣＤ４６，ＣＤ５５，ＣＤ５９，ＣＤ７３，及びＣＤ１４０ｂの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは７０％以上，より好ましくは８０％以上，更に好ましくは９０％以上で陽性である。
また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－３）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ９，ＣＤ４４，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ９８，及びＥＧＦ－Ｒの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６５％以上，より好ましくは７５％以上，更に好ましくは８０％以上で陽性である。
また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－４）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４９ｆ，及びＣＤ１６６の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは７０％以上，更に好ましくは７５％以上で陽性である。
また，一実施形態において，中間体細胞として保存される多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，
（ｃ－５）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ５８，ＣＤ６３，ＣＤ１０５，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６４の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは６５％以上で陽性であり，更に好ましくは７０％以上で陽性である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，好ましくは，上記の（ｃ－１），（ｃ－２），（ｃ－３），（ｃ－４），及び（ｃ－５）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｃ－１）及び（ｃ－２）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－６）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１２０ｂ，ＣＤ１３２，ＣＤ１５８ａ，ＣＤ１６１，ＣＤ１８４，ＣＤ１９５，ＣＤ２０６，ＣＤ２１０，ＣＤ２１２，ＣＤ２２６，ＣＤ２４４，ＣＤ２６７，ＣＤ２７８，ＣＤ２７９，ＣＤ２８２，ＣＤ２９４，ＮＫＢ１，ＳＳＥＡ－１，ＴＲＡ－１－６０，ＴＲＡ－１－８１，Ｖβ２３，ＳＳＥＡ－３，ＣＬＡ，及びインテグリンβ７の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下，更に好ましくは２％以下，より更に好ましくは１％以下の細胞で陽性である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－７）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ８ｂ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２４，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６６ｆ，ＣＤ８６，ＣＤ８８，ＣＤ９４，ＣＤ１００，ＣＤ１０３，ＣＤ１０４，ＣＤ１１４，ＣＤ１１７，ＣＤ１１８，ＣＤ１２１ｂ，ＣＤ１２２，ＣＤ１２３，ＣＤ１２４，ＣＤ１２６，ＣＤ１２７，ＣＤ１２８ｂ，ＣＤ１３５，ＣＤ１３７，ＣＤ１３７リガンド，ＣＤ１５０，ＣＤ１６３，ＣＤ１７２ｂ，ＣＤ１７７，ＣＤ１７８，ＣＤ１８０，ＣＤ１９７，ＣＤ２２０，ＣＤ２２９，ＣＤ２３１，ＣＤ２５５，ＣＤ２６８，ＣＤ３０５，ＣＤ３１４，ＣＤ３２１，ＣＤｗ３２７，ＣＤｗ３２８，ＣＤ３２９，ＣＤ３３５，ＣＤ３３６，ＢＬＴＲ－１，ＣＬＩＰ，ＣＭＲＦ－４４，ＣＭＲＦ－５６，ｆＭＬＰ－Ｒ，Ｖβ８，Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ，及びγδＴＣＲの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞，更に好ましくは２％以下の細胞で陽性である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，
（ｃ－８）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｂ，ＣＤ１ｄ，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ５，ＣＤ６，ＣＤ７，ＣＤ８ａ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１５，ＣＤ１８，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２５，ＣＤ２６，ＣＤ２７，ＣＤ２８，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３５，ＣＤ３７，ＣＤ３８，ＣＤ４０，ＣＤ４１ａ，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ４８，ＣＤ５０，ＣＤ５３，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６４，ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ），ＣＤ６９，ＣＤ７０，ＣＤ７２，ＣＤ７４，ＣＤ８０，ＣＤ８４，ＣＤ８５，ＣＤ８７，ＣＤ８９，ＣＤｗ９３，ＣＤ９７，ＣＤ１０６，ＣＤ１３４，ＣＤ１３８，ＣＤ１４１，ＣＤ１４４，ＣＤ１５４，ＣＤ１５８ｂ，ＣＤ１６２，ＣＤ１８３，ＣＤ２０５，ＣＤ２３５ａ，ＣＤ２７１，ＣＤ３０９，ＣＤ３２６，ＣＤ３３７，αβＴＣＲ，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞で陽性である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，好ましくは，上記の（ｃ－１），（ｃ－２），（ｃ－３），（ｃ－４），（ｃ－５），（ｃ－６），（ｃ－７），及び（ｃ－８）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｃ－１）及び（ｃ－６）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
また，更なる培養工程に供される中間体細胞は，全体として観察したとき，例えば，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現しており，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その発現量が増加する。
本発明の一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，ＩＦＮ―γ存在下で培養したときに，キヌレニンの分泌量を増加させるものである。
本発明の一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３４，及びＣＤ２０６の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。また，本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５，ＣＤ２０６，ＣＤ２３５ａ，及びＳＳＥＡ－１の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１９，ＣＤ２６，ＣＤ１０６，ＣＤ１１７，及びＣＤ２７１の少なくとも一つが陰性，例えばこれらの全てが陰性である。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１４０ｂ及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つが陽性，例えばこれらの全てが陽性である。
本発明の一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５５，ＣＤ５８，及びＣＤ５９の少なくとも一つ，例えばこれらの全てが陽性である。
本発明の一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。
また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，全体として観察したときに，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。このとき，ＩＦＮ―γで細胞を刺激したとき，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となる。また，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現しており，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その分泌量が増加する。更に，ＩＦＮ―γで刺激することにより，キヌレニンの分泌量が増加する。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，種々の液性因子を分泌するものである。
（ｃ－９）一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，及びシスタチンＣの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ｃ－１０）一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＩＬ－８，ＧＲＯα，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＶＣＡＭ－１，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ｃ－１１）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを培養したときに，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－２３，ＴＮＦ－α，ＩＬ－１８，ＩＬ－３３，ＩＬ－２７，ＴＡＲＣ，ＥＮＡ－７８，ＭＩＰ－３α，ＭＩＰ－１β，ＩＰ－１０，ＳＣＦ，及びＩＣＡＭ－１の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ｃ－１２）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－２１，ＩＦＮ－α，Ｅｏｔａｘｉｎ，ＭＩＰ－１α，ＭＩＧ，Ｉ－ＴＡＣ，及びＧＭ－ＣＳＦの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現しないか，ほとんど発現しないものである。
（ｃ－１３）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－６の発現量が増加するものである。
（ｃ－１４）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－１１の発現量が増加するものである。
（ｃ－１５）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＰ－１０の発現量が増加するものである。
（ｃ－１６）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＭＣＰ－１の発現量が増加するものである。
（ｃ－１７）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときにＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されるが，ＩＦＮ－γ存在下で培養したときには，ＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されないものである。
（ｃ－１８）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときと比較してＨＧＦの発現量が減少する一方，これをＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較してＨＧＦの発現量が増加するものである。
（ｃ－１９）また，一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－８の発現量が増加するものである。
一実施形態において，更なる培養工程に供される中間体細胞は，好ましくは，上記の（ｃ－９）乃至（ｃ－１９）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくは４以上，なおも更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｃ－９）及び（ｃ－１５）で示される特徴を有する細胞，上記の（ｃ－９），（ｃ－１４）及び（ｃ－１５）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
また，更なる培養工程に供される中間体細胞は，全体として観察したときに，解凍直後若しくは解凍して培養した場合に，軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能とを有する。つまり，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合に，アグリカンの発現量が増加し，また，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合に，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加する。中間体細胞が軟骨細胞への分化能及び骨細胞への分化能を有することは，それぞれ実施例２０及び実施例１９に記載の方法で調べることができる。これらの方法により軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能を有することが示された細胞群のみを，更なる培養工程に供される中間体細胞とすることができる。但し，これら分化能を調べる方法は，実施例に記載の方法に限定されるものではない。他の適切な手法により軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能を有することが示された細胞群のみを，中間体細胞としてその後の培養工程に供するようにすることもできる。
本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞が示す上記の表面抗原マーカー発現パターン及び／又は他の遺伝子発現パターンに基づき，適宜設けた基準により，特定の発現パターンを示す細胞のみを，更なる培養工程に供される中間体細胞とする，という方式を製造工程の管理で用いることもできる。
また，更なる培養工程に供される中間体細胞は，解凍直後若しくは解凍して培養したときにおいて全体として観察したとき，ほとんどが歯髄由来多能性幹細胞で占められている。それらは平面培養中の光学顕微鏡下で，略紡錘形の固着細胞として観察され，細胞全体に占める略紡錘形の細胞の比率は，好ましくは９９％以上であり，より好ましくは９９．５％以上であり，更に好ましくは９９．９％以上であり，更により好ましくは９９．９５％以上である。上記に基づき適宜設けた基準により，略紡錘形の細胞の比率が，ある一定以上である細胞群のみを中間体細胞としてその後の培養工程に供するようにすることができる。
また，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを解凍して培養したとき，１０回以上の細胞分裂能を有することが好ましく，１５回以上の細胞分裂能を有することがより好ましく，例えば，１４回以上の細胞分裂能を有するものである。また，更なる培養工程に供される中間体細胞は，これを解凍して細胞培養プレート上で培養したときの平均倍化時間が，好ましくは９６時間以内であるものであり，より好ましくは８４時間以内のものであり，更に好ましくは７２時間以内のものであり，更により好ましくは４８時間以内のものであり，更により好ましくは３６時間以内のものである。このときの細胞の培養条件は，上記の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞の培養条件と同一又は同等のもの，例えば実施例５に記載の条件（即ち，細胞培養プレート上，１０％ ＦＢＳ添加した５．５６ｍＭグルコース含有のＤＭＥＭ培地，５％ＣＯ２存在下，３７℃）が用いられる。上記に基づき適宜設けた基準により，細胞分裂能が，ある一定以上である細胞群のみを，中間体細胞としてその後の培養工程に供するようにすることができる。また，適宜設けた基準により，平均倍化時間が，ある一定の時間内である細胞群のみを，中間体細胞としてその後の培養工程に供するようにすることもできる。かかる基準としては，例えば，１０回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が９６時間以内であるもの，１４回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるもの，１５回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるものである。
すなわち，更なる培養工程に供される中間体細胞は，高い分裂能を有し且つ２種以上の細胞に分化できるという幹細胞の性質を保持するものである。更なる培養工程に供される中間体細胞は，高いコロニー形成能を有する細胞ということもできる。ここでコロニー形成能とは，細胞をプレートに播種して培養したときに，プレート上で細胞が分裂してコロニーを形成する能力のことをいう。
中間体細胞は，これを解凍したときに，溶液中，例えば培地中に浮遊させた状態での直径の平均が，好ましくは２０μｍ以下，１８μｍ以下であり，例えば，１０～２０μｍ，１０～１８μｍ，１２～２０μｍ，１４～２０μｍ，１６～２０μｍである。
中間体細胞の製造工程終了時又はその前後で実施される品質検査の項目を以下に品質検査ａ～ｋとして例示する。品質検査は，これらの項目の１又は２以上について行われる。これらの項目の全てを実施してもよい。このとき品質検査に供される細胞は，（１）中間体細胞として凍結保存液に懸濁させる前の細胞の一部を分取した細胞，（２）中間体細胞として凍結保存液に懸濁させる前の細胞の一部を分取し，これを更に継代させた細胞，（３）中間体細胞として凍結させるために凍結保存液に懸濁させた凍結前の細胞，（４）中間体細胞として凍結させたものを解凍した直後の細胞，又は（５）中間体細胞として凍結させたものを解凍し更に培養して得られた細胞，の何れかである。特に指定のない限り，これら（１）～（５）の細胞の２種以上について同一の品質検査を行ってもよい。
（品質検査ａ）光学顕微鏡下で観察したときに，細胞全体に占める略紡錘形の形態を示す細胞数の割合が，９９％以上，９９．５％以上，９９．９％以上，又は９９．９５％以上であることの検証；
（品質検査ｂ）細胞の生存率が，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，又は９５％以上であることの検証；
（品質検査ｃ）細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５は陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４が陰性であることの検証；
（品質検査ｄ）細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性であることの検証；
（品質検査ｅ）細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０が陰性，ＣＤ８０が陰性，ＣＤ８６が陰性，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性であることの，少なくとも一つの検証；
（品質検査ｆ）細胞が，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，且つプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その発現量が増加することの検証；
（品質検査ｇ）軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したときに，アグリカンの発現量が増加することの検証；
（品質検査ｈ）骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したときに，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加することの検証；
（品質検査ｉ）細胞培養プレート上で１０回以上，１４回以上，又は１５回以上の細胞分裂能を有することの検証；
（品質検査ｊ）細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間が，該品質検査ｉの実施期間において，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であることの検証。
（品質検査ｋ）細胞を培地中に浮遊させた状態での平均の直径が，２０μｍ以下，１８μｍ以下，１０～２０μｍ，１０～２０μｍ，１０～１８μｍ，１２～２０μｍ，１４～２０μｍ，又は１６～２０μｍであることの検証。
