WO2009151301A2 - 인간배아줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료용 이식재 및 치료 방법 - Google Patents

인간배아줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료용 이식재 및 치료 방법 Download PDF

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WO2009151301A2
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cells
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vascular progenitor
stem cell
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정형민
임좌진
문성환
김주미
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(주)차바이오앤디오스텍
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells

Definitions

  • the present invention relates to a wound treatment technique using embryonic stem cell-derived vascular precursor cells. More specifically, the present invention relates to a wound treatment technique using human embryonic stem cell-derived vascular precursor cells.
  • stem cell-derived vascular progenitor cells By transplanting stem cell-derived vascular progenitor cells, vascular progenitor cells promote angiogenesis, thereby treating the wound site more effectively in a shorter time than conventional adult stem cell-derived vascular progenitor cells.
  • epidermal cells are difficult to cultivate quickly enough to stabilize patient tissues, and cultured epidermal cells do not grow well on human-derived fibroblasts as well as engraftment. In the process, the epidermis and dermis bonds have fatal disadvantages.
  • the present inventors conducted various studies for the development of wound treatment technology using human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells.
  • human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells are expanded and cultured to the extent possible to treat disease models and transplanted into wound disease animal models.
  • the present invention utilizes human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the vascular progenitor cells derived from embryonic stem cells; (b) providing a wound treatment method using the embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells, comprising transplanting the cultured embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells into the skin of a mammal.
  • the present invention provides a method for treating wounds using human embryonic stem cells as embryonic stem cells, and using vascular progenitor cells derived therefrom.
  • Human embryonic stem cells used in the culture are differentiated through the formation of embryoid bodies in a hypoxic state to separate vascular progenitor cells, and then flow cells using markers.
  • Human embryonic stem cells using embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells concentrated at high concentration through separation (FACS) are preferred, and markers used for flow cytometry are preferably used as a marker of CD133 / KDR.
  • the culture dish is preferably coated with a collagen, and then cultured.
  • EGM-2 MV culture medium is used as the culture medium. It is preferable to culture by using, but if necessary, known cultures such as trypsin-EDTA, DMEM culture, M199 culture, or these mixed cultures can be used, and cell proliferation can be propagated by subculture, and each stage of subculture. The required culture solution can be selected and cultured.
  • the embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells are preferably transplanted together with a matrigel for the formation of a support for the cells to be transplanted. If necessary, in order to block the external environment during implantation, the PE ring may be attached to the wound site and then vascular progenitor cells may be implanted therein.
  • the present invention further provides embryonic stem cells through embryonic body formation in a hypoxic state.
  • vascular progenitor cells By differentiating, separating vascular progenitor cells, and providing embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells for wound transplantation in mammals, characterized in that they are concentrated at high concentration through flow cytometry (FACS) using a marker.
  • FACS flow cytometry
  • the embryonic stem cells may be used human embryonic stem cells, these
  • It can be cultured continuously, it can be provided as a product that can be distributed by known methods such as lyophilization.
  • the present invention further provides embryonic stem cells through embryonic body formation in a hypoxic state.
  • the embryonic stem cells may be used human embryonic stem cells, these human embryonic stem cells may be provided as a commodity that can be distributed by adding preservatives, culture fluids and the like.
  • the wound treatment method of the present invention can greatly reduce the problem of cell supply restriction by using human embryonic stem cells having infinite self-proliferation ability as a cell source, and can also reduce the problem of adult umbilical cord blood cells.
  • Stem cell origin by using human embryonic stem cells having infinite self-proliferation ability as a cell source, and can also reduce the problem of adult umbilical cord blood cells.
  • the progress after transplantation of human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells of the present invention shows that the collagen layer is formed on the wound site much more effectively than the comparative group of umbilical cord blood stem cell-derived vascular progenitor cells. It can be seen that is promoted.
  • the new blood vessels generated by transplanted human embryonic stem cell-derived vascular precursor cells and angiogenesis-promoting factors secreted therefrom are wound healing factors (growth factors, inflammatory cells) present in the animal body. By making the movement of substrate cells and skin progenitor cells easier, the wound treatment can be made more effective.
