KR20200113832A

KR20200113832A - 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법

Info

Publication number: KR20200113832A
Application number: KR1020190034575A
Authority: KR
Inventors: 차재민; 정선영; 김태희
Original assignee: 인천대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2020-10-07

Abstract

본 발명은 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법은 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 하이드로겔의 기계적 강도 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통하여, 줄기세포의 유전자 발현 양상을 조절할 수 있으며, 나아가 줄기세포의 대사과정을 리프로그래밍함으로써 차세대 고효율 줄기세포를 대량 생산할 수 있다.

Description

하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법{A METHOD FOR REGULATION OF GENE EXPRESSION IN STEM CELL BY USING MECHANICAL STIFFNESS OF HYDROGEL}

본 발명은 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자가 재생 및 다 계통 분화 능력이 있는 세포로 정의된다. 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cell, hESC)와 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, hiPSCs)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSCs)는 세 가지 모든 배엽층(germ layer)의 유도체로 분화할 수 있는 자가 재생 및 다능성의 가능성을 가지고 있다고 보고되었다. 이러한 이유로 많은 연구자들은 PSC 또는 PSC-유래 세포를 사용하여 다양한 질병을 치료하는 방법에 중점을 두었다.

그러나 다양한 줄기세포 치료의 임상적 성공에도 불구하고 PSC의 통제할 수 없는 다능성으로 인한 잠재적인 기형종(teratoma) 형성이 hPSC 치료의 임상적 번역(clinical translation)을 위한 주요 장애로 남아 있다. 한편, 성체 줄기세포(adult stem cell, ASC)는 기형종과 위험을 가지지 않으며 윤리적인 문제가 없기 때문에 많은 관심을 끌었고 임상 시험에 투여되었다. 많은 연구가 ASC의 다양한 질병에 대한 임상적 효과를 보고했다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)는 지방, 연골 및 뼈와 같은 간엽 계통으로 분화할 수 있는 자가-재생성, 다능성 성체 줄기세포이다. 비-조혈 줄기세포로서 MSC의 표현형은 CD73, CD90 및 CD105와 같은 표면 마커의 발현 및 CD14, CD34 및 CD45의 결핍으로 특징지어진다. MSC는 초기에 골수에 존재한다고 여겨졌지만, 후속 연구에 의하면 MSC는 지방 조직, 심장, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 치수(dental pulp), 말초 혈액, 제대혈, 생리혈, 융모막과 같은 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 줄기세포 니치(niche) 및 조직 항상성의 유지는 이러한 다양한 조직에 존재하는 MSC에 의해 이루어진다.

MSC의 임상적 사용에 대한 관심은 MSC를 정제하고 배양하는 방법의 발전으로 급속도로 성장했다. 세포 치료를 위한 MSC의 안전성과 유효성을 평가한 첫 번째 연구는 조혈모세포 이식으로 유발된 조혈 회복을 보고했다. 혈액학적 악성 종양으로 고통받는 15명의 환자에게 체외에서 확장된 자가 간엽 전구세포(mesenchymal progenitor cell, MPC)를 이식하였다. 환자는 부작용을 나타내지 않았다. Chen 등의 임상 연구에서 급성 심근경색 환자에게 자가(autologous) MSC가 관상 동맥 내 주입으로 전달되었다. 3개월간 투여한 결과 좌심실 기능이 향상되었다. MSC의 면역 억제 특성을 이용한 임상 연구도 수행되었다. 신장 동종 이식(allograft transplantation) 후 MSC 치료를 받은 환자에서 면역 억제 효과가 나타났다. 초기 임상 2 상 시험에서 Le Blanc 등에 의해 MSC의 이식 편대 숙주 질환(GvHD) 저해 성질이 연구되었다. 동시에, MSC는 연골 및 뼈 복구에서 치료 효과를 유지하는 것으로 알려져 있다. MSC의 관절 내 주사는 연골 회복을 촉진하여 통증, 장애의 임상 점수를 감소시키고 골관절염 환자의 삶의 질을 높였다.

