CN103798224A - 汗腺样细胞冻存复苏液及保持细胞活性的冻存复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种汗腺样细胞的冻存液及复苏液，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。本发明还提供了一种利用该冻存液和复苏液的细胞冻存复苏方法，与传统冻存复苏方法相比，采用本发明提供的方法，冻存复苏存活率高，不影响汗腺样细胞的特性，也不会改变其汗腺样细胞分化状态，解决了汗腺样细胞储存复苏困难的问题。
Description
技术领域
本发明涉及人体汗腺再生研究领域，更具体地，涉及一种令汗腺样细胞可以保持活性的冻存复苏的方法，及该方法中应用的冻存液和复苏液。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，可排出机体25%的热量以保持体温相对恒定。大面积深度烧伤患者因汗腺被毁或其分泌管道被瘢痕组织堵塞而丧失了分泌汗液的功能，皮肤的体温调节功能障碍，严重影响患者的生活质量。因此，恢复大面积深度烧伤患者的排汗功能对于提高患者生活质量意义重大。目前研制出的人工皮肤均无汗腺等皮肤附属器，无法解决这一问题。间充质干细胞向汗腺细胞分化与汗腺细胞种植的研究为此带来了希望。但诱导后汗腺样细胞冻存复苏后存活效率低，只有30%左右，不利于复苏应用。
目前，在细胞冻存时可用的冻存液包括血清和血清替代物两类，由于血清具有成分不明确、质量不稳定、价格昂贵等缺点，利用血清替代物进行细胞冻存和复苏已成为发展趋势。特别是临床应用级细胞的储存，血清的成分复杂性使得若将其应用于临床尚存在很多未知的风险，因此临床上普遍使用血清替代物作为细胞冻存液。常规的血清替代物冻存液主要成分是70%的无血清培养基、20%牛血清白蛋白和10%二甲基亚砜。一般采用简单的两步法降温冻存，具体方法是：将血清替代物冻存液加入细胞悬液后放入冻存管中，置于-80℃冰箱过夜后转入液氮中保存。对冻存细胞复苏时，一般是将冻存管直接置于37℃迅速解冻，再加入完全生长培养基重悬细胞，离心后弃去上清，加入生长培养基继续培养。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种令汗腺样细胞可以保持活性的冻存复苏的方法，及该方法中应用的冻存液和复苏液。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种汗腺样细胞冻存液，其是在作为基础液的血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。
如上所述的冻存液，优选地，所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为20-60ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。
如上所述的冻存液，更优选地，所述人表皮生长因子的浓度为70-80ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为30-50ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.1mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。
如上所述的冻存液，优选地，所述血清替代物为Knock-out血清替代物（Knock-out Serum Replacement，Invitrogen公司，美国）。
一种汗腺样细胞复苏液，其是在作为基础液的血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。
如上所述的复苏液，优选地，所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为20-60ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。
如上所述的复苏液，更优选地，所述人表皮生长因子的浓度为70-80ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为30-50ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.1mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。
如上所述的复苏液，优选地，所述血清替代物为Knock-out血清替代物。
一种保持细胞活性的冻存方法，其特征在于，
将待冻存的细胞消化收集离心后，加入如上所述的冻存液，令细胞浓度为0.5-2×106/mL，以1.5mL/支移至冻存管中，置4℃预冷30分钟，放入程序降温仪中以每分钟降1℃的速度均匀梯度降温至-80℃、转移至液氮中长期保存。
如上所述的冻存方法，优选地，将细胞降温至-80℃16小时后再转移至液氮中长期保存。
一种保持细胞活性的复苏方法，其特征在于，
将冻存的细胞从液氮中取出，在40±3℃水浴中解冻1-3分钟，加入2-5倍体积已经37℃预热的如上所述的复苏液重悬。
如上所述的复苏方法，优选地，在重悬后以600-1000rpm/min离心2-3分钟去除上清。
一种保持细胞活性的冻存复苏方法，其特征在于，
冻存时，将待冻存的细胞消化收集离心后，加入如上所述的冻存液，令细胞浓度为0.5-2×106/mL，以1.5mL/支移至冻存管中，置4℃预冷30分钟，放入程序降温仪中以每分钟降1℃的速度均匀梯度降温至-80℃、转移至液氮中长期保存；
复苏时，将冻存的细胞从液氮中取出，在40±3℃水浴中迅速解冻1-3分钟，加入2-5倍体积已经37℃预热的如上所述的复苏液重悬。
如上所述的冻存复苏方法，优选地，将细胞降温至-80℃16小时后再转移至液氮中长期保存。
如上所述的冻存复苏方法，优选地，在重悬后以600-1000rpm/min离心2-3分钟去除上清。
本发明的有益效果为：
本发明涉及一种汗腺样细胞经冻存和复苏仍保持活力的方法，并对冻存液成份、复苏液成份及冻存程序、复苏程序进行了改进和优化。本发明的冻存液及复苏液具有成分明确、容易使用、稳定性好的优点。而采用本发明方法，冻存复苏存活率高，实验证明，汗腺样细胞的存活率可从现有技术的30%左右提高到80%以上。并且，采用本发明方法不会影响汗腺样细胞的特性，也不会改变其汗腺样细胞分化状态。
因此，本发明解决了汗腺样细胞储存复苏困难的问题，建立了一种适用于诱导后汗腺样细胞长期储存的方法，对于烧伤患者的早期临床治疗具有重要意义，并为建立干细胞库奠定了良好基础。
附图说明
图1为复苏接种后4小时，对本发明冻存复苏方法与传统方法分别进行活细胞计数的结果统计图。
图2为光学显微镜下的复苏后的汗腺样细胞贴壁形态（×100），图2a为本方法复苏的汗腺样细胞，图2b为传统方法复苏的冻存汗腺样细胞。
具体实施方式
