CN117551600B - 一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法 - Google Patents
一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117551600B CN117551600B CN202410013331.2A CN202410013331A CN117551600B CN 117551600 B CN117551600 B CN 117551600B CN 202410013331 A CN202410013331 A CN 202410013331A CN 117551600 B CN117551600 B CN 117551600B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- medium
- stem cells
- culture
- induction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 134
- 230000006698 induction Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 40
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims abstract description 10
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 claims description 13
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims description 12
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 claims description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 9
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 9
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 7
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101710186643 Insulin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 abstract 1
- 210000003317 double-positive, alpha-beta immature T lymphocyte Anatomy 0.000 description 60
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 13
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 13
- 239000000306 component Substances 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 4
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 2
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000003797 telogen phase Effects 0.000 description 2
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000002951 depilatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006628 dp medium Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000031774 hair cycle Effects 0.000 description 1
- 230000009583 hair follicle growth Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000003616 phosphatase activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法。使用无血清诱导培养基对间充质干细胞进行诱导培养，获得真皮乳头细胞；所述无血清诱导培养基是在DMEM/F‑12基础培养基中添加活性成分形成，所述活性成分包括L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、血清替代物、胰岛素‑转铁蛋白‑硒补充剂、肝细胞生长因子和氢化可的松。本技术方案的诱导方法以及培养基，可解决从干细胞诱导分化形成真皮乳头细胞的效率有限的技术问题，采用无血清诱导培养基及诱导方法，进一步提升细胞制剂或者疗法的安全性；采用诱导多能干细胞作为诱导起始细胞的来源，不会带来医学伦理学问题，具有理想的应用推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法。
背景技术
真皮乳头(dermal papillary，DP)细胞是位于毛囊底部的一种特殊的间充质细胞群，已被证明可以调节毛囊的形成和生长周期。DP细胞也已被证明能和表皮细胞一起完成全新毛囊的产生，此外，在真皮和表皮之间单独植入DP细胞也可以在植入部位诱导毛囊的新生。因此，DP细胞被认为是治疗脱发疾病的一种理想的细胞疗法。
然而，DP细胞在人体中的数量有限，在体外扩增能力有限，且提取DP细胞时会彻底损伤原有毛囊，同时在培养的时候会在极大降低DP细胞的诱导毛囊的能力，导致难以获取足够数量且功能良好的DP细胞，这严重阻碍了DP细胞的临床应用。