현재의 연구가 임상 시험에서 줄기세포의 잠재적인 사용을 뒷받침하고 있지만 줄기세포 치료의 한계에 대하여 아직 논란이 남아있다. 첫 번째 장애는 ASC(adult stem cell)가 배양에서 확장하기 어렵고 단지 몇 가지 예외를 제외하고 시험관 내에서 다능성이 거의 유지되지 않는다는 것이다. 대조적으로, ESC(embryonic stem cell)는 in vitro에서 모든 종류의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 그러나 세포 수가 2배가 되는 시간을 단축하여 증식률을 높이기 위해 변화하는 후생적 핵형(epigenetic karyotype)은 순수한 ESC뿐만 아니라 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 이용한 복제 ESC에서도 종종 나타난다. 또한, 한 연구는 세포의 실험실 조작이 비정상적인 염색체를 얻는 원인이 될 수 있다고 보고했다.

따라서 줄기세포의 불안정성 메커니즘을 완전히 이해하지 못하더라도 엄격한 배양 조건과 염색체 이상 검사가 기존의 세포주의 유지에 필요하다. 고려해야 할 또 다른 문제는 남아있는 미분화 줄기세포로 인한 기형종(teratoma) 형성뿐만 아니라 생체 내 이식된 줄기세포의 바람직하지 않은 생착(engraftment) 위치 또는 조절 불가능한 분화이다. 13세의 남성 모세관확장성 운동실조증(ataxia-telangiectasia) 환자는 이식 4년 후 비-숙주 기원 다초점(multifocal) 뇌종양으로 진단받았다. 이 사례는 종양 형성의 위험성을 조심스럽게 고려해야 한다.

줄기세포의 크기도 문제가 된다. 혈관 내 주사는 세포 전달에 널리 사용되는 방법이다. 혈관 내 전달은 주입된 세포의 최소 침습(minimal invasion)과 넓은 분포에 대해 유리한 것으로 간주될 수 있다. 그러나 전신에 걸쳐 분포되기 전에 폐를 통해 주입된 세포의 초기 통과인 "일차통과(first-pass)" 효과는 중요한 문제로 남아있다. 연구에 의하면 MSC의 크기와 유사한 20-30 ㎛의 지름을 가진 대부분의 입자가 폐에 포획된 것으로 나타났다. 다른 실험 데이터에 따르면 심장이나 뇌에는 1% 미만의 MSC만 발견되었고 MSC의 80% 이상은 폐에 걸렸다.

줄기세포 기반 치료법과 관련된 추가 위험 요소가 있다: 다른 세포나 배양제와의 오염, 동물 혈청 사용으로 인한 외래 병원체와의 종간 오염, 동종 이계 줄기세포 이식에 대한 면역 거부, 효과 부족, 이식된 세포의 낮은 생존율, 줄기세포 기원에 대한 기증자 부족 또는 윤리적 문제, 대량 생산 방법의 부재. 이러한 이유로, 줄기세포가 난치병 치료 방법으로 유망해진 후에도 새로운 치료법에 대한 요구가 증가하고 있다.

대한민국 공개특허공보 제10-2017-0123852호

본 발명자는 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않고, 줄기세포의 배양조건을 달리하여 줄기세포의 유전자 발현을 조절하는 방법에 대하여 연구하였다. 그 결과, 기계적 강성을 조절함으로써 달성된 서로 다른 매트릭스 특성을 갖는 겔마(GelMA) 하이드로겔 내에 줄기세포를 3차원적으로 캡슐화하고, 배양한 결과 서로 다른 기계적 특성에 따라서 줄기세포의 유전자 발현 양상이 달라지는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시 예에서, 기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법을 제공하며, 상기 방법은 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화된 줄기세포를 진탕 배양 또는 바이오리액터로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 바이오리액터(bioreactor)는 생물의 체내에서 이루어지는 물질의 분해, 합성, 화학적인 변환 등의 생화학적 반응 과정을 인공적으로 재현하는 시스템을 지칭하며, 생물반응장치라고도 한다.

상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 성체 줄기세포(adult stem cells), 유도만능줄기세포(induced pluripotent step cells; iPS cells), 및 전발생세포(progenitor cells)를 모두 포괄하는 의미로 사용될 수 있으며, 예컨대, 줄기세포는 배아줄기세포, 성체 줄기세포, 만능유도줄기세포, 및 전발생세포들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 줄기세포는 동종 유래의 줄기세포 및/또는 자가 유래의 줄기세포일 수 있다. 바람직하게 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 예컨대, 중간엽줄기세포, 보다 구체적으로 인간 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

3차원 고분자 세포 지지체는 세포의 체외 배양 및 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체로 세포성장을 유도분화하고 촉진시킬 수 있으며, 생체적합성이며 생분해성인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 3차원 고분자 세포 지지체는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA)를 포함하는 하이드로겔로서, 줄기세포의 부착능이 우수하며, 젤라틴과 같은 천연 생체고분자를 기반으로 한다.

