CN117946963A - 人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用，该分离方法是组织解剖含有小鼠触须毛囊单位的面部组织，胶原酶Ⅴ消化至组织松散膨大，从真皮层一侧拔出保持完好的触须毛囊，外科手术刀切除毛乳头；将毛囊移植到transwell膜上，静置培养；毛乳头用胶原酶Ⅰ消化后，洗涤、离心得到悬液，悬液滴加于transwell膜上，静置培养；胰酶消化收获毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞两种细胞。两种同一成体来源种子细胞可共同培养构成毛囊类器官。本发明分离方法较现有方法相同时间提高了细胞产量，确保了原代细胞表型维持。毛囊类器官模拟体内相对位置对毛发新生研究具有重要价值，也为毛发新生药物筛选和评价开发了平台。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用。
背景技术
各种环境、疾病、心理、遗传等因素破坏了新生或者循环过程，带来的结果就是日益严重的脱发问题，严重影响当代人的生活质量。毛囊(Hair Follicle)作为最重要的皮肤附属物，由神经外胚层-中胚层相互作用形成的微小型器官，其发育与生长是具有周期性的动态循环过程。毛囊的形态发生与再生依赖于上皮与间充质的密切合作，也被称之为“上皮-间质互作”(epidermis-mesenchyme interaction，EMI)。他是一个复杂的细胞-细胞通讯网络，通过旁分泌途径涉及Wnt、Hedgehog、Notch和BMP等信号通路之间的强列相互作用。EMI成为了手囊形态发生和再生的一个先决条件，已经成为毛囊组织再生的理论基础。
因此，再生毛囊的策略就是在体外模拟体内的EMI，主要采取上皮和真皮细胞结合的方法，其中上皮细胞包括表皮干细胞、角质形成细胞等，真皮细胞包括毛乳头细胞、皮肤前体细胞。当然也存在使用诱导多能干细胞分化成毛囊。目前多选用新生来源或者胚胎来源细胞或者不同个体来源，如Hasan Erbil Abaci等人(2018)使用新生来源的角质形成细胞与成体毛乳头细胞结合体外构建成人工毛囊。潜在的来源细胞仍然十分匮乏，无法满足广泛的需求。需要一种同一成体来源的大量种子细胞的获取方法解决这一问题。
在毛囊发育与新生的过程中，毛乳头和毛囊隆突区是毛囊永久存在的结构，在毛囊中的位置相对清晰。毛囊外根鞘中上端的隆突区被视为最重要的毛囊干细胞巢，富含高度未分化的干细胞与祖细胞，毛囊隆突区干细胞(Bulge Region Stem Cells,BRSCs)起源于外胚层与神经管，具有上皮样干细胞(epidermis-like)的特征，一种高度未分化的自体干细胞来源，被称为“皮肤的骨髓”。这些干细胞在维持皮肤稳态和表皮损伤后的创面修复中起作用，更重要的是在毛囊周期循环具有重要作用。另一方面，皮肤的真皮细胞成分、高度特化的间充质样细胞(mesenchyme-like)--真皮毛乳头细胞(Dermal Papilla Cells,DPCs)，是毛囊形态发生和循环中不可或缺的重要细胞，是毛囊新生的关键细胞。使用来自于啮齿类动物的种子细胞做毛囊再生研究有必要寻找新的分离培养策略。
毛囊隆突区干细胞分离传统方法是基于流式细胞术(FACS)的细胞分选细胞，Trempus CS等(2003)和Nowak JA等(2009)采取结合表面蛋白CD34和α6-整合素的识别可以大量富集隆突区干细胞。受设备和技术背景限制整个过程操作复杂，单细胞悬液在分离过程极易受到损伤，细胞活力变差，克隆形成低。随之发展出外迁法分离毛囊隆突区干细胞的方法，若采用细胞外迁的方法无论是毛囊隆突区干细胞还是真皮毛乳头细胞的分离都需要我们在毛囊单位的获取过程中尽可能做到保持结构的完整特别是隆突区和毛乳头。传统的毛囊单位获取方法多为单纯机械解剖法。如Call M等人(2018)采取剪刀取下含有触须的唇垫。在解剖显微镜下，用镊子和剪刀去除皮下脂肪和结缔组织，以暴露触须，用细镊子将单个触须从垫上拔下。由于组织紧密、毛囊单位微小，使得操作难度增大也很难保证毛囊结构不被破坏。同样对于细胞分离培养来说也是借助于光学显微镜对分离得到的毛囊单位进行解剖，例如Amoh Y.等人(2005)将解剖的毛囊隆突区部位铺板在包被有鼠尾胶原的孔板以及段恩奎等(2010)将分离的毛囊贴壁培养分离干细胞却也都存在贴壁效果差分离时间长等问题。
另一方面对于毛乳头细胞采用是同样的外迁方法，最早是Jahoda C等人1981年通过显微解剖的方法成功在体外分离和培养大鼠毛乳头细胞，不可避免带来很大的机械损伤，存在技术难度过高的问题，且巨大的工作量很难带来更好的效率。尽管做了解剖方法的优化，例如Gledhill K等(2013)分离毛乳头的方案为切下毛囊的根端可见真皮鞘、被包裹的毛乳头以及部分发干，在显微镜下固定并对底部施加压力使得整个真皮鞘反转，毛乳头暴露，对暴露出来的毛乳头进行切割，然后收集培养。仍然是一个费事费力的大工程，也无法规避上述问题。与此同时为改良贴壁效率问题Topouzi H等(2017)在铺板时用针尖划痕在培养皿底面，在一定程度上提高了贴附效率缩短培养时间。