上記品質検査は，（品質検査ａ）～（品質検査ｊ）の１０項目について実施してもよい。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の９項目を選択して実施してもよい。９項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｉ，及びｊが選択されるが，限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の８項目を選択して実施してもよい。８項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｉ，及びｊが選択されるが，限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の７項目を選択して実施してもよい。７項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｉ，及びｊが選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の６項目を選択して実施してもよい。６項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｉ，及びｊが選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の５項目を選択して実施してもよい。５項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，ｃ，ｉ，及びｊが選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の４項目を選択して実施してもよい。４項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，ｃ，及びｊが選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の３項目を選択して実施してもよい。３項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ，ｂ，及びｃが選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の２項目を選択して実施してもよい。２項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ及びｂ，品質検査ａ及びｃ，品質検査ａ及びｄ，品質検査ａ及びｅ，品質検査ａ及びｆ，品質検査ａ及びｇ，品質検査ａ及びｈ，品質検査ａ及びｉ，品質検査ａ及びｊ，品質検査ｂ及びｃ，品質検査ｂ及びｄ，品質検査ｂ及びｅ，品質検査ｂ及びｆ，品質検査ｂ及びｇ，品質検査ｂ及びｈ，品質検査ｂ及びｉ，品質検査ｂ及びｊ，品質検査ｃ及びｄ，品質検査ｃ及びｅ，品質検査ｃ及びｆ，品質検査ｃ及びｇ，品質検査ｃ及びｈ，品質検査ｃ及びｉ，品質検査ｃ及びｊ，品質検査ｄ及びｅ，品質検査ｄ及びｆ，品質検査ｄ及びｇ，品質検査ｄ及びｈ，品質検査ｄ及びｉ，品質検査ｄ及びｊ，品質検査ｅ及びｆ，品質検査ｅ及びｇ，品質検査ｅ及びｈ，品質検査ｅ及びｉ，品質検査ｅ及びｊ，品質検査ｆ及びｉ，品質検査ｆ及びｊ，または品質検査ｉ及びｊが選択されるが，これらに限定されることはない。
〔生産培養〕
中間体細胞に対して行われる更なる培養工程は，最終製品となる多能性幹細胞富化歯髄由来細胞の製造に至る培養工程であり，この工程を特に生産培養という。
生産培養に用いられる培地は，好ましくは，ウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地である。培地に添加されるウシ胎児血清の濃度（ｖ／ｖ％）は，好ましくは８～２５％であり，より好ましくは８～２０％であり，例えば，１０％である。ダルベッコの修飾イーグル培地（ウシ胎児血清添加前）の詳細な組成の一例を表１に示す。所望により，３～５ｍＭ，例えば４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを培地に添加してもよい。また，生産培養においては，通常は抗生物質が添加されない。但し，ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加することもできる。ストレプトマイシンを培地に添加する場合，ストレプトマイシンの培地中での濃度が，１０ｍｇ／Ｌ～２５０ｍｇ／Ｌとなるように，例えば１００ｍｇ／Ｌとなるように添加する。また，各成分は，その同等物，例えばその塩で置換可能である。
生産培養は，細胞を細胞培養プレート上で行ってもよく，細胞培養装置内，例えばバイオリアクター内において，細胞をマイクロキャリア上で行ってもよい。また，生産培養は，細胞を，細胞培養プレート上で培養して増殖させた上で，更に細胞培養装置内，例えばバイオリアクター内においてマイクロキャリア上で行ってもよい。また，細胞をマイクロキャリア上で培養する場合にあっては，バイオリアクターに替えて，振盪フラスコを用いることもできる。生産培養において，細胞を細胞培養プレート上で培養する場合，その条件は，上記の歯髄懸濁物を培養して得られた細胞の培養条件と同一又は類似のものである。つまり，解凍後の中間体細胞を，細胞培養プレート上での培養と回収を繰り返して，細胞数を拡大させるものである。なお，バイオリアクターとしては，ＧＥヘルスケア社，メルク社，ザルトリウス社等から市販されているものを好適に使用することができる。以下，細胞培養装置としてバイオリアクターを用いた細胞の培養法について特に詳述する。
生産培養において，バイオリアクターを用いて，細胞をマイクロキャリア上で培養する場合，細胞を接着させたマイクロキャリアを，バイオリアクターに投入し，培地中でマイクロキャリアを撹拌させて細胞を培養する。マイクロキャリアは，細胞が接着することのできる素材の粒子（小粒子）であり，その表面上（多孔性のものにあっては孔内の表面を含む）で細胞を培養するために用いるものである。その意味で，マイクロキャリアは担体粒子又は担体小粒子ということもできる。細胞培養時（即ち，水和時）のマイクロキャリアの直径（粒径）は，好ましくは５０～４００μｍであり，例えば，８０～３００μｍ，８０～２５０μｍ，１００～２００μｍ，１３０～１８０μｍである。マイクロキャリアは粒子表面から内側に向かって孔の開いた多孔性のものであってもよい。多孔性のマイクロキャリアにあっては，細胞培養時のその孔の直径（孔径）は，好ましくは３～４０μｍであり，例えば，５～２５μｍ，１０～２０μｍ，５～１５μｍである。
マイクロキャリアの素材について特に限定はなく，細胞を表面に接着させた状態で培養できるものである限り，その素材として用いることができる。マイクロキャリアとしては，高分子化合物を粒子状に成型したもの，セラミック製粒子，ガラス製粒子等がある。かかる高分子化合物としては，例えば，ビニル樹脂，ウレタン樹脂，エポキシ樹脂，ポリスチレン，ポリメチルメタクリレートポリエステル，ポリアミド，ポリイミド，シリコン樹脂，フェノール樹脂，メラミン樹脂，ユリア樹脂，アニリン樹脂，アイオノマー樹脂，ポリカーボネート，コラーゲン，デキストラン，ゼラチン，セルロース，アルギン酸塩及びこれらの混合物が挙げられる。マイクロキャリアは，その表面を更に細胞接着性分子等により修飾したものであってもよい。かかる細胞接着性分子としては，例えば，ゼラチン，ケラチン，エラスチン，ヘパラン硫酸，デキストラン，デキストラン硫酸，コンドロイチン硫酸，ヒアルロン酸ナトリウム，ｎ－イソプロピルアクリルアミド，コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ，フィブロネクチン，ビトロネクチン，ラミニン－１乃至１２，ニトジェン，テネイシン，トロンボスポンジン，オステオポンチン，フィブリノーゲン，ポリ－Ｄ－リジン，ポリ－Ｌ－リジン，キチン，キトサン，セファロース，ラミニン，エンタクチンＩ，又はこれら細胞接着性分子の細胞接着ドメインを含む断片若しくはペプチド，及びこれらの混合物が挙げられる。また，マイクロキャリアの比重は，培地に対する比重が，１に近いことが好ましく，０．９～１．２であることが好ましく，例えば，０．９～１．１であり，約１．０である。
素材がゼラチンマトリックスであり，細胞培養時の粒径が１３０～１８０μｍ，孔径が１０～２０μｍ（又は５～１５μｍ）であるものは，マイクロキャリアとして好適に使用できる。
生産培養における細胞のマイクロキャリアへの接着は，溶液中で細胞とマイクロキャリアを撹拌，混合することにより行われる。この工程は，細胞のマイクロキャリアへの接着工程という。接着工程において，撹拌中にマイクロキャリアと接触した細胞がマイクロキャリアの表面に順次接着することになる。この工程で用いられる溶液は，好ましくは細胞培養用の培地であるが，これに特に限定されるものではない。接着工程における細胞とマイクロキャリアの撹拌は断続的に行ってもよい。この場合，例えば，撹拌を１分～２０分行った後に，１０分～２時間静置させる。
細胞培養用の培地を溶液として用いて接着工程を行う場合，当該工程は，バイオリアクター内で行うこともできる。バイオリアクター内で接着工程を行う場合，バイオリアクターに細胞培養用の培地と細胞とマイクロキャリアとを投入して撹拌し，細胞をマイクロキャリアに接着させる。細胞の接着後は，バイオリアクター内で，そのまま細胞培養を続けることができる。バイオリアクター内での接着工程における細胞とマイクロキャリアの撹拌は断続的に行ってもよい。この場合，例えば，撹拌を１分～２０分行った後に，１０分～２時間静置させる。
バイオリアクターは，一般に，固定化酵素反応装置などの生化学的反応器と，発酵槽や生物学的排水処理装置などの生物学的反応器・微生物学的反応器のことをいう。本発明における後述の実施例で用いられているバイオリアクターは，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞をマイクロキャリアに接着させて培地中で撹拌しながら培養するのに適している。当該バイオリアクターは，細胞を培養するための培養槽，培地を撹拌するための撹拌装置，気相投入口，液相投入口，排水口，センサー部を有する。培養槽は略円筒型の内腔を有する槽である。この状態で，培養槽内でマイクロキャリアを接着させた多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を培養することができる。培養槽の内腔には，培養槽内の培地のための撹拌装置が設けられている。撹拌装置は，例えばインペラーであり，その回転により培地が撹拌される。インペラーによる培地の撹拌は，細胞の接着したマイクロキャリアのほとんどが，培養槽の内腔の底面に沈殿することなく，培地中に浮遊した状態となるように調整される。インペラーの回転速度は，培養槽の形状，インペラーの形状，マイクロキャリアの種類等により，適宜選択されるべきものであるが，例えば，３０～１００ｒｐｍ，５０～８０ｒｐｍ，約７０ｒｐｍである。気相投入口は，培養槽中に，空気，酸素，二酸化炭素等の気相を送り込むためのものである。気相投入口は，その出口が培地の液面下にあってよく，この場合，気相は培地に気泡となって送り込まれる。液相投入口は，培養槽内に，培地，グルコース溶液等の各種溶液を投入するためのものである。排水口は，培養槽内の培地を排出するためのものであり，培地交換の際には，この排水口から培地が排出される。排水口はまた，培地と共に細胞の接着したマイクロキャリアを取り出すためにも用いられる。培養中にマイクロキャリアをサンプリングするとき，または培養終了後にマイクロキャリアを回収する際に，この排水口を用いることができる。センサー部は，培養槽内の培地の温度，ｐＨ，溶存酸素濃度を測定するセンサーを含む。センサー部は，更に，グルコース濃度，乳酸濃度を測定するセンサーを含むことができる。溶液の温度，ｐＨ，溶存酸素濃度，グルコース濃度及び乳酸濃度を測定するためのセンサーは，周知のものから適宜選んで設置することができる。
バイオリアクターの培養槽は，バイオリアクター内に固定されるか，又は取り外し可能なように設置される。培養槽を取り外し可能なように設置することにより，培養槽の洗浄が容易となる。通常，培養槽は，金属製又は硬質樹脂製であり，使用後に洗浄して繰り返し使用される。このような培養槽に代えて，バイオリアクター内に柔軟な樹脂製の培養用バッグをセットし，バッグ内に培地及び細胞を投入して培養を行うこともできる。培養用バッグは，バイオリアクター内で，通常の培養槽と同様にして取り扱うことができるように支持されている。培養用バッグは使い捨てにできるので，使用後の洗浄操作が不要になり，培養の際の作業効率を高めることができる。
生産培養において，培地中のグルコース濃度がある値以下となった場合には，培地にグルコースが補充される。例えば，グルコース濃度が０．１ｍＭ以下となった場合に，終濃度が５～７ｍＭとなるようにグルコースが補充される。また，生産培養において，乳酸濃度がある値以上となった場合には，培地の全部又は一部が交換される。例えば，乳酸濃度が２０ｍＭ以上となった場合には，培地の全部が交換されるか，又は，乳酸濃度が例えば，５ｍＭ以下，２ｍＭ以下となるように，培地の一部が交換される。
バイオリアクター内での培養中，培地へは，酸素，空気，及びＣＯ２が気相投入口より供給される。酸素の供給量は，培地中の溶存酸素濃度が飽和濃度の５０～１００％となるよう，例えば，溶存酸素濃度が，５０％又は１００％に保持されるように制御される。また，ＣＯ２の流量は，培地のｐＨが，細胞が好適に成育できるように，例えば７．０～７．８に保持されるように供給される。溶存酸素濃度及びｐＨはセンサー部で経時的にモニタされているので，モニタされた数値が，設定された値から外れたときには，それに応じて酸素，ＣＯ２の供給量を増減することにより，溶存酸素濃度，ｐＨを一定の値に保つことができる。また，細胞の増殖にあわせて，追加のマイクロキャリアをバイオリアクター内に供給することもできる。
バイオリアクター内での培養は，マイクロキャリアの表面が，ある比率まで細胞で占められるようになるまで行われる。このときの比率は，例えば，２０％，４０％，８５％，９５％，９８％と適宜設定することができる。また，バイオリアクター内での培養は，マイクロキャリアの表面上での細胞密度が，ある値となるまで細胞で占められるまで行われる。このときの細胞密度は，例えば，３０００，５０００，１００００，２００００，２２０００個／ｃｍ２と適宜設定することができる。
生産培養終了後に歯髄由来細胞製剤として凍結させる細胞は，歯髄懸濁物の培養で細胞培養プレート上にコロニーを形成した細胞として回収してから，１５回以上分裂させたものであることが好ましく，２０回以上分裂させたものであることがより好ましい。例えば，１５～３０回，１５～２３回，１５～２０回，２０～３０回，２０～２８回，又は２３～２６回分裂させた細胞が凍結保存される。
中間体細胞を経てから生産培養終了後に歯髄由来細胞製剤として凍結させる細胞は，歯髄懸濁物の培養で細胞培養プレート上にコロニーを形成した細胞として回収してから，中間体細胞とするまでに，１０回以上分裂させたものであることが好ましく，１５回以上分裂させたものであることがより好ましい。例えば，１３～２０回，１３～２３回，又は１４～２０回分裂させた細胞が中間体細胞として凍結保存される。次いで，中間体細胞を解凍して開始する生産培養では，開始してから歯髄由来細胞製剤とするまでに，細胞を５回以上分裂させることが好ましく，例えば，８回以上又は１０回以上分裂させることが好ましい。特に，生産培養におけるマイクロキャリアを用いた培養の際には，細胞は，好ましくは２～５回分裂させることが好ましく，例えば２～３回分裂させることが好ましい。
中間体細胞から歯髄由来細胞製剤を取得するまでに，細胞を培養して分裂させるときの，細胞の平均倍化時間は，細胞を細胞培養プレート上で培養する場合にあっては，９６時間以内であることが好ましく，８４時間以内であることがより好ましく，７２時間以内であることが更に好ましく，４８時間以内であることが更により好ましく，３６時間以内であることが更により好ましい。中間体細胞から歯髄由来細胞製剤を取得するまでに，細胞を培養して分裂させるときの，細胞の平均倍化時間は，細胞をマイクロキャリアを用いて培養する場合にあっては，８日以内であることが好ましく，６日以内であることがより好ましく，５日以内であることが更に好ましく，４日以内であることが更に好ましく，例えば，２～８日，２～７日，２～６日，２．５～６日，又は２．５～５．５日である。
生産培養全期間における又はマイクロキャリアを用いた培養の際の，細胞の平均倍化時間に基準を設け，平均倍化時間が当該基準以内のもののみを凍結保存し，その後の利用に供するようにすることもできる。かかる基準としては，例えば，細胞培養プレート上で培養する場合にあっては，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内と，マイクロキャリアを用いて培養する場合にあっては，８日以内，６日以内，５日以内，４日以内又は３日以内等と，適宜設定することができる。この基準値を満たさない細胞は，凍結保存することなく破棄することにより，ある一定以上の細胞分裂能を有する細胞のみを選択的に歯髄由来細胞製剤として保存することができる。
生産培養においては，歯髄由来細胞製剤を取得するまでに，１個の抜歯体（例えば１個の第三大臼歯）から得られる多能性幹細胞の数が，好ましくは，１×１０６個以上となるまで，より好ましくは１×１０７個以上となるまで，更に好ましくは３×１０７個以上となるまで，更により好ましくは１×１０８個以上となるまで，更により好ましくは１×１０９個以上となるまで，例えば，１×１０７～１×１０１０個となるまで細胞を増殖させる。理論上，２０回，２５回，及び３０回分裂させることにより，細胞数はそれぞれ，１×１０６倍以上，３×１０７倍以上，及び１×１０９倍以上にまで増加する。
〔製剤の製造〕
生産培養終了後，マイクロキャリアは，細胞が接着した状態で回収され，その状態で洗浄される。このときマイクロキャリアを洗浄するための洗浄液として用いることのできる溶液には，細胞に障害を与えず，且つ，セリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼ，特にトリプシンの酵素活性を阻害することがないものである限り特に限定はないが，生理食塩水，ＰＢＳ，ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（血清不含），表４に示す組成を有する洗浄溶液が好適であり，例えば，ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（血清不含）を用いることができる。
洗浄後のマイクロキャリアは，プロテアーゼにより処理される。このとき用いられるプロテアーゼには，蛋白質性の細胞接着分子を分解できるものである限り特に限定はないが，セリンプロテアーゼ，メタロプロテアーゼ又はその混合物が好ましく，セリンプロテアーゼとしてはトリプシンが好適なものの一つであり，メタロプロテアーゼとしてはゼラチナーゼが好適なものの一つである。プロテアーゼ処理することにより，細胞がマイクロキャリアから遊離する。また，マイクロキャリアの素材がゼラチン等の蛋白質である場合は，プロテアーゼ処理により，マイクロキャリア自体が分解される。このときマイクロキャリアが多孔性であれば，孔内の表面に固着した細胞もマイクロキャリアから遊離する。多孔性のゼラチンマトリックスのマイクロキャリアである場合，プロテアーゼで処理することにより，ゼラチンが分解されて，遊離した細胞とゼラチンの分解物を含む懸濁液が得られる。この場合，プロテアーゼとしてはトリプシン，ゼラチナーゼ，又はその混合物が特に好適である。
マイクロキャリアの素材がゼラチン等の蛋白質である場合，プロテアーゼにより，マイクロキャリアから遊離した細胞とマイクロキャリアの材料である蛋白質の分解物（素材がゼラチンであるときにはゼラチンの分解物）を含む懸濁液が得られる。遊離した歯髄由来細胞製剤を製剤化するには，細胞の洗浄操作により，この懸濁液からプロテアーゼ，マイクロキャリアの材料の分解物等の夾雑物を除くことが好ましい。以下，マイクロキャリアの材料がゼラチンである場合の，細胞の洗浄操作について詳述する。
プロテアーゼによる処理により得られた懸濁液は，遠心分離による回収と洗浄溶液による懸濁を繰り返して洗浄することができる。プロテアーゼ及び微細なゼラチンの分解物は，遠心分離により除くことができる。しかし，ゼラチンの分解物の中には遠心したときに細胞と共に沈殿する大きさの残渣もある。このようなゼラチンの粗大な残渣の除去は，膜ろ過等の手段により行うことができる。かかる観点から，膜ろ過を行う場合，そのろ過膜の孔径は，２０～８０μｍが好ましい。例えば，孔径が，２５μｍ，２６μｍ，２７μｍ，２８μｍ，３０μｍ，５０μｍ，７０μｍ，８０μｍのろ過膜を用いることができる。ろ過膜によるろ過は，大孔径のろ過膜でろ過した後に，小孔径のろ過膜でろ過することにより，ろ過膜の目詰まりを防止し効率よく行うことができる。例えば，最初に孔径が６０～１００μｍのろ過膜でろ過した後に，孔径が２５～５０μｍのろ過膜でろ過してもよく，最初に孔径が６０～７５μｍのろ過膜でろ過した後に，孔径が２５～３０μｍのろ過膜でろ過してもよい。ろ過膜によるろ過は，小孔径のろ過膜のみでろ過することによっても行うことができる。この場合に用いられるろ過膜の孔径は２５～５０μｍが好ましく，２５～３０μｍがより好ましく，例えば，孔径が，２５μｍ，２６μｍ，２７μｍ，２８μｍ，３０μｍのろ過膜である。このとき，ゼラチンの粗大な残渣はろ過膜を通過せず取り残され，ろ液中に細胞が回収される。但し，細胞を回収することなく細胞が懸濁されている溶液を，限外ろ過膜等を用いて後述する凍結保存液（製剤細胞用凍結保存液）に置き換えることにより，凍結前製剤細胞懸濁液を調整することもできる。
上記洗浄操作で用いられる洗浄溶液は，培地とプロテアーゼを十分に除くためのものであり，マイクロキャリアがゼラチン等の蛋白質である場合は，その分解物をも除くためのものである。かかる洗浄溶液の組成に特に限定はなく，生理食塩水，リン酸緩衝生理食塩水，酢酸リンゲル液，重炭酸リンゲル液等を用いることができるが，好ましくは，重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミンを添加した溶液である。酢酸リンゲル液及び重炭酸リンゲル液は市販のものを使用することができる。例えば，酢酸リンゲル液としてはＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（バクスター社），フィジオ１４０（大塚製薬社）を用いることができ，重炭酸リンゲル液としては，ビカーボン注（味の素社）を用いることができる。好適な重炭酸リンゲル液の成分組成及び電解質濃度の一例を表２及び表３にそれぞれ示す。
洗浄溶液の成分組成として好適な一例を表４に示す。また，洗浄溶液に含まれる電解質濃度として好適な一例を表５に示す。なお，表４及び表５に示される洗浄溶液の成分のうち，アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムは省くこともできる。
なお，プロテアーゼによる処理後に夾雑物を除去するために，遠心分離と膜ろ過を行う場合，遠心分離を先に行い，続いて膜ろ過を行ってもよく，膜ろ過を先に行い，続いて遠心分離を行ってもよいが，好ましくは膜ろ過を先に行い，続いて遠心分離を行う。
洗浄溶液で洗浄後の回収細胞は，凍結保存液（製剤細胞用凍結保存液）に懸濁した状態にされる。この懸濁液（凍結前製剤細胞懸濁液）を細胞凍結保存用容器に封入して凍結したものが，歯髄由来細胞製剤のうち，保存や輸送に最適の形態のものとなる。凍結前製剤細胞懸濁液の溶液部分（製剤細胞用凍結保存液）の組成は，哺乳動物細胞，特にヒトの多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を死滅させることなく凍結，解凍できるものである限り特に制限はない。製剤細胞用凍結保存液は細胞保護剤を含む。細胞保護剤は，例えば，細胞を凍結させるときに細胞内に氷の結晶が形成されて細胞が破壊されることを抑制する機能を有するものである。細胞保護剤として好適なものとして，ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），エチレングリコール，プロピレングリコール，セリシン，グリセロールが挙げられる。これらの２以上を組み合わせて細胞保護剤として使用することもできる。細胞保護剤としてジメチルスルホキシドを用いる場合，その濃度は好ましくは５～１５％（ｖ／ｖ）であり，より好ましくは９～１１％（ｖ／ｖ）であり，例えば１０％（ｖ／ｖ）である。凍結保存液は緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は，水溶液のｐＨを６～８，例えば６．８～７．８に調整することのできるものが好ましい。かかる緩衝剤としては，例えば，炭酸イオン，重炭酸イオン，クエン酸イオン及びナトリウムイオンを含有するものが挙げられる。製剤細胞用凍結保存液は更にヒト血清アルブミンを含んでもよい。ヒト血清アルブミンを用いる場合，その濃度は好ましくは４０～１００ｇ／Ｌであり，より好ましくは４６～５６ｇ／Ｌであり，例えば５１ｇ／Ｌである。