  • the wound treatment method of the present invention has no restriction on cell supply, and is a conventional adult.
  • FIG. 26 is a photograph showing the morphology of human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells
  • FIG. Lb is CD34, KDR and Flt-1, which are representative vascular cell markers of human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells.
  • SMA, Tie-2, vWF expression was confirmed by flow cytometry.
  • FIG. 2 is a photograph and schematic diagram illustrating a wound animal model preparation and transplantation process for verifying a wound treatment effect.
  • Figure 3 is a culture (EGM-2 MV, 200ul), human fibroblasts (hEF, 3X10 5 ), umbilical cord blood derived to verify the effect of wound healing of human embryonic stem cell-derived vascular precursor cells
  • Figure 4a shows the wound tissue after 2 weeks through Masson's Trichrome staining
  • Figure 4b is the result of confirming re-epithelialization through CK6 staining of the same tissue.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating vascular formation of the same tissue as in FIG. 4 through fluorescence immunostaining. Results are different
  • embryonic stem cell includes all embryonic stem cells derived from mammals, and includes human embryonic stem cells.
  • the human embryonic stem cells include pluripotent cells derived from the inner cell mass of human morula.
  • the human embryonic stem cells are, for example, CHA-hES3 (Jumi Kim, Sung-Hwan Moon, Soo-Hong Lee, Dong-Ryul Lee, Gou-Young Koh, and Hyung-Min Chung, Effective Isolation and Culture of Endothelial Cellsin Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem cells (2007) STEM CELLS AND DEVELOPMENT 16: 269.280) and the like may be used, but is not limited to these examples.
  • human embryonic stem cells can be easily constructed by those skilled in the art.
  • human embryonic stem cell-derived vascular precursor cells are human embryos.
  • the teratoma-free human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells are cultured in collagen-coated culture dish in EGM-2 / MV (Cambrex) culture broth, and the concentration of cells is about 70-80%.
  • trypsin -EDTA Gibco was removed from the culture dish using a subculture and then grown by subculture.
  • the fabrication of the wound animal model for verification of wound treatment effect was performed by inducing a 12 mm skin exfoliation wound using a biopsy punch on the back of a 6-week-old nude mouse.
  • the PE ring was mounted on the wound site for exclusion.
  • the wound animal model is manufactured as shown in FIG. 2.
  • the cultured human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells were transplanted into the wound animal model.
  • 3x l0 5 of the human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells matrigel in the 200 ⁇ implanted in PE ring inside the wound in animal models.
  • Fibroblast 3 ⁇ 10 s
  • CB-EPC cord blood-derived vascular progenitor cells
  • Stem cell-derived vascular progenitor cells and other comparative groups were mixed with matrigel and implanted into the PE ring on the dorsal animal model dorsal side (see FIG. 2).
  • Example 1 As specified in Example 1 (3), culture medium (EGM-2 MV medium, 2 ⁇ ), human fibroblasts (hEF, Fibroblast, 3 ⁇ 10 5 ), cord blood-derived vascular progenitor cells (CB-EPC, 3 ⁇ ) 10 s ), human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells (hES-VAPC, VAPC, 3 ⁇ 10 5 ) were transplanted, and each treatment group was observed for two weeks to observe the extent of wound size reduction (see FIG. 3).
  • human fibroblasts hEF, Fibroblast, 3 ⁇ 10 5
  • CB-EPC cord blood-derived vascular progenitor cells
  • hES-VAPC human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells
  • wound size reduction is the most In the late fibroblast and umbilical cord-derived vascular progenitor cell treatment group (CB-EPC), the wound size was reduced more rapidly than the culture fluid treatment group, but the human embryonic stem cell-derived vascular precursor cell treatment group In the case of VAPC, the wound size was observed to be significantly reduced compared to other treatment groups.