因此一种可以同时稳定、高效分离和扩增毛囊隆突区干细胞和真皮毛乳头细胞的方法迫切需要。能在短时间内使用极少量的组织得到足够量的两种不同细胞，构建组合细胞团的共同培养，以便使用同一成体来源的模拟的毛囊类器官探究“上皮-间质互作”，解决在皮肤和毛囊的生物工程构建中的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于解决人工毛囊种子来源的问题，提供一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用。本发明在分离时结合消化法和机械法，可以同时分离纯度高的毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞，组合培养得到模拟的毛囊类器官。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，包括如下步骤：
(1)啮齿动物面部触须垫部位消毒后将其解剖剥离、清洗后，用胶原酶Ⅴ消化。
其中，所述的啮齿动物包括小鼠；所述的解剖剥离优选采用眼科剪进行；所述的消化的条件优选为用5mg/mL胶原酶Ⅴ在37℃下消化30-60min。
(2)消化至组织松散膨大后终止消化，从真皮层一侧拔出保持完好的触须毛囊，切除毛乳头。
其中，所述的拔出毛囊优选采用镊子进行；所述的切除毛乳头优选在体视镜下采用外科手术刀进行。
(3)将步骤(2)所得毛囊清洗后移植到嵌入皿transwell膜上，使用分离培养基静置培养。
其中，所述的transwell膜上六孔板每孔优选移植8-12根毛囊；所述的培养的条件优选为37℃、5％ O2、5％ CO2、90％ N2分压条件。
(4)将步骤(2)所得毛乳头用胶原酶Ⅰ消化后清洗、分散、离心，使用分离培养基重悬得到悬液；悬液滴加于嵌入皿transwell膜上，使用分离培养基静置培养。
其中，所述的消化的条件优选为用2mg/mL胶原酶Ⅰ在37℃下消化2h；所述的transwell膜上六孔板每孔优选6-8个毛乳头；所述的培养的条件优选为37℃、5％ CO2条件。
(5)收取步骤(3)和(4)培养所得细胞，使用生长培养基进行传代培养，获得毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞。优选的，该步骤具体包括：步骤(3)中细胞密度达50％-70％第一次胰酶消化收获细胞，毛囊保留原位继续培养一周后，第二次胰酶消化收获细胞提高获得率；步骤(4)中细胞密度达80％胰酶消化收获细胞。使用生长培养基进行传代培养，获得毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞。其中，所述的胰酶优选为0.25％胰酶。所述的传代培养的条件优选为37℃、5％ CO2条件。
所述的方法中，步骤(1)、(3)、(4)中所述的清洗使用的洗涤液优选为：商业购买的PBS缓冲液，其中添加200units/mL青霉素，200mg/mL链霉素。
步骤(2)中所述的拔出毛囊的方法优选包括如下步骤：持一把镊子夹住毛干近端稳定毛囊，逆毛干生长方向推动以使真皮一侧毛囊暴露明显，为避免毛囊损伤用另一把镊子从真皮层一侧拔出单独的毛囊单位，将过长不必要的毛干剪短。
步骤(3)、(4)中所述的分离培养基的成分优选为：DMEM低糖培养基，20％ FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF。
步骤(3)中，隆突区干细胞分离培养过程：初始阶段培养基添加在膜的下方且液面与膜恰好接触约1mL体积，37℃，5％ O2、5％ CO2、90％ N2分压条件下使用分离培养基静置培养，随着培养天数的增加，细胞的不断迁出，下方液体不断增加，通常一周左右增加到1.5mL，上方液体0.5mL，细胞密度50％左右则下方2mL上方1mL，此后维持该加液量，该培养过程中换液的频率2-3天一次。
步骤(4)中，毛乳头细胞分离培养过程：在transwell膜上，受重力影响上方多余液体自然透过，较大的毛乳头截留在膜上方，3天后毛乳头完全贴壁，后每两天换液一次。
步骤(5)中所述的生长培养基的成分优选为：DMEM低糖培养基，10％ FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF，10ng/mL bFGF。
上述人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法在制备毛囊类器官中的应用。