重炭酸リンゲル液にヒト血清アルブミン溶液とジメチルスルホキシドを添加したものは，製剤細胞用凍結保存液として好適なものの一例である。製剤細胞用凍結保存液は，好ましくは，塩化ナトリウムが５９～８０．４ｍＭ，塩化カリウムが２．３～３．０８ｍＭ，塩化カルシウム二水和物が０．８５～１．１６ｍＭ，塩化マグネシウム六水和物が０．２８～０．３８５ｍＭ，炭酸水素ナトリウムが１４～１９．２ｍＭ，クエン酸ナトリウムニ水和物が０．９４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンが４６～５６ｇ／Ｌ，アセチルトリプトファンナトリウムが３．７３～４．５５ｍＭ，カプリル酸ナトリウムが３．７４～４．５８ｍＭ，ＤＭＳＯが９～１１％（ｖ／ｖ）である。表６に示される中間体細胞用凍結保存液は，製剤細胞用凍結保存液としても好適に用いることができる。
すなわち，製剤細胞用凍結保存液は，概ね，中間体細胞用凍結保存液として用いることのできるものを，好適に用いることができる。例えば，その組成は，塩化ナトリウムが６５．８～８０．４ｍＭ，塩化カリウムが２．５２～３．０８ｍＭ，塩化カルシウム二水和物が０．９５～１．１６ｍＭ，塩化マグネシウム六水和物が０．３１５～０．３８５ｍＭ，炭酸水素ナトリウムが１５．７～１９．２ｍＭ，クエン酸ナトリウムニ水和物が１．０４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンが４６～５６ｇ／Ｌ，アセチルトリプトファンナトリウムが３．７３～４．５５ｍＭ，カプリル酸ナトリウムが３．７４～４．５８ｍＭ，ＤＭＳＯが９～１１％（ｖ／ｖ）である。表６に示されるものの他，塩化ナトリウムが７０．８～７１．３ｍＭ，塩化カリウムが２．７１～２．７３ｍＭ，塩化カルシウム二水和物が１．０１～１．０２ｍＭ，塩化マグネシウム六水和物が０．３３５～０．３４５ｍＭ，炭酸水素ナトリウムが１６．９～１７．０ｍＭ，クエン酸ナトリウムニ水和物が１．１２～１．１４ｍＭ，ヒト血清アルブミンが５３．６～５４．３ｇ／Ｌ，アセチルトリプトファンナトリウムが４．３６～４．４１ｍＭ，カプリル酸ナトリウムが４．３７～４．４３ｍＭ，ＤＭＳＯが１０．６～１０．９％（ｖ／ｖ）である。なお，これらのうち，アセチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウムは省くことができる。製剤細胞用凍結保存液の生理食塩水に対する浸透圧比は，好ましくは０．９～１．１である。
また，ナトリウムイオン，カリウムイオン，カルシウムイオン，マグネシウムイオン，炭酸水素イオン，クエン酸イオン，ヒト血清アルブミン，及びジメチルスルホキシドを含む溶液は，中間体細胞用凍結保存液として好適に用いることができる。例えば，ナトリウムイオンを９１～１１３ｍＭ，カリウムイオンを２．５２～３．０８ｍＭ，カルシウムイオンを０．９５～１．１６ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３１５～０．３８５ｍＭ，炭酸水素イオンを１５．６～１９．２ｍＭ，クエン酸イオンを１．０４～１．２８ｍＭ，ヒト血清アルブミンを４６～５６ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを９～１１％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。また例えば，ナトリウムイオンを１００～１０２ｍＭ，カリウムイオンを２．７１～２．７７ｍＭ，カルシウムイオンを１．０１～１．０３ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３３５～０．３４５ｍＭ，炭酸水素イオンを１６．９～１７．２ｍＭ，クエン酸イオンを１．１３～１．１５ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５２．２～５４．３ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０．３～１０．９％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。更に例えば，ナトリウムイオンを１０２ｍＭ，カリウムイオンを２．８０ｍＭ，カルシウムイオンを１．０５ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３５ｍＭ，炭酸水素イオンを１７．４ｍＭ，クエン酸イオンを１．１６ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５１ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。更に例えば，ナトリウムイオンを１０１ｍＭ，カリウムイオンを２．７７ｍＭ，カルシウムイオンを１．０３ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３４ｍＭ，炭酸水素イオンを１７．２ｍＭ，クエン酸イオンを１．１５ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５２ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。更に例えば，ナトリウムイオンを１００ｍＭ，カリウムイオンを２．７１ｍＭ，カルシウムイオンを１．０１ｍＭ，マグネシウムイオンを０．３４ｍＭ，炭酸水素イオンを１６．９ｍＭ，クエン酸イオンを１．１３ｍＭ，ヒト血清アルブミンを５３．６ｇ／Ｌ，及びジメチルスルホキシドを１０．７％（ｖ／ｖ）の濃度でそれぞれ含む溶液はその好適な一例である。
アセチルトリプトファン又はその塩を更に含む場合，その濃度は好ましくは３．７３～４．５５ｍＭ，より好ましくは４．２４～４．４１ｍＭであり，例えば，４．１４ｍＭ，４．２４ｍＭ，４．３６ｍＭ等である。カプリル酸又はその塩を更に含む場合，その濃度は好ましくは３．７４～４．５８ｍＭ，より好ましくは４．２５～４．４３ｍＭであり，例えば，４．１６ｍＭ，４．２５ｍＭ，４．３７ｍＭ等である。
製剤細胞用凍結保存液に懸濁させた状態の，懸濁液中における細胞密度に特に制限はないが，好ましくは５×１０６～８×１０７個／ｍＬであり，より好ましくは１．５×１０７～３×１０７個／ｍＬであり，更に好ましくは２．１×１０７～３．０×１０７個／ｍＬであり，例えば２．５×１０７個／ｍＬである。懸濁させた多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，細胞凍結保存用容器に分注した後，凍結保存される。
多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を，製剤細胞用凍結保存液に懸濁させた状態における，細胞懸濁液の組成は，懸濁させる細胞密度により異なるが，概ね，塩化ナトリウムが５９～６１ｍＭ，塩化カリウムが２．３～２．６ｍＭ，塩化カルシウム二水和物が０．８５～０．９８ｍＭ，塩化マグネシウム六水和物が０．２８～０．３２ｍＭ，炭酸水素ナトリウムが１４～１６ｍＭ，クエン酸ナトリウムニ水和物が０．９４～１．０８ｍＭ，ヒト血清アルブミンが４９～５０ｇ／Ｌ，アセチルトリプトファンナトリウムが４．０～４．１ｍＭ，カプリル酸ナトリウムが４．０～４．１ｍＭ，ＤＭＳＯが９～１１％（ｖ／ｖ）である。
１つの細胞凍結保存用容器に分注される細胞懸濁液の量は，適宜調整されるべきものであるが，好ましくは，１～２０ｍＬである。また，１つの細胞凍結保存用容器に分注される細胞数は，好ましくは５×１０６～９．２×１０８個である。
製剤細胞用凍結保存液に懸濁させた細胞の凍結保存のための好適な容器，細胞の凍結及び保存の手順及び条件は，中間体細胞の凍結保存について既に記載したのと同様である。
このようにして凍結保存した細胞は，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞を有効成分として含有してなる医薬（歯髄由来細胞製剤）として使用することが可能である。この場合，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は凍結状態で搬送し，使用時に解凍して患者に投与される。
生産培養を経て得られる歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，解凍直後の生存率が５０％以上であることが好ましく，６０％以上であることがより好ましく，７０％以上であることが更に好ましく，例えば，生存率が８０％以上，９０％以上，９５％以上であることが好ましい。適宜に設けた基準により，生存率がある一定の数値以上であるもののみを歯髄由来細胞製剤として，医薬として供するようにすることができる。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量増加が全体として観察される。また，当該細胞は，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加するのが全体として観察される。すなわち，当該細胞は，全体として観察したとき，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を備えている。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したときに，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性である。同様に，当該細胞は，ＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。例えば，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したときに，解凍直後若しくは解凍して培養したときの表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０が陽性であり，且つＣＤ３４が陰性であり，又は例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６は陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５は陰性である。
また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したときに，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性である。例えば，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したときに，解凍直後若しくは解凍して培養したときの表面抗原マーカーの発現パターンが，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であるものである。これらの表面抗原マーカーが陽性の細胞は，同種異型の個体に移植したときに，抗原として認識されて生体内から排除される傾向にあることが知られている。これらの表面抗原マーカーの少なくとも一つが陰性であることは，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞が，それだけ低免疫原性で，同種異型の個体に移植したときに，生体内から排除され難い傾向を有することを示している。また，これら表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となってもよい。例えば，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したとき，例えば，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。
また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したときに，解凍直後若しくは解凍して培養したときの表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。ＩＦＮ－γで細胞を刺激したとき，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－１）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ５９，及びＣＤ１６４の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは８０％以上，より好ましくは９０％以上，更に好ましくは９５％以上で陽性である。
又，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－２）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ９，ＣＤ１３，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５８，ＣＤ６３，ＣＤ７３，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ９８，ＣＤ１４７，ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ及びＥＧＦ－Ｒの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは７０％以上，より好ましくは８０％以上，更に好ましくは９０％以上で陽性である。
又，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－３）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ４９ｅ，ＣＤ５５，ＣＤ９５，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６６の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６５％以上，より好ましくは７５％以上で陽性であり，更に好ましくは８０％以上で陽性である。
又，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－４）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０，ＣＤ４９ｆ，ＣＤ１０５，及びＣＤ１４０ｂの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陽性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは６０％以上，より好ましくは７０％以上で陽性であり，更に好ましくは７５％以上で陽性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，好ましくは，上記の（ｄ－１），（ｄ－２），（ｄ－３），及び（ｄ－４）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｄ－１）及び（ｄ－２）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－５）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｄ，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤ８ａ，ＣＤ８ｂ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１５，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１８，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２４，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ３０，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３５，ＣＤ３７，ＣＤ３８，ＣＤ４１ａ，ＣＤ８６，ＣＤ８７，ＣＤ８８，ＣＤ８９，ＣＤｗ９３，ＣＤ９４，ＣＤ１００，ＣＤ１０２，ＣＤ１０３，ＣＤ１１４，ＣＤ１１７，ＣＤ１１８，ＣＤ１２０ｂ，ＣＤ１２１ｂ，ＣＤ１２２，ＣＤ１２３，ＣＤ１２４，ＣＤ１２６，ＣＤ１２７，ＣＤ１２８ｂ，ＣＤ１３２，ＣＤ１３４，ＣＤ１３５，ＣＤ１３７，ＣＤ１３７リガンド，ＣＤ１３８，ＣＤ１４４，ＣＤ１５０，ＣＤ１５３，ＣＤ１５４，ＣＤ１５８ａ，ＣＤ１５８ｂ，ＣＤ１６１，ＣＤ１６２，ＣＤ１６３，ＣＤ１７２ｂ，ＣＤ１７７，ＣＤ１７８，ＣＤ１８０，ＣＤ１８４，ＣＤ１９５，ＣＤ１９６，ＣＤ１９７，ＣＤ２０５，ＣＤ２０６，ＣＤ２１０，ＣＤ２１２，ＣＤ２２０，ＣＤ２２６，ＣＤ２２９，ＣＤ２３１，ＣＤ２３５ａ，ＣＤ２４４，ＣＤ２５５，ＣＤ２６７，ＣＤ２６８，ＣＤ２７８，ＣＤ２７９，ＣＤ２８２，ＣＤ２９４，ＣＤ３０５，ＣＤ３０９，ＣＤ３１４，ＣＤ３２１，ＣＤｗ３２７，ＣＤｗ３２８，ＣＤ３２９，ＣＤ３３５，ＣＤ３３６，ＣＤ３３７，ＢＬＴＲ－１，ＣＬＩＰ，ＣＭＲＦ－４４，ＣＭＲＦ－５６，ｆＭＬＰ－Ｒ，ＳＳＥＡ－１，ＴＲＡ－１－６０，ＣＬＡ，インテグリンβ７，及びＩｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下，更に好ましくは２％以下，より更に好ましくは１％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－６）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１ｂ，ＣＤ６，ＣＤ２７，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ａ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４３，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４８，ＣＤ５０，ＣＤ５３，ＣＤ５７，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６４，ＣＤ６６ｂ，ＣＤ６６ｆ，ＣＤ６９，ＣＤ７０，ＣＤ７２，ＣＤ７５，ＣＤ８４，ＣＤ８５，ＣＤ９７，ＣＤ９９Ｒ，ＣＤ１８３，ＣＤ１９３，ＳＳＥＡ－３，及びγδＴＣＲの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下，更に好ましくは２％以下の細胞で陽性でのみある。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－７）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４ｖ４，ＣＤ１４，ＣＤ３６，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ），ＣＤ７９ｂ，ＣＤ８３，ＣＤ１０６，ＣＤ１５２，ＣＤ２０９，ＣＤ２７１，ＣＤ２７５，ＣＤ３２６，ＭＩＣ Ａ／Ｂ，及びαβＴＣＲの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは１０％以下，より好ましくは５％以下の細胞で陽性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，
（ｄ－８）全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ２６，ＣＤ４０，ＣＤ５６，ＣＤ８０，ＣＤ１４６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てが陰性である。ここで，これらの抗原は，全体に含まれる個々の細胞を観察したときに，観察した細胞の好ましくは２０％以下，より好ましくは１０％以下の細胞でのみ陽性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，好ましくは，上記の（ｄ－１），（ｄ－２），（ｄ－３），（ｄ－４），（ｄ－５），（ｄ－６），（ｄ－７），及び（ｄ－８）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｄ－１）及び（ｄ－５）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，全体として観察したとき，解凍直後若しくは解凍後の培養において，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その発現量が増加する。
また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＩＦＮ―γの存在下で培養したときに，キヌレニンの分泌量を増加させるものである。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３４，及びＣＤ２０６の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。また，本発明の一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５，ＣＤ２０６，ＣＤ２３５ａ，及びＳＳＥＡ－１の少なくとも一つ又はすべてが陰性である
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＣＤ１９，ＣＤ２６，ＣＤ３４，ＣＤ５６，ＣＤ１０６，ＣＤ１１７，ＣＤ１４６，及びＣＤ２７１の少なくとも一つが陰性，例えばこれらの全てが陰性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１４０ｂ及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つが陽性，例えばこれらの全てが陽性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０，ＣＤ４９ｅ及びＣＤ９５の少なくとも一つが陽性，例えばこれらの全てが陽性である。
本発明の一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５５，ＣＤ５８，及びＣＤ５９の少なくとも一つ，例えばこれらの全てが陽性である。
本発明の一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。
また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，解凍直後若しくは解凍して培養したときにおいて全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性である。また，ＩＦＮ―γで細胞を刺激したとき，例えば，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は陽性となる。また，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その分泌量が増加する。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，種々の液性因子を分泌するものである。
（ｄ－９）一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，及びシスタチンＣの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ｄ－１０）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＩＬ－８，ＧＲＯα，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＶＣＡＭ－１，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ｄ－１１）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，これを培養したときに，ＩＬ－２３，ＩＦＮ－α，ＴＮＦ－α，ＩＬ－１８，ＩＬ－２７，ＴＡＲＣ，ＥＮＡ－７８，ＭＩＰ－３α，ＭＩＰ－１β，ＩＰ－１０，ＳＣＦ，及びＩＣＡＭ－１の少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現するものである。