为获得足量的功能性的DP细胞，科学家们展开了由可增殖的干细胞向DP细胞的分化的探索。韩国科学家Bo-Young Yoo及其同事首先将脐带间充质干细胞(UCMSC)分化为DP样的细胞球，并在裸鼠上证明了其诱导毛发的能力，然而UCMSC的来源及增殖能力仍然非常有限。美国科学家Alexey V. Terskikh及其同事将人胚胎干细胞(hESC)诱导经神经嵴的中间过程最终诱导为DP细胞，hESC-DP细胞中约有70%的细胞表达DP细胞标志蛋白Versican或α-SMA，且具有毛发诱导能力。hESC具有体外培养无限增殖、自我更新及多向分化的特性，但是hESC所引起的一系列医学伦理学问题，在一定程度上阻碍了hESC技术的发展及应用。日本科学家Manabu Ohyama及其同事将人诱导多能干细胞(hiPSC)经由LNGFR和THY-1双阳性间充质细胞，分化为DP细胞，但LNGFR和THY-1双阳性间充质细胞获得率仅为10％，且需经流式分选获得纯度细胞，限制了后续细胞大量获得。此外上述技术使用成分不明确的胎牛血清以支持细胞生长，为其临床应用带来挑战。
综上，亟需开发一种新型的将干细胞诱导分化为DP细胞的方法，通过此法可以获得较高的DP细胞诱导效率，且可以避免成分不明确的培养介质成分的使用，进一步提升细胞制剂或者疗法的安全性。
发明内容
本发明意在提供一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，以解决从干细胞诱导分化形成真皮乳头细胞的效率有限的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，使用无血清诱导培养基对间充质干细胞进行诱导培养，获得真皮乳头细胞；所述无血清诱导培养基是在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM/F-12基础培养基中添加活性成分形成，所述活性成分包括KnockOut血清替代物、胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、肝细胞生长因子和氢化可的松。
本技术方案还提供了一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基，其包括基础成分和活性成分；所述基础成分为DMEM/F-12基础培养，所述活性成分包括0.542mg/mL的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、体积百分比为10%-20%的KnockOut血清替代物、体积百分比0.5%-5%的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、10ng/mL-100ng/mL的肝细胞生长因子和5ng/mL-50ng/mL的氢化可的松。
本技术方案还提供了一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法获得的真皮乳头细胞在制备促进毛发生长的产品中的应用。
进一步，所述间充质干细胞由诱导多能干细胞经诱导培养获得；诱导多能干细胞经过四个阶段的悬浮培养之后，形成脑类器官；脑类器官再经贴壁培养获得间充质干细胞；其中，四个阶段的悬浮培养过程中，第一阶段的培养基中加入Dorsomorphin、A83-01、聚乙烯醇；第二阶段的培养基中加入SB-431542、CHIR-99021、聚乙烯醇；第三阶段的培养基中加入SB-431542、CHIR-99021、Martigel、聚乙烯醇；第四阶段的培养基中加入B27、胰岛素；贴壁培养的培养基中加入B27和b-FGF。
进一步，无血清诱导培养基中含有体积百分比为10%-20%的KnockOut血清替代物、体积百分比0.5%-5%的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、10ng/mL-100ng/mL的肝细胞生长因子和5ng/mL-50ng/mL的氢化可的松。
进一步，诱导培养的时间为15-21天。
进一步，间充质干细胞的融合度达到60%-85%时，开始使用无血清诱导培养基对间充质干细胞进行诱导培养。
进一步，无血清诱导培养基中含有0.542mg/mL的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、体积百分比为10%的KnockOut血清替代物、10μL/mL的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、20ng/mL的肝细胞生长因子和10ng/mL的氢化可的松。
进一步，将真皮乳头细胞悬液接种于含有维持培养基的低吸附培养设备中，经培养获得真皮乳头细胞；所述维持培养基是在DMEM/F-12基础培养基中添加KnockOut血清替代物和胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂形成。
进一步，将真皮乳头细胞悬液接种于含有维持培养基的低吸附培养设备中，经6-24h培养获得真皮乳头细胞。
综上所述，本技术方案的原理在于：
本发明基于诱导形成间充质干细胞(iMSC)的方案，提供一种促进iMSC分化为DP细胞的成分明确的无血清诱导培养基及诱导方法，诱导过程中无需流式分选等操作，诱导获得的绝大部分细胞高表达DP细胞标志蛋白，且高表达其中功能相关蛋白，同时具有调节毛囊的形成和生长周期的能力。本技术方案的诱导方法以及培养基，可以解决从干细胞诱导分化形成真皮乳头细胞的效率有限的技术问题。除此之外，本技术方案采用了无血清诱导培养基及相应诱导方法，进一步提升细胞制剂或者疗法的安全性。本技术方案还采用了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）作为诱导起始细胞（间充质干细胞，iMSC）的来源，由于其最初来源的iPSC，其具有体外培养无限增殖、自我更新及多向分化的特性，同时iPSC不会带来医学伦理学问题。
本方案的有益效果在于：
（1）本发明中iDPC（经诱导获得的真皮乳头细胞）诱导起始细胞为iPSC来源的诱导间充质干细胞（iMSC），由于其最初来源的iPSC，其具有体外培养无限增殖、自我更新及多向分化的特性，同时iPSC不会带来医学伦理学问题，是体外诱导DP细胞理想的来源。
（2）本发明中iDPC的诱导是将iPSC诱导经神经嵴-iMSC的中间过程最终诱导为DP细胞，高度模拟了人头皮中DP细胞经由外胚层发育途径。最终iDPC细胞获得率高于95％，另外本发明中涉及iPSC来源iMSC的获得率亦在95％以上，中间体细胞及最终获得细胞均显著高于以往报道及专利。相较于现有的神经来源的iDPC的诱导方案，本发明使用iPSC细胞作为起始细胞，避免了使用ESC带来的伦理问题，且本发明iDPC细胞获得率高于95％高于现有方案的70%。且本发明在C57BL/6鼠上验证了显著促毛发生长能力，显示出其临床应用的巨大潜能。另外本发明亦验证了脐带间充质干细胞作为起始细胞，诱导为DP细胞效率，其获得率低于iMSC作为起始细胞，证明了iMSC作为该方案起始细胞的优势。