一种制备毛囊类器官的方法，包括如下步骤：使用上述方法获得毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞；毛乳头细胞通过体外三维培养形成球体细胞团后，更换含毛囊隆突区干细胞的培养基悬液，继续培养，获得由毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞构成的毛囊类器官。所述的培养的条件优选为37℃、5％ CO2条件。
进一步地，所述的制备毛囊类器官的方法，包括如下步骤：使用上述方法获得毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞；将毛乳头细胞用生长培养基制成3000-5000个细胞/10μL的悬液，通过体外三维培养形成球体细胞团后，将培养液更换为用生长培养基制成含相同浓度毛囊隆突区干细胞/10μL的悬液，继续培养，获得由毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞构成的毛囊类器官。
所述的体外三维培养的方法包括：悬滴法，超低贴附培养，凝胶微型模具培养等有或者没有生物材料的组合培养。
通过本发明方法获得的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞、毛乳头细胞或毛囊类器官在毛囊组织工程再生、体外毛发新生、及毛发新生药物筛选中的应用。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)本发明利用酶消化法和机械法相结合的方法在获取完整毛囊的基础上，实现了同时分离毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞两种细胞，提高了利用效率，得到加倍的细胞产出。
(2)其中毛乳头细胞的分离方法较现有方法大大提高了毛乳头的贴壁率且操作省时省力，同时达到了相同时间更高细胞产量的显著效果，确保了原代细胞表型维持，传代状况稳定良好。
(3)本发明分离的小鼠触须毛囊隆突区细胞和毛乳头细胞对毛发新生研究具有重要价值，构建的毛囊类器官为研究毛囊生长周期中两种不同类型的细胞之间的相互作用提供了良好的模型。毛囊类器官模拟体内相对位置对毛发新生研究具有重要价值，也为毛发新生药物筛选和评价开发了平台。
附图说明
图1为不同方法分离毛乳头效率比较。
图2为毛囊隆突区干细胞免疫荧光鉴定，蛋白水平上对毛囊隆突区干细胞进行鉴定，图A-I中的靶蛋白依次为Nestin、sca-1、CD105、CD117、CD73、CD44、CD54、CD90、CD45，全部均为目标靶蛋白和DAPI细胞核染色合并图。
图3为毛囊隆突区干细胞流式细胞术鉴定，图中A-L依次为标志物CD104a、CD105、CD90、CD44、CD73、CD51、CD34、CD54、CD31、CD62、CD26、CD45，全部均为标志物与阴性对照的组合图，其中左侧浅色为阴性对照，右侧深色为样本分析，上方数值为相对表达量。
图4为毛囊毛乳头细胞分离过程中不同时间阶段的形态学观察；图A为毛囊毛乳头细胞培养1天游离的毛乳头逐渐贴壁(100×)，图B为毛囊毛乳头细胞培养4天时，细胞迁出明显(100×)，图C为毛囊毛乳头细胞培养6天时，细胞迁出细胞快速增殖(100×)，图D为毛囊毛乳头细胞培养10天时，细胞融合率达到80％以上(100×)。
图5为毛囊毛乳头细胞生长和增殖特性；图A为MTT法测定不同代数的细胞活性，图B为EdU法测定不同代数的细胞增殖。
图6为毛囊毛乳头细胞免疫荧光鉴定；图A-D依次为毛囊毛乳头细胞的标志蛋白ALP、CD133、CD56、α-SMA (100×)，从左到右依次为目标靶蛋白、DAPI细胞核染色、两者合并。
图7为不同时间内两种种子细胞共同培养的位置分布观察。图A-D依次为2H、12H、24H、36H；图A’-D’表达GFP的隆突区干细胞；图A”-D”箭头区域为不表达GFP的毛乳头细胞。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但本发明内容不会因此而受到实施例的任何限制。
实施例1.小鼠触须毛囊干细胞的分离
1、小鼠毛囊单位的获取：小鼠面部两侧触须垫部位使用浓度75％的酒精仔细消毒，采用眼科剪解剖剥离，组织洗涤液反复清洗干净，用5mg/mL胶原酶Ⅴ在37℃、220rpm下消化45min；含10％ FBS的DMEM培养基终止消化，组织松散膨大，持一把镊子夹住毛干近端稳定毛囊，逆毛干生长方向推动以使真皮一侧毛囊暴露明显，避免毛囊损伤另一把镊子从真皮层一侧拔出单独的毛囊单位，剪短过长不必要的毛干；在体视镜下，外科手术刀切除毛乳头。