（ｄ－１２）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときに，ＩＬ－２１，Ｅｏｔａｘｉｎ，ＭＩＰ－１α，ＭＩＧ，Ｉ－ＴＡＣ，ＩＰ－１０，及びＧＭ－ＣＳＦの少なくとも一つ，好ましくはこれらの全てを発現しないか，ほとんど発現しないものである。
（ｄ－１３）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを培養したときの，ＩＬ－６，ＩＬ－２３，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＥＮＡ－７８，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，シスタチンＣ，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１の発現量の少なくとも一つが，中間体細胞の発現量と比較して増加するものである。例えば，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＨＧＦ，ＴＩＭＰ－３，及びＴＩＭＰ－１の発現量が，中間体細胞の発現量と比較して増加するものである。
（ｄ－１４）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－６の発現量が増加するものである。
（ｄ－１５）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－１１の発現量が増加するものである。
（ｄ－１６）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＩＰ－１０の発現量が増加するものである。
（ｄ－１７）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下，又はＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，これらの無存在下で培養したときに比較して，ＭＣＰ－１の発現量が増加するものである。
（ｄ－１８）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，ＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されるが，ＩＦＮ－γ存在下で培養したときには，ＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されないものである。
（ｄ－１９）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＨＧＦの発現量が減少する一方，これをＩＦＮ－γ存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＨＧＦの発現量が増加するものである。
（ｄ－２０）また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これをＴＮＦ－α存在下で培養したときに，その無存在下で培養したときに比較して，ＩＬ－８の発現量が増加するものである。
一実施形態において，本発明の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞，好ましくは，上記の（ｄ－９）乃至（ｄ－２０）で示される特徴の２以上，より好ましくは３以上，更に好ましくは４以上，なおも更に好ましくはこれら全ての特徴を有するものである。例えば，上記の（ｄ－９）及び（ｄ－１６）で示される特徴を有する細胞，上記の（ｄ－９），（ｄ－１５）及び（ｄ－１６）で示される特徴を有する細胞は，本発明の好適な一実施形態である。
また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，解凍直後若しくは解凍して培養したときにおいて全体として観察したとき，軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合に，アグリカンの発現量が増加する。また，当該多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養した場合，全体として観察したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加する。すなわち，当該多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，軟骨細胞及び骨細胞への分化能を有する。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞が軟骨細胞への分化能及び骨細胞への分化能を有することは，それぞれ実施例２０及び実施例１９に記載の方法で調べることができる。これらの方法により軟骨細胞への分化能と骨細胞への分化能を有することが確認された細胞群のみを，製品として医療機関等に供給するようにすることができる。
適宜設けた基準により，所定の表面抗原マーカーの発現パターン及び／又は遺伝子発現パターンを示す細胞のみを歯髄由来細胞製剤として保存するようにすることができる。
また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，解凍直後若しくは解凍して培養したときにおいて全体として観察したとき，ほとんどが歯髄由来多能性幹細胞で占められている。平面培養中の歯髄由来多能性幹細胞は，光学顕微鏡下で略紡錘形の固着細胞として観察される。光学顕微鏡下で観察したときの，平面培養中の細胞全体に占める略紡錘形の細胞の比率は，好ましくは９９％以上であり，より好ましくは９９．５％以上であり，更に好ましくは９９．９％以上であり，より更に好ましくは９９．９５％以上である。適宜設けた基準により，略紡錘形の細胞の比率が，ある一定以上である歯髄由来細胞製剤のみを，製品として医療機関等に供給するようにすることができる。
また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを解凍して培養したときに，３回以上の細胞分裂能を有するものであり，好ましくは４回以上，より好ましくは５回以上，更に好ましくは１０回以上の細胞分裂能を有するものである。また，歯髄由来細胞製剤は，これを解凍して細胞培養プレート上で培養したときの平均倍化時間が，好ましくは９６時間以内であるものであり，より好ましくは８４時間以内のものであり，更に好ましくは７２時間以内のものであり，更により好ましくは４８時間以内のものであり，更により好ましくは３６時間以内のものである。このときの細胞の培養条件は，上記の多能性幹細胞富化歯髄由来細胞と同一若しくは同等のもの，例えば実施例５に記載の条件が用いられる。適宜設けた基準により，細胞分裂能が，ある一定以上である歯髄由来細胞製剤のみを，製品として医療機関等に供給することができる。また，適宜設けた基準により，平均倍化時間が，ある一定の時間内である歯髄由来細胞製剤のみを，製品として医療機関等に供給することもできる。かかる基準としては，例えば，３回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるもの，４回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるもの，５回以上の細胞分裂能を有し平均倍化時間が７２時間以内であるものである。
すなわち，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，高い分裂能を有し且つ２種以上の細胞に分化できるという幹細胞の性質を保持するものである。更なる培養工程に供される中間体細胞は，高いコロニー形成能を有する細胞ということもできる。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境下で，好ましくは１６回以上の細胞分裂を経たものであり，例えば２１回以上，２２回以上，又は２３回以上の細胞分裂を経たものである。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを解凍したときに，溶液中，例えば培地中に浮遊させた状態でのその直径の平均が２０μｍ以下，１８μｍ以下であり，例えば，１０～２０μｍ，１０～１８μｍ，１２～２０μｍ，１４～２０μｍ，１６～２０μｍである。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の品質検査の項目を以下に品質検査ａ’～ｋ’として例示する。品質検査は，これらの項目の１又は２以上について行われる。これらの項目の全てを実施してもよい。このとき品質検査に供される細胞は，（１）歯髄由来細胞製剤として凍結保存液に懸濁させる前の細胞の一部を分取した細胞，（２）歯髄由来細胞製剤として凍結保存液に懸濁させる前の細胞の一部を分取し，これを更に継代させた細胞，（３）歯髄由来細胞製剤として凍結させるために凍結保存液に懸濁させた凍結前の細胞，（４）歯髄由来細胞製剤として凍結させたものを解凍した直後の細胞，又は（５）歯髄由来細胞製剤として凍結させたものを解凍し更に培養して得られた細胞，の何れかである。特に指定のない限り，これら（１）～（５）の細胞の２種以上について同一の品質検査を行ってもよい。
（品質検査ａ’）光学顕微鏡下で観察したときに，細胞全体に占める略紡錘形の形態を示す細胞数の割合が，９９％以上，９９．５％以上，９９．９％以上，又は９９．９５％以上であることの検証。
（品質検査ｂ’）細胞の生存率が，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，又は９５％以上であることの検証。
（品質検査ｃ’）細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５は陰性であることの検証，
又は，細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４が陰性であることの検証。
（品質検査ｄ’）細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性であることの検証。
（品質検査ｅ’）細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となることの検証，又は
細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＩＦＮ－γで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０が陰性，ＣＤ８０が陰性，ＣＤ８６が陰性，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であることの少なくとも一つの検証。
（品質検査ｆ’）細胞が，プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現するものであり，且つプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することにより，その発現量が増加することの検証。
（品質検査ｇ’）軟骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したときに，アグリカンの発現量が増加することの検証。
（品質検査ｈ’）骨細胞への分化を誘導することの知られている物質を含有する培地で培養したときに，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加することの検証。
（品質検査ｉ’）細胞培養プレート上で細胞が，３回以上，４回以上，又は５回以上の細胞分裂能を有することの検証。
（品質検査ｊ’）細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間が，該品質検査ｉ’の実施期間において，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であることの検証。
（品質検査ｋ’）細胞を培地中に浮遊させた状態での平均の直径が，２０μｍ以下，１８μｍ以下，１０～２０μｍ，１０～１８μｍ，１２～２０μｍ，１４～２０μｍ，又は１６～２０μｍであることの検証。
上記品質検査は，（品質検査ａ’）～（品質検査ｊ’）の任意の１０項目について実施してもよい。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の９項目を選択して実施してもよい。９項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，ｃ’，ｄ’，ｅ’，ｆ’，ｇ’，ｉ’，及びｊ’が選択されるが，限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の８項目を選択して実施してもよい。８項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，ｃ’，ｄ’，ｅ’，ｆ’，ｉ’，及びｊ’が選択されるが，限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の７項目を選択して実施してもよい。７項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，ｃ’，ｄ’，ｅ’，ｉ’，及びｊ’が選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の６項目を選択して実施してもよい。６項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，ｃ’，ｄ’，ｉ’，及びｊ’が選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の５項目を選択して実施してもよい。５項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，ｃ’，ｉ’，及びｊ’が選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の４項目を選択して実施してもよい。４項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，ｃ’，及びｊ’が選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の３項目を選択して実施してもよい。３項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’，ｂ’，及びｃ’が選択されるが，これに限定されることはない。また品質検査は，これら１０項目の中から，任意の２項目を選択して実施してもよい。２項目を選択して品質検査を実施する場合は，例えば，品質検査ａ’及びｂ’，品質検査ａ’及びｃ’，品質検査ａ’及びｄ’，品質検査ａ’及びｅ’，品質検査ａ’及びｆ’，品質検査ａ’及びｇ’，品質検査ａ’及びｈ’，品質検査ａ’及びｉ’，品質検査ａ’及びｊ’，品質検査ｂ’及びｃ’，品質検査ｂ’及びｄ’，品質検査ｂ’及びｅ’，品質検査ｂ’及びｆ’，品質検査ｂ’及びｇ’，品質検査ｂ’及びｈ’，品質検査ｂ及びｉ，品質検査ｂ及びｊ，品質検査ｃ及びｄ，品質検査ｃ及びｅ，品質検査ｃ’及びｆ’，品質検査ｃ’及びｇ’，品質検査ｃ’及びｈ’，品質検査ｃ’及びｉ’，品質検査ｃ’及びｊ’，品質検査ｄ’及びｅ’，品質検査ｄ’及びｆ’，品質検査ｄ’及びｇ’，品質検査ｄ’及びｈ’，品質検査ｄ’及びｉ’，品質検査ｄ’及びｊ’，品質検査ｅ’及びｆ’，品質検査ｅ’及びｇ’，品質検査ｅ’及びｈ’，品質検査ｅ’及びｉ’，品質検査ｅ’及びｊ’，品質検査ｆ’及びｉ’，品質検査ｆ’及びｊ’，または品質検査ｉ’及びｊ’が選択されるが，これらに限定されることはない。
本発明の多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞の製造方法は，歯髄に含まれる多能性幹細胞を培養し，増殖させた多能性幹細胞を中間体細胞として凍結保存させた後，これを解凍し更に培養し増殖させることにより歯髄由来細胞製剤を製造するものである。中間体細胞から歯髄由来細胞製剤を調製するまでの工程は，多能性幹細胞を粒子の表面に接着させた状態で培養するステップを含む。かかる工程が含まれることにより，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，中間体細胞と異なる性質を有するものとなる。
例えば，表面抗原の陽性率についてみると，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，中間体細胞と比較して，ＣＤ３９，ＣＤ４９ａ，ＣＤ６１，ＣＤ１０７ａ，ＣＤ１０７ｂ，及びＣＤ１４３のいずれか一つ又はこれらの全ての陽性率が高い。例えば，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，中間体細胞と比較して，ＣＤ１０７ｂの陽性率が高い。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のこれらの表面抗原の陽性率は，中間体細胞と比較して，好ましくは１０％以上高いものであり，より好ましくは２０％以上高いものである。また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，中間体細胞と比較して，ＣＤ１４６の陽性率が低い。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のＣＤ１４６の陽性率は，中間体細胞と比較して，２０％以上，又は５０％以上低い。
また例えば，液性因子の発現量についてみると，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，中間体細胞と比較して，ＩＬ－６，ＩＬ－２３，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＥＮＡ－７８，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，シスタチンＣ，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１のいずれか一つ又はこれらの全ての発現量が多い。特に，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，中間体細胞と比較して，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＨＧＦ，ＩＧＦＢＰ－４，ＴＩＭＰ－３，及びＴＩＭＰ－１のいずれか一つ又はこれらの全ての発現量が多い。特に，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，中間体細胞と比較して，ＩＬ－６及びＨＧＦのいずれか一つ又はこれらの全ての発現量が多い。
中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，高い分裂能を有し且つ２種以上の細胞に分化できるという幹細胞の性質を保持するものである。これらの細胞は，高いコロニー形成能を有する細胞ということもできる。
中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５の少なくとも一つが陰性である。また，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，例えば，ＣＤ７３及びＣＤ９０が陽性であり，且つＣＤ３４が陰性である。この発現パターンは，間葉系幹細胞と共通する。しかし，特徴的な性質も有する。
本発明の一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３４，及びＣＤ２０６の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。また，本発明の一実施形態において，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７，ＣＤ８１，及びＣＤ１４７の少なくとも一つ又はすべてが陽性であり，且つＣＤ１９，ＣＤ３１，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ４５，ＣＤ２０６，ＣＤ２３５ａ，及びＳＳＥＡ－１の少なくとも一つ又はすべてが陰性である。
一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１９，ＣＤ２６，ＣＤ３４，ＣＤ１０６，ＣＤ１１７，及びＣＤ２７１の少なくとも一つが陰性，例えばこれらの全てが陰性である。また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＣＤ１９，ＣＤ２６，ＣＤ３４，ＣＤ５６，ＣＤ１０６，ＣＤ１１７，ＣＤ１４６，及びＣＤ２７１の少なくとも一つが陰性，例えばこれらの全てが陰性である。これらの中で，ＣＤ１０６は，機能が十分に解明されていないものの，炎症部位の血管内皮細胞で発現していることから，炎症性シグナルの活性化に関与していると考えられる。これらの表面抗原の発現パターンは，一般的に高いコロニー形成能を有する幹細胞で知られているものと相違するが，それでもなお，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞が，高いコロニー形成能を有することは驚くべきことである。
一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１４０ｂ及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃの少なくとも一つが陽性，例えばこれらの全てが陽性である。
一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４９ｅ及びＣＤ９５の少なくとも一つが陽性，例えばこれらの全てが陽性である。
一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ１０が陽性である。ＣＤ１０の機能は十分に解明されていないが，エンケファリンやサブスタンスＰなどの炎症関連物質及び，炎症関連ペプチドを分解することで炎症反応の収束に関与している可能性がある。
また，一実施形態において，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，中間体細胞と比較してＣＤ３９の陽性率が高い。また，これらの細胞は，何れもＣＤ７３が陽性である。ＣＤ３９はＣＤ７３と協働してＡＴＰをアデノシンに変換することにより細胞外アデノシン濃度を上昇させる。アデノシンは免疫反応を負に制御して炎症を抑制する機能を有する。この機能は，ＣＤ３９の陽性率の高い歯髄由来細胞製剤において，中間体細胞と比較して高いと考えられる。
また，一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４６が陽性である。ＣＤ４６は補体（Ｃ３）の活性を抑制することにより，補体依存性細胞障害の回避に関与していると考えられる。