（3）本发明中的诱导方案不涉及与饲养层细胞或其他细胞的共培养，亦不使用成分不明的血清，整体诱导方案简单，不涉及流式分选等操作，为其的临床应用提供了安全保证及极大的便利。
附图说明
图1为实施例1的真皮乳头细胞诱导培养过程示意图以及不同时期的典型显微图片（A为诱导培养流程示意图；B为不同培养阶段得细胞显微图像）。
图2为实施例2的真皮乳头细胞的碱性磷酸酶活性检测结果（A为诱导多能干细胞（iPSC）；B为诱导间充质干细胞（iMSC）；C为由诱导间充质干细胞诱导获得的真皮乳头细胞（iMSC-iDPC）；D为脐带来源间充质干细胞(UCMSC)；E为由脐带来源间充质干细胞诱导获得的真皮乳头细胞（UCMSC-iDPC））。
图3为实施例3的真皮乳头细胞的细胞免疫荧光鉴定（α-SMA和Versican）。
图4为实施例4的真皮乳头细胞对表皮细胞新生毛发的作用效果的研究结果。
图5为实施例5的真皮乳头细胞球促毛发生长实验结果（A为第13天时实验动物照片，展示各鼠背部相同区域毛发生长情况；B为第13天时实验动物照片，展示各鼠毛发长度差异；C为第13天时小鼠背部脱毛区域中相同区域毛发覆盖面积占比及再生毛发长度差异的统计学分析）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：真皮乳头(DP)细胞诱导培养过程
诱导开始之前，将使用的诱导间充质干细胞（iMSC）或脐带来源间充质干细胞(UCMSC)培养并维持在的37℃和5%CO2培养箱中，采用现有技术的常规手段每3天更换适量间充质干细胞培养基培养（Nuwacell®ncMission hMSC Medium）扩增细胞，直至细胞汇合度达到60%-85%之间，然后开始真皮乳头(DP)细胞的诱导培养，过程图详见图1，具体过程描述如下（为了描述方便，将iMSC和UCMSC统一称为MSC）。
其中，诱导间充质干细胞（iMSC）的制备方法在专利CN113025569B已详细阐明简而言之：将iPSC采用脑类器官1阶段培养基进行悬浮培养；在不同时期依次将培养基更换为不同阶段的脑类器官培养基；将细胞转入微型类器官生物反应器中，培养3-4天后接种到明胶包被的培养容器中，采用MSC第一阶段培养基进行贴壁培养得到诱导间充质干细胞；具体过程可参见该专利的实施例1，且本方案的iMSC由起始细胞iPSC诱导获得。上述过程更详细的描述如下：
S1：采用脑类器官1阶段培养基对诱导多能干细胞进行悬浮培养；
S2：依次使用脑类器官2阶段培养基、脑类器官3阶段培养基和脑类器官4阶段培养基对诱导多能干细胞进行悬浮培养；
S3：将经S2培养的细胞转入微型类器官生物反应器中，培后接种到明胶包被的培养容器中，采用N-MSCs第一阶段培养基进行贴壁培养得到间充质干细胞；
所述脑类器官1阶段培养基包括：GMEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、KnockOut血清替代物 12-18％、Dorsomorphin 0.8-1.5μM、A83-01 0.8-1.2μM和聚乙烯醇0.5-1.5％；
所述脑类器官2阶段培养基包括：GMEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、N2 1％-2％、SB-431542 0.8-1.2μM、CHIR-99021 0.8-1.2μM、聚乙烯醇0.8-1.5％；
所述脑类器官3阶段培养基包括：MEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、N2 1％-2％、SB-431542 0 .8-1 .2μM、CHIR99021 0.8-1.2μM、Martigel 0.8-1 .5％、聚乙烯醇0.8-1.5％；
所述脑类器官4阶段培养基包括：GMEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、N2 1％-2％、B27 2％-3％、胰岛素2μg/mL；
所述N-MSCs第一阶段培养基包括：
GMEM基础培养基、NEAA 1-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇100nM、N2 1％-2％、B27 2％-3％、b-FGF 5-6ng/ml。
另外需要说明的是，iMSC由诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）诱导培养获得。例如，iPSC可以采用STEMCELL公司货号05924的ErythroidProgenitor Reprogramming Kit（红系祖细胞重编程试剂盒）的试剂诱导的多能干细胞。使用该试剂盒按照说明书操作要求，对采用现有技术常规手段获取的红系祖细胞进行诱导，获得稳定的红系祖细胞来源的人源的诱导多能干细胞。上述iPSC的获取方法也记载在了申请人的在先专利CN113025569B中，是一种现有技术的常规方式。
第0天：显微观察确认MSC生长状况及细胞汇合度，从细胞中除去培养基，并用0.1mL/1cm2DPBS清洗以除去死细胞及剩余培养基。加入0.2mL/1cm2的促进MSC分化为DP细胞（即DPC）的成分明确的无血清诱导培养基，铺平培养皿，放入培养箱，培养24h。
在培养初始阶段，iMSC与UCMSC状态类似，多为梭状或无规则星状，细胞核边界清晰，细胞之间呈无规则散乱分布，UCMSC贴壁较好，而iMSC较差。
其中，无血清诱导培养基的成分组成为：在含有0.542mg/mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM/F-12基础培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient MixtureF-12，（Gibco™_）中加入：体积百分比为10%-20%的KnockOut血清替代物（KOSR）（Gibco™），体积百分比0.5%-5%的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂（Gibco™），含量为10ng/mL-100ng/mL的肝细胞生长因子（HGF）(近岸蛋白)，5ng/mL-50ng/mL的氢化可的松（麦克林）。
在后续的实验研究中，使用到的无血清诱导培养基具体为：在含有 0.542 mg/mLL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM/F-12基础培养基中加入：体积百分比为10 %的KnockOut血清替代物，体积百分比1 %胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂，含量为 20 ng/mL的肝细胞生长因子， 10 ng/mL的氢化可的松。