2、毛囊干细胞的分离：用洗涤液不断清洗已去除毛乳头部分所得的毛囊，将毛囊移植到插入皿transwell膜上，六孔板每孔8-12根，初始阶段培养基添加在膜的下方且液面与膜恰好接触约1mL体积，37℃，5％ O2、5％ CO2、90％ N2分压条件下使用分离培养基(DMEM低糖培养基，20％ FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF)静置培养，随着培养天数的增加，细胞在膜表面的不断迁出，下方液体不断增加，通常一周左右增加到1.5mL，上方液体0.5mL，细胞密度50％左右则下方2mL上方1mL维持到细胞密度达80％，该培养过程中换液的频率2-3天一次。Transwell膜上的细胞贴附紧密不易消化，采用两步消化收获细胞，即在细胞密度达60％左右第一次胰酶(0.25％)消化收集细胞后，毛囊组织继续培养一周左右第二次胰酶(0.25％)消化收集仍附着在膜上的细胞，使收益最大同时规避胰酶对细胞的伤害。
实施例2.小鼠触须毛乳头细胞的同步分离
1、毛乳头的获取：手术切除的毛乳头使用2mg/mL胶原酶Ⅰ在37℃下消化2h，显微镜下观察到有游离的毛乳头效果最佳，消化后，洗涤液多次洗涤、移液枪吸头反复吹打分散、离心，此间为减小损耗避免毛乳头黏附在吸头内吹打前反复吸取洗涤液润湿吸头内壁，使用分离培养基(DMEM低糖培养基，20％ FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF)重悬得到悬液。
2、毛乳头细胞的分离：将微量悬液滴加于插入皿transwell膜上，六孔板每孔6-8个毛乳头，下方补充分离培养基0.5-1mL，37℃、5％ CO2条件下静置培养，受重力影响上方多余液体自然透过transwell膜，较大的毛乳头截留在膜上方，3天后毛乳头完全贴壁，后每两天换液一次，细胞密度分别达80％左右，0.25％胰酶消化收获细胞。
3、对照例：对照1：在包被胶原蛋白的孔板上，用针头将毛乳头划痕嵌入孔板底部，每周换液两次。对照2：在包被胶原蛋白的孔板上，将毛乳头细胞直接铺板，每周换液两次。对照3：在包被胶原蛋白的孔板上，将毛乳头细胞直接铺板，且玻片压盖住所有毛乳头，每周换液两次。
4、本发明与对照例的效果比较见图1和下表1：
表1：采用不同方法在相同时间收获细胞数量的比较
可以看出在相同毛乳头个数其他条件相同下的相同时间10天内，本发明与对照例1相比细胞数量高出超50％；与对照例2相比约为其2.5倍；远超对照例3收获细胞量，本发明优于现有方法。
实施例3.毛囊隆突区干细胞的鉴定
将实施例1获得的毛囊干细胞使用生长培养基(DMEM低糖培养基，10％ FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF，10ng/mL bFGF)传代培养后，对细胞相关表型进行鉴定。
蛋白表型的鉴定：利用免疫荧光方法对毛囊隆突区干细胞进行鉴定，结果见图2，Nestin、sca-1、CD105、CD117、CD73、CD44、CD54、CD90结果均为阳性，CD45结果为阴性；同时利用流式细胞术方法对毛囊隆突区干细胞表面蛋白进行了鉴定，结果见图3，CD104a、CD105、CD90表达量非常高，CD44、CD73、CD51、CD34、CD54、CD31均为阳性，CD62为弱阳性，CD26、CD45为阴性。表明本发明成功获得了毛囊隆突区干细胞。
实施例4.毛乳头细胞的鉴定
将实施例2获得的毛乳头细胞使用生长培养基(DMEM低糖培养基，10％ FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF，10ng/mL bFGF)传代培养后，对细胞相关表型进行鉴定。
1、细胞形态学观察：本发明所得毛乳头为椭圆或者水滴状，呈游离状态，其在分离过程中不同时间阶段的形态学观察见图4，在培养24小时之后便已经开始牢固贴附在transwell膜上开始细胞呈迁出状态，3-4天便可见明显的细胞迁出，并且在接下来的一周内细胞快速增殖，细胞为三角或是多边形逐渐形成簇状排布的细胞集落，整个过程约10天细胞生长密度到80％，且此时细胞生长速度变缓，收获并按1：2比例传代，传代细胞贴壁率达90％，细胞开始呈成纤维细胞状梭形狭长，3天细胞融合。
2、生长和增殖特性：在体外培养过程中，由于真实体内环境的差异，毛乳头细胞逐渐会发生一些表型的变化，其中包括细胞活性和增殖特性的改变，采用MTT法测定不同代数的细胞活性(图5A)，同时用EdU法测定不同代数的细胞增殖的差异(图5B)，本发明所得的毛乳头细胞在传至P3代时有最好的细胞活性和最活跃的增殖，因此在后续的应用中P3代的细胞是不错的选择。
3、蛋白表型的鉴定：碱性磷酸酶(ALP)是毛乳头细胞的标志型表达物，通过特异性化学显色证明本发明分离毛乳头细胞ALP呈阳性，同时利用免疫荧光方法对毛乳头细胞进行鉴定，ALP、α-SAM、CD133、CD56，上述结果均为阳性(图6)，其中α-SAM为弱阳性该蛋白体内天然毛乳头细胞并不表达。进一步验证了本发明分离的细胞为毛乳头细胞。
实施例5.毛乳头细胞和毛囊隆突区干细胞的共同培养