また，一実施形態において，これらの細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４７が陽性である。ＣＤ４７は，細胞にマクロファージによる貪食への抵抗性を付与する。
また，一実施形態において，これらの細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ５５が陽性である。ＣＤ５５は，補体の古典的経路または第二経路を調節する機能を有し，補体による細胞障害の回避に関与していると考えられる。
また，一実施形態において，これらの細胞は，これを全体として観察したとき，表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ５８が陽性である。ＣＤ５８の機能は十分に解明されていないが，制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を誘導することにより，炎症反応の収束に寄与することが示唆されている。
また，一実施形態において，これらの細胞は，ＣＤ５９が陽性である。ＣＤ５９は，補体（Ｃ９）に作用することで膜障害複合体の形成を阻害することにより，補体による細胞障害の回避に関与していると考えられる。
中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，種々の液性因子を分泌するものである。一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，シスタチンＣ，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＩＬ－８，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子），ＴＩＭＰ－１，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－３の少なくとも一つ，例えばこれらの全てを分泌する。これらに加えて，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＧＲＯα，ＶＣＡＭ－Ｉ，及びＩＰ－１０の少なくとも一つ，例えばこれらの全てを分泌する。
一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＩＬ－６を分泌する。ＩＬ－６の分泌量は，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激により増加する。ＩＬ－６は，炎症性サイトカインとしても知られているが，ＩＬ－６欠損マウスで肝臓における炎症反応が悪化すること等が知られており，抗炎症作用を有すると考えられる。
中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，種々の液性因子を分泌するものである。一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＩＬ－１１を分泌する。ＩＬ－１１の分泌量は，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激により増加する。ＩＬ－１１は，炎症性サイトカインの分泌を抑制することにより，抗炎症作用を示すと考えられる。
中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，種々の液性因子を分泌するものである。一実施形態において，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，ＩＰ－１０を分泌する。ＩＰ－１０の分泌量は，ＴＮＦ－α刺激，及びＩＦＮ－γ刺激により増加する。ＩＰ－１０は，炎症性サイトカインの分泌を抑制することにより，抗炎症作用を示すと考えられる。
歯髄由来細胞は，抗炎症作用等の機能を有する。上記の表面抗原，液性因子，及びその他の要素の，一部又はすべてが協働してその機能が発揮される。
本発明の歯髄由来細胞製剤を有効成分として含む医薬組成物は，種々の疾患の治療薬として用いることができる。例えば，歯髄由来細胞製剤は，自己免疫疾患，炎症性疾患，間節リウマチ，クローン病，慢性炎症性腸疾患，心筋梗塞，脳梗塞（慢性期脳梗塞，急性期脳梗塞を含む），慢性炎症性脱髄性多発性神経炎，多発性硬化症，全身性エリテマトーデス，肝硬変（非代償性肝硬変を含む），敗血症，骨関節炎，乾癬，および器官移植片拒絶を含む群から選択される疾患または障害の治療及び予防に用いることができる。自己免疫疾患等の治療薬として用いることのできる細胞製剤として，間葉系幹細胞等の幹細胞を含むものが知られている。しかしながら，既知の細胞製剤は，全ての患者に顕著な治療効果を示すものではなく，その用法も限定的である。本発明の歯髄由来細胞製剤は，自己免疫疾患等の治療薬として用いることのできる細胞製剤に多様性を加えるものである。例えば，既知の細胞製剤により治療効果が得られなかった患者，既知の細胞製剤では治療効果が証明されていない疾患に罹患した患者の治療剤として，本発明の歯髄由来細胞製剤を用いることにより，かかる患者に新たな治療機会を提供することができる。
歯髄由来細胞製剤は，上記疾患に罹患する患者に，点滴静注，局所注射等の手段により投与される。
歯髄由来細胞製剤は用時解凍して用いられる。使用時に，歯髄由来細胞製剤は，液体窒素保存容器から取り出され，解凍される。解凍は，例えば，３６．５～３７．５℃のウォーターバス内で加温することにより行う。解凍後の歯髄由来細胞製剤は，医薬品として点滴静注，局所注射等の手段によりヒトに投与することができる。点滴静注の場合，歯髄由来細胞製剤はバイアルから透析バッグに移されてから患者に点滴静注により投与される。局所注射の場合，歯髄由来細胞製剤はバイアルからシリンジに移されてから，患者の局所に注射される。
歯髄由来細胞製剤の使用前の解凍は，医療機関において実施されることが想定される。歯髄由来細胞製剤の医療機関への供給は，例えば以下のようにして行われるが，これに特に限定されるものではない。歯髄由来細胞製剤は，その製造業者，販売業者等の保管庫で凍結保存されたものが，医療機関の求めに応じて凍結状態で出荷されて医療機関まで輸送される。医療機関に凍結された状態で搬入された製剤は，患者に投与する直前に解凍され，そうして静脈注射等により患者に投与される。歯髄由来細胞製剤を凍結したままで取り扱う装置として，移動式低温作業台（ＷＯ２０１７／０９９１０５）は好適に用いることができる。
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１：培地および試薬の調製〕
ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地：ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（グルコース濃度５．５６ｍＭ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にＦＢＳ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を終濃度が１０％となるように添加したもの。
ＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）培地：ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅ（グルコース濃度５．５６ｍＭ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にＦＢＳ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を終濃度が２０％となるように添加したもの。
ストレプトマイシン水溶液：硫酸ストレプトマイシンを終濃度０．０１ｇ／ｍＬとなるように純水に溶解したもの。
プロテアーゼ溶液：リベラーゼ ５ｍｇ（Ｒｏｃｈｅ社）にＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅを加えて終濃度２．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したもの。プロテアーゼとしてコラゲナーゼＩ，コラゲナーゼＩＩ及びテルモリシンを含有する溶液である。
ＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）ストレプトマイシン培地：ＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）培地とストレプトマイシン溶液とを，体積比で，１００：１で混和したもの。
トリプシン－ＥＤＴＡ溶液：０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。
１％クロルヘキシジングルコン酸塩溶液：５％（ｗ／ｖ）フェルマジン溶液（シオエ製薬社）を注射用水で５倍希釈したもの。
重炭酸リンゲル液：下記の表７及び表８に示す組成を有するビカーボン輸液（エイワイファーマ社）
Figure 2024103800000007
Figure 2024103800000008
ヒト血清アルブミン溶液：下記の表９に示す組成を有する献血アルブミン２５－ニチヤク（日本製薬社）
Figure 2024103800000009
洗浄溶液：ヒト血清アルブミンの終濃度が１．１９％（ｗ／ｖ）となるように，１０００ｍＬの重炭酸リンゲル液（ビカーボン輸液，エイワイファーマ社）に２５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン溶液（日本製薬社）を５０ｍＬ添加したもの。表１０及び表１１に洗浄溶液の組成を示す。
Figure 2024103800000010
Figure 2024103800000011
細胞保護液：重炭酸リンゲル液（ビカーボン輸液，エイワイファーマ社）とヒト血清アルブミン２５％溶液とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｍｙｌａｎ社）を，体積比で，１１：９：５となるように混合したもの。
Figure 2024103800000012
〔実施例２：ヒト抜歯体からの歯髄の取得〕
インフォームドコンセントを得て取得した１個のヒト抜歯体（第３大臼歯）を，重炭酸リンゲル液（ビカーボン注）で軽く洗浄した後，１％クロルヘキシジングルコン酸塩溶液を用いて抜歯体の表面を殺菌した。次いで，抜歯体を砕いてから歯髄を他の組織から切除した。
〔実施例３：歯髄の酵素処理〕
実施例２で得られた歯髄に，ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅで約１０倍希釈したプロテアーゼ溶液を添加した後，３７℃に設定したウォーターバス内で，十分に組織が分解されたことが目視により確認されるまで放置した。
次いで，酵素処理後の細胞の全量を遠心管に移し，ＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）ストレプトマイシン培地を添加して酵素反応を停止させてから，遠心して組織片，細胞等を沈殿させた。上清を除去し，得られた沈殿物にＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）ストレプトマイシン培地を添加して組織片，細胞等を懸濁させ，再度遠心して細胞等を沈殿させた。沈殿物にＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）ストレプトマイシン培地を添加し，ピペッティングで緩やかに細胞を懸濁させて，組織片，歯髄由来細胞等を含む歯髄懸濁物を得た。
〔実施例４：歯髄懸濁物の培養〕
実施例３で調製した歯髄懸濁物を細胞培養プレートに添加し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養を開始した。ＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ）ストレプトマイシン培地を２～４日毎に交換しながら，該プレート上に形成されたコロニーが目視により確認されるまで，培養を継続した。
〔実施例５：歯髄由来細胞の培養〕
コロニーが目視により確認された細胞培養プレートから培地を取り除き，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を細胞の表面が同溶液で覆われるように添加し，３７℃で５～１０分間静置して細胞を剥離させた。次いで，細胞培養プレートにＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を遠心管に回収した。回収した細胞を遠心（３００×ｇ，５分）して沈殿させ，上清を除去した。遠心管にＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加し細胞を懸濁させて細胞懸濁液とした。
細胞懸濁液に含まれる生細胞数を測定した後，３０００～２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように，細胞培養プレートに細胞を播種し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養を開始した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を２～４日毎に交換しながら，該プレート上で細胞がコンフルエントとなるまで，培養を継続した。
細胞がコンフルエントとなった細胞培養プレートから培地を除いた後，該プレートにトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を，細胞の表面が同溶液で覆われるように添加した。３７℃で５～１０分間該プレートを静置して細胞を剥離させた。次いで，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液と同量のＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を該プレートに添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を遠心管に回収した。回収した細胞を遠心（３００×ｇ，５分）して沈殿させ，上清を除去し，ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させた。
上記の細胞の回収と培養を繰り返し，生細胞数が１×１０８個以上となるまで細胞を増殖させた。この培養期間中の細胞の分裂回数（すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下での分裂回数）は１６～１７回であり，細胞の平均倍化時間は培養期間を通して２日（４８時間）以内であった。
〔実施例６：歯髄由来細胞（中間体細胞）の回収〕
実施例５における最後の培養で細胞がコンフルエントとなった細胞培養プレートから培地を除き，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を，細胞の表面が同溶液で覆われるように添加した。３７℃で５～１０分間静置し，細胞を剥離させた。次いで，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液と同量のＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を細胞培養プレートに添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を容器に回収し，遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。細胞を洗浄するため，洗浄溶液を５００ｍＬ～１０００ｍＬ添加して細胞を懸濁させた後，再度遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。この細胞の洗浄操作を繰り返して行い，最終的に遠心後の沈殿として細胞を回収した。こうして得られた細胞を中間体細胞とした。
〔実施例７：歯髄由来細胞（中間体細胞）の凍結〕
実施例６で調製した細胞の沈殿に洗浄溶液と細胞保護液を加えて，細胞濃度が１１×１０６個／ｍＬ（±５％）となるよう細胞を懸濁させた。こうして得られた細胞懸濁液を凍結保存用バイアル（素材：Ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ，Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ｖｉａｌ，Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に充填して密封した。この細胞懸濁液を中間体細胞懸濁液とした。中間体細胞懸濁液の溶液部分（中間体細胞用凍結保存液）に含まれる成分を表１３に示す。中間体細胞懸濁液を，プログラムフリーザーを用いて凍結させてから，液体窒素保存容器内に移して保存した。この凍結させた中間体細胞懸濁液を，中間体細胞凍結品とした。
Figure 2024103800000013
〔実施例８：歯髄由来細胞（中間体細胞）の解凍〕
実施例７で調製した歯髄由来細胞（中間体細胞）を充填したバイアルを液体窒素保存容器から取り出し，３６．５～３７．５℃のウォーターバス内で加温して解凍した。解凍した細胞懸濁液を遠心管に移し，３０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を加えて懸濁させた。遠心（３００×ｇ，５分）して細胞を沈殿させ，上清を除去した。次いで，ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を２０ｍＬ添加して中間体細胞を懸濁させた。
〔実施例９：歯髄由来細胞の生産培養（前培養）〕
実施例８で調製した細胞懸濁液に含まれる中間体細胞の生細胞数を測定した後，２００００細胞／ｃｍ２以下の密度となるように，細胞培養プレートに細胞を播種し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養を開始した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を２～４日毎に交換しながら，細胞培養プレート上で細胞がコンフルエントとなるまで，培養を継続した。なお，生細胞数から算出された解凍後の中間体細胞に含まれる細胞の生存率（生細胞数／全細胞数×１００％）は，概ね８５～９５％であった。
細胞がコンフルエントとなった細胞培養プレートの培地を除き，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を，細胞の表面が同溶液で覆われるように添加し，３７℃で５～６０分間静置し，細胞を剥離させた。次いで，同量のＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を細胞培養プレートに添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁させた。細胞懸濁液を容器に回収し，遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させた後，再度遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を再度懸濁させた。
細胞懸濁液に含まれる生細胞数を測定した後，２００００細胞／ｃｍ２以下の密度となるように，細胞培養プレートに細胞を播種し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養を開始した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を２～４日毎に交換しながら，該プレート上で細胞がコンフルエントとなるまで，培養を継続した。
上記の細胞の回収と培養を繰り返し，生細胞数が１×１０９個以上となるまで細胞を増殖させた。この中間体細胞の細胞培養プレート上での培養期間中の細胞の分裂回数は５～６回であり，細胞の平均倍化時間は培養期間を通して２日（４８時間）以内であった。
細胞がコンフルエントとなった細胞培養プレートの培地を除き，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を添加した。３７℃で５～６０分間静置し，細胞を剥離させた。次いで，ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を細胞培養プレートに添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を容器に回収した。回収した細胞を遠心して沈殿させ，上清を除去した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を５００ｍＬ～６００ｍＬ添加して細胞を懸濁させた後，再度遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を５００ｍＬ～６００ｍＬ添加して細胞を再度懸濁させた。
〔実施例１０：歯髄由来細胞の生産培養（バイオリアクターの準備）〕
電子天秤でマイクロキャリアを５０ｇ（±１．０ｇ）量りとって試薬瓶に入れ，ＰＢＳを２０００ｍＬを添加した後にオートクレーブで滅菌した。なお，マイクロキャリアは，粒径が１３０～１８０μｍ（水和時）である，細胞培養用のゼラチン素材のマイクロキャリアであり，オートクレーブで滅菌処理が可能なように耐熱性を持たせたものを用いた。
バイオリアクターにリアクター用５０Ｌバッグ，ベントフィルター，及びセンサーループをセッティングし，更に温度センサー，ｐＨメーターと溶存酸素計を設置した。バイオリアクター内（のバッグ）に１０ＬのＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地と５０ｇ（乾重量）のマイクロキャリアを加えて，撹拌しながら３７℃で加温した。なお撹拌は，同装置に設けられたインペラーを用いて行った。
〔実施例１１：歯髄由来細胞の生産培養（細胞のマイクロキャリアへの接着工程）〕
実施例９で調製した細胞懸濁液に含まれる生細胞数を測定した後，１０００～５０００細胞／ｃｍ３の密度となるようにバイオリアクター内に添加した。リアクター内を数分間撹拌した後，撹拌を停止させて１時間以上静置した。この撹拌と静置を繰り返して行い，細胞をマイクロキャリアへ接着させた。
〔実施例１２：歯髄由来細胞の生産培養（細胞培養工程）〕
接着工程終了後に，バイオリアクター内を撹拌して培養を開始した。培養中にバイオリアクター内を定期的に観察し，リアクターの底部にマイクロキャリアが沈降していた場合には，リアクター内の撹拌回転数を上げて，マイクロキャリアが培地中に浮遊状態になるようにした。
生産培養は，実施例１３に記載の測定により，生細胞数が５×１０９個以上となるまで細胞が増殖するまで行った。マイクロキャリアでの培養期間中の細胞の分裂回数は２～３回であり，細胞の平均倍化時間は，概ね３～６日であった。生産培養を経た細胞は，ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で少なくとも２３回の細胞分裂をしたものであり，２３～２７回の細胞分裂をしたものである。
〔実施例１３：歯髄由来細胞の生産培養（細胞数の測定）〕