본 발명에 따른 유전자 조절 방법은 줄기세포를 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화하는 것을 특징으로 하며, 상기 캡슐화 방법은 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA) 용액에 줄기세포 및 광개시제를 혼합하고, 상기 혼합 용액에 UV를 조사하여 이루어지고, 상기 메타크릴레이트화된 젤라틴은 UV 조사에 의하여 상호 교차결합(cross-linking)된다.

상기 3차원 고분자 세포 지지체의 기계적 강도는 상기 혼합 용액에 조사되는 UV 강도에 의하여 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 GelMA 수화젤을 제조할 때 GelMA의 methacryloylation 정도, 즉 GelMA의 치환도가 높을수록 가교 밀도가 증가하고 제조된 수화젤의 강성(stiffness)이 증가할 수 있어 이와 같은 방법에 의하여 세포 지지체의 기계적 강도를 조절할 수도 있다.

상기 조사되는 UV의 강도는 1 ~ 10mW/cm², GelMA(시편)와의 거리는 3 ~ 10cm이며, 이는 고분자의 종류에 따라서 적절하게 조절될 수 있으며, 바람직하게는 2 ~ 5mW/cm²이고, 거리는 5 ~ 9cm이며 가장 바람직하게는 3.8mW/cm², 거리는 7cm이다. UV의 강도가 너무 강하면 줄기세포의 DNA 손상을 유발하여 세포노화와 세포사멸을 유도할 수 있기 때문에, UV의 강도와 GelMA와의 거리를 상기 기재된 범위로 유지하는 것이 바람직하다.

상기 세포 지지체의 기계적 강도는 3 ~ 30kPa 범위에서 3단계로 구분되는데 연성(soft)의 강도를 갖는 세포 지지체는 1 ~ 5초 동안 UV를 조사하며 이때 세포 지지체의 영률(Young's modulus, kPa)은 3 ~ 10kPa이고; 중성(medium)의 강도를 갖는 세포 지지체는 6 ~ 15초 동안 UV를 조사하며 이때 영률은 11 ~ 18kPa이고; 강성(hard)의 강도를 갖는 세포 지지체는 16 ~ 25초 동안 UV를 조사하며 이때 영률은 19 ~ 30kPa이다.

상기 세포 지지체의 기계적 강도가 3kPa 미만이면 세포 배양 과정에서 하이드로젤이 풀어지게 되고, 기계적 강도가 30kPa를 초과하는 경우에는 세포가 자라지(growth) 못하게 된다.

적절한 상업적 UV 광개시제는 CIBA SPECIALTY CHEMICALS사로부터 입수 가능한 Irgacure TM 184, Irgacure TM 500, Irgacure TM 907, Irgacure TM 369, Irgacure TM 1700, Irgacure TM 651, Irgacure TM 819, Irgacure TM 1000, Irgacure TM 1300, Irgacure TM 1870, Irgacure TM 2959, Darocur TM 1173, Darocur TM 2959, Darocur TM 4265 및 Darocur TM ITX, BASF AG사로부터 입수 가능한 Lucerin TM TPO, LAMBERTI사로부터 입수 가능한 Esacure TM KT046, Esacure TM KIP150, Esacure TM KT37 및 Esacure TM EDB, SPECTRA GROUP Ltd.사로부터 입수 가능한 H-Nu TM 470 및 H-Nu TM 470X를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone(Irgacure TM 2959)을 사용하였다.

상기 방법으로 줄기세포를 캡슐화한 이후, 이를 진탕 배양하면 캡슐화된 줄기세포의 줄기세포능(Stemness)이 향상된다. 특히 강성 그룹(19 ~ 30kPa)에서 배양된 줄기세포는 INS2, LIF, POU5F1, SOX2, TERT, WNT3A 및 ZFP42 유전자의 발현이 다른 그룹과 비교하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

연성 그룹(3 ~ 10kPa)에서 배양된 줄기세포는 뉴런-형(neuron-like) 또는 응집된(aggregated) 형태학적 특징을 나타내었으며, 연골형성(chondrogenesis), 면역 조절(immunomodulation), 신경생성(neurogenesis), 테노제네시스(tenogenesis), 골형성(osteogenesis) 및 근발생(myogenesis) 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 감소하는 특징을 나타내었다.