  • CB-EPC medium treatment group
  • VAPC human embryonic stem cell-derived vascular precursor cell treatment group
  • Example 1 (3) human embryonic embryonic cell-derived vascular progenitor cells were transplanted into the wound animal model, and two weeks later, samples of the wound region were taken and histologically analyzed.
  • the synthesis of the human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cell transplant group treated according to the treatment method of the present invention was confirmed to be significantly higher in the synthesis of collagen compared to the culture group treated group.
  • CK6 immunostaining of the samples confirmed that re-epithelialization occurred faster than the culture solution treatment group (see FIG. 4b).
  • Example 1 (3) human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells were transplanted into a wound animal model, and after 2 weeks, a sample of the wound was collected and subjected to fluorescence immunostaining of tissue specimens. It was.
  • the present invention relates to techniques for wound healing in mammals, including humans.
  • the present invention relates to an implant and a transplantation method comprising human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells.

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Abstract

본 발명은 인간배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해 분화시켜 혈관전구세포를 분리, 농축된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 포함하는 창상 치료용 이식재를 제공하는 한편, (a)이식을 위한 배아 줄기세포 유래의 혈관전구세포를 배양하는 단계; (b)상기 배양된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 포유동물의 피부에 이식하는 단계를 포함하는, 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법을 제공한다.

Description

명세서
인간배아줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료용 이식재 및 치료 방법
기술분야
[1] 본 발명은 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 기술로서，창상 부위에 고농도로 배양된 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이식함으로써 , 혈관전구세포가 혈관 신생을 촉진시켜 종래 성 체 줄기세포 유래 혈관전구세포보다 단시간 내에 효과적으로 창상 부위를 치료하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
[2] 현재 창상치료 (wound healing)는 대부분 인공 피부이식을 통한 치료법 이 널리 행해지고 있다. .
[3] 큰 화상이나 외과수술시 피부 결손이 있는 창상에 적용되는 인공피부는 합성 고분자와 천연 고분자로 이루어져 있어 대개 위층인 실리콘은 체액이 증발하여 소실되는 것을 막고, 아래층은 콜라겐이나 황산 콘드로이친으로 구성되어 새로운 혈관과 결합조직의 재생을 유도하며 , 환자 자신의 세포를 이용하는 방법으로는 피부의 각층을 구성하는 세포를 채취하여 시험관 내에서 확장시킨 후 적 절한 합성고분자 또는 천연고분자 등으로 만들어진 인공피부에 접종하여 조직 형성을 유도한 뒤 다시 환자에 이식하는 방법 이 이용되어 지고 있다.
[4] 하지만，인공피부를 이용한 치료법들은 상처회복측면에서 볼 때，일정한
결과를 도출해 내지 못하고 있는 실정 이며，특히 배양피부의 경우 표피세포는 환자조직을 안정 시 킬 만큼 배양이 신속히 잘되지 않는 어려움이 있으며 , 배양된 표피세포는 인간유래 섬유아세포 위에서 잘 자라지 않을 뿐 아니라 생착 과정에서 표피 .진피 간 결합이 불안정한 치명적 단점을 갖고 있다.
[5] 정상적 인 상처 의 회복기전은 여 러 단계를 거치나 상처 후 웅고기，염증기 , 세포이주기 및 조직 재편기의 모든 과정들은 궁극적으로 국소 상처 부분의 혈액순환이 상처 회복을 주도하고 있다. 이 러한 국소혈액순환은 새로운 혈관의 신생으로 촉진되어 신생된 혈관올 통해 상처회복에 필요한 각종 성장인자, 염증세포, 기질세포 및 피부전구세포 등을 실어 나르며 , 또한 조직파편의 제거 및 육아조직 등의 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
[6] 이러한 측면에서 신생혈관 생성능력 이 있는 혈관전구세포의 이식에 의한 창상 치료 효과를 기 대할 수 있올 것이며, 성 체 즐기세포 유래의 혈관전구세포를 이용한 창상치료의 효과는 이미 보고 된 바 있다.