マイクロキャリアを含む培養液をリアクター内から３０～４０ｍＬ採取して遠心管に移し，５分以上静置してマイクロキャリアを沈降させた後に上清を除いた。ＰＢＳを２５ｍＬ加えて細胞を懸濁させ，５分以上静置した後に上清を除いた。この操作を更に１回行った。上清を除去後，マイクロキャリアにトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を添加した。３７℃のウォーターバス内で５～１０分間振とうした後，トリプシン－ＥＤＴＡ溶液と同量のＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して反応を停止させるとともに細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を遠心（３００×ｇ，５分）して細胞を沈殿させ，上清を除去した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を１～５ｍＬ添加して細胞を懸濁させた後，細胞懸濁液に含まれる生細胞数を測定した。
〔実施例１４：歯髄由来細胞の生産培養（グルコース濃度及び乳酸濃度の測定）〕
培養中の細胞懸濁液をリアクター内から５～４０ｍＬ採取して遠心管に移し，細胞懸濁液を５分以上静置してマイクロキャリアを沈降させた後，上清の一部を新しい１．５ｍＬチューブに移した。マイクロシリンジを用いて上清を５０μＬ採取し，バイオセンサー（ＢＦ－７Ｄ，王子計測機器社）を用いて，上清中のグルコース濃度および乳酸濃度を測定した。グルコース濃度が低下した場合には，グルコースが０．１ｍＭ未満の濃度とならないようにグルコースを補充するか又は培地の全部または一部を交換した。また乳酸濃度が上昇した場合には，乳酸が２０ｍＭ以上の濃度とならないように培地の全部または一部を交換した。
〔実施例１５：生産培養で得た歯髄由来細胞の回収〕
所定の細胞数まで細胞が増殖したことを確認後，リアクターおよびセンサーループの撹拌を停止し，１０分以上静置してマイクロキャリアを沈降させた。可能な限りの量の上清を除去した後，残存する培地で細胞を懸濁させた。細胞懸濁液を１０Ｌバッグ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）内に回収し，５分以上静置してマイクロキャリアを沈降させた後に上清を除いた。
ＤＭＥＭ Ｌｏｗ Ｇｌｕｃｏｓｅを加えてマイクロキャリアを懸濁させ，５分以上静置してマイクロキャリアを沈降させた後に上清を除いた。この操作を数回繰り返して行った。次いで，上清を除去後のマイクロキャリアにトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を添加した。トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を添加後，３７℃のウォーターバス内で３０～６０分間振とうすることにより，細胞をマイクロキャリアから剥離させるとともに，マイクロキャリアを分解した。
細胞懸濁液に残存するマイクロキャリアの断片，細胞塊等を除去するため，回収したろ液を孔径２０～３５μｍのフィルターに通過させて，細胞をフィルターのろ液中に回収した。回収したろ液を遠心して細胞を沈殿させて，上清を除去した。細胞を洗浄するため，実施例１で調製した洗浄溶液を添加して細胞を懸濁させ，再度遠心して細胞を沈殿させて上清を除去した。この洗浄操作を，繰り返して行い，最終的に，遠心後の沈殿として細胞を回収した。
〔実施例１６：歯髄由来細胞の製剤化及び凍結保存〕
実施例１５で回収した細胞の沈殿に洗浄溶液と細胞保護液を加えて，細胞濃度が２５～３１×１０６個／ｍＬとなるように細胞を懸濁させた。こうして得られた細胞懸濁液を凍結保存用バイアル（素材：Ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ，Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ｖｉａｌ，Ａｓｅｐｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に充填して密封した。この細胞懸濁液を凍結前歯髄由来細胞製剤とした。凍結前歯髄由来細胞製剤の溶液部分（製剤細胞用凍結保存液）に含まれる成分を表１４に示す。
Figure 2024103800000014
バイアルに充填した凍結前歯髄由来細胞製剤を，常法によりプログラムフリーザーを用いて凍結してから，液体窒素保存容器内に移して保存した。この凍結させた細胞懸濁液を，歯髄由来細胞を有効成分として含む製剤（歯髄由来細胞製剤）とした。
〔実施例１７：歯髄由来細胞の性状（細胞の形態等）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を加えて軽く振り混ぜた後，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。上清を除去し，１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，再度遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁させ，５０００～１００００細胞／ｃｍ２の密度となるように，細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。位相差顕微鏡により，細胞培養プレート上での細胞の形態を観察した。中間体細胞凍結品及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞を培養したものは，全て略紡錘形の固着細胞であり，その他の形状の細胞を含まなかった。なお，生細胞数から算出された解凍後の中間体細胞凍結品及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の生存率（生細胞数／全細胞数×１００％）は，概ね８５～９５％であった。
〔実施例１８：歯髄由来細胞製剤の性状（粒子径）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，それぞれＤ－ＰＢＳ（－）溶液で希釈し，約５×１０６個／ｍＬの細胞希釈液を調製した。細胞粒子径は，生死細胞オートアナライザー（Ｖｉ－ＣｅｌｌＸＲ，ベックマン・コールター社）を用いた画像解析法により計測した。生死細胞オートアナライザーを用いた画像解析法について，以下に概略する。細胞希釈液にトリパンブルーを加えて細胞を染色し，この細胞希釈液を送液して細長い流路を通過させ，流路の顕微鏡拡大画像を複数枚撮影する。死細胞ではトリパンブルーが細胞膜を透過し染色されるため，それぞれの画像において，色付きの粒子として観察される細胞を死細胞，透明な粒子として観察される細胞を生細胞として計測する。細胞粒子径は，その画像上において計測される一の粒子の直径と，顕微鏡の拡大倍率とを用いて算出される。撮影した全ての画像における粒子径の値から平均値が求められる。
（結果）
細胞粒子径（細胞の直径）の平均値は，中間体細胞凍結細胞を解凍したものでは１７．３６μｍ±１．４０μｍ（平均値±ＳＤ，ｎ＝３），歯髄由来細胞製剤を解凍したものでは１６．９８±１．２３μｍ（平均値±ＳＤ，ｎ＝３）であった（図１）。
〔実施例１９：歯髄由来細胞の性状（骨細胞分化能）〕）
骨細胞分化能は，Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８４，１４３－７（１９９９），Ｃｏｌｔｅｒ ＤＣ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８，７８４１－５（２００１）の記載等を参考にして，下記の方法で調べた。
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤をそれぞれ解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁させ，５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように，細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。コラーゲンＩでコートされた２４ウェル細胞培養プレートに，細胞を，ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地中の細胞密度（１５０００～２５０００細胞／ｃｍ２）で播種して３日間培養した。細胞を２群に分け，一方の群の培地を，骨細胞分化用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にデキサメタゾン，Ｌ－グルタミン，アスコルビン酸塩，ペニシリン／ストレプトマイシン，ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＭＣＧＳ），β－グリセロフォスフェートを含む骨細胞分化用添加因子セット（Ｌｏｎｚａ社）を添加したものである骨細胞分化誘導培地に入れ換え，３～４日毎に培地交換しながら２～３週間分化培養を行った。この群を骨細胞分化誘導群とした。もう一方の群については，培地を新しいＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に入れ換え，３～４日毎に培地交換しながら２～３週間培養を行った。この群をコントロール群とした。骨細胞分化誘導群及びコントロール群の細胞をそれぞれ培養後，ＰＢＳで１回洗浄し，各ウェルに０．４ｍＬの１０％ギ酸を添加し室温で１時間静置して細胞に蓄積したカルシウムを細胞から遊離させた。遊離したカルシウム濃度を，カルシウムＥ－テストワコー（和光純薬社）を用いて定量した。
図２に測定結果を示す。中間体細胞凍結品，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のいずれも，骨細胞分化誘導群において，コントロール群と比較して，細胞のカルシウム濃度の上昇が認められた。この結果は，中間体細胞凍結品及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞が共に骨細胞へ分化したことを示しており，本発明の歯髄由来細胞が骨細胞への分化能を有することを示すものである。
〔実施例２０：歯髄由来細胞の性状（軟骨細胞分化能）〕
軟骨細胞分化能は，Ｋｉａｎｉ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １２ １９－３２（２００２），Ａｕｎｇ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．６３ １４８－５８（２０１１）の記載等を参考にして，下記の方法で調べた。
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁させ，５０００～１００００細胞／ｃｍ２の密度となるように，細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。細胞を２群に分け，一方の群の細胞を，軟骨細胞分化誘導培地であるＳｔｅｍ ＭＡＣＳ（登録商標）ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）に１×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁させ，これを低吸着性容器（ステムフル（登録商標），住友ベークライト社）に１ｍＬずつ播種し，スフェロイドを形成させた。３～４日毎に培地交換しながら２～３週間分化培養を行った。これを軟骨細胞分化誘導群とした。他方の群については，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を用いて継代培養し，これをコントロール群とした。
培養後，細胞を回収し，５５℃温浴中，３０分間プロテイナーゼＫで処理して細胞を溶解させた。溶解させた細胞からＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により全ＲＮＡを抽出して全ＲＮＡ抽出液を調製し，次いで吸光光度計（Ｄｅｎｏｖｉｘ社）を用いて全ＲＮＡ抽出液に含まれるＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡ濃度測定後，ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。さらにＰＣＲ反応液を調製し，各群のｃＤＮＡ ２５ｎｇを鋳型とし，〔（５０℃／２分）×１サイクル，（９５℃／１０分）×１サイクル，（９５℃／１５秒，６０℃／１分）×４０サイクル〕のＰＣＲ条件下でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行い，アグリカン遺伝子とβアクチン遺伝子を増幅させた。ＰＣＲプライマーには，アグリカンプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ００１５３９３６＿ｍ１）及びβアクチンプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／４３１０８８１Ｅ）をそれぞれ用いた。
図３に測定結果を示す。中間体細胞凍結品，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のいずれも，軟骨細胞分化誘導群で，コントロール群と比較してアグリカンのＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）が高いことが判明した。この結果は，軟骨細胞分化誘導群において，軟骨の細胞外マトリクスを構成する主要な分子であるアグリカンの発現量が増加したことを示すものであり，中間体細胞凍結品及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の何れもが軟骨細胞への分化能を有することを示すものである。
〔実施例２１：歯髄由来細胞の性状（表面抗原の測定－１）〕
歯髄由来細胞は，ヒト間葉系幹細胞と同じく略紡錘状の形状を示した。そこで，ヒト間葉系幹細胞で陽性であることが知られている表面抗原マーカーであるＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６，及び間葉系幹細胞で陰性であることが知られている表面抗原マーカーであるＣＤ３４とＣＤ４５の発現の有無を，フローサイトメーターを用いて調べた。
リン酸緩衝液生理食塩水ｐＨ７．４，ｃｏｎｔａｉｎｓ ＢＳＡ，ｐｏｗｄｅｒ（ＳＩＧＭＡ社）を純水に溶解し，０．４５μｍフィルターに通して，ＰＢＳ－Ｂ〔０．１３８Ｍ塩化ナトリウム，０．００２７Ｍ塩化カリウム，１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）〕を調製した。ＩｇＧ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ（ＳＩＧＭＡ社）をＰＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に溶解し，０．４５μｍフィルターに通して，２０ｍｇ／ｍＬ ＩｇＧ溶液を調製した。１８ｍＬのＰＢＳ－Ｂに，２ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬ ＩｇＧ溶液を加えて，ブロッキング溶液を調製した。
また，抗ＣＤ３４抗体としてＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（ａｎｔｉ－ＣＤ３４－ＦＩＴＣ，ＢＤ社），抗ＣＤ４５抗体としてＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ａｎｔｉ－ＣＤ４５－ＦＩＴＣ，ベックマンコールター社），抗ＣＤ７３抗体としてＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ７３抗体（ａｎｔｉ－ＣＤ７３－ＦＩＴＣ，ＢＤ社），抗ＣＤ９０抗体としてＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ９０抗体（ａｎｔｉ－ＣＤ７３－ＦＩＴＣ，ＢＤ社），抗ＣＤ１０５抗体としてＰＥ標識抗ヒトＣＤ１０５抗体（ａｎｔｉ－ＣＤ１０５－Ｒ－ＰＥ，ＢＤ社），抗ＣＤ１６６抗体としてＰＥ標識抗ヒトＣＤ１６６抗体（ａｎｔｉ－ＣＤ１６６－ＰＥ，Ａｎｃｅｌｌ社），及びコントロール抗体としてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ａｎｔｉ－ＩｇＧ１－ＦＩＴＣ，ベックマンコールター社）とＰＥ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ＩｇＧ１－ＰＥ，ベックマンコールター社）を用いた。
（細胞の染色方法）
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。上清を除去し，１０ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ生細胞数を測定した。細胞（１×１０７個）を５０ｍＬ遠心管に採取し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して沈殿させ，上清を除去した。ＰＢＳ－Ｂを加えて全量を１０ｍＬにして細胞を懸濁させた後，再度細胞を遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して沈殿させ，上清を除去した。次いで，細胞を１ｍＬのブロッキング溶液に懸濁させ，氷上で１時間静置した。９本の５ｍＬ反応チューブ（番号（１）～（９））に，各抗体溶液を表１５に示すとおり添加した。次いで，各チューブに，ブロッキング溶液に懸濁させた細胞の懸濁液を１００μＬずつ添加して軽く振り混ぜ，氷上で２０分間静置させて，各抗体溶液に含まれる抗体と細胞表面に発現する表面抗原マーカーとを結合させた。次いで，各チューブにＰＢＳ－Ｂを３ｍＬずつ添加して混和した後，細胞を遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して沈殿させて上清を除去し，細胞に結合していない抗体を除去した。この抗体の除去操作を３回繰り返した。各チューブにＰＢＳ－Ｂを４００μＬ加え細胞を懸濁させた。
Figure 2024103800000015
（測定及び解析）
チューブ番号（１）～（９）の細胞について，ＦＩＴＣ及びＰＥの各蛍光色素の量をＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）（ＢＤ社）で測定し，陰性コントロールとの比較により，表面抗原に特異的に結合した抗体を介して細胞表面に結合した蛍光色素の量を求めた。なお，チューブ（２）はチューブ（３）～（６），チューブ（７）は（８）及び（９）の陰性コントロールである。チューブ（１）は非染色細胞である。
図４に測定結果を示す。チューブ番号（５），（６），及び（８），（９）の細胞（それぞれ，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６染色細胞）についてみると，中間体細胞凍結品，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のいずれについても，これらの表面抗原について８５％以上の細胞で陽性であった。チューブ番号（３）と（４）の細胞（それぞれ，ＣＤ３４及びＣＤ４５染色細胞）についてみると，中間体細胞凍結品，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のいずれについても，これらの表面抗原についてほとんどの細胞が陰性であった。これらの結果は，歯髄由来細胞が，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，及びＣＤ１６６が陽性であり，ＣＤ３４とＣＤ４５が陰性であることを示すものである。
〔実施例２２：歯髄由来細胞の性状（表面抗原の測定－２）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，細胞懸濁液全量をＤＭＥＭ培地に加えた。遠心（３００×ｇ，５分間，室温）を行い，上清を除去後，ＤＭＥＭ培地を加えて懸濁した。次いで，細胞をＢＤ Ｌｙｏｐｌａｔｅ（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐａｎｅｌ，ＢＤ社）を用いて，表面抗原に対する抗体を用いて抗体染色した。抗体染色は，Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐａｎｅｌ（ＢＤ社）のプロトコルに従い実施した。以下にＨｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐａｎｅｌを用いた，表面抗原の測定方法の概略を説明する。９６ウェルプレートの各ウェルに，細胞懸濁液を分注する。各ウェルに各種表面抗原に対する抗体を一次抗体として添加して３０分静置し，表面抗原と抗体を結合させる。遠心して細胞を沈殿させて上清を除く。細胞を洗浄した後に，各ウェルに一次抗体に対する抗体を二次抗体として添加して３０分静置し，表面抗原と抗体を結合させる。二次抗体は，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７により蛍光標識されたものである。遠心して細胞を沈殿させて上清を除く。細胞を再懸濁し，この細胞懸濁液について，フローサイトメトリーを用いて，二次抗体の結合した細胞を陽性細胞として蛍光検出し，各表面抗原の陽性細胞の存在比率を求める。測定は，中間体細胞については９ロット，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞については，７ロットについて行い，各抗原について陽性比率を求めた。
（結果）
中間体細胞および歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞において，陽性であった表面抗原を図５，図６にそれぞれ示す。
中間体細胞では，ＣＤ４７，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ１４７，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃについては全てのロットで９５％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ２９，ＣＤ４６，ＣＤ５５，ＣＤ５９，ＣＤ７３，及びＣＤ１４０ｂについては，全てのロットで９０％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ９，ＣＤ４４，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ９８，及びＥＧＦ－Ｒについては，全てのロットで８０％以上の陽性率を示し，概ね９０％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ４９ｆ及びＣＤ１６６については，全ての細胞で７０％以上の陽性率を示し，概ね９０％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ１０，ＣＤ１３，ＣＤ５８，ＣＤ６３，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６４については，全ての細胞で６０％以上の陽性率を示し，概ね９０％以上の陽性率を示した（図５）。これらに加えて，中間体細胞ではＣＤ１０５も陽性である（図４）。