강성 그룹(19 ~ 30kPa)에서 배양된 줄기세포는 둥글고 응집되지 않은 형태학적 특징을 나타내었으며, 혈관신생(angiogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 골형성(osteogenesis), 신경생성(neurogenesis) 및 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.

또한 중성 그룹(11 ~ 18kPa)에서 배양된 줄기세포는 강성 그룹과 유사한 유전자 발현 양상을 나타내는 것을 확인하였다.

또한 연성 그룹(3 ~ 10kPa)에서 배양된 줄기세포는 상기 줄기세포에서 세포 골격 확장(cytoskeleton extension)이 일어나지만, 강성 그룹(19 ~ 30kPa)에서 배양된 줄기세포는 세포 골격 확장(cytoskeleton extension)이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법은 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 하이드로겔의 기계적 강도 조절이라는 간편하고 안전한 방법을 통하여, 줄기세포의 유전자 발현 양상을 조절할 수 있으며, 나아가 줄기세포를 리프로그래밍함으로써 차세대 고효율 줄기세포를 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 캡슐화 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다; (a) 처리되지 않은 슬라이드 글라스를 10% NaOH 용액에 담근 후, TMS-PMA 및 PEG로 코팅하였다. (b) 트립신 처리된 MSC를 1:5(v/v)의 비율로 0.005% PI 용액에서 10% 겔마와 혼합하였다. (c) 제작된 PDMS 스페이서 위에 Cell-GelMA 혼합물을 300㎛의 높이로 놓고 UV를 조사하였다. (d) 자외선의 출력은 3.8 mW/cm²이고, 경화 시간은 연성, 중성 및 강성에 대해 각각 3초, 10초 및 20초이다. (e) 캡슐화된 MSC는 20 rpm의 속도로 궤도 진탕기에서 5일 동안 배양되었다.
도 2는 GelMA의 기계적 성질을 AFM로 측정한 결과를 나타낸다; (a) GelMA 샘플의 힘-거리 곡선과 (b, c) GelMA의 힘-거리 곡선으로부터의 영률값.
도 3은 연성, 중성 및 강성 GelMA 하이드로겔의 FIB Quanta 3D 이미지이다.
도 4는 MSC 마커의 qRT-PCR 분석결과를 나타낸 것으로, 획득된 Ct값은 GAPDH로 정규화되었다.
도 5는 2차원 배양(2D) 대조군 MSCs의 면역세포화학(Immunocytochemistry) 이미지이다; (a) DAPI 처리되지 않은 음성 대조군, (b) DAPI 처리된 음성 대조군, (c) 양성 MSC 마커인 CD105로 면역 염색된 2차원 배양(2D) 대조군 MSCs.
도 6은 캡슐화된 MSC의 광학 현미경 이미지이다;(a) 연성, (b) 중성, (c) 강성 GelMA 하이드로겔.
도 7은 캡슐화된 MSC의 Live and Dead 결과를 보여주는 사진이다;(a) 연성, (b) 중성, (c) 강성 GelMA 하이드로겔.
도 8은 배양 5일 후의 캡슐화된 MSC의 팔로이딘(phalloidin) 염색 이미지이다; (a) 연성, (b) 중성, (c) 강성 GelMA 하이드로겔, 팔로이딘(녹색), DAPI(파랑).
도 9는 캡슐화된 MSC 및 2차원 배양(2D) MSC의 유전자 발현 프로파일 분석결과를 비교한 그림이다; 캡슐화된 MSC의 유전자 발현 프로파일에 대한 (a) qPCR array, (b) 산점도(scatter plot), (c) 그래프.
도 10은 캡슐화된 MSC의 DNA 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

(1) 캡슐화 준비

무-처리 베어 슬라이드 글래스는 다이아몬드 커터를 사용하여 24 Х 24mm로 절단하고 실온에서 밤새 10% NaOH 용액에 담가 놓았다. 글래스를 증류수 및 70% 에탄올로 2회 세척한 후 건조시켰다. 완전 건조된 글래스는 80℃에서 3-트리메톡시실릴프로필 메타크릴레이트(3-trimethoxysilyl propyl methacrylate, TMS-PMA) 용액으로 밤새 처리하였다. TMS-PMA 코팅 유리를 PEG 용액으로 스핀 코팅하였다. Working PEG 용액은 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS), 폴리(에틸렌 글리콜) 1000 디메타크릴레이트(Poly(ethylene glycol) 1000 dimethacrylate, PEG), 광개시제(2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone)를 각각 10:1:0.1의 비율로 포함한다. PEG-코팅된 유리는 3.8 mW/cm²의 출력에서 60초 동안 UV 유도 가교 결합되었다(Omnicure® S2000, Excelitas Technologies Corp., Massachusetts, USA). 경화된 유리를 PBS로 다시 세척하고 건조시켰다. 캡슐화하기 전에, 10% 겔마(GelMA, Gelatin methacryloyl)를 함유하는 겔마 하이드로겔 용액 및 PBS 중의 0.05%의 광개시제를 새로 제조하고 즉시 사용하였다. 높이가 300㎛인 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 스페이서도 캡슐화 공정을 위해 제작되었다.