第1天-第21天：继续在促进MSC分化为DP细胞的成分明确的无血清诱导培养基中培养细胞至21天，每天显微观察确认DP细胞生长状况及细胞汇合度，每天更换培养基，培养基用量为0.2mL/1cm2。
在培养至第7天时，iMSC-iDPC细胞（由诱导间充质干细胞诱导获得的真皮乳头细胞）以及UCMSC-iDPC细胞（由脐带来源间充质干细胞诱导获得的真皮乳头细胞）形态转变为多边形片状，细胞之间紧密相连相互聚集成单层结构，iMSC-iDPC细胞核较为明显，而UCMSC-iDPC细胞核不明显。在培养至第21天时，形态与第7天时类似，但细胞之间的聚集更为明显，iMSC-iDPC主要为单层聚集，而UCMSC-iDPC为多层聚集，中心区域有聚集成球趋势。
第21天：将细胞培养于无血清诱导培养基至21天时，显微观察确认细胞状态及细胞密度，从细胞中除去培养基，并用0.1mL/1cm2DPBS清洗以除去死细胞两次。在37℃下用0.1 mL/1cm2Tryple消化液处理细胞3min，然后用DP细胞维持培养基终止消化，950rpm离心5min收集细胞并去除上清以除去消化液，用DP细胞维持培养基（DMEM/F-12基础培养基+10%KOSR+1 %胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂）重悬细胞。将细胞收集在离心管中，用吸管轻轻吹打细胞悬液至单细胞状态（取部分镜下观察）。细胞计数，用DP细胞维持培养基稀释细胞至2×105个细胞/1mL，将细胞悬液接种至U底的超低吸附96孔板（Corning）中，接种量50μL/孔，放入培养箱，培养24h。由UCMSC诱导获得的DP细胞称为UCMSC-iDPC，由iMSC诱导获得的DP细胞称为iMSC-iDPC。通常来说，采用本技术方案的诱导培养方法，诱导培养的时间为15-21天，即可将大部分的iMSC转化为DP细胞。
第22天：显微观察确认96孔板中DP细胞聚集情况及DP球状态及DP球大小，每孔补液50μL。DP细胞具有强大的自聚集能力，诱导获得的细胞在6-24h内会自聚集为球型（形成DPLTs）。由UCMSC-iDPC形成的细胞球称为UCMSC-iDPC球，由iMSC-iDPC形成的细胞球称为iMSC-iDPC球。
在培养至第22天时，iMSC-iDPC和UCMSC-iDPC聚集成球，其中UCMSC-iDPC球体积更大，直径在400μm左右，而iMSC-iDPC球体积较小，直径约320μm。
统计采用iMSC为诱导起始细胞或者UCMSC为诱导起始细胞的DP细胞获得率，分别为95%和35%左右（以α-SMA表达比例计）。
实施例2：真皮乳头细胞的碱性磷酸酶活性检测
DP细胞的碱性磷酸酶活性与其诱导毛囊的能力正相关，所以体外检测DP细胞的碱性磷酸酶活性能在一定程度上检验DP细胞的功能。依据碱性磷酸酶检测试剂盒的操作说明，对iPSC、iMSC、iMSC来源的DP细胞(iMSC -iDPC)，UCMSC、UCSMC来源的DP细胞(UCMSC-iDPC)进行碱性磷酸酶活性检测。结果如图2所示，iPSC，iMSC-iDPC均具有极强的碱性磷酸酶活性，其中所有的iPSC均能检测到碱性磷酸酶活性，而iMSC-iDPC中有97.4%的细胞能检测到碱性磷酸酶活性（碱性磷酸酶活性细胞比例=4倍镜视野下碱性磷酸酶活性细胞数/4倍镜视野下总细胞数）。而iMSC，UCMSC，UCMSC-iDPC的碱性磷酸酶活性较差，活性细胞比例分别为9.89%，1.2%和3.4%。证明该培养基能很好地促进iMSC分化为有功能的DP细胞，而对于UCMSC的促分化效果较差。
实施例3：真皮乳头细胞的免疫荧光检测
体外培养的DP细胞表达α-SMA，此外，Versican也是DP细胞的标志之一，同时，Versican表达的强弱也会反映DP细胞的功能。对诱导的DP细胞进行免疫荧光检测其α-SMA和Versican的表达情况，其结果如图3所示，Versican在所有的iDP细胞中表达，且较诱导前表达量提升。而α-SMA在大部分的iMSC-iDPC中表达，阳性细胞比例约为95%（α-SMA阳性细胞比例=α-SMA阳性且被DAPI标记的细胞数/被DAPI标记的细胞核数；其中，DAPI用于标记细胞核，是一种能够发出蓝色荧光的染料；α-SMA阳性通过偶联在α-SMA抗体上的绿色荧光物质指示，为本领域常规的免疫荧光方法），但UCMSC-iDPC中仅少数细胞表达α-SMA（约占35%）。其结果仍然说明该培养基促进iMSC分化为的DP细胞的效果较促UCMSC分化效果好。
实施例4：iMSC-iDPC细胞对表皮细胞新生毛发的作用效果的研究
硅胶腔室实验是检测iDPC细胞诱导毛发生成能力的经典实验。如图4所示，将2.5×106个表皮细胞与2.5×106个iMSC-iDPC细胞混合在DMEM/F12培养基中备用。麻醉胸腺缺陷裸鼠后，在小鼠背部剪下一块全厚度的皮肤。用镊子拉动皮肤以将硅胶腔室插入皮肤下方，缝合以固定硅胶腔室，将细胞打入腔室底部，而对照组只打DMEM培养基。5天后移除腔室。19天后打细胞组创口区域出现白色毛发，而对照组创口周围几乎光裸。证明iMSC-iDPC具有诱导毛发新生的功能。
实施例5：iMSC-iDPC球促毛发生长实验
有报道证明将原代提取的DP细胞球补充到C57BL/6鼠脱毛区域可缩短已有毛囊的休止期，诱导C57BL/6鼠毛更快生长。小鼠麻醉后，用剃毛机将C57BL/6鼠背部毛发剃短，将脱毛部位清洗干净，然后擦干水分之后再使用爽身粉去除残留水分以及油脂。取一匙脱毛用的蜜蜡，均匀地涂抹在脱毛部位，将布条按照体毛的生长方向贴好，等待3min，然后逆毛囊生长方向撕下来以脱毛统一毛发周期。然后在实验组皮下注射含有1×106个iMSC-iDPC的细胞球的DMEM培养基，实验组皮下注射DMEM培养基，观察后续毛发生长情况。其结果如图5所示，A、B为第13天时实验动物照片，展示各鼠背部相同区域毛发生长情况及毛发长度差异；C为第13天时小鼠背部脱毛区域中相同区域毛发覆盖面积占比（图片采集使用体式显微镜，图片分析使用imageJ，毛发覆盖面积占比=图片中毛发覆盖区域面积/图片总面积）及再生毛发长度差异的统计学分析。
其结果显示注射细胞组毛发覆盖面积占比约为84.97%±6.21%（mean±SD，n=4）而对照组毛发覆盖面积占比约为48.20%±4.67%；注射细胞组毛发长度为1.73mm±0.75mm（mean±SD，n=20），而对照组毛发长度为3.17mm±0.92mm，注射细胞组毛发覆盖面积较对照组更多，毛发长度较对照组更长，说明注射细胞组中小鼠的毛发生长情况更佳。该结果证明iMSC-iDPC细胞具有缩短毛囊的休止期，诱导毛发生长的能力。
