CN106957813B - 一种猪胰岛细胞复苏液及复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪胰岛细胞的复苏液及复苏方法。复苏液包含1640培养基、海藻糖和4‐PBA。复苏方法包括步骤一，将冻存的猪胰岛细胞从液氮中取出，迅速恢复至冻存液溶解，离心，弃去上清；步骤二，加入所述的猪胰岛细胞复苏液重悬猪胰岛细胞；步骤三，每4‑6min用猪胰岛细胞复苏液倍比稀释至少3次，离心，弃去上清；步骤四，用含0.5‑1mmol/L 4‑PBA的含10％质量浓度的猪血清的1640培养基进行培养。本发明降低了现有技术中复苏过程二甲基亚砜(DMSO)对猪胰岛细胞的毒性，降低了细胞复苏过程中的内质网应激，提高冻存的猪胰岛细胞复苏率。

Description

一种猪胰岛细胞复苏液及复苏方法
技术领域
本发明涉及猪胰岛细胞的冻存领域，具体涉及一种猪胰岛细胞的复苏液及复苏方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，随着人们生活、饮食和工作方式的改变，我国糖尿病的罹患人口急剧增加。糖尿病如果得不到理想的治疗，容易并发心脑血管、肾脏、视网膜及神经系统的慢性病变和各种感染等，严重时可发生酮症酸中毒，甚至导致残废或死亡。尽管现在因酮症酸中毒而死亡的病例逐渐减少，但是糖尿病肾病、视网膜病和末梢神经系统并发症等，仍然是糖尿病诊治过程中重要而艰巨的课题。研究表明通过移植胰岛细胞可以改善糖尿病高血糖状态。胰岛细胞移植的方法逐渐引起人们的重视。
而我们面临的问题是人体胰腺供给远远不能满足临床需要。因此异种胰岛细胞来源是一个重要途径。由于猪胰岛素与人胰岛素的氨基酸排列最接近，仅有一个氨基酸不同，已用于治疗I型糖尿病多年；猪的代谢特点，如血糖调定点等与人类相似；组织来源广泛；猪胰腺分离胰岛在技术上可能，并且猪胰岛能够在新鲜人血清组织培养中存活、增生。猪胰岛可能最适合于作为糖尿病患者的供体。而制约猪胰岛细胞的临床移植推广的主要因素之一就是猪胰岛细胞的冻存复苏率。
猪胰岛细胞对外界环境的变化十分敏感，复苏过程对细胞造成化学变化、物理变化，对细胞产生损害。尤其是细胞在冻融过程发生坏死或凋亡是其对种种不利条件做出的应激反应。其中内质网应激是导致细胞凋亡和坏死的一条重要途径。内质网是具有重要功能的细胞器，是真核细胞蛋白质合成的主要场所。细胞在低温状态下，会合成多种蛋白质来调节自身抵抗低温的能力。而错误折叠，并与未折叠蛋白在腔内聚集都能导致内质网应激，进而导致细胞凋亡。PERK-eIF2α信号通路是内质网应激中的3条重要信号之一，抑制PERK-eIF2α信号通路，能下调Bip和Chop蛋白的表达，抑制细胞内质网应激的产生，减少冻存细胞复苏时的凋亡和坏死。
因此，抑制内质网应激是细胞复苏过程减少细胞凋亡的重要手段。目前猪的胰岛细胞尚没有合适的复苏方法和合适的复苏保护液，严重影响猪胰岛细胞的冻存复苏率。针对上述问题，本发明提供了一种有效地复苏胰岛细胞团方法，避免胰岛细胞在复苏过程中受到低温、化学损伤产生的内质网应激的影响，以提供符合临床应用标准的猪胰岛细胞团。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种复苏效果良好的猪胰岛细胞的复苏液及复苏方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪胰岛细胞复苏液，包含1640培养基、海藻糖和4-PBA。
作为进一步的优选，所述的1640培养基含有0.05-0.5mol/L海藻糖和1-5mmol/L4-PBA。
作为进一步的优选，所述的1640培养基含有0.05mol/L海藻糖和5mmol/L 4-PBA。
一种猪胰岛细胞复苏方法，包括以下步骤：
步骤一，将冻存的猪胰岛细胞从液氮中取出，迅速恢复至冻存液溶解，600-800rpm离心1min，弃去上清；
步骤二，加入上所述的猪胰岛细胞复苏液重悬猪胰岛细胞；
步骤三，每4-6min用猪胰岛细胞复苏液倍比稀释一次，至少稀释3次，离心，弃去上清；
步骤四，用含0.5-1mmol/L 4-PBA的含10％质量浓度的猪血清的1640培养基进行培养。
作为进一步的优选，步骤二，加入上述的猪胰岛细胞复苏液重悬猪胰岛细胞，在4℃下平衡20-30min。
作为进一步的优选，步骤三，每4-6min用猪胰岛细胞复苏液倍比稀释，一共稀释3次，600-800rpm离心1min，弃去上清。
作为进一步的优选，步骤四，用含1mmol/L 4-PBA的含10％质量浓度的猪血清的1640培养基培养16-24h。
本发明降低了现有技术中复苏过程二甲基亚砜(DMSO)对猪胰岛细胞的毒性，降低了细胞复苏过程中的内质网应激，提高冻存的猪胰岛细胞复苏率。
附图说明
图1冻存前胰岛细胞；
图2复苏后胰岛细胞；
a为传统复苏方法，b为本发明方法；
图3复苏后猪胰岛细胞流式检测；
a为传统复苏方法，b为本发明方法；
图4猪胰岛细胞复苏后蛋白表达量。
具体实施方式：
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1猪胰岛细胞的复苏实验
用传统复苏方法复苏冻存猪胰岛细胞：即将冻存管迅速复温到37℃，直接1:10加入1640培养基稀释冻存液，800-1000rpm离心1min，弃去上清，加入1640培基培养至24h。
用本发明方法复苏冻存猪胰岛细胞：即将冻存管从液氮中取出，迅速恢复至冻存液溶解，600rpm离心1min，弃去上清；然后加入本发明复苏液重悬猪胰岛细胞，在4℃下平衡30min；每5min用复苏液倍比稀释一次，一共3次，600rpm离心1min，弃去上清；用含1mmol/L4-PBA的10％猪血清1640培基进行培养24h。
将两种方法复苏的胰岛细胞用Annexin V–PI染色，通过FACSCalibur flowcytometer观察细胞发生凋亡的情况。实验结果表明，采用本发明猪胰岛细胞复苏方法复苏的猪胰岛细胞比传统方法复苏的猪胰岛细胞活力高40.55％。
实施例2猪胰岛细胞的复苏过程内质网应激检测
PERK-eIF2α信号通路是内质网应激中的三条重要信号之一，抑制PERK-eIF2α信号，能明显抑制细胞产生内质网应激，并且降低GADD153和GRP78的表达量。
用传统复苏方法复苏冻存猪胰岛细胞：即将冻存管迅速复温到37℃，直接1:10加入1640培养基稀释冻存液，800-1000rpm离心1min，弃去上清，加入1640培基培养至24h。
用本发明方法复苏冻存猪胰岛细胞：即将冻存管从液氮中取出，迅速恢复至冻存液溶解，600rpm离心1min，弃去上清；然后加入复苏液重悬猪胰岛细胞，在4℃下平衡30min；每5min用复苏液倍比稀释一次，一共3次，600rpm离心1min，弃去上清；用含1mmol/L 4-PBA的10％猪血清1640培基进行培养分别于0.5h收集细胞提取总蛋白用Western Blot法检测细胞中p-PERK、p-eIF2α，16h收集细胞提取总蛋白用Western Blot法检测细胞中GADD153和GRP78。
实验结果显示，用本发明方法复苏猪胰岛细胞比常规方法复苏猪胰岛细胞，能明显抑制p-PERK、p-eIF2α、GADD153和GRP78。表明该方法比常规方法能明显抑制猪胰岛细胞复苏过程的内置网应激减少内质网应激途径的细胞凋亡和坏死(见图4)。