(2) MSC의 배양 및 캡슐화

인간중간엽줄기세포(hMSCs, PT2501, Lonza, Basel, Switzerland)를 5% CO₂를 함유한 습한 대기에서 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. MSC의 확장(expansion)을 위해 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제-항균제를 포함하는 Low-glucose DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 사용하였다. 배지는 3-4일마다 교체되었다. 캡슐화된(Encapsulated) MSCs는 10% FBS와 1% 항생제-항균제를 포함하는 Low-glucose DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 함께 배양하였다.

hMSC의 캡슐화를 위해, 세포를 TrypLE Express(Gibco)로 해리시키고 세포 수를 혈구계(hemocytometer)로 계산하였다. 트립신 처리된(Trypsinized) 세포를 1.5 x 10⁵ 세포/총 부피 75㎕의 농도로 5:1의 비율로 겔마(GelMA) 용액과 캡슐화 배지에 현탁시켜, 최종 겔마(GelMA) 농도를 8.3%로 만들었다. 현탁된 hMSC를 포함하는 GelMA 용액 75㎕를 TMS-PMA 및 PEG-코팅된 슬라이드 글라스에 부었다. MSC는 달리 조절된 기계적 강도(mechanical stiffnesses)를 갖는 가교 결합된 겔마(GelMA) 내에 캡슐화되었다; 즉, 연성(Soft)(3.8mW/cm²에서 3초), 중성(Medium)(3.8mW/cm²에서 10초), 강성(Hard)(3.8mW/cm²에서 20초). 캡슐화된 MSC는 20rpm의 궤도-진탕 조건하에서 5일 동안 배양되었다. 배지는 배양 기간 동안 변경되지 않았다.

실험예

(1) 겔마(GelMA) 하이드로겔에 의한 배양 기질(culture matrix)의 물리적 특성 조절

겔마(GelMA) 하이드로겔의 기계적 성질은 하이드로젤용 probehand가 장착된 원자 힘 현미경(AFM, XE-120, Park Systems, Suwon, South Korea)을 사용하여 힘-거리(F/D) 곡선 측정에 의해 조사되었으며, F/D 곡선 측정은 PBS 용액으로 채워진 액체 환경에서 수행되었고 각 샘플의 무작위로 선택된 5개의 포인트에서 기록되고 평균화되었다.

샘플	1	2	3	4	5
연성(Soft)	7.11	9.21	11.84	11.86	6.51
중성(Medium)	13.15	11.7	13.39	16.65	15.47
강성(Hard)	26.39	17.99	20.53	22.15	17.42

상이한 강도(stiffness)를 갖는 각 겔마 하이드로겔의 영률(Young's modulus, kPa)을 측정하였으며, 결과는 '강성' 그룹에서 가장 높은 영률(19 ~ 30kPa)을 나타냈으며 연성 그룹에서 가장 낮은 영률(3 ~ 10kPa)을 나타내었다(도 2). 겔마(GelMA) 하이드로겔의 공극율(Porosity)과 형태(morphology)는 Focused Ion Bean Quanta 3D(FIB Quanta 3D)에 의해 관찰되었다. 기공 크기(Pore size)와 공극율은 하이드로겔의 강도가 증가함에 따라 감소하였다(도 3).

(2) 상이한 기계적 특징에서 MSC의 캡슐화 및 배양

인간 골수 유래 MSC를 정상 세포 확장 배지(expansion medium)와 함께 배양하였다. MSC는 qRT-PCR 및 면역세포화학(Immunocytochemistry)을 사용하여 세포 표면 마커 발현에 대해 평가되었다.