[7] Kim WS 등은 지방 즐기세포 유래 세포를 이용하여 창상 치료 효과를 입증한 바 있으며 (Won-Serk Kim, Byung-Soon Park, Jong-Hyuk Sung, Jun-Mo Yang, Seok-Beom Park, Sahng-June Kwak, Jeong-Soo Park, Wound healing effect of adipose-derived stemcells: A critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts(2007) Journal of Dermatological Science 48, 15-24), Stephen M 등은 골수 줄기세포 유래의 혈관전구세포를 이용하여 허혈성 질환으로 인한 창상 치료에 그 효과를 입증하였으며 (Stephen M. Bauer, Lee J. Goldstein, Richard J. Bauer, Haiying Chen, Mary Putt,ScD, and Omaida C. Velazquez, The bone marrow-derived endothelial progenitorcell response is impaired in delayed wound healing from ischemia. Journal of vascular surgery (2006) 43(1): 134-41), Suh W 등은 제대혈 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용하여 창상 치료 효과를 입증한 바 있다 (Suh W, Kim KL, Kim JM, Shin IS, LEE YS, Jang HS, LEE JS, Byun J, Choi JH, Jeon ES, Kim DK, Transplantation of endothelial progenitor cells accelerates dermal wound healing with increased recruitment of monocytes/macrophages and neovascularization (2005) 23(10): 1571-8).
[8] 하지만，일반 골수나 제대혈 등과 같은 성체 줄기세포로부터 혈관전구세포를 얻는 수율은 지 극히 낮아 이에 대한 대안이 필요하다ᅳ 따라서 무한대의 증식능과 분화능을 지닌 인간배아 줄기세포의 이용은 새로운 세포치료제의 대안으로 개발 가능할 것이다.
[9] 인간배아 줄기세포는 무한한 자가 재생 능력 (self-renewality)과 특정 환경
내에서 인간의 몸을 구성하는 삼배엽성 세포 (내배엽，중배엽，외배엽)로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)을 가진 세포로서 (Thomson J A, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282: 1145-1147), 혈관 세포, 신경 세포，근육 세포，췌장 세포 등으로 분화를 유도한 연구들이 발표됨에 따라 난치 병 치료에 큰 가능성을 가진 세포로 여 러 분야에서 증요한 세포로 인식 되어왔다.
[10] 그러므로 창상 치료를 위한 세포 치료제의 개발을 위해서는，무한 공급이
가능한 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 동물 모델에의 적용을 통한 보다 획기적 이고 근본적 인 치료법 제공이 절실히 요구되어 진다. 발명의 상세한 설명
기술적 과제
[11] 본 발명자들은 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 기술 개발을 위한 다양한 연구를 수행하였다.
[12] 그 결과，인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 질환 모델 치료에 가능한 정도의 수로 증식 /배양하여 창상 질환 동물 모델에 이식 시 , 현재 널리
이용되어지고 있는 제대혈 유래 혈관전구세포에 비해 단시간 내 보다
효과적으로 상처부위 크기가 감소하는 것을 발견하였다. 또한, 인간배아 줄기세포 유래 혈관 즐기세포 처치군 에서의 조직학 분석 결과, 배양액 처치군에 비해 많은 양의 콜라겐층이 형성되었으며 , 이와 함께 재상피화가 보다 빠르게 촉진되었음을 발견할 수 있었다.
[13] 따라서，본 발명은 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한, 보다
효과적 인 창상 치료 기술 개발의 제공을 목적으로 한다ᅳ
기술적 해결방법
[14] 본 발명은 (a)이식을 위한 배아 줄기세포 유래의 혈관전구세포를 배양하는 단계; (b)상기 배양된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 포유동물의 피부에 이식하는 단계를 포함하는, 배아 즐기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법을 제공한다.
[15] 본 발명은 배아 줄기세포로는 인간배아 줄기세포를 이용하여，이로부터 유래된 혈관전구세포를 이용하는 창상 치료 방법을 제공한다.