对比例1：
该对比例可以参见文献：Ksenia Gnedeva，et al .Derivation of Hair-Inducing Cell from Human Pluripotent Stem Cells，Plos one，2015；以及专利申请文件：CN106661547B-调控毛发生长的方法和组合物。
在该对比例方案中，自hESC经神经嵴中间体获得人DP样细胞。在该对比例中，诱导hESC分化成hESC衍生的神经嵴细胞(hESC-NC)的过程参见文献：Curchoe CL ,et al .Early acquisition of neural crest competence during hESCs neuralization .PLoSOne，2010；Cimadamore F ,et al .Human ESC-Derived Neural Crest Model Reveals aKey Role for SOX2 in Sensory Neurogenesis，Cell Stem Cell，2011。根据这些文献中的描述，神经嵴细胞(hESC-NC，其中含有一定的神经来源的间充质干细胞)的诱导获得过程不同于本技术方案，而本技术方案获得神经来源的间充质干细胞的方法是按照申请人在先专利CN113025569B进行。本技术方案是在CN113025569B获得的神经源性的间充质干细胞的基础上进行的诱导，进而形成DP细胞。
在本对比例中，利用神经嵴培养获得DP细胞，神经嵴是多效的一群细胞，它们产生多种间充质组织的前体，获得DP细胞的具体过程如下：将第一次传代的神经嵴细胞用下述组成的DP培养基培养3天：DMEM/F-12 Glutamax、10％FBS、1mM L-谷氨酰胺、1×抗生素/抗真菌剂。之后，将它们用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液解离成单细胞悬浮液并以密度100×103个细胞/mm2涂布到未包被的培养皿上。次日通过更换培养基去除24小时后未能附着的漂浮细胞。让附着的细胞在未包被的培养皿上生长，隔天更换培养基；每4-5天对培养物传代。由此获得来自hESC的DP细胞（经神经嵴中间体过程），记为hESC-DP。但是，经过检测，仅70%左右的hESC-DP表达Versican或者α-SMA，即DP细胞获得率为70%左右。和本技术方案实施例1的采用iMSC为诱导起始细胞的DP细胞获得率95&（以α-SMA计）、100%（以Versican计）相比，本技术方案的DP细胞获得率显著高于本对比例的hESC-DP，这说明了本方案诱导获得神经来源的间充质干细胞具有更为理想的诱导成为DP细胞的效果，诱导率更高。
除此之外，本对比例还在人ESC的H9系（本对比例前文所述的hESC）以外，还使用三种先前表征的自正常人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞(hIPSC)系。遵循先前描述的方案生成hIPSC-NC细胞（即形成神经嵴细胞），使用本对比例的方案使hIPSC-NC细胞分化以获得hIPSC-DP（形成DP细胞）。DP标志物SMA以及Versican的Q-PCR分析显示只有一种hIPSC系(BJ16)在与hESC-DP细胞相比时产生具有一些DP标志物表达的细胞。通过补片移植进一步表征BJ16 IPSC-DP细胞。这种细胞群与阴性对照相比时不诱导显著数目的毛发。移植GFP阳性BJ16 IPSC-DP细胞导致形成毛发及GFP阳性真皮乳头和真皮囊，频率比hESC-DP细胞的情况低得多(50个中1根毛发)。
上述数据说明了使用现有技术（即对比例1的方式）的诱导形成神经嵴细胞（神经来源的间充质干细胞）的方法，并使用上述的神经嵴细胞诱导获得DP细胞，DP细胞诱导率不理想。并且即使采用自正常人BJ成纤维细胞生成的人诱导的多能干细胞(hIPSC)系，但未采用本方案的获取间充质干细胞的方法（即申请人在先专利CN113025569B的方法），进而诱导获得的DP细胞的诱导毛发生成的能力差（和其阴性对照差不多），而本技术方案获得的DP细胞可以显著诱导毛发生成（可参见图5）。按照申请人在先专利CN113025569B方法诱导获得的间充质干细胞，在进一步诱导形成DP细胞方面，相对于现有技术，既保证了较高的DP细胞诱导率，又保证了获得的DP细胞具有较为理想的生物学功能（例如促进毛发生长）。本方案的研究结果，使得申请人在先专利CN113025569B获得的间充质干细胞的用途得到了进一步扩展，可以在诱导形成DP细胞方面，获得更优异的效果。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，其特征在于：使用无血清诱导培养基对间充质干细胞进行诱导培养，获得真皮乳头细胞；所述无血清诱导培养基是在含有0.542mg/mL的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM/F-12基础培养基中添加活性成分形成，所述活性成分包括体积百分比为10%-20%的KnockOut血清替代物、体积百分比0.5%-5%的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、10ng/mL-100ng/mL的肝细胞生长因子和5ng/mL-50ng/mL的氢化可的松；
所述间充质干细胞由诱导多能干细胞经诱导培养获得；诱导多能干细胞经过四个阶段的悬浮培养之后，形成脑类器官；脑类器官再经贴壁培养获得间充质干细胞；四个阶段的悬浮培养以及贴壁培养过程中使用的培养基为：
第一阶段的培养基的组成为：GMEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、KnockOut血清替代物 12-18％、Dorsomorphin 0.8-1.5μM、A83-01 0.8-1.2μM和聚乙烯醇0.5-1.5％；
第二阶段的培养基的组成为：GMEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、N2 1％-2％、SB-431542 0.8-1.2μM、CHIR-99021 0.8-1.2μM、聚乙烯醇0.8-1.5％；
第三阶段的培养基的组成为：MEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、N2 1％-2％、SB-431542 0 .8-1 .2μM、CHIR99021 0.8-1.2μM、Martigel0.8-1 .5％、聚乙烯醇0.8-1.5％；