면역세포화학(Immunocytochemistry) 실험은 아래의 과정으로 수행하였다; hMSCs는 4℃에서 10분간 4%(w/v) 파라포름알데히드(Biosesang, 성남, 한국)에 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 샘플을 0.2% Triton X-100에서 15분 동안 투과화하였다. 샘플을 PBS로 3회 재세척하고 밤새 4℃에서 4% BSA(Bovine serum albumin)으로 차단시켰다. 차단 후, 캡슐화된 세포를 세포의 세포 골격 구조의 이미징을 위해 4℃에서 밤새 Alexa Fluor 488 Phalloidin(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)과 함께 배양 하였다. MSC의 특성 규명을 위해 2D 대조군 MSC를 4℃에서 밤새 1차 항체 mouse-anti CD105(Abcam, Cambridge, England)와 2차 항체 AlexaFluor 488 anti-mouse IgG(Abcam)와 함께 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 샘플을 1% BSA로 3회 세척하고 암실에서 실온에서 10분 동안 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Thermo Fisher Scientific)과 함께 배양 하였다. 샘플을 1% BSA 및 PBS로 각각 1회 세척하였다. 시료는 mountant(ThemoFisher Scientific)를 사용하여 보존하였다. 공초점 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 이미지를 시각화하였다.

상기 실험 결과 MSC는 qRT-PCR 결과에서 CD73 및 CD105에 대해 양성 발현, CD34 및 CD45에 대해 음성을 나타내었다(도 4). 염색 데이터는 양성 대조군에서 MSCs의 CD105 발현을 나타내었으며 음성 대조군에는 CD105 발현을 확인할 수 없었다(도 5).

MSC는 겔마(GelMA)의 기계적 강성을 조절함으로써 달성된 서로 다른 매트릭스 특성을 갖는 겔마(GelMA) 하이드로겔에 3차원적으로 캡슐화되었다. 캡슐화된 MSC는 20 rpm의 궤도-진탕 조건하에서 FBS 배양 배지를 사용하여 배양되었다.

캡슐화된 MSC는 기질의 강성이 다양함에 따라 다른 형태를 나타내었다. 연성 조건에서 MSCs는 '뉴런-형(neuron-like)'과 때로는 '응집된(aggregated)' 형태를 보여 주었으며, 세포 골격 확장(cytoskeleton extension)이 관찰되었다. 강성 그룹에서는 반대로, MSC의 형태는 둥글고 응집되지 않았으며, 그 세포 골격이 확장되지 않았다(도 6 및 8). 그러나 MSC는 여전히 다른 세포 거동을 보이면서도 MSC 줄기세포능(stemness)을 유지하였다(도 9). 캡슐화된 MSCs는 live and dead assay에서 높은 생존력을 보였다(도 7). 또한, DNA 정량화 결과는 배양 기간 동안 캡슐화된 MSC가 성장(growing)하는 것으로 나타났다(도 10).

(3) 캡슐화 및 2D 대조군 MSC의 유전자 발현 프로파일링

생물학적 특성을 특성화하기 위해, 캡슐화된 MSC 및 2D 대조군 MSC의 유전자 발현 패턴을 분석하였다. 유전자 발현 패턴은 qRT-PCR에 의해 분석하였으며 그 실험방법은 아래와 같다.

캡슐화된 MSC의 총 RNA를 배양 5일째에 추출하고, Collagenase(Sigma)를 GelMA 하이드로겔 분해에 사용하였다. 클로로포름(Sigma)을 1:5(v/v)의 비율로 TRIzol 시약(ThemoFisher Scientific) 처리 샘플에 첨가하였다. 클로로포름과 TRIzol을 혼합한 시료를 4℃, 15,000 rpm으로 15 ~ 20분간 원심 분리한 후, 상등액을 단리하고 1:1의 비율로 이소프로판올(Sigma)과 혼합하였다. 다시 4℃, 15,000 rpm으로 20분간 원심 분리한 후, 상등액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올로 세척한 다음 동일한 조건에서 다시 원심 분리하였다. 용액을 제거하고 펠릿을 실온에서 수 분간 완전히 건조시켰다. 펠릿을 적절한 DEPC 처리되지 않은 nuclease-free water(Invitrogen)에 용해시켰다. ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO, Osaka, Japan)를 사용하여 역전사하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 제조하였으며, qRT-PCR 어레이는 지시에 따라 RT² 프로파일러 PCR 어레이(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행되었다.

상기 qRT-PCR 결과를 도 9(a)에 그래프로 나타내었다. 상기 실험에서 확인한 발현 유전자는 [표 2]에 도시하였다.