一方，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞では，ＣＤ２９，ＣＤ５９，ＣＤ４４，及びＣＤ１６４については，全てのロットで９５％以上の陽性率を示し，概ね９８％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ９，ＣＤ１３，ＣＤ４６，ＣＤ４７，ＣＤ５８，ＣＤ６３，ＣＤ７３，ＣＤ８１，ＣＤ９０，ＣＤ９８，ＣＤ１４７，ＥＧＦ－Ｒ，及びＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃについては，全てのロットで９０％以上の陽性率を示し，概ね９５％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ４９ｂ，ＣＤ４９ｃ，ＣＤ４９ｅ，ＣＤ５５，ＣＤ９５，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６６については，全てのロットで８０％以上の陽性率を示し，ＣＤ９５，ＣＤ１５１，及びＣＤ１６６を除き，概ね９０％以上の陽性率を示した。また，ＣＤ１０，ＣＤ４９ｆ，及びＣＤ１４０ｂでは，全てのロットで７０％以上の陽性率を示し，概ね８０％以上の陽性率を示した（図６）。これらに加えて，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞ではＣＤ１０５も陽性である（図４）。
次いで，中間体細胞および歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞において，陰性であった表面抗原を表１６，表１７にそれぞれ示す。
中間体細胞では，ＣＤ１２０ｂ，ＣＤ１３２，ＣＤ１５８ａ，ＣＤ１６１，ＣＤ１８４，ＣＤ１９５，ＣＤ２０６，ＣＤ２１０，ＣＤ２１２，ＣＤ２２６，ＣＤ２４４，ＣＤ２６７，ＣＤ２７８，ＣＤ２７９，ＣＤ２８２，ＣＤ２９４，ＮＫＢ１，ＳＳＥＡ－１，ＴＲＡ－１－６０，ＴＲＡ－１－８１，Ｖβ２３，ＳＳＥＡ－３，ＣＬＡ，及びインテグリンβ７については，全てのロットで１％以下の陽性率を示した。また，ＣＤ８ｂ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２４，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６６ｆ，ＣＤ８６，ＣＤ８８，ＣＤ９４，ＣＤ１００，ＣＤ１０３，ＣＤ１０４，ＣＤ１１４，ＣＤ１１７，ＣＤ１１８，ＣＤ１２１ｂ，ＣＤ１２２，ＣＤ１２３，ＣＤ１２４，ＣＤ１２６，ＣＤ１２７，ＣＤ１２８ｂ，ＣＤ１３５，ＣＤ１３７，ＣＤ１３７リガンド，ＣＤ１５０，ＣＤ１６３，ＣＤ１７２ｂ，ＣＤ１７７，ＣＤ１７８，ＣＤ１８０，ＣＤ１９７，ＣＤ２２０，ＣＤ２２９，ＣＤ２３１，ＣＤ２５５，ＣＤ２６８，ＣＤ３０５，ＣＤ３１４，ＣＤ３２１，ＣＤｗ３２７，ＣＤｗ３２８，ＣＤ３２９，ＣＤ３３５，ＣＤ３３６，ＢＬＴＲ－１，ＣＬＩＰ，ＣＭＲＦ－４４，ＣＭＲＦ－５６，ｆＭＬＰ－Ｒ，Ｖβ８，Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ，及びγδＴＣＲについては全てのロットで２％以下の陽性率を示し，概ね陽性率は１％以下であった。また，ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｂ，ＣＤ１ｄ，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ５，ＣＤ６，ＣＤ７，ＣＤ８ａ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１５，ＣＤ１８，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２５，ＣＤ２７，ＣＤ２８，ＣＤ３３，ＣＤ３５，ＣＤ３７，ＣＤ３８，ＣＤ４１ａ，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ４８，ＣＤ５０，ＣＤ５３，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６４，ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ），ＣＤ６９，ＣＤ７０，ＣＤ７２，ＣＤ７４，ＣＤ８４，ＣＤ８５，ＣＤ８７，ＣＤ８９，ＣＤｗ９３，ＣＤ９７，ＣＤ１３４，ＣＤ１３８，ＣＤ１４１，ＣＤ１４４，ＣＤ１５４，ＣＤ１５８ｂ，ＣＤ１６２，ＣＤ１８３，ＣＤ２０５，ＣＤ２３５ａ，ＣＤ３０９，ＣＤ３２６，ＣＤ３３７，及びαβＴＣＲについては，全ての細胞で５％以下の陽性率を示した。また，ＣＤ２６，ＣＤ１０６，及びＣＤ２７１については，一部のロットで５％を超える陽性率を示すものがあったが，陽性率の平均値は５％以下であった（表１６Ａ～表１６－Ｄ）。これらに加えて，中間体細胞ではＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原も陰性である（図４，図１１Ａ）。
歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞では，ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｄ，ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤ８ａ，ＣＤ８ｂ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１５，ＣＤ１５ｓ，ＣＤ１６，ＣＤ１８，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２４，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ３０，ＣＤ３１，ＣＤ３２，ＣＤ３３，ＣＤ３４，ＣＤ３５，ＣＤ３７，ＣＤ３８，ＣＤ４１ａ，ＣＤ８６，ＣＤ８７，ＣＤ８８，ＣＤ８９，ＣＤｗ９３，ＣＤ９４，ＣＤ１００，ＣＤ１０２，ＣＤ１０３，ＣＤ１１４，ＣＤ１１７，ＣＤ１１８，ＣＤ１２０ｂ，ＣＤ１２１ｂ，ＣＤ１２２，ＣＤ１２３，ＣＤ１２４，ＣＤ１２６，ＣＤ１２７，ＣＤ１２８ｂ，ＣＤ１３２，ＣＤ１３４，ＣＤ１３５，ＣＤ１３７，ＣＤ１３７リガンド，ＣＤ１３８，ＣＤ１４４，ＣＤ１５０，ＣＤ１５３，ＣＤ１５４，ＣＤ１５８ａ，ＣＤ１５８ｂ，ＣＤ１６１，ＣＤ１６２，ＣＤ１６３，ＣＤ１７２ｂ，ＣＤ１７７，ＣＤ１７８，ＣＤ１８０，ＣＤ１８４，ＣＤ１９５，ＣＤ１９６，ＣＤ１９７，ＣＤ２０５，ＣＤ２０６，ＣＤ２１０，ＣＤ２１２，ＣＤ２２０，ＣＤ２２６，ＣＤ２２９，ＣＤ２３１，ＣＤ２３５ａ，ＣＤ２４４，ＣＤ２５５，ＣＤ２６７，ＣＤ２６８，ＣＤ２７８，ＣＤ２７９，ＣＤ２８２，ＣＤ２９４，ＣＤ３０５，ＣＤ３０９，ＣＤ３１４，ＣＤ３２１，ＣＤｗ３２７，ＣＤｗ３２８，ＣＤ３２９，ＣＤ３３５，ＣＤ３３６，ＣＤ３３７，ＢＬＴＲ－１，ＣＬＩＰ，ＣＭＲＦ－４４，ＣＭＲＦ－５６，ｆＭＬＰ－Ｒ，ＳＳＥＡ－１，ＴＲＡ－１－６０，ＣＬＡ，インテグリンβ７，及びＩｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴについては，全てのロットで１％以下の陽性率を示した。また，ＣＤ１ｂ，ＣＤ６，ＣＤ２７，ＣＤ４１ｂ，ＣＤ４２ａ，ＣＤ４２ｂ，ＣＤ４３，ＣＤ４５，ＣＤ４５ＲＢ，ＣＤ４８，ＣＤ５０，ＣＤ５３，ＣＤ５７，ＣＤ６２Ｅ，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ６２Ｐ，ＣＤ６４，ＣＤ６６ｂ，ＣＤ６６ｆ，ＣＤ６９，ＣＤ７０，ＣＤ７２，ＣＤ７５，ＣＤ８４，ＣＤ８５，ＣＤ９７，ＣＤ９９Ｒ，ＣＤ１８３，ＣＤ１９３，ＳＳＥＡ－３，及びγδＴＣＲについては全てのロットで２％以下の陽性率を示し，概ね陽性率は１％以下であった。また，ＣＤ４ｖ４，ＣＤ１４，ＣＤ３６，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ６６（ａ，ｃ，ｄ，ｅ），ＣＤ７９ｂ，ＣＤ８３，ＣＤ１５２，ＣＤ２０９，ＣＤ２７５，ＣＤ３２６，ＭＩＣ Ａ／Ｂ，及びαβＴＣＲについては全てのロットで５％以下の陽性率を示し，概ね陽性率は２％以下であった。また，ＣＤ１０６及びＣＤ２７１については，一部のロットで５％を超える陽性率を示すものがあったが，陽性率の平均値は５％以下であった（表１７Ａ～表１７Ｅ）。これらに加えて，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞ではＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４５，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原も陰性である（図４，図１１Ｂ）。
Figure 2024103800000016
Figure 2024103800000017
Figure 2024103800000018
Figure 2024103800000019
Figure 2024103800000020
Figure 2024103800000021
Figure 2024103800000022
Figure 2024103800000023
Figure 2024103800000024
中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞において，陽性率に１０％以上の差があったものを図７に示す。実施例９～１５に記載の方法で，中間体細胞を更に培養して得られた歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞においては，中間体細胞と比較して，ＣＤ３９，ＣＤ４９ａ，ＣＤ６１，ＣＤ１０７ａ，ＣＤ１０７ｂ及びＣＤ１４３の陽性率が２０％以上増加する一方，ＣＤ１４６の陽性率が６０％低下した。これらの結果は，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞が，中間体細胞と異なる性質を有するものである。すなわち実施例９～１５に記載の方法により培養を行うことにより，中間体細胞と異なる新たな細胞として，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞を得ることができることを示す。
〔実施例２３：歯髄由来細胞の性状（（血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）分泌能試験）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁させ，５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように，細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地で０．７×１０５個／ｍＬの濃度で懸濁させた後，その１０ｍＬをＴ２５細胞培養プレートに播種し，５日間培養した。培養後，培養上清の全量を回収し，回収した培養上清の重量を電子天秤（島津製作所社）で計測し，測定時まで－８０℃で凍結保存した。上清を回収・除去した後，ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。
上記凍結保存した培養上清を解凍し，培養上清中に含まれるＶＥＧＦを，Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて標識した後，マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて検出した。既知の濃度のＶＥＧＦで作成した検量線に，得られた検出値を内挿して，培養上清中に含まれるＶＥＧＦ濃度を求めた。ＶＥＧＦの分泌量は，下記式により，細胞数あたりの分泌量として算出した。
［ＶＥＧＦの分泌量＝ＶＥＧＦ濃度測定値×培養上清の体積／生細胞数（１×１０５個）］
図８に測定結果の一例を示す。この結果は，中間体細胞，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞ともに，ＶＥＧＦの分泌能を有するが，その能力は，中間体細胞から更なる培養を経て歯髄由来細胞製剤にまで至る過程で，増強されることを示す。ＶＥＧＦは，血管新生作用を有する物質であることから，歯髄由来細胞製剤は，これをヒトに投与することにより，ＶＥＧＦを介して体内で血管の形成を促進することができる。また，中間体細胞を経て製造された歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞では，ＶＥＧＦの分泌能が増強されることから，かかる製造方法により製造された歯髄由来細胞製剤は，血管新生作用を発揮させるべき疾患の治療薬としてより有効であると考えられる。
〔実施例２４：歯髄由来細胞の性状（プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）分泌能試験）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁せさ，５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように，細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地で１×１０５個／ｍＬの濃度で懸濁させた後，１２ウェル細胞培養プレート中の６ウェル分に１ｍＬの細胞希釈液をそれぞれ播種した。更に，３ウェルには４０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有するＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を１ｍＬずつ加え，残りの３ウェルにはＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を１ｍＬずつ加え，前者をＴＮＦα刺激群，後者を無刺激群（コントロール群）として，約２４時間培養した。培養後，培養上清の全量を回収し，回収した上清の重量を電子天秤（島津製作所社）で計測し，測定時まで－８０℃で凍結保存した。上清を回収・除去した後，ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。
上記凍結保存した培養上清を解凍し，培養上清中に含まれるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて標識した後，マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて検出した。既知の濃度のＰＧＥ２で作成した検量線に，得られた検出値を内挿して，培養上清中に含まれるＰＧＥ２濃度を求めた。ＰＧＥ２の分泌量は，下記式により，細胞数１×１０５個あたりの分泌量として算出した。
［ＰＧＥ２の分泌量＝ＰＧＥ２濃度測定値×培養上清の体積／生細胞数（１×１０５個）］
図９に測定結果を示す。この結果は，中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞ともに，ＴＮＦα反応性のＰＧＥ２の分泌能を有するが，その能力は，中間体細胞から更なる培養を経て歯髄由来細胞製剤にまで至る過程で増加することを示すものである。ＰＧＥ２は強力な抗炎症作用を有することから，歯髄由来細胞製剤は，これをヒトに投与することにより，ＰＧＥ２を介して体内で炎症部位に作用し，炎症に伴う組織破壊を抑制することができる。また，中間体細胞を経て製造された歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞では，ＰＧＥ２の分泌能が増強されることから，かかる製造方法により製造された歯髄由来細胞製剤は，抗炎症作用を発揮させるべき疾患の治療薬としてより有効であると考えられる。
〔実施例２５：キヌレニン分泌試験〕
（試験方法）
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍した後，５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように細胞培養フラスコに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで４日間培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄してトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し，３７℃で５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。細胞を１５０００～２５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように２枚の細胞培養フラスコに播種した。このうち１枚の細胞培養フラスコには１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮγ（塩野義製薬社）を含有するＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を加え，もう１枚の細胞培養フラスコにはＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を加え，前者をＩＦＮγ刺激群，後者を無刺激群（コントロール群）として，３日間培養した。培養後，細胞培養上清を全量回収した。回収した細胞培養上清の重量を電子天秤（島津製作所社）で計測し，測定時まで－８０℃で凍結保存した。上清を回収・除去した後，ＰＢＳで細胞を洗浄してトリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃で５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，ＩＦＮγ刺激群及び無刺激群の生細胞数をそれぞれ測定した。上記凍結保存した培養上清を解凍し，３０％トリクロロ酢酸（ナカライテスク社）を添加して遠心（１００００ｇ，１０分）した後，培養上清中に含まれるキヌレニンを，ＨＰＬＣ（島津製作所社）を用いて検出した。既知の濃度のキヌレニンで作成した検量線に，得られた検出値を内挿して，培養上清中に含まれるキヌレニン濃度（モル濃度）を求めた。キヌレニンの分泌量は，下記式により，細胞数あたりの分泌量として算出した。
［キヌレニンの分泌量＝キヌレニン濃度測定値×２０８．２１×培養上清の体積／生細胞数（１×１０５個）］
（結果）
結果を図１０に示す。中間体細胞及び歯髄由来細胞製剤ともに，ＩＦＮγ存在下で培養することにより，キヌレニンの分泌量が顕著に増加する。キヌレニンはＴ細胞の増殖を抑制するとともに，単球を抗炎症性のＭ２マクロファージに分化させることができる。従って，多能性幹細胞富化歯髄由来細胞は，これをヒトに投与することにより，キヌレニンを介して抗炎症作用を発揮することができると考えられる。
〔実施例２６：歯髄由来細胞の性状（低免疫原性試験）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁させ，５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。細胞を１５０００～２５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように２枚の細胞培養プレートに播種した。このうち１枚の細胞培養プレートには１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮγ（塩野義製薬社）を含有するＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を加え，もう１枚の細胞培養プレートにはＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を加え，前者をＩＦＮγ刺激群，後者を無刺激群（コントロール群）として，３日間培養した。培養後，ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，ＩＦＮγ刺激群及び無刺激群の生細胞数をそれぞれ測定した。次いで，各群の細胞懸濁液を遠心（１５００ｒｐｍ，５分）し，上清を除去した後ブロッキング溶液（実施例２１に記載）を加えて細胞濃度が１×１０７細胞／ｍＬとなるように調整し，氷上で１時間静置した。
ＭＨＣ－クラスＩ抗原，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６に対する抗体として，ＦＩＴＣ標識抗ヒトＭＨＣ－クラスＩ抗原抗体（Ａｎｃｅｌｌ社），ＦＩＴＣ標識抗ヒトＭＨＣ－クラスＩＩ抗原抗体（Ａｎｃｅｌｌ社），ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社），ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社），ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をそれぞれ用いた。また，コントロール抗体として，ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ベックマンコールター社），及びＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた。
５ｍＬ反応チューブ（番号（１）～（１６））に各抗体溶液を表１６に示すとおり添加した。次いで，５ｍＬ反応チューブ（１）～（８）にはＩＦＮγ刺激群の細胞懸濁液を，又，５ｍＬ反応チューブ（９）～（１６）にはＩＦＮγ無刺激群の細胞懸濁液を１００μＬずつ添加して軽く振り混ぜ，氷上で２０分間静置させて，各抗体溶液に含まれる抗体と細胞表面に発現する表面抗原マーカーとを結合させた。次いで，ＰＢＳ－Ｂを３ｍＬずつ添加して混和した後，細胞を遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して沈殿させて上清を除去し，細胞に結合していない抗体を除去した。この抗体の除去操作を３回繰り返した。次いで，各チューブにＰＢＳ－Ｂを４００μＬ加え細胞を懸濁させた。
Figure 2024103800000025
チューブ番号（１）～（１６）の細胞について，ＦＩＴＣの蛍光色素の量をＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ社）で測定し，陰性コントロールとの比較により，表面抗原に特異的に結合した抗体を介して細胞表面に結合した蛍光色素の量を求めた。なお，チューブ（２）はチューブ（４）及び（６）～（８）の，チューブ（３）はチューブ（５）の，チューブ（１０）はチューブ（１２）及び（１４）～（１６）の，チューブ（１１）は（１３）の，それぞれ陰性コントロールである。チューブ（１）及び（９）は非染色細胞である。
（結果）
図１１Ａ及び図１１Ｂに測定結果を示す。ＭＨＣ－クラスＩ抗原の測定結果についてみると，ＩＦＮγ刺激の有無に関わらず，中間体細胞，歯髄由来細胞製剤ともに，ほぼ全ての細胞が陽性であった。ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の測定結果についてみると，中間体細胞，歯髄由来細胞製剤ともに，ＩＦＮγ無刺激では，実質的に全ての細胞が陰性であったが，ＩＦＮγ刺激により，ほとんどの細胞が陽性となった。ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６の測定結果についてみると，ＩＦＮγ刺激の有無に関わらず，中間体細胞，歯髄由来細胞製剤ともに，ほぼ全ての細胞が陰性であった。