Claims (6)

1.一种猪胰岛细胞复苏液，其特征在于，包含1640培养基、海藻糖和4-PBA；所述的1640培养基含有0.05-0.5mol/L海藻糖和1-5mmol/L 4-PBA。
2.根据权利要求1所述的猪胰岛细胞复苏液，其特征在于，所述的1640培养基含有0.05mol/L海藻糖和5mmol/L 4-PBA。
3.一种猪胰岛细胞复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将冻存的猪胰岛细胞从液氮中取出，迅速恢复至冻存液溶解，600-800rpm离心1min，弃去上清；
步骤二，加入权利要求1或2所述的猪胰岛细胞复苏液重悬猪胰岛细胞；
步骤三，每4-6min用猪胰岛细胞复苏液倍比稀释一次，至少稀释3次，离心，弃去上清；
步骤四，用含0.5-1mmol/L 4-PBA的含10％质量浓度的猪血清的1640培养基进行培养。
4.根据权利要求3所述的猪胰岛细胞复苏方法，其特征在于，
步骤二，加入权利要求1或2所述的猪胰岛细胞复苏液重悬猪胰岛细胞，在4℃下平衡20-30min。
5.根据权利要求3所述的猪胰岛细胞复苏方法，其特征在于，
步骤三，每4-6min用猪胰岛细胞复苏液倍比稀释，一共稀释3次，600-800rpm离心1min，弃去上清。
6.根据权利要求3所述的猪胰岛细胞复苏方法，其特征在于，
步骤四，用含1mmol/L 4-PBA的含10％质量浓度的猪血清的1640培养基培养16-24h。
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