기능	관련 유전자(마커)
Stemness	CTNNB1(Catenin(cadherin associated protein), beta 1); FGF2(Fibroblast growth factor 2); INS2(Insulin II); LIF(Leukemia inhibitory factor); POU5F1(POU domain, class 5, transcription factor 1); SOX2(SRY-box containing gene 2); TERT(Telomerase reverse transcriptase); WNT3A(Wingless-related MMTV integration site 3A); ZFP42(Zinc finger protein 42)
MSC-Specific	ALCAM(Activated leukocyte cell adhesion molecule); ANPEP(Alanyl(membrane) aminopeptidase); BMP2(Bone morphogenetic protein 2); BMP7(Bone morphogenetic protein 7); CASP3(Caspase 3); CD44(CD44 antigen); ENG(Endoglin); ERBB2(v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2); FUT4(Fucosyltransferase 4); FZD9(Frizzled homolog 9); ITGA6(Integrin alpha 6); ITGAV(Integrin alpha V); KDR(Kinase insert domain receptor); MCAM(Melanoma cell adhesion molecule); NGFR(Nerve growth factor receptor); NT5E(5' nucleotidase, ecto); PDGFRB(Platelet derived growth factor receptor, beta polypeptide); PROM1(Prominin 1); THY1(Thymus cell antigen 1, theta); VCAM1(Vascular cell adhesion molecule 1)
Adipogenesis	PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma); RHOA(Ras homolog gene family, member A)
Tenogenesis	GDF15(Growth differentiation factor 15); SMAD4(MAD homolog 4); TGFB1(Transforming growth factor, beta 1)
Myogenesis	ACTA2(actin alpha 2); JAG1(Jagged 1); NOTCH1(Notch gene homolog 1)
Chondrogenesis	ABCB1(ATP-binding cassette, sub-family B(MDR/TAP), member 1A); BMP4(Bone morphogenetic protein 4); GDF5(Growth differentiation factor 5); GDF6(Growth differentiation factor 6); GDF7(Growth differentiation factor 7); HAT1(Histone aminotransferase 1); ITGAX(Integrin alpha X); KAT2B(lysine acetyltransferase 2B); SOX9(SRY-box containing gene 9); COL1A1(Collagen, type I, alpha 1)
Osteogenesis	ANXA5(Annexin A5); BGLAP(Bone gamma carboxyglutamate protein 1); BMP6(Bone morphogenetic protein 6); FGF10(Fibroblast growth factor 10); HDAC1(Histone deacetylase 1); HNF1A(HNF1 homeobox A); MMP2(Matrix metallopeptidase 2); PTK2(PTK2 protein tyrosine kinase 2); RUNX2(Runt related transcription factor 2); SMURF1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1); SMURE2(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2); TBX5(T-box 5)
Angiogenesis	CSF3(Colony stimulating factor 3); EGF(Epidermal growth factor); FUT1(Fucosyltransferase 1); HGF(Hepatocyte growth factor); PIGS(Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class S); VEGFA(Vascular endothelial growth factor A); VWF(Von Willebrand factor homolog); NUDT6(Nudix(nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 6)
Neurogenesis	NUDT6; NES(Nestin); BDNF(Brain derived neurotrophic factor); VIM(Vimentin); SLC17A5(solute carrier family 17 member 5); CSF2(Colony stimulating factor 2); IL1B(Interleukin 1 beta); IL6(Interleukin 6)
Immunomodulation	ITGB1(Integrin beta 1); KITLG(KIT ligand); PTPRC(Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C); TGFB3(Transforming growth factor, beta 3); ICAM1(Intercellular adhesion molecule 1); IFNG(Interferon gamma); IGF1(Insulin-like growth factor 1); IL10(Interleukin 10); TNF(Tumor necrosis factor)
Anti-Apoptosis	GTF3A(General transcription factor III A)

강성 그룹의 MSC는 2D 대조군 MSC와 비교하여, 강화된 혈관신생(angiogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 골형성(osteogenesis), 신경생성(neurogenesis) 및 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 발현을 보였다.