本发明提供了令汗腺样细胞在冻存复苏后依旧能保持活性的一种冻存液和一种复苏液，其在传统的冻存复苏液中添加了人表皮生长因子、重组人角质细胞生长因子-2、三碘甲状腺原氨酸、半琥珀酸氢化可的松、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠和牛血清白蛋白，并通过设计实验，确定了各组分的优化浓度。
本发明还利用所述冻存液和复苏液，提供了能够保持细胞活性的一种冻存方法和一种复苏方法，其中，冻存方法包括向汗腺样细胞悬液中加入优化的冻存液和在液氮中冻存的步骤；复苏方法包括向从液氮中取出的冻存细胞中加入优化的复苏液使细胞复苏和复苏后的细胞经复苏液洗涤后制成细胞悬液的步骤。
以下举若干具体实施例详细阐述本发明。本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例仅为辅助阐述本发明之用，而非用于限定本发明的保护范围。
实施例1
（一）细胞冻存
制备冻存液：本实施例中所用冻存液的成分为：基础液血清替代物中含有：
人表皮生长因子，浓度为70ng/mL，重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为40ng/mL，三碘甲状腺原氨酸，浓度为25ng/mL，半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.7μg/mL，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.05mL/mL，牛血清白蛋白，浓度为0.4g/mL，配制成的冻存液置于4℃冰箱中预冷30分钟。
取诱导的汗腺样细胞，将其消化收集离心后，加入经过预冷的所述冻存液，令其中细胞浓度为0.5-2×106/mL，以1.5mL/支移至冻存管中，置4℃预冷30分钟。放入程序降温仪中以每分钟降1℃的速度均匀梯度降温至-80℃、16小时后转移至液氮中长期保存。
本发明各实施例中，血清替代物选用美国Invitrogen公司的Knock-out血清替代物，其在本领域应用得最为广泛，质量较为稳定，价格也相对较优，但其他质量可靠的市售血清替代物理论上也可以达到同样或相近的效果。所用汗腺样细胞由间充质干细胞经过诱导后分化形成，所用间充质干细胞可从细胞库购买得到。本发明所有实验条件均满足国家临床实验标准，也均已通过医院道德伦理委员会审议。
（二）细胞复苏
制备复苏液：本实施例中所用复苏液的成分为：基础液Knock-out血清替代物中含有：
人表皮生长因子，浓度为70ng/mL，重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为40ng/mL，三碘甲状腺原氨酸，浓度为25ng/mL，半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.7μg/mL，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.05mL/mL，牛血清白蛋白，浓度为0.4g/mL。
将步骤（一）中冻存的细胞从液氮中取出，置42℃水浴中1-3分钟迅速解冻溶解，加入3倍体积37℃预热的复苏液重悬，以800rpm/min离心3分钟去除上清。
在细胞复苏时，由于是将细胞从冻存的低温环境中取出后置入较高的温度中快速复温，在此过程中细胞十分脆弱，极易受到外界环境的干扰而降低存活率，因此保持复苏液与冻存液成分的一致性，更加有利于细胞复苏后的存活率。
（三）细胞洗涤
将实施例2复苏收集到的细胞加入2-5倍于细胞体积的Knock-out血清替代物、离心后去除上清洗涤，重复洗涤2-3次。再加入等体积的0.9%生理盐水轻轻吹打重悬细胞。
实施例2
（一）细胞冻存
本实施例中所用冻存液的成分为：基础液Knock-out血清替代物中含有：
人表皮生长因子，浓度为80ng/mL，重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为50ng/mL，三碘甲状腺原氨酸，浓度为30ng/mL，半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.8μg/mL，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.1mL/mL，牛血清白蛋白，浓度为0.6g/mL。
冻存操作与实施例1相同。
（二）细胞复苏
本实施例中所用复苏液的成分为：基础液Knock-out血清替代物中含有：人表皮生长因子，浓度为80ng/mL，重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为50ng/mL，三碘甲状腺原氨酸，浓度为30ng/mL，半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.8μg/mL，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.1mL/mL，牛血清白蛋白，浓度为0.6g/mL。
将步骤（一）中冻存的细胞从液氮中取出，置42℃水浴中1-3分钟迅速解冻溶解，加入5倍体积37℃预热的复苏液重悬，以600rpm/min离心3分钟去除上清。
（三）细胞洗涤
操作与实施例1相同。
实施例3
（一）细胞冻存
本实施例中所用冻存液的成分为：基础液Knock-out血清替代物中含有：
人表皮生长因子，浓度为75ng/mL，重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为45ng/mL，三碘甲状腺原氨酸，浓度为27ng/mL，半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.75μg/mL，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.07mL/mL，牛血清白蛋白，浓度为0.4g/mL。
冻存操作与实施例1相同。
（二）细胞复苏
本实施例中所用复苏液的成分为：基础液Knock-out血清替代物中含有：
人表皮生长因子，浓度为75ng/mL，重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为45ng/mL，三碘甲状腺原氨酸，浓度为27ng/mL，半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.75μg/mL，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.07mL/mL，牛血清白蛋白，浓度为0.4g/mL。
将步骤（一）中冻存的细胞从液氮中取出，置42℃水浴中1-3分钟迅速解冻溶解，加入2倍体积37℃预热的复苏液重悬，以1000rpm/min离心3分钟去除上清。
（三）细胞洗涤
操作与实施例1相同。
实施例4本发明提供的冻存液、复苏液及冻存复苏方法的确认
（一）细胞形态和活性检测
