CN112021304A - 一种脐带间充质干细胞的冻存方法及复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：(1)取间充质干细胞，培养基重悬后，重铺至培养瓶中，待培养瓶中的细胞融合达90％以上时收获；(2)将培养瓶中的培养基倒掉，洗涤后加入胰蛋白酶消化，消化完成后加入混合生理盐水终止消化；(3)将消化后的细胞转入离心管中，离心处理后，弃上清，将沉淀重悬后再次离心，弃上清后得到间充质干细胞；(4)将间充质干细胞加入至冻存液中重悬后分装至冻存管中，梯度降温，转移至深低温冰箱后，冻存完成。本发明提供的一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其中所用的冻存液对脐带间充质干细胞具有良好冻存效果，高效且不含任何动物源成分的可直接进行临床输注的MSCs冻存液。

Description

一种脐带间充质干细胞的冻存方法及复苏方法
技术领域
本发明属于临床输注的脐带间充质干细胞冻存液制备技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞的冻存方法。
背景技术
干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万能细胞”。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
由MSCs制备的干细胞注射液在临床上可以用于预防和治疗异体造血干细胞移植后产生的移植物抗宿主病(GVHD)，以及治疗自生免疫性疾病，Ⅰ型糖尿病、如红斑狼疮、风湿性关节炎和硬皮病等。现用的胎牛血清冻存液能够长时间维持细胞活率，但该细胞冻存液不能作为注射液直接用于临床输注，其回输人体可能会引起严重的过敏反应。因此探究一种高效且不含任何动物源成分的可直接进行临床输注的脐带间充质干细胞冻存液，具有良好的应用前景和经济效益。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明提供一种低炼耗、高效率、并适合工业化生产的脐带间充质干细胞的冻存方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)取间充质干细胞，培养基重悬后，重铺至培养瓶中，待培养瓶中的细胞融合达90％以上时收获；
(2)将培养瓶中的培养基倒掉，用0.9％的氯化钠水溶液洗涤后加入胰蛋白酶消化，消化完成后加入混合生理盐水终止消化，所述混合生理盐水由以下重量份的组分制成：0.9％的氯化钠水溶液88-100份、α-熊果苷1-5份、L-谷氨酰胺0.8-1.6份；
(3)将消化后的细胞转入离心管中，离心处理后，弃上清，将沉淀重悬后再次离心，弃上清后得到间充质干细胞；
(4)将间充质干细胞加入至冻存液中重悬后分装至冻存管中，梯度降温，转移至深低温冰箱后，冻存完成，所述冻存液按重量份计，冻存液1：10％人血白蛋白+1％右旋糖酐+79％复方电解质液+10％DMSO。
具体地，上述步骤(1)中，培养基中含有2％胎牛血清、40％MCDB201、18-20μg/L血小板衍生生长因子、10-15μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10-15μg/L表皮生长因子。
具体地，上述步骤(1)中，上述步骤(2)中，胰蛋白酶的加入量为2-4g/ml，胰蛋白酶消化时间为25-35秒。
具体地，上述步骤(2)中，上述步骤(3)中，离心处理时的离心机的转速为1000-1200r/min，离心时间为8-12min。
具体地，上述步骤(4)中，梯度降温的具体操作为：将冻存管放入-40℃的环境中冻存处理30min后，再放入-80℃的环境中冻存处理。
本发明还提供一种采用上述冻存方法冻存的脐带间充质干细胞的复苏方法，包括以下操作步骤：
(1)将深低温冰箱中的细胞取出，37℃水浴锅中速溶，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液加入备好的生理盐水和人血白蛋白的混合液中，混匀后取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率；
(3)取1×106个细胞加入15ml复苏培养基中，加入培养瓶中培养，待培养细胞融合达90％以上时复苏完成。
具体地，上述生理盐水与人血白蛋白的体积比为15-20:1。