[16] 상기 배양에 이용되는 인간배아 줄기세포는 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해 분화시켜 혈관전구세포를 분리한 다음, 마커를 이용한 유세포
분리 (FACS)를 통해 고농도로 농축된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용하는 인간배아 줄기세포인 것이 바람직하고, 유세포 분리에 이용되는 마커는 CD133/KDR의 이증마커를 사용하는 것이 바람직하다.
[17] 상기 단계 (a)에서 상기 인간배아 즐기세포 유래 혈관전구세포의 효과적 인 증식 및 배양을 위해 배양 접시에 콜라겐 코팅을 한 후 배양하는 것이 바람직하고， 배양액으로는 EGM-2 MV 배양액을 사용하여 배양하는 것이 바람직하나, 필요에 따라서는 트립신 -EDTA, DMEM 배양액, M199 배양액 또는 이들 흔합 배양액 등 공지의 배양액이 이용될 수 있고，세포증식은 계대 배양으로 증식될 수 있으며 , 계대 배양 단계별로 각각 필요한 배양액을 선별하여 배양할 수 있다.
[18] 상기 단계 (b)에서 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포는 이식되는 세포의 지지 체 형성올 위해 매트리 젤 (matrigel)과 함께 이식하는 것이 바람직하다. 필요에 따라서는 이식 시 외부환경을 차단하기 위하여 창상 부위에 PE 링을 장착한 후 그 내부에 혈관전구세포를 이식할 수 있다.
[19]
[20] 또한，본 발명은 배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해
분화시켜 , 혈관전구세포를 분리한 다음，마커를 이용한 유세포 분리 (FACS)를 통해 고농도로 농축된 것을 특징으로 하는 포유동물의 창상 이식용 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 제공한다.
[21] 상기 배아 줄기세포로는 인간배아 줄기세포가 이용될 수 있으며 , 이들
인간배아 줄기세포는 무한증식성을 가지므로 계대 배양 등을 통하여
지속적으로 배양할 수 있으며 , 동결건조 등 공지의 방법으로 유통이 가능한 상품으로 제공될 수 있다.
[22] 또한，본 발명은 배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해
분화시켜 혈관전구세포를 분리한 다음, 마커를 이용한 유세포 분리 (FACS)를 통해 고농도로 농축된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 포함하는 창상 치료용 이식 재를 제공한다. 상기 배아 줄기세포는 인간배아 줄기세포가 이용될 수 있으며，이들 인간배야 줄기세포쎄 보존제，배양액 등을 첨 가하여 유통이 가능한 상품으로 제공될 수 있다.
유리한 효과
[23] 본 발명의 창상 치료 방법은 무한 자가증식 능력을 가진 인간배아 줄기세포를 세포 공급원으로 이용함으로써, 세포 공급 제한성의 문제를 크게 감소시 킬 수 있을 뿐 아니라, 종래 제대혈 즐기세포와 같은 성 체 줄기세포 유래
혈관전구세포를 이용하는 것보다 단시간에 보다 효율적으로 창상 부위를 치료시키는 효과가 있다.
[24ᅵ 특히 , 본 발명의 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포 이식 후의 경과를 보면, 제대혈 줄기세포 유래 혈관전구세포 등의 비교군에 비 해 창상 부위에 월등히 많이 콜라겐 층이 형성됨으로써 보다 효과적으로 재상피화가 촉진되는 것을 알 수 있다. 또한，본 발명의 치료 방법에 따르면 이식된 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포와 이로부터 분비된 혈관 생성 촉진 인자들로 인해 생성된 새로운 혈관들은 동물 체내에 존재하는 상처 치유 인자 (성장인자, 염증세포，기 질세포 및 피부전구세포 등)들의 이동을 보다 용이하게 함으로써 창상 치료를 보다 효과적으로 할 수 있다.
[25] 따라서，본 발명의 창상 치료 방법은 세포 공급의 제한이 없으며，종래 성체
줄기세포 창상 치료 방법보다 단시간 내에 , 보다 높은 효율로 상처를 치유할 수 있다.