구체적으로 강성 그룹에서는 혈관신생(angiogenesis) 관련 유전자 중에서 CSF3, EGF, FUT1, HGF 및 VWF 유전자; 연골형성(chondrogenesis) 관련 유전자 중에서 ABCB1, BMP4, GDF6, GDF7, HAT1 및 ITGAX; 골형성(osteogenesis) 관련 유전자 중에서 BGLAP. BMP6, FGF10, HDAC1, HNF1A, RUNX2, SMURF1 및 TBX5; 신경생성(neurogenesis) 관련 유전자 중에서 NES, CSF2 및 IL1B; 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 중에서 PTPRC, TGFB3, ICAM1, IFNG, IL10 및 TNF 유전자가 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

대조적으로, 지질생성(adipogenesis), 테노제네시스(tenogenesis), 근발생(myogenesis), 및 항-세포사멸(anti-apoptosis)에 관련된 유전자는 하향 조절되었다.

구체적으로 지질생성(adipogenesis) 관련 유전자 중에서 RHOA; 테노제네시스(tenogenesis) 관련 유전자 중에서 GDF15, SMAD4 및 TGFB1; 근발생(myogenesis) 관련 유전자 중에서 ACTA2 및 JAG1; 항-세포사멸(anti-apoptosis) 관련 유전자인 GTF3A 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

흥미롭게도 강성 그룹의 MSC는 2D 대조군 MSC와 비교하여, 줄기세포로서의 특성은 고도로 상향 조정되었고 다른 생물학적 특성은 변화를 보였다. 구체적으로 줄기세포능(Stemness) 마커 유전자 중에서 INS2, LIF, POU5F1, SOX2, TERT, WNT3A 및 ZFP42 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

중성 그룹의 MSC는 강성 그룹과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타내었으나, 연성 그룹의 MSC는 강성 그룹과는 다른 유전자 발현 패턴을 나타내는 경향이 있었다. 연성 그룹의 MSC에서 연골형성(chondrogenesis), 면역 조절(immunomodulation), 신경생성(neurogenesis), 테노제네시스(tenogenesis), 골형성(osteogenesis), 근발생(myogenesis) 관련 유전자, 및 MSC 특이적 마커는 하향 조절되었으나, 혈관신생(angiogenesis), 지질생성(adipogenesis), 항-세포사멸(anti-apoptosis)에 관련된 유전자는 큰 변화를 나타내지 않았다.

구체적으로 연골형성(chondrogenesis) 관련 유전자 중에서 BMP4, KAT2B 및 COL1A1; 골형성(osteogenesis) 관련 유전자 중에서 ANXA5, PTK2, SMURF1 및 SMURE2; 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 중에서 ITGB1 및 PTPRC; 신경생성(neurogenesis) 관련 유전자 중에서 BDNF 및 VIM; 테노제네시스(tenogenesis) 관련 유전자 중에서 GDF15 및 SMAD4; 근발생(myogenesis) 관련 유전자 중에서 ACTA2 및 JAG1 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

기계적 강도가 조절된 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 줄기세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차원 고분자 세포 지지체 내부에 캡슐화된 줄기세포를 진탕 배양 또는 바이오리액터로 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 만능유도줄기세포, 및 전발생세포(progenitor cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차원 고분자 세포 지지체는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA)를 포함하는 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 캡슐화는 메타크릴레이트화된 젤라틴(methacrylated gelatin, GelMA) 용액에 줄기세포 및 광개시제를 혼합하고, 상기 혼합 용액에 UV를 조사하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도는 상기 혼합 용액에 조사되는 UV 강도에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 줄기세포의 줄기세포능(Stemness)을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도는 3 ~ 30 kPa 범위에서 조절되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도가 3 ~ 10kPa인 경우, 연골형성(chondrogenesis), 면역 조절(immunomodulation), 신경생성(neurogenesis), 테노제네시스(tenogenesis), 골형성(osteogenesis) 및 근발생(myogenesis) 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도가 3 ~ 10kPa인 경우, 상기 줄기세포는 뉴런-형(neuron-like) 또는 응집된(aggregated) 형태학적 특징을 나타내는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도가 11 ~ 30kPa인 경우, 혈관신생(angiogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 골형성(osteogenesis), 신경생성(neurogenesis) 및 면역 조절(immunomodulation) 관련 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도가 19 ~ 30kPa인 경우, 상기 줄기세포는 둥글고 응집되지 않은 형태학적 특징을 나타내는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.
제1항에 있어서,
상기 기계적 강도가 3 ~ 10kPa인 경우, 상기 줄기세포에서 세포 골격 확장(cytoskeleton extension)이 일어나지만, 19 ~ 30kPa인 경우, 세포 골격 확장(cytoskeleton extension)이 일어나지 않는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 유전자 발현 조절 방법.