采用如实施例1所述的冻存液、复苏液及冻存复苏方法对汗腺样细胞进行冻存复苏，同时采用传统方法作为对照。复苏接种后4小时，将本发明冻存复苏方法与传统方法进行活细胞计数对比，如图1所示，本方法与传统方法相比，提高了汗腺样细胞复苏存活率，从现有技术所获得的20%左右提高到80%以上，从图中结果可以看出，使用本发明方法冻存复苏后的汗腺样细胞存活率，明显高于使用传统细胞冻存复苏方法的存活率。
复苏贴壁后3天，本发明冻存复苏方法与传统方法汗腺样细胞贴壁置于光学显微镜下观察对比，结果如图2所示。其中，图2a为采用传统方法复苏得到的细胞，图2b为采用本发明方法复苏得到的细胞。由图中可见，在普通光学显微镜下观察：使用传统方法对细胞进行冻存复苏后，光镜下可见较少存活汗腺样细胞，细胞存活率仅为20%左右，细胞大小不均匀、形态不规则，且生长增殖速度缓慢，甚至不生长，一周之内会出现大部分死亡；而使用本发明的冻存复苏液冻存复苏后，成活细胞明显增多，其复苏成活率大于80%，细胞形态规则正常，生长增殖速度也明显增快。
通过实验结果可以看出，使用本发明方法冻存复苏汗腺样细胞，能很好的保证汗腺样细胞生长的质量，缩短细胞复苏的扩增周期，完整地保存其形态结构与生物学特征，并且更好地保持其表面标记物。本发明解决了汗腺样细胞储存复苏困难的问题，为大规模的临床应用奠定了很好的基础。
Claims (10)
1.一种汗腺样细胞冻存液，其特征在于，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：
人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；
重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；
三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；
半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；
牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。
2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，
所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL；
所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为20-60ng/mL；
所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL；
所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9μg/mL；
所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。
3.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，
所述人表皮生长因子的浓度为70-80ng/mL；
所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为30-50ng/mL；
所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL；
所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8μg/mL；
所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.1mL/mL；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。
4.如权利要求1-3中任一项所述的冻存液，其特征在于，所述血清替代物为Knock-out血清替代物。
5.一种汗腺样细胞复苏液，其特征在于，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：
人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；
重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；
三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；
半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；
牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。
6.如权利要求5所述的复苏液，其特征在于，
所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL；
所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为20-60ng/mL；
所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL；
所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9μg/mL；
所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。
7.如权利要求5所述的复苏液，其特征在于，
所述人表皮生长因子的浓度为70-80ng/mL；
所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为30-50ng/mL；
所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL；
所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8μg/mL；
所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.1mL/mL；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。
8.如权利要求5-7中任一项所述的复苏液，其特征在于，所述血清替代物为Knock-out血清替代物。
9.一种保持细胞活性的冻存方法，其特征在于，
将待冻存的细胞消化收集离心后，加入如权利要求1-3中任一项所述的冻存液，令细胞浓度为0.5-2×106/mL，以1.5mL/支移至冻存管中，置4℃预冷30分钟，放入程序降温仪中以每分钟降1℃的速度均匀梯度降温至-80℃、转移至液氮中长期保存。
10.一种保持细胞活性的复苏方法，其特征在于，
将冻存的细胞从液氮中取出，在40±3℃水浴中解冻1-3分钟，加入2-5倍体积已经37℃预热的如权利要求5至7中任一项所述的复苏液重悬。
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