第四阶段的培养基的组成为：GMEM基础培养基、NEAA 1％-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇 80-120nM、N2 1％-2％、B27 2％-3％、胰岛素2μg/mL；
贴壁培养的培养基的组成为：GMEM基础培养基、NEAA 1-2％、Glumax 1％-2％、β-巯基乙醇100nM、N2 1％-2％、B27 2％-3％、b-FGF 5-6ng/ml。
2.根据权利要求1所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，其特征在于：诱导培养的时间为15-21天。
3.根据权利要求2所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，其特征在于：间充质干细胞的融合度达到60%-85%时，开始使用无血清诱导培养基对间充质干细胞进行诱导培养。
4.根据权利要求3所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，其特征在于：无血清诱导培养基中含有0.542mg/mL的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、体积百分比为10%的KnockOut血清替代物、10μL/mL的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、20ng/mL的肝细胞生长因子和10ng/mL的氢化可的松。
5.根据权利要求4所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，其特征在于：将真皮乳头细胞悬液接种于含有维持培养基的低吸附培养设备中，经培养获得真皮乳头细胞；所述维持培养基是在DMEM/F-12基础培养基中添加KnockOut血清替代物和胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂形成。
6.根据权利要求5所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法，其特征在于：将真皮乳头细胞悬液接种于含有维持培养基的低吸附培养设备中，经6-24h培养获得真皮乳头细胞。
7.用于权利要求1-6中任一项所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法的培养基，其特征在于，其包括基础成分和活性成分；所述基础成分为DMEM/F-12基础培养，所述活性成分包括0.542mg/mL的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、体积百分比为10%-20%的KnockOut血清替代物、体积百分比0.5%-5%的胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂、10ng/mL-100ng/mL的肝细胞生长因子和5ng/mL-50ng/mL的氢化可的松。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的诱导方法获得的真皮乳头细胞在制备促进毛发生长的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410013331.2A CN117551600B (zh) | 2024-01-04 | 2024-01-04 | 一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410013331.2A CN117551600B (zh) | 2024-01-04 | 2024-01-04 | 一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117551600A CN117551600A (zh) | 2024-02-13 |
| CN117551600B true CN117551600B (zh) | 2024-04-02 |
Family
ID=89813066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410013331.2A Active CN117551600B (zh) | 2024-01-04 | 2024-01-04 | 一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117551600B (zh) |
Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101755046A (zh) * | 2007-07-20 | 2010-06-23 | 东国大学校产学协力团 | 采用间充质干细胞制备真皮乳头组织的方法 |
| KR20120126463A (ko) * | 2011-05-11 | 2012-11-21 | 고려대학교 산학협력단 | 외부유전자의 도입 없이 중간엽 줄기세포로부터 신경줄기세포를 생산하는 방법 |
| CN103798224A (zh) * | 2012-11-05 | 2014-05-21 | 中国人民解放军总医院第一附属医院 | 汗腺样细胞冻存复苏液及保持细胞活性的冻存复苏方法 |
| CN106661547A (zh) * | 2014-07-09 | 2017-05-10 | 桑福德伯纳姆医学研究所 | 调控毛发生长的方法和组合物 |
| CN106834213A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-13 | 广州润虹医药科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞形成毛乳头细胞的诱导培养基及诱导方法 |
| CN110923196A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-03-27 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法 |
| CN113025569A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-25 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN113046309A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-29 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用 |