도면의 간단한 설명
[26] 도 la는 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포의 형 태학적 모습을 나타내는 사진이며，도 lb는 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포의 대표적 인 혈관 세포 표지 인자인 CD34, KDR, Flt-1, SMA, Tie-2, vWF 등의 발현을 유세포 분석기를 통해 확인한 결과이다.
[27] 도 2는 창상 치료 효과 검증을 위한 창상 동물 모델 제작 및 이식 과정올 나타낸 사진과 모식도 이다.
[28] 도 3는 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포의 창상 치료 효과 검증을 위해 배양액 (EGM-2 MV, 200ul), 인간 섬유아세포 (hEF, 3X105), 제대혈 유래
혈관전구세포 (CB-EPC, 3X105)등의 비교군과 함께 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포 (hES-VAPC XIO5)를 이식한 군에서의 상처 크기 감소를 2주간 관찰한 결과이다.
[29] 도 4a는 2주후 상처부위 조직을 채취하여 Masson's Trichrome염색을 통해
콜라겐의 합성을 확인 한 결과이며 , 도 4b는 동일 조직 의 CK6 염색을 통해 재상피화를 확인 한 결과이다.
[30] 도 5는 도 4와 동일 조직을 형광 면역 염 색을 통해 혈관 생성 정도를 관찰한 결과이 다ᅳ
발명의 실시를 위한 형태
[31] 본 명세서에서 , "배아 줄기세포 "는 포유동물 유래의 모든 배아 줄기세포를 포함하며，인간배아 줄기세포를 포함한다.
[32] 상기 인간배아 줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 포함한다. 상기 인간배아 줄기세포는 예를 들면, CHA-hES3 (Jumi Kim, Sung-Hwan Moon, Soo-Hong Lee, Dong-Ryul Lee, Gou-Young Koh, and Hyung-Min Chung, Effective Isolation and Culture of Endothelial Cellsin Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem cells (2007) STEM CELLS AND DEVELOPMENT 16:269.280) 등이 사용될 수 있으나，이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한，인간배아 줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다ᅳ
[33] 본 발명에 있어서 "인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포 "는 인간배아
줄기세포에서 유래된 혈관전구세포를 의미하고，테라토마가 제거된 고농도의 순수 혈관전구세포를 포함한다.
[34] "인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포 "는 인간배아 줄기세포를 저산소
상태에서 배상체 형성올 통해 분화시 킨 후, 유세포 분리를 통해 고농도로 농축된 혈관전구세포를 포함한다.
[35]
[36] 이하，실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명 한다. 그러나，이들
실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로，본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[37]
[38] 실시 예 1.
[39] (1) ?1 ?>배아 즘기 세포 유래 혐과저구세포의 배양 및 증식
[40] 인간배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해 분화시 킨 후,
CD 33/KDR 의 이증 마커를 이용한 유세포 분리를 통해 인간배아 즐기세포 유래 혈관전구세포를 고농축으로 분리하였다.
[41] 상기 테라토마가 제거된 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 콜라겐이 코팅된 배양 접시 위에서 EGM-2/MV(Cambrex) 배양액 증에서 배양하고, 세포의 농도가 약 70-80% 정도로 배양 접시에 분포되었을 때 트립신 -EDTA (Gibco)를 이용하여 배양 접시로부터 때어낸 후 계대 배양을 실시하여 증식시켰다.
[42]
[43] (2) 창상 동물 모템 제작
[44] 창상 치료 효과 검증을 위한 상기 창상 동물 모델 제작은 6주령의 누드마우스 등쪽에 바이옵시 편치 (biopsy punch)를 이용하여 12mm 피부 전층박리상처를 유도한 뒤，자연 치유 능력으로 인한 치료효과의 배제를 위해 PE 링을 상처 부위에 장착하여 제작하였다. [45] 상기 창상 동물 모델 제작은 도 2와 같다.
[46]
[47] (^ 창상 동물 모템로의 이간배아 줄기세포 유래 혐관저구세포 이식
[48] 상기 배양된 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 제작된 창상 동물 모델에 이식하였다. 이식 시 , 3x l05의 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 200 ^의 matrigel 과 섞어 창상 동물 모델의 PE 링 내부에 이식하였다.