具体地，所述复苏培养基由以下重量份的组分制成：低糖型DMEM培养基87-92份、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.01-0.03份、抗坏血酸钠0.1-0.5份、胎牛血清4-6份。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其中所用的冻存液对脐带间充质干细胞具有良好冻存效果，高效且不含任何动物源成分的可直接进行临床输注的MSCs冻存液；
2、本发明提供的冻存液，在速溶的过程中物理性质稳定，不会对冻存的脐带间充质干细胞造成损伤，进而有效的保证了冻存细胞的存活率；
3、本发明提供的混合生理盐水，对消化反应的终止效果显著，并且对细胞的毒性小，可有效的保证细胞的活性，进而提高了复苏后的细胞存活率。
附图说明
图1为实施例1和实施例2的细胞活率对比图。
图2为细胞冻存10天时早期凋亡测试结果。
图3为细胞冻存30天时早期凋亡测试结果。
图4为细胞冻存10天复苏培养后的细胞表型，其中B是实施例1处理后的冻存间充质干细胞，D是实施例2处理后的冻存间充质干细胞。
图5为细胞冻存30天复苏培养后的细胞表型，其中B是实施例1处理后的冻存间充质干细胞，D是实施例2处理后的冻存间充质干细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)取间充质干细胞，培养基重悬后，重铺至培养瓶中，待培养瓶中的细胞融合达90％以上时收获，培养基中含有2％胎牛血清、40％MCDB201、18μg/L血小板衍生生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮生长因子；
(2)将培养瓶中的培养基倒掉，用0.9％的氯化钠水溶液洗涤后加入2g/ml的胰蛋白酶消化25秒，消化完成后加入混合生理盐水终止消化，所述混合生理盐水由以下重量份的组分制成：0.9％的氯化钠水溶液88份、α-熊果苷1份、L-谷氨酰胺0.8份；
(3)将消化后的细胞转入离心管中，离心处理后，弃上清，将沉淀重悬后再次离心，弃上清后得到间充质干细胞，离心处理时的离心机的转速为1000r/min，离心时间为8min；
(4)将间充质干细胞加入至冻存液中重悬后分装至冻存管中，梯度降温，转移至深低温冰箱后，冻存完成，所述冻存液按重量份计，由以下重量份的组分制成：冻存液1：10％人血白蛋白+1％右旋糖酐+79％复方电解质液+10％DMSO。
梯度降温的具体操作为：将冻存管放入-40℃的环境中冻存处理30min后，再放入-80℃的环境中冻存处理。
实施例2
一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)取间充质干细胞，培养基重悬后，重铺至培养瓶中，待培养瓶中的细胞融合达90％以上时收获，培养基中含有2％胎牛血清、40％MCDB201、20μg/L血小板衍生生长因子、15μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L表皮生长因子；
(2)将培养瓶中的培养基倒掉，用0.9％的氯化钠水溶液洗涤后加入4g/ml的胰蛋白酶消化35秒，消化完成后加入混合生理盐水终止消化，所述混合生理盐水由以下重量份的组分制成：0.9％的氯化钠水溶液100份、α-熊果苷5份、L-谷氨酰胺1.6份；
(3)将消化后的细胞转入离心管中，离心处理后，弃上清，将沉淀重悬后再次离心，弃上清后得到间充质干细胞，离心处理时的离心机的转速为1200r/min，离心时间为12min；
(4)将间充质干细胞加入至冻存液中重悬后分装至冻存管中，梯度降温，转移至深低温冰箱后，冻存完成，所述冻存液按重量份计，由以下重量份的组分制成：冻存液1：10％人血白蛋白+1％右旋糖酐+79％复方电解质液+10％DMSO。
梯度降温的具体操作为：将冻存管放入-40℃的环境中冻存处理30min后，再放入-80℃的环境中冻存处理。
实施例3
一种脐带间充质干细胞的复苏方法，包括以下操作步骤：
(1)将深低温冰箱中的细胞取出，37℃水浴锅中速溶，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液加入备好的生理盐水和人血白蛋白的混合液中，混匀后取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率，生理盐水与人血白蛋白的体积比为15-20:1；
(3)取1×106个细胞加入15ml复苏培养基中，加入培养瓶中培养，待培养细胞融合达90％以上时复苏完成，复苏培养基由以下重量份的组分制成：低糖型DMEM培养基87-92份、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.01-0.03份、抗坏血酸钠0.1-0.5份、胎牛血清4-6份。
试验：
试验1