1、获得的毛乳头细胞通过悬滴法3000个细胞/10μL培养形成球体细胞团，使用生长培养基培养在37℃、5％ CO2下培养。
2、培养形成完整的球体约24H-48H，将培养液更换为含相同浓度(3000个细胞/10μL)带有GFP标记的毛囊隆突区干细胞悬液(用生长培养基重悬细胞获得的悬液)，37℃、5％CO2培养48H后构成两者共同培养的细胞团。
3、荧光显微镜观察记录，共培养的细胞团呈(半)包裹状态或上下位置关系(图7)。
Claims (10)
1.一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)啮齿动物面部触须垫部位消毒后将其解剖剥离、清洗后，用胶原酶Ⅴ消化；
(2)消化至组织松散膨大，从真皮层一侧拔出保持完好的触须毛囊，切除毛乳头；
(3)将步骤(2)所得毛囊清洗后移植到嵌入皿transwell膜上，使用分离培养基静置培养；
(4)将步骤(2)所得毛乳头用胶原酶Ⅰ消化后清洗、分散、离心，使用分离培养基重悬得到悬液；悬液滴加于嵌入皿transwell膜上，使用分离培养基静置培养；
(5)收取步骤(3)和(4)培养所得细胞，使用生长培养基进行传代培养，获得毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞。
2.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的拔出毛囊的方法包括如下步骤：持一把镊子夹住毛干近端稳定毛囊，逆毛干生长方向推动以使真皮一侧毛囊暴露明显，用另一把镊子从真皮层一侧拔出单独的毛囊单位。
3.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
步骤(3)中所使用的嵌入皿为六孔板时，每孔移植8-12根毛囊；
步骤(4)中所使用的嵌入皿为六孔板时，每孔移植6-8个毛乳头。
4.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
步骤(3)中，所述的培养的条件为：37℃，5％O2、5％CO2、90％N2分压条件；
步骤(4)中，所述的培养的条件为：37℃，5％CO2条件。
5.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：步骤(1)、(3)、(4)中，所述的清洗使用的洗涤液为添加200units/mL青霉素、200mg/mL链霉素的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
步骤(3)、(4)中，所述的分离培养基的成分为：DMEM低糖培养基，20％FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF；
步骤(5)中，所述的生长培养基的成分为：DMEM低糖培养基，10％FBS，1％青霉素/链霉素，20ng/mL mEGF，10ng/mL bFGF。
7.权利要求1-6任一项所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法在制备毛囊类器官中的应用。
8.一种制备毛囊类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：使用权利要求1-6任一项所述的方法获得毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞；毛乳头细胞通过体外三维培养形成球体细胞团后，更换含毛囊隆突区干细胞的培养基悬液，继续培养，获得由毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞构成的毛囊类器官。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：使用权利要求1-6任一项所述的方法获得毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞；将毛乳头细胞用生长培养基制成3000-5000个细胞/10μL的悬液，通过体外三维培养形成球体细胞团后，将培养液更换为用生长培养基制成含3000-5000个毛囊隆突区干细胞/10μL的悬液，继续培养，获得由毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞构成的毛囊类器官。
10.通过权利要求1-6任一项所述的方法获得的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞、毛乳头细胞或通过权利要求8或9所述的方法获得的毛囊类器官在毛囊组织工程再生、体外毛发新生、毛发新生药物筛选中的应用。
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