ＭＨＣ－クラスＩ抗原及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は，抗原を免疫細胞に提示する機能を有する細胞表面抗原である。また，ＭＨＣ－クラスＩ抗原はほぼ全ての細胞で発現していることが知られており，また，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原は多くの細胞でＩＦＮγ刺激によりその発現が誘導されることが知られている。一方，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は免疫系細胞の活性化に関与する表面抗原である。すなわち，中間体細胞凍結品及び歯髄由来細胞製剤は，ともに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６を発現しないことから，積極的に免疫細胞を活性化することはないと考えられる。つまり，これらの結果は，中間体細胞凍結品及び歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，何れも，免疫原性を有さず，ＩＦＮγ刺激した場合にあっても，免疫原性が惹起されない性質を有することを示すものである。
〔実施例２７：中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞のサイトカインを含む各種因子の分泌能の測定〕
（前培養）
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，融解した細胞懸濁液全量をＤＭＥＭ培地に加えた。遠心（３００×ｇ，５分間，室温）を行い，上清を除去後，ＤＭＥＭ培地を加えて懸濁し，Ｍｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ社）を用いて細胞懸濁液中の生細胞数と全細胞数を計測し生存率を算出した。生細胞が中間体細胞凍結品中の細胞では７０００個／ｃｍ２，歯髄由来細胞製剤中の細胞では１２０００個／ｃｍ２となるようＴ２２５フラスコに細胞を播種し，ＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４日間培養した。培養後，Ｔ２２５フラスコから培地を除去した後，ＤＰＢＳで洗浄し，０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加してＣＯ２インキュベーター内に５分静置した。細胞の剥離を確認した後，ＤＭＥＭ培地を添加して細胞を懸濁させて，全量を回収した。遠心（３００×ｇ，５分間，室温）を行い，細胞を沈殿させた。上清を除去後，ＤＭＥＭ培地を加えて懸濁し，Ｍｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ社）を用いて細胞懸濁液中の生細胞数と全細胞数を計測し生存率を算出した。
（培養上清の回収）
前培養で回収した細胞を，生細胞の個数が２８０００個／フラスコとなるようにＴ２５フラスコに播種し，無刺激群，ＴＮＦα及びＩＦＮγ刺激群に振り分けて培養を開始した。各群の培地量は１フラスコあたり１０ｍＬとし，ＴＮＦαの最終濃度は１０ｎｇ／ｍＬ（原液２μｇ／ｍＬ），ＩＦＮγの最終濃度は１００Ｕ／ｍＬに調製した（原液１×１０６Ｕ／ｍＬ）。培養を開始してから３日目に，培養上清を０．５ｍＬずつクライオチューブに回収し，凍結保存した。培養上清回収後にＤＰＢＳで洗浄し，０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加してＣＯ２インキュベーター内に５分静置した。細胞の剥離を確認した後，ＤＭＥＭ培地を添加し，全量を回収した。遠心（３００×ｇ，５分間，室温）を行い，上清を除去後，ＤＭＥＭ培地を加えて懸濁し，Ｍｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ社）を用いて細胞懸濁液中の生細胞数と全細胞数を計測し生存率を算出した。
（サイトカイン測定）
回収した培養上清に含まれるサイトカインを含む各種因子の濃度を，ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて測定した。ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘの測定原理を以下に概略する。ビーズに結合させた，抗原（サイトカインの種類）ごとに異なる一次抗体を，測定対象となる物質を含むサンプルに添加して，一次抗体と当該物質を結合させる。次いで，ビオチン化した二次抗体を添加して一次抗体と結合した当該物質に結合させ，更に，フィコエリスリン（ＰＥ）標識ストレプアビジンを結合させる。アビジンはビオチンに特異的に結合するため，これをフローサイトメトリーで測定することにより，その蛍光強度に応じてビーズに結合したフィコエリスリン（ＰＥ）標識ストレプアビジンを定量することができる。この定量値は，サンプルに含まれる測定対象となる物質の量に比例するので，当該物質を定量することができる。
（結果：無刺激群における各種因子の発現量）
無刺激群における培養上清に含まれる各種因子の濃度を図１２に示す。中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，何れもＭＭＰ－２，ＩＧＦＢＰ－４，及びシスタチンＣを高いレベルで発現する（図１２）。
また，中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，何れもＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＭＣＰ－１，ＩＬ－８，ＧＲＯα，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，ＶＣＡＭ－１，ＴＩＭＰ－３，ＴＩＭＰ－２，及びＴＩＭＰ－１を発現する（図１３）。
更に，中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，微量ではあるが，何れも，ＩＬ－２３，ＴＮＦ－α，ＩＬ－１８，ＩＬ－３３，ＩＬ－２７，ＴＡＲＣ，ＥＮＡ－７８，ＭＩＰ－３α，ＭＩＰ－１β，ＩＰ－１０，ＳＣＦ，及びＩＣＡＭ－１を発現する（図１４）。また，中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，何れも，ＩＬ－２１，Ｅｘｏｔａｘｉｎ，ＭＩＰ－１α，ＭＩＧ，Ｉ－ＴＡＣ，及びＧＭ－ＣＳＦを発現しないか，又はほとんど発現しない。ＩＦＮ－αは，中間体細胞では発現が検出されないが，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞では，微量に発現している。また，表には示さないが，中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の何れにおいても，炎症性サイトカインであるＩＬ－２，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－９，及びＩＬ－１３は発現していないか，又はほとんど発現していない。
（結果：無刺激群における各種因子の発現量の，中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞との間の差異）
中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞との間で，発現量が比較的異なる因子について，培養上清に含まれる各種因子の濃度比を図１５に示す。これらの因子は，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞で，中間体細胞と比較して発現量が多い。特に，ＩＬ－６，ＩＬ－１１，ＨＧＦ，ＩＧＦＢＰ－４，ＴＩＭＰ－３，及びＴＩＭＰ－１は，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の発現量が，中間体細胞の１．５倍以上である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＩＬ－６の発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＩＬ－６の濃度を図１６に示す。中間体細胞では，ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激の何れにおいても，ＩＬ－６の発現量が，無刺激の場合と比較して増加する。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＩＬ－１１の発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＩＬ－１１の濃度を図１７に示す。中間体細胞では，ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激の何れにおいても，ＩＬ－１１の発現量が，無刺激の場合と比較して増加する。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＩＰ－１０の発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＩＰ－１０の濃度を図１８に示す。中間体細胞では，ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激の何れにおいても，ＩＰ－１０の発現量が，無刺激の場合と比較して増加する。図１８中，無刺激の場合のＩＰ－１０の濃度が図中に現われないが，ＩＰ－１０の濃度が低いためであり，図１４に示されるように，中間体細胞は無刺激の場合においても発現している。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＭＣＰ－１の発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＭＣＰ－１の濃度を図１９に示す。中間体細胞では，ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激の何れにおいても，ＭＣＰ－１の発現量が，無刺激の場合と比較して増加する。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＧＭ－ＣＳＦの発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＧＭ－ＣＳＦの濃度を図２０に示す。無刺激の場合，ＧＭ－ＣＳＦは中間体細胞と歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞の何れにおいてもほとんど発現が認められない。中間体細胞では，ＴＮＦ－α刺激によりＧＭ－ＣＳＦの発現が誘導されるが，ＩＦＮ－γ刺激では発現は誘導されない。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＨＧＦの発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＨＧＦの濃度を図２１に示す。中間体細胞では，ＨＧＦの発現量が無刺激の場合と比較して，ＴＮＦ－α刺激により減少する一方，ＩＦＮ－γ刺激により増加する。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
（結果：ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ刺激によるＩＬ－８の発現量の変化）
ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γで刺激したときにおける培養上清に含まれるＩＬ－８の濃度を図２２に示す。中間体細胞では，ＩＬ－８の発現量が無刺激の場合と比較して，ＴＮＦ－α刺激により増加するが，ＩＦＮ－γ刺激では変化がない。歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞についても同様である。
〔実施例２８：歯髄由来細胞の性状（細胞分裂能）〕
実施例７で調製した中間体細胞凍結品及び実施例１６で調製した歯髄由来細胞製剤を解凍し，遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を沈殿させた。次いで，細胞をＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地に懸濁させ，５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄し，トリプシン－ＥＤＴＡを添加し，３７℃に５～１０分間静置して細胞を剥離させた。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ）培地を添加して細胞を懸濁させ，生細胞数を測定した。再度，細胞を５０００～１５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように細胞培養プレートに播種し，細胞が９０～１００％コンフルエントになるまで培養した。細胞の継代培養を繰り返し，継代培養終了時毎に生細胞数を測定して，細胞の分裂回数を算出した。細胞の分裂回数は，各継代培養の開始時の生細胞数と培養終了時の生細胞数から下記の式により算出した。
細胞の分裂回数＝ｌｏｇ２（培養終了時の生細胞数／培養開始時の生細胞数）
（結果）
中間体細胞凍結品に含まれる細胞は，解凍後も，１４回以上の分裂能を有し，またそのときの倍化時間は，３日以内（７２時間以内）であった。また，歯髄由来細胞製剤に含まれる細胞は，解凍後も，４回以上の分裂能を有し，またそのときの倍化時間は，３日以内（７２時間以内）であった。
〔実施例２９：歯髄由来細胞製剤の使用例１〕
歯髄由来細胞製剤は，リウマチ性関節炎，膠原病等の自己免疫疾患に伴う諸症状を寛解するための薬剤として，これら疾患に罹患する患者に，点滴静注，局所注射等の手段により投与される。
〔実施例３０：歯髄由来細胞製剤の使用例２〕
歯髄由来細胞製剤は用時解凍して用いられる。使用時に，歯髄由来細胞製剤は，液体窒素保存容器から取り出され，３６．５～３７．５℃のウォーターバス内で加温して解凍される。解凍後の歯髄由来細胞製剤は，医薬品として点滴静注，局所注射等の手段によりヒトに投与することができる。点滴静注の場合，歯髄由来細胞製剤は細胞凍結保存用容器から透析バッグに移されてから患者に点滴静注により投与される。局所注射の場合，歯髄由来細胞製剤は細胞凍結保存用容器からシリンジに移されてから，患者の局所に注射される。
〔実施例３１：歯髄由来細胞製剤の使用例３〕
歯髄由来細胞製剤は，使用前に医療機関において解凍して用いられる。従って，歯髄由来細胞製剤は，その製造業者，販売業者等の保管庫で凍結保存されたものが，医療機関の求めに応じて凍結状態で出荷されて医療機関まで輸送される。凍結された状態で搬入された細胞は，医療機関において患者に投与される直前に解凍され，点滴静注等の手段により患者に投与される。
本発明は，例えば，ヒトに投与し得る歯髄由来細胞を有効成分として含有してなる医薬品を提供するに有用である。

Claims (13)

  1. 多能性幹細胞が富化された歯髄由来細胞の製造方法であって，
    （ａ）ヒトの永久歯又は乳歯から得られた歯髄をプロテアーゼで消化して歯髄の懸濁物を調製するステップと，
    （ｂ）該懸濁物を培養して，該懸濁物に含まれる多能性幹細胞を増殖させるステップと，
    （ｃ）該増殖させた多能性幹細胞を，第１の凍結保存液に懸濁させた状態にして凍結させるステップと，
    （ｄ）該凍結させた多能性幹細胞を解凍させるステップと，
    （ｅ）該解凍させた多能性幹細胞を，担体粒子の表面に接着させた状態で培養して，該担体粒子の表面で多能性幹細胞を増殖させるステップと，
    （ｆ）該担体粒子をプロテアーゼと接触させて，該担体粒子の表面に接着した多能性幹細胞を該担体粒子から分離させるステップと，
    （ｇ）分離させた多能性幹細胞の懸濁物を調製するステップと，
    を含んでなるものであり，該ステップ（ｃ）又は（ｄ）において，該多能性幹細胞の品質検査が行われるものであり，
    該品質検査が，該第１の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取した細胞，該第１の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取し継代させた細胞，該第１の凍結保存液に懸濁させ分取した凍結前の細胞，分取し凍結させて解凍した直後の細胞，及び／又は分取し凍結させ解凍し更に培養して得られた細胞に対して，行われるものであり、
    該品質検査が，下記品質検査ａ，ｅ，ｆ及びｇの２以上について行われるものであり、且つ、該多能性幹細胞がヒトに投与されるものである、製造方法：
    品質検査ａ：光学顕微鏡下で観察したとき，細胞全体に占める略紡錘形の形態を示す細胞数の割合が，９９％以上，９９．５％以上，９９．９％以上，又は９９．９５％以上であることの検証；
    品質検査ｅ：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となることの検証，又は，
    細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０が陰性，ＣＤ８０が陰性，ＣＤ８６が陰性，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性であることのうち，少なくとも何れかの検証；
    品質検査ｆ：細胞が，プロスタグランジンＥ２及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し，且つプロスタグランジンＥ２にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することによりその発現量が増加することの検証；
    品質検査ｇ：軟骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量が増加することの検証。
  2. 該品質検査が，該品質検査ａ，ｅ，ｆ及びｇの全てについて行われるものである、請求項１に記載の製造方法。
  3. ステップ（ｇ）において，該懸濁物をろ過膜に負荷し，通過した細胞を回収することを更に含んでなる，請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 該ろ過膜が，２０μｍ～８０μｍの孔径を有するものである，請求項３に記載の製造方法。
  5. （ｈ）ステップ（ｇ）で得られた該懸濁物を，第２の凍結保存液に懸濁させた状態にして凍結させるステップ，
    を更に含んでなるものである，請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
  6. ステップ（ｈ）において用いられる第２の凍結保存液が，重炭酸リンゲル液，ヒト血清アルブミン，及びＤＭＳＯを含んでなるものである，請求項５に記載の製造方法。
  7. ステップ（ｇ）において，該多能性幹細胞の品質検査が行われるものである，請求項１乃至４に記載の製造方法。
  8. ステップ（ｇ）又は（ｈ）において，該多能性幹細胞の品質検査が行われるものである，請求項５又は６に記載の製造方法。
  9. 該品質検査が，該第２の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取した細胞，該第２の凍結保存液に懸濁させる前の細胞から分取し継代させた細胞，該第２の凍結保存液に懸濁させ分取した凍結前の細胞，分取し凍結させて解凍した直後の細胞，及び／又は分取し凍結させ解凍し更に培養して得られた細胞に対して，行われるものである，請求項８に記載の製造方法。
  10. 該品質検査が，下記品質検査ａ’～ｊ’の１又は２以上について行われるものである，請求項７又は９に記載の製造方法：
    品質検査ａ’：光学顕微鏡下で観察したときに，細胞全体に占める略紡錘形の形態を示す細胞数の割合が，９９％以上，９９．５％以上，９９．９％以上，又は９９．９５％以上であることの検証；
    品質検査ｂ’：細胞の生存率が，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，又は９５％以上であることの検証；
    品質検査ｃ’：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５及びＣＤ１６６が陽性であり，且つＣＤ３４及びＣＤ４５は陰性であることの検証，又は
    細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ７３及びＣＤ９０の少なくとも一つが陽性であり，且つＣＤ３４が陰性であることの検証；
    品質検査ｄ’：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陰性であることの検証，又は
    細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原の少なくとも一つが陰性であることの検証；
    品質検査ｅ’：細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０，ＣＤ８０，及びＣＤ８６は陰性のままであり，ＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性となることの検証，
    又は，細胞の表面抗原マーカーの発現パターンにおいて，インターフェロンγで細胞を刺激したときに，ＣＤ４０が陰性，ＣＤ８０が陰性，ＣＤ８６が陰性，及びＭＨＣ－クラスＩＩ抗原が陽性であることのうち，少なくとも何れかの検証；
    品質検査ｆ’：細胞が，プロスタグランジンＥ２及び／又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現し，且つプロスタグランジンＥ２にあっては，細胞をＴＮＦαで刺激することによりその発現量が増加することの検証；
    品質検査ｇ’：軟骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，アグリカンの発現量が増加することの検証；
    品質検査ｈ’：骨細胞への分化を誘導する物質を含有する培地で培養したとき，細胞におけるカルシウムの蓄積量が増加することの検証；
    品質検査ｉ’：細胞培養プレート上で細胞が，３回以上，４回以上，又は５回以上の細胞分裂能を有することの検証；
    品質検査ｊ’：細胞培養プレート上での細胞の平均倍化時間が，該品質検査ｉ’の実施期間において，９６時間以内，８４時間以内，７２時間以内，４８時間以内，又は３６時間以内であることの検証。
  11. ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＣＤ１０７ｂの陽性率が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する陽性率よりも高いものである，
    請求項７乃至１０の何れかに記載の製造方法。
  12. ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＣＤ３９，ＣＤ４９ａ，ＣＤ６１，ＣＤ１０７ａ，ＣＤ１０７ｂ，及びＣＤ１４３のうち少なくとも一つの陽性率が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する陽性率よりも高く，且つ
    ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＣＤ１４６の陽性率が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する陽性率よりも低いものである，
    請求項７乃至１１の何れかに記載の製造方法。
  13. ステップ（ｇ）又は（ｈ）において品質検査に供される多能性幹細胞におけるＩＬ－６，ＨＧＦ，ＩＧＦＢＰ－４，ＩＬ－１１，ＴＩＭＰ－３，及びＴＩＭＰ－２の少なくとも一つの発現量が，ステップ（ｃ）又は（ｄ）において品質検査に供される多能性幹細胞における対応する発現量よりも高いものである，請求項７乃至１２の何れかに記載の製造方法。
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