[49] 인간배아 즐기세포 유래 혈관전구세포의 효력 검증을 위해 동일한 창상 동물 모델에 비교군으로 배양액 (EGM-2 MV medium, 200μί), 인간 섬유아세포 (hEF,
Fibroblast, 3x 10s), 제대혈 유래 혈관전구세포 (CB-EPC, 3X105)를 이식한 후, 2주간 상처 크기의 감소 정도를 관찰하였다.
[50] 또한, 2주후 조직학 분석과 면역 염색을 통해 상처 치유에 중요한 인자인
콜라겐의 합성과 재상피화 과정을 관찰하였다.
[51] 콜라겐 합성의 확인은 Masson's Trichrome염 색을 실시하였으며，재상피화는
CK6 염색을 통해 확인하였다.
[52]
[53] 실험 예 1.
[54] 실시 예 1의 ( 1)에서 명시된 조건하에서 배양되어진 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 형 태학적으로 관찰하였다. 도 la에서와 같이 양성 대조군으로 사용되어지는 제대혈 유래 혈관전구세포 (CB-EPC)와 유사한 형 태학적 특성을 가지는 것을 확인하였다. 형 태학적 분석과 함께 상기 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포의 혈관전구세포로서의 특성 검증을 위 해, 도 lb에서와 같이 3번 계대배양을 한 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 유세포 분석기를 이용하여 혈관 세포의 표지 인자인 CD34, KDR, SMA, Flt- 1, Tie-2, vWF 등의 발현을 확인하였다ᅳ
[55] 상기 결과는 본 발명에 사용된 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포가 종래의 혈관전구세포와 유사한 특성을 지님을 나타낸다.
[56]
[57] 실험 예 2.
[58] 실시 예 1의 (2)에서 명시된 방법으로 창상 동물 모델을 제작한 후，인간배아
줄기세포 유래 혈관전구세포와 다른 비교군들을 matrigel 과 섞어 창상 동물 모델 등쪽의 PE링 내부로 이식하였다 (도 2 참조).
[59]
[6이 실험 예 3.
[61] 실시 예 1의 (3)에서 명시한 바와 같이 배양액 (EGM-2 MV medium, 2 μί), 인간 섬유아세포 (hEF, Fibroblast, 3x l05), 제대혈 유래 혈관전구세포 (CB-EPC, 3x 10s), 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포 (hES-VAPC, VAPC, 3x l05)를 각각 이식 한 뒤 각 처치군을 2주간 관찰하여 상처 크기의 감소 정도를 관찰 하였다 (도 3 참조). 도 3에 보이는 바와 같이 배양액 처치군 (Medium)의 경우 상처 크기 감소가 가장 늦게이루어졌으며,인간섬유아세포 (Fibroblast)와제대혈유래혈관전구세포 처치군 (CB-EPC)의경우배양액처치군보다는다소빠른상처크기의감소를 관찰할수있었으나,인간배아줄기세포유래혈관전구세포처치군 (VAPC)의 경우가타처치군에비해현저히빠른속도로상처크기가감소하는것을관찰할 수있었다.
[62] 상기결과는본발명에사용된인간배아줄기세포유래혈관전구세포를이용한 창상치료효과가다른처치군에비해월둥히효율적임을나타낸다.
[63]
[64] 실험예 4.
[65] 실시예 1의 (3)에서명시한바와같이인간배아즐기세포유래혈관전구세포를 제작된창상동물모델에이식한뒤, 2주후상처부위의샘플을채취하여조직학 분석올실시하였다.
[66] 도 4a에서확인할수있는바와같이,본발명의치료법에따라처치된인간배아 줄기세포유래혈관전구세포이식군의경우,비교군인배양액처치군에비해 월등히높은콜라겐의합성이확인되었다.동일조직표본의 CK6면역염색을 통해배양액처치군에비해재상피화가빠르게일어났음을확인할수있었다 (도 4b참조).