| CN113544259A (zh) * | 2020-01-31 | 2021-10-22 | 瑞帝安有限公司 | 从人类脂肪来源间充质干细胞分化为毛乳头细胞的方法 |
| KR20220063839A (ko) * | 2020-11-10 | 2022-05-18 | (주)안트로젠 | 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법 |
| CN114929858A (zh) * | 2019-10-14 | 2022-08-19 | 乔治-奥古斯特-哥廷根大学公法大学医学基金会 | 由多能干细胞生产骨骼肌细胞和骨骼肌组织 |
| WO2023285816A1 (en) * | 2021-07-12 | 2023-01-19 | 3D Bio-Tissues Limited | Cell culture medium and supplements for corneal and skin cell culture |
| KR20230022350A (ko) * | 2021-08-06 | 2023-02-15 | 충남대학교산학협력단 | 두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 |
| WO2023201229A1 (en) * | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Research Development Foundation | Methods for making and using differentiated neural cells |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4022037A1 (en) * | 2019-07-10 | 2022-07-06 | Helmuth Heinrich Kunz | Methods for deriving autologous and hypoimmunogenic hair follicle containing sheets in vitro |
-
2024
- 2024-01-04 CN CN202410013331.2A patent/CN117551600B/zh active Active
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101755046A (zh) * | 2007-07-20 | 2010-06-23 | 东国大学校产学协力团 | 采用间充质干细胞制备真皮乳头组织的方法 |
| KR20120126463A (ko) * | 2011-05-11 | 2012-11-21 | 고려대학교 산학협력단 | 외부유전자의 도입 없이 중간엽 줄기세포로부터 신경줄기세포를 생산하는 방법 |
| CN103798224A (zh) * | 2012-11-05 | 2014-05-21 | 中国人民解放军总医院第一附属医院 | 汗腺样细胞冻存复苏液及保持细胞活性的冻存复苏方法 |
| CN106661547A (zh) * | 2014-07-09 | 2017-05-10 | 桑福德伯纳姆医学研究所 | 调控毛发生长的方法和组合物 |
| CN106834213A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-13 | 广州润虹医药科技有限公司 | 一种诱导多能干细胞形成毛乳头细胞的诱导培养基及诱导方法 |
| CN114929858A (zh) * | 2019-10-14 | 2022-08-19 | 乔治-奥古斯特-哥廷根大学公法大学医学基金会 | 由多能干细胞生产骨骼肌细胞和骨骼肌组织 |
| CN110923196A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-03-27 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法 |
| CN113544259A (zh) * | 2020-01-31 | 2021-10-22 | 瑞帝安有限公司 | 从人类脂肪来源间充质干细胞分化为毛乳头细胞的方法 |
| KR20220063839A (ko) * | 2020-11-10 | 2022-05-18 | (주)안트로젠 | 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법 |
| CN113046309A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-29 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用 |
| CN113025569A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-06-25 | 成都云测医学生物技术有限公司 | 人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| WO2023285816A1 (en) * | 2021-07-12 | 2023-01-19 | 3D Bio-Tissues Limited | Cell culture medium and supplements for corneal and skin cell culture |
| KR20230022350A (ko) * | 2021-08-06 | 2023-02-15 | 충남대학교산학협력단 | 두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 |
| WO2023201229A1 (en) * | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Research Development Foundation | Methods for making and using differentiated neural cells |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Method for the preparation of dermal papilla tissue employing mesenchymal stem cells;Giovanni Schepici;Int J Mol Sci;20220607;第23卷(第12期);第1-24页 * |