-80℃下冻存10天、30天后检测细胞活率，细胞活率的获得采取了两种检测手段，日常的台盼蓝染色和更加精细的早期凋亡检测。实验结果显示，采用实施例1和实施例2的八例样本细胞10天后复苏，细胞活率均在95％以上，即使除去早期凋亡的部分，细胞活率仍在90％以上。30天后复苏，细胞活率均在95％以上，除去早期凋亡的部分，细胞活率在90％左右，如图1-图3所示。
试验2
-80℃下冻存10天、30天后复苏培养后细胞状态及其表型实验结果显示，采用实施例1和实施例2的八例样本细胞10天后复苏，一切按照正常操作程序进行培养，生长速度与常用冻存液冻存之后复苏的细胞无明显差别，收获后进行细胞表型的流式检测，符合出库标准，如图4所示。30天后复苏，生长速度与常用冻存液冻存之后复苏的细胞相比略慢，时间差在一天左右，收获后进行细胞表型的流式检测，符合出库标准，如图5所示。
实验结果显示，实施例1和实施例2提供的脐带间充质干细胞的冻存方法符合我们的要求，高效无动物源成分并且可以直接用于临床输注。脐带间充质干细胞具有数量需求量大、应用紧急的特点，以上方法及时的解决了这样的问题，液氮中冻存状态下取出，水浴速溶后即可输注人体，在保证了干细胞质量的前提下，做到细胞的急用、即用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取间充质干细胞，培养基重悬后，重铺至培养瓶中，待培养瓶中的细胞融合达90％以上时收获；
(2)将培养瓶中的培养基倒掉，用0.9％的氯化钠水溶液洗涤后加入胰蛋白酶消化，消化完成后加入混合生理盐水终止消化，所述混合生理盐水由以下重量份的组分制成：0.9％的氯化钠水溶液88-100份、α-熊果苷1-5份、L-谷氨酰胺0.8-1.6份；
(3)将消化后的细胞转入离心管中，离心处理后，弃上清，将沉淀重悬后再次离心，弃上清后得到间充质干细胞；
(4)将间充质干细胞加入至冻存液中重悬后分装至冻存管中，梯度降温，转移至深低温冰箱后，冻存完成，所述冻存液按重量份计，由以下重量份的组分制成：冻存液1：10％人血白蛋白+1％右旋糖酐+79％复方电解质液+10％DMSO。
2.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，上述步骤(1)中，培养基中含有2％胎牛血清、40％MCDB201、18-20μg/L血小板衍生生长因子、10-15μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10-15μg/L表皮生长因子。
3.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，上述步骤(1)中，上述步骤(2)中，胰蛋白酶的加入量为2-4g/ml，胰蛋白酶消化时间为25-35秒。
4.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，上述步骤(2)中，上述步骤(3)中，离心处理时的离心机的转速为1000-1200r/min，离心时间为8-12min。
5.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，上述步骤(4)中，梯度降温的具体操作为：将冻存管放入-40℃的环境中冻存处理30min后，再放入-80℃的环境中冻存处理。
6.一种采用权利要求1冻存方法冻存的脐带间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)将深低温冰箱中的细胞取出，37℃水浴锅中速溶，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液加入备好的生理盐水和人血白蛋白的混合液中，混匀后取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率；
(3)取1×106个细胞加入15ml复苏培养基中，加入培养瓶中培养，待培养细胞融合达90％以上时复苏完成。
7.根据权利要求6所述的一种脐带间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，上述生理盐水与人血白蛋白的体积比为15-20:1。
8.根据权利要求6所述的一种脐带间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，所述复苏培养基由以下重量份的组分制成：低糖型DMEM培养基87-92份、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.01-0.03份、抗坏血酸钠0.1-0.5份、胎牛血清4-6份。
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