[67] 상기결과는본발명에사용된인간배아즐기세포유래혈관전구세포를이용한 창상치료효과가상처치유에필수적인콜라겐의다량합성으로이것이 재상피화를위한가교역할을수행하여재상피화를빠르게촉진했음을 나타낸다.
[68]
[69] 실험예 5.
[70] 실시예 1의 (3)에서명시한바와같이인간배아줄기세포유래혈관전구세포를 제작된창상동물모델에이식한뒤, 2주후상처부위의샘풀을채취하여 조직표본의형광면역염색법을실시하였다.
[71] 형광면역염색법을통한이식된세포의확인을위해인간배아즐기세포유래 혈관전구세포를 Dil(red)로표지한후이식하였으며,샘플채취하루전에모든 혈관인지를위해혈관에염색되는 Lectin(green)올꼬리를통해주사한뒤, 조직을채취하여형광현미경을통해확인하였다.
[72] 도 5에서알수있는바와같이,인간배아줄기세포유래혈관전구세포를
이식한군의경우, Lectin(green)이발현되어지는부위에 Dil(red)로표지된 인간배아줄기세포유래혈관전구세포가존재하는것을확인하였다.
[73] 상기결과는본발명에사용된인간배아줄기세포유래혈관전구세포가이식 후창상부위에새로운혈관을생성하였으며，이를통해상처부위로상처치유 인자들의전달이보다용이했을것이며,이를통해보다효과적인창상치유 효과가나타났음을의미한다. 산업상 이용가능성
본 발명은 인간을 포함한 포유류의 창상 치료 기술에 관한 것이다. 본 발명은 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 포함하는 이식재 및 이식 방법에 관한 것이다.

Claims

청구범위
[I] (a) 이식을 위한 배아 즐기세포 유래의 혈관전구세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 인간을 제외한 포유동물의 피부에 이식하는 단계를 포함하는, 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법.
[2] 제 1항에 있어서 , 상기 세포 배양 단계는 배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해 분화시켜 혈관전구세포를 분리 한 다음，마커를 이용한 유세포 분리 (FACS)를 통해 고농도로 농축된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용하는 인간배아 줄기세포인, 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[3] 제 2항에 있어서，상기 배아 줄기세포는 인간배아 줄기세포인，배아
줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[4] 제 2항 또는 제 3항에 있어서 , 유세포 분리에 이용되는 마커는 CD133/KDR의 이증마커 인，배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[5] 제 1항 또는 제 2항에 있어서 , 상기 배양 단계는 배양 접시에 콜라겐 코팅을 한 후 배양액과 함께 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 배양하는 것인, 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[6] 제 5항에 있어서，상기 배양액은 EGM-2 MV 배양액, 트립신 -EDTA, DMEM
배양액， M199 배양액 또는 이들 흔합 배양액인, 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[7] 제 1항에 있어서，상기 이식 단계에서 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포는 이식되는 세포의 지지체 형성을 위 해 매트리젤 (matrigel)과 함께 이식하는 것인, 배아 즐기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[8] 제 1항 또는 제 7항에 있어서, 상기 이식 단계는 창상 부위에 PE 링을 장착한 후 그 내부에 혈관전구세포를 이식하는 것인，배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 이용한 창상 치료 방법 .
[9] 배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성올 통해 분화시켜
혈관전구세포를 분리한 다음, 마커를 이용한 유세포 분리 (FACS)를 통해 고농도로 농축된 것을 특징으로 하는 포유동물의 창상 이식용 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포.
[10] 제 9항에 있어서 , 상기 배아 줄기세포는 인간배아 줄기세포인 것올
특징으로 하는 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포.
[I I] 배아 줄기세포를 저산소 상태에서 배상체 형성을 통해 분화시켜
혈관전구세포를 분리한 다음，마커를 이용한 유세포 분리 (FACS)를 통해 고농도로 농축된 배아 줄기세포 유래 혈관전구세포를 포함하는 창상 치료용 이식재.
[12] 제 11항에 있어서 , 상기 배아 줄기세포는 인간배아 줄기세포인 창상 치료용 이식재.
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