| Optimization of the Reconstruction of Dermal Papilla like Tissues Employing Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells;Bo-Young Yoo 等;Biotechnology and Bioprocess Engineering;20100318;第15卷;第182-190页 * |
| 人毛乳头细胞生物学研究及人真皮来源间充质干细胞的诱导分化;潘霄汝;中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药科技辑;20180322(第3期);E075-1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117551600A (zh) | 2024-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111117946B (zh) | 一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法 | |
| CA2645142C (en) | Regulating stem cells | |
| US20110217385A1 (en) | Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof | |
| KR102122039B1 (ko) | 인간 유래 만능줄기세포에서 모유두전구세포로의 분화방법 및 이의 용도 | |
| WO2022110180A1 (en) | Generation of neural progenitor cells from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells | |
| US20210355439A1 (en) | Differentiation medium and method for preparing oligodendrocyte precursor | |
| CN115011553A (zh) | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 | |
| CN113337458A (zh) | 一种提高多能干细胞定向诱导心肌细胞产量及纯度的方法 | |
| AU2023200492A1 (en) | Expansion and differentiation of neuronal precursor cells | |
| EP2820123B1 (en) | Method for guiding the derivation of endothelial cells from human pluripotent stem cells employing two-dimensional, feeder-free differentiation | |
| CN117551600B (zh) | 一种促进诱导间充质干细胞分化为真皮乳头细胞的培养基及诱导方法 | |
| Vasyliev et al. | Large-scale expansion and characterization of human adult neural crest-derived multipotent stem cells from hair follicle for regenerative medicine applications | |
| CA2578685A1 (en) | Method for preparing conditioned medium of astrocyte-like cells | |
| KR20110042210A (ko) | 세포를 배양시키는 방법 | |
| CN112680410B (zh) | 诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液 | |
| CN112608904B (zh) | 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用 | |
| CN116875537B (zh) | 一种构建毛囊类器官的方法 | |
| CA2632834C (en) | Regulating stem cells | |
| WO2023215423A2 (en) | Methods of generating three-dimensional retinal organoids from human pluripotent stem cells | |
| CN117946963A (zh) | 人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用 | |
| CN116622635A (zh) | 角膜类器官的制备及其在制备组织工程角膜上皮片层中的应用 | |
| CN117448267A (zh) | 一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法与应用 | |
| CN116083349A (zh) | 人或恒河猴的多能干细胞诱导分化骨骼肌前体细胞的方法 | |
| CN111936620A (zh) | 视网膜色素上皮细胞膜片及其制备方法 | |
| IL193947A (en) | Cells cultured as cd31brigi: it, a method for stimuli to differentiate into a congenital / precursor cell population (pcp), use of the same drug preparation population, and implantation device that includes it |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |