KR20230022350A - 두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 혈청 대체제, 글루타민 대체제, 간세포성장인자 (HGF), 종양증식인자-베타 (TGF-β) 신호전달 억제제, 섬유아세포성장인자-10 (FGF10), 염기성 섬유아세포성장인자 (bFGF), 프로스타글란딘 E2, R-spondin 및 골형성단백질 (BMP) 신호전달 억제제로 이루어진, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid) 형성용 조성물 및 이를 이용한 환자 유래 두경부암 오가노이드의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도{Method for preparing head and neck cancer organoid and use thereof}
본 발명은 두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
오가노이드(organoids)란 장기 유사체 혹은 미니 장기로 불리우며 실제 장기 기관의 기능 및 구조를 닮아 있는 자가조직화(self-organizing)가 가능한 3차원 세포 집합체(3D cell culture)로 정의된다. 오가노이드는 구체적으로 장기 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하며, 장기 또는 조직의 형태와 기능을 재현할 수 있었야 한다. 오가노이드는 1957년 Etienne Y.에 의해 만들어졌으며, 2009년 Hans Clevers 연구팀은 3D 배양을 통한 보다 정교한 구조의 장 오가노이드를 개발하였고 네이처(Nature)지에 이 연구가 실리게 되면서 오가노이드를 통한 암 연구 및 세포 연구가 활발하게 되었다. 현재는 간, 췌장, 심장 등 주요 장기뿐만 아니라 모낭, 침샘, 혈관 등 다양한 조직에 대한 오가노이드 제작법이 확인된 상황이다.
오가노이드는 크게 2가지 방법으로 제작할 수 있는데, 첫 번째는 줄기세포의 장기 생성 능력과 재생 능력을 활용하는 것이고, 두 번째는 장기를 구성하는 세포와 성분을 3차원으로 구현하여 실제 조직과 유사하게 배열하는 것이다. 줄기세포를 활용한 오가노이드는 미세하고 복잡한 구조 구현이 가능하다는 장점이 있으나, 줄기세포로부터 장기가 형성되는 과정이 밝혀져 있어야 하고 이를 조절할 수 있는 방법이 필요하다는 한계가 있다. 3차원 구현 기술을 활용한 오가노이드는 원하는 모양으로 제작이 가능하고, 이미 만들어진 주형을 활용, 재현함이 용이한 장점이 있으나, 실제 장기의 복잡한 세포 구성과 구조 모사에 한계가 존재한다.
오가노이드는 일반적으로 신약개발, 인공장기 개발 및 질병치료에 활용될 수 있다. 새로운 약물을 발견하는데 오가노이드를 사용하여 실험이 가능하고, 장기적으로는 조직(장기)을 대체할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 또한, 오가노이드는 질병치료를 위한 환자별 모델을 제공할 수 있다. 또한, 종양 오가노이드는 암의 개인별 맞춤의학을 위한 용도로 활용될 수 있고, 동일한 환자의 암세포와 정상세포와의 비교를 통한 암의 신속한 평가를 가능하게 하며, 면역항암제 분야에 활용 가능하다.
한편, 한국등록특허 제2120378호에는 암 세포와 신경능선 세포(neural crest cell)를 공배양(co-culture)하는 단계를 포함하는 '암 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2021-0077726호에는 콜라겐 I 동종삼량체의 존재하에 1차 조직을 배양함으로서 1차 조직으로부터 오가노이드의 생성을 증진시키는 '종양 오가노이드를 생성하기 위한 조성물 및 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '두경부암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 환자 유래 두경부암 오가노이드 제조를 위해 기존 문헌(Cancer Discov. 2019, 9(7):852-871)에서 제시한 조건 그대로 오가노이드 형성 실험을 수행한 결과, 정상 세포에서는 오가노이드가 형성되었으나, 암 조직 유래 세포에서는 오가노이드 생성이 전혀 이루어지지 않는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자는 기존 두경부암 오가노이드 제조용 조성물의 성분을 가감하여 두경부암 오가노이드 제조를 위한 새로운 배지 조성을 확립하였으며, 새롭게 제조한 배지를 이용하여 오가노이드 형성 실험을 수행한 결과, 정상 세포 및 암 유래 세포 모두에서 오가노이드가 잘 생성되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 혈청 대체제, 글루타민 대체제, 간세포성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF), 종양증식인자-베타 (transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 억제제, 섬유아세포성장인자-10 (fibroblast growth factor 10, FGF10), 염기성 섬유아세포성장인자 (bFGF), 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2, PGE2), R-spondin 및 골형성단백질 (bone morphogenetic protein, BMP) 신호전달 억제제로 이루어진, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid) 형성 또는 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 두경부암 환자로부터 분리된 두경부암 조직을 용해하여 얻은 세포와 세포배양 기질을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 혼합물에 상기 두경부암 오가노이드 형성용 배지를 첨가하여 배양하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid)의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 환자 유래 두경부암 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 오가노이드 또는 동물 모델에 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 항암제의 치료 효능 분석 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 오가노이드 또는 동물 모델에 항암제 후보 물질을 투여하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성 또는 제조용 조성물은 낮은 두경부암 오가노이드 제조 효율을 보인 기존 배지 조성을 최적화한 것으로, 본 발명의 조성물을 이용하면 높은 수율로 두경부암 오가노이드를 제조할 수 있다.
난치성 두경부암 환자의 경우 환자 맞춤 치료를 위한 치료제 스크리닝 시스템이 확보되지 못하여 예후가 나쁜 경우가 많다. 또한, 난치성 두경부암 환자를 위한 신약개발 시험을 위한 시스템도 확보되어 있지 못한 상황이다. 따라서, 본 발명의 조성물을 이용하여 제작된 환자 맞춤형 두경부암 오가노이드는 환자 개인의 질환 특성에 맞는 치료, 질병 기전 연구 및 신규한 두경부암 치료제 개발을 위한 모델로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 환자 유래 두경부암 오가노이드 제조 방법의 모식도이다.
도 2는 정상 편도 조직(좌) 및 두경부암 유래 조직(우)을 이용하여 기존 문헌(Cancer Discov. 2019, 9(7):852-871)의 배지 조건으로 오가노이드를 제조한 결과이다. scale bar: 100㎛.
도 3은 기존 문헌의 배지 조건(좌) 또는 본 발명의 배지 조건(우)을 이용하여 형성된 두경부암 오가노이드의 모습을 보여주는 사진이다. scale bar: 100㎛.
도 4는 정상 조직을 대상으로 본 발명의 배지 조건을 이용하여 제조된 오가노이드의 모습이다. scale bar: 100㎛, P숫자: passage 넘버를 의미한다.
도 5는 두경부암 조직을 대상으로 본 발명의 배지 조건을 이용하여 제조된 암 오가노이드의 모습이다. scale bar: 100㎛.
도 6은 본 발명의 배지 조건을 이용하여 제조된 두경부암 오가노이드와 암 조직의 H&E 및 면역염색 결과이다. Ki67: 다양한 암에서 발견되는 세포증식인자, ALDH1A1 및 CD44: 두경부암의 줄기세포 마커.
도 7은 본 발명에서 제조한 두경부암 오가노이드를 이용한 항암제(시스플라틴)의 항암 효과 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈청 대체제, 글루타민 대체제, 간세포성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF), 종양증식인자-베타 (transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 억제제, 섬유아세포성장인자-10 (fibroblast growth factor 10, FGF10), 염기성 섬유아세포성장인자 (bFGF), 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2, PGE2), R-spondin 및 골형성단백질 (bone morphogenetic protein, BMP) 신호전달 억제제로 이루어진, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid) 형성 또는 제조용 조성물을 제공한다.
본 명세서 내 "암 조직" 및 "암 세포"는 "종양 조직" 및 "종양 세포"와 동일한 개념으로 사용된다. 용어 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 상기 암은 바람직하게는 두경부암(Head and neck cancer)일 수 있다.
"두경부암"은 코, 부비동, 구강, 안면, 후두, 인두, 침샘, 갑상선 등에 발생한 모든 종류의 악성종양을 말한다. 발생한 위치에 따라 구강암(oral cancer), 후두암(larynx cancer), 인두암(pharynx cancer), 침샘암(salivary gland tumor), 갑상선암(thyroid cancer), 비부비동암(nasal cavity cancer) 등으로 나눌 수 있다.
본 발명의 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 조성물은 바람직하게는, 1X의 혈청 대체제, 1.5~2.5 mM의 글루타민 대체제, 40~60 ng/㎖의 HGF, 15~25 nM의 TGF-β 신호전달 억제제, 5~15 ng/㎖의 FGF10, 3~7 ng/㎖의 bFGF, 0.5~1.5 μM의 PGE2, 0.5~1.5 ㎍/㎖의 R-spondin 및 90~110 ng/㎖의 BMP 신호전달 억제제를 함유하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1X의 혈청 대체제, 1.8~2.2 mM의 글루타민 대체제, 45~55 ng/㎖의 HGF, 18~22 nM의 TGF-β 신호전달 억제제, 8~12 ng/㎖의 FGF10, 4~6 ng/㎖의 bFGF, 0.8~1.2 μM의 PGE2, 0.8~1.2 ㎍/㎖의 R-spondin 및 95~105 ng/㎖의 BMP 신호전달 억제제를 함유하는 것일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 1X의 혈청 대체제, 2.0 mM의 글루타민 대체제, 50 ng/㎖의 HGF, 20 nM의 TGF-β 신호전달 억제제, 10 ng/㎖의 FGF10, 5 ng/㎖의 bFGF, 1 μM의 PGE2, 1 ㎍/㎖의 R-spondin 및 100 ng/㎖의 BMP 신호전달 억제제를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 혈청 대체제는 B27 보충물 (B27 supplement)이며, 글루타민 대체제는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드 (L-alanyl-L-glutamine dipeptide; 제품명 GlutaMax)이며, 상기 TGF-β 신호전달 억제제는 3-(6-메틸피리딘-2-닐)-N-페닐-4-(퀴놀린-4-닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드 [3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-(quinolin-4-yl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide; A83-01]이며, 상기 BMP 신호전달 억제제는 노긴 (Noggin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 조성물을 포함하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 배지를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 배지는 항생물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 항생물질은 이에 한정되는 것은 아니나, 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), P/S(Penicillin/Streptomyci), 암피실린(ampicillin) 또는 세팔로스포린(cephalosporin)일 수 있고, 바람직하게는 P/S 일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 배지는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12), RPMI 1640, 윌리암 배지 E(Williams' s medium E), 맥코이 5A(McCoy' s 5A) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배양 배지를 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
(a) 두경부암 환자로부터 분리된 두경부암 조직을 용해하여 얻은 세포와 세포배양 기질을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 혼합물에 상기 두경부암 오가노이드 형성용 배지를 첨가하여 배양하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid)의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포배양 기질은 마트리겔(matrigel)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 오가노이드 배양을 위해 당업계에 사용되는 세포배양 기질이라면 제한없이 사용가능하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 세포와 마트리겔의 혼합비율은 바람직하게는 1:8~10의 중량비일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:9의 중량비일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "마트리겔"은 EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience사의 제품명), 라미닌, 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (heparin sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스 (extracellular matrix, ECM)를 함유한다. 마트리겔을 이루고 있는 복합체는 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포외 환경을 제공함으로써, 세포배양을 위한 기질로 이용되고 있다.
또한, 본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 배양 단계는 세포배양 기질이 첨가된 웰 플레이트의 각 웰에서 세포가 3차원 형태로 형성될 때까지 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 오가노이드는 3차원 구(sphere) 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 '용해'는 두경부암 환자로부터 분리된 두경부암 조직을 수술용 메스 등으로 잘개 자른 후, 효소 처리에 의해 세포 단위로 용해시킨 것일 수 있다. 상기 효소는 바람직하게는 트립신 (trypsin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 환자 유래 두경부암 오가노이드를 제공한다.
본 명세서에서 "오가노이드"는 줄기세포나 장기세포에서 분리한 세포를 배양하거나 재조합해서 만든 미니장기로서, 본 발명에서는 두경부암 환자로부터 분리한 조직을 세포화한 후, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 배양함으로써, 환자 유래 두경부암 오가노이드를 제조하였다. 본 발명에 따른 두경부암 오가노이드는 두경부암 환자로부터 채취한 암 조직 일부를 3차원 배양한 것으로서, 구축된 환자 유래 두경부암 오가노이드 라인을 보관하거나, 지속적으로 배양하여 대량 제작할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 환자 유래 두경부암 오가노이드는 특정 환자의 암 동향을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 환자 유래 두경부암 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델을 제공한다.
본 발명에 따른 이종이식 동물모델은 환자의 암 조직에 특징적인 조직학적 특성이 유지될 수 있으며, 종래 환자 유래 암 이식모델의 문제점으로 지적되었던 낮은 생체 이식률, 이식 소요 시간이 오래 걸리는 점, 이식에 상대적으로 많은 양의 암 조직이 필요한 점 등의 문제점을 보완하였는바, 특정 환자의 암 동향을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이종이식(xenograft)"은 종이 다른 동물의 기관이나 조직, 세포 등을 이식하는 방법을 말한다.
본 명세서에서 상기 "동물 모델"은 질환 동물 모델을 의미한다. 구체적으로, 동물 모델은 인간의 질병과 유사한 상태의 질병에 걸리거나 선천적으로 그 질병에 걸리도록 만들어낸 동물 모델일 수 있다. 본 발명에서 상기 동물 모델은 두경부암의 동물 모델일 수 있다. 또한, 본 발명의 두경부암 동물 모델로 이용될 수 있는 동물은 인간을 제외한 포유 동물로, 예를 들면, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 환자 유래 두경부암 오가노이드 또는 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 항암제의 치료 효능 분석 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로,
(a) 본 발명에 따른 환자 유래 두경부암 오가노이드 또는 상기 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에 항암제를 투여하는 단계; 및
(b) 상기 오가노이드 또는 동물 모델에서 두경부암 세포의 성장 또는 전이를 분석하여 항암제의 치료 효능을 결정하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 치료 효능 분석 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 항암제의 치료 효능은 암의 종류에 따라 관련 유전자의 발현 정도 또는 미세 혈관 밀도를 측정하여 항암제의 치료 효능을 분석할 수 있으며, 암 세포의 성장 또는 전이는 육안으로 관찰하거나 또는 캘리퍼스와 같은 도구를 이용하여 측정할 수 있다. 따라서, 암 세포의 추가적인 성장 또는 전이가 억제되는 경우, 분석대상의 항암제는 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 환자 유래 두경부암 오가노이드 또는 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에 항암제 후보 물질을 투여하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로,
(a) 본 발명에 따른 환자 유래 두경부암 오가노이드 또는 상기 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에 항암제 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(b) 상기 오가노이드 또는 동물 모델에서 두경부암 세포의 성장 또는 전이를 분석하여 항암제 후보물질의 치료 효능을 결정하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 스크리닝 방법은 우선, 본 발명에서 제공하는 환자 유래 두경부암 오가노이드 또는 상기 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에 항암제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항암제 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 동물 모델에 항암제 후보 물질을 처리하는 경우 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 등을 통해 투여할 수 있으나, 동물 모델의 종류에 따라 적절한 방법으로 선택하여 투여할 수 있다.
본 발명에서는 상기 후보 물질을 처리한 환자 유래 두경부암 오가노이드 또는 상기 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델에서 두경부암 관련 바이오마커의 발현 수준의 변화를 확인하거나, 혹은 암 세포의 증식, 성장, 침윤성 또는 전이성의 변화를 관찰하거나 또는 캘리퍼스(calipers)와 같은 도구를 이용하여 측정하는 단계를 수행하여 항암제 후보 물질의 효능을 평가할 수 있다. 예컨대, 상기 후보 물질에 의하여 두경부암 조직에서 발현 수준이 감소 또는 증가된 바이오마커의 발현 수준이 증가 또는 감소하였거나, 암 세포의 증식, 성장, 침윤성 또는 전이성 등이 감소한 경우 상기 후보 물질을 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다. 또는 상기 후보 물질에 의하여 암의 발병이 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 상기 후보 물질을 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 인체 유래 시료 및 시약
본 발명은 충남대학교 병원 IRB(Institutional Review Board)로부터 승인을 받아 실험을 진행하였다(IRB 승인번호: 2019-07-041-007). 또한, 본 발명에서 사용된 인체 시료는 충남대 병원 내 인체자원은행에서 모든 환자들로부터 동의서를 받은 후 사용하였다.
오가노이드 배양을 위해 본 발명에 사용된 시약은 하기와 같다: DMEM/F12 (Welgene, cat no. LM 002-08), Glutamax (Gibco, cat no. 35050), B27 supplement (Gibco, cat no. 17504-044), P/S (HyClone, cat no. SV30010), HGF (R&D systems, cat no. 294-HG), A83-01 (Tocris, cat no. 2939), FGF10 (Peprotech, cat no. 100-26), bFGF (R&D systems, cat no. 233-FB-010), Prostaglandin E2 (Tocris, cat no. 2296), R-spondin (Peprotech, cat no. 120-38), Noggin (R&D systems, cat no. 6057-NG).
실시예 1. 두경부암 오가노이드의 제작을 위한 배지 조건화
본 발명자는 두경부암 오가노이드 제작을 위해, 먼저 정상 조직(편도 조직)을 이용하여 기존 문헌들(Shah AT et al., PLoS ONE 2017, 12(1):e0170415; Maimets M et al., Stem Cell Reports. 2016, 6(1):150-62; Tanaka N et al., Oral Oncology 2018, 87:49-57; Clevers H et al., Cancer Discov. 2019, 9(7):852-871)에 개시된 배지 조성을 이용하여 오가노이드 형성 유무를 확인하였다. 그 결과, 하기 표 1의 배지 조성이 다른 배지 조성들에 비해 오가노이드 형성율이 우수한 것을 확인하였다. 그 후, 선택된 배지 조성을 이용하여 환자 유래 두경부암 조직으로 오가노이드 제작을 시도하였다.
실험은 정상 편도 조직과 두경부암(laryngeal, pharyngeal, oral cancer) 유래 조직을 사용하였다. 각 조직은 PBS 용액으로 세척한 후, 멸균된 디쉬 위에 올려놓고 수술용 메스를 이용하여 3~5 mm3 크기로 잘개 자른 후 단일 세포로 용해시키기 위해 효소(트립신) 반응을 수행하였다. 트립신 처리는 상기 잘개 자른 조직을 50㎖ 튜브로 옮기고 1X GlutaMax와 1X P/S을 포함하는 DMEM/F12 배지와 섞어준 후 트립신-EDTA(Welgene, cat no. LS015-10)를 최종 농도 0.125%가 되도록 추가한 뒤 37℃ 진탕배양기에서 100 rpm의 속도로 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 70㎛ 스트레이너(strainer)로 상기 반응물을 여과하여 용해되지 않은 조직 등을 제거하였다. 그 후, 적혈구를 제거하기 위해 상기 여과물에 Red Blood Cell lysis buffer(Roche, cat no. 11814389001)를 제조사의 지침에 따라 처리한 후, 4℃, 1,500 rpm, 5분 조건으로 원심분리를 수행하였다. 그 후 상층액은 제거하고 세포 펠렛을 1X GlutaMax와 1X P/S을 포함하는 DMEM/F12 배지로 현탁하여 세척한 후 원심분리하여 세포 펠렛을 획득하였다. 상기 세포 펠렛은 1X GlutaMax와 1X P/S을 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 현탁한 후, 마트리겔(Corning, cat no. 354250)과 혼합하였다. 마트리겔은 세포와 혼합하기 전 얼음에 올려 시원하게 만든 후 사용하였으며, 세포 현탁액과 마트리겔의 혼합 비율은 중량비로 1:9가 되도록 하였다. 세포가 혼합된 마트리겔을 Nunc™ 4-Well Dishes의 각 웰에 올리고 37℃에서 30분간 고형화시킨 후, 표 1에 개시된 조성으로 제조된 배지 500㎕를 추가한 후 37℃에서 배양하였다. 3일 간격으로 새로운 배지로 교체해주었다(도 1).
기존 문헌의 배지 조성
기존 문헌의 배지 조건
(Cancer Discov. 2019, 9(7):852-871)
Reagent Final conc.
DMEM/F12
Glutamax 1X
penicillin/streptomycin 1X
HEPES 0.01 M
B27 1X
N-acetyl-l-cysteine 1.25 mM
Nicotinamide 10 mM
EGF 50 ng/㎖
A83-01 500 nM
hFGF2 5 ng/㎖
hFGF10 10 ng/㎖
CHIR99021 3 μM
Forskolin 1 μM
Prostaglandin E2 1 μM
R-spondin 4%
Noggin 100 ng/㎖
그 결과, 정상 편도 조직을 이용한 경우 오가노이드가 잘 생성되었으나(도 2 좌측), 두경부암 유래 조직을 이용한 경우 오가노이드가 일정 크기 이상 형성되지 않는 것을 알 수 있었다(도 2 우측). 또한, 상기 표 1에서 R-spondin은 조정배지(conditioned media)를 통해 준비하였는데, 만들 때마다 농도가 상이할 수 있었고, 이에 첨가 농도를 4%에서 30%까지 높여서 오가노이드 제작 실험을 진행해 보았으나, 두경부암 세포의 크기만 어느정도 자랄 뿐 정상적인 오가노이드 사이즈(직경 50 ㎛ 이상)까지 자라지 않는 것이 관찰되었다.
이에, 본 발명자는 두경부암 조직 세포로부터 두경부암 오가노이드를 잘 형성할 수 있는 배지 조건을 새롭게 확립하였다. 특히, 오가노이드 제조를 위해 필수적인 R-spondin의 농도를 일정하게 하고자 재조합 R-spondin을 사용하였다. 새롭게 조성한 배지 조건은 DMEM/F12 배지에 Glutamax, B27 supplement를 포함하며, HGF, A83-01, FGF10, bFGF, Prostaglandin E2, R-spondin 및 Noggin을 함유하도록 제조하였다(표 2).
본 발명의 배지 조성
본 발명의 배지 조성
Reagent Final conc.
DMEM/F12
Glutamax (Gibco™) 1X(2mM)
penicillin/streptomycin 1X
B27 1X
HGF 50 ng/㎖
A83-01 20 nM
FGF10 10 ng/㎖
bFGF 5 ng/㎖
Prostaglandin E2 1 μM
R-spondin 1 ㎍/㎖
Noggin 100 ng/㎖
본 발명자는 동일한 두경부암[tongue cancer(oral cancer)] 유래 조직을 사용하여 전술한 것과 동일한 방법으로 오가노이드 배양을 시도하였으며, 세포와 혼합된 고형화된 마트리겔에 각각 표 1과 표 2의 조성으로 제조된 배지를 처리하여 배지 조성에 따른 두경부암 오가노이드 형성 차이를 비교해보았다. 그 결과, 도 3에 개시된 것과 같이, 기존 문헌에 개시된 배지 조성(표 1)을 이용한 조건보다 본 발명의 배지 조성을 이용한 실험군에서 두경부암 오가노이드 형성이 현저히 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 본 발명의 배지 조건을 이용한 두경부암 오가노이드 제조 효율 분석
본 발명자는 상기 표 2의 조성으로 제조된 배지를 이용하여 다양한 두경부암 조직을 이용하여 오가노이드 배양 여부를 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 배지 조건을 이용한 경우 36%의 성공률로 두경부암 오가노이드가 잘 형성되는 것을 알 수 있었다(표 3 및 표 4). 대부분의 시료에서 배양 후 5~6일부터 오가노이드 형성이 시작되는 것이 관찰되었으며, 배양 후 14일 전후로 완전한 오가노이드로 성장되는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조건은 정상 세포 및 두경부암 세포 모두에서 오가노이드가 잘 형성되었다(도 4 및 도 5). 형성된 오가노이드는 비정형(irregular), 빽빽한(dense) 형태 또는 낭포성(cystic)의 형태학적 특징을 보여주었다.
두경부암 오가노이드 배양에 사용된 시료 정보
Date Name M/F Number Age Type Subtype Process
200417 이** M 01777003 64 Supraglottic cancer Laryngeal P2
200422 안** M 00528742 77 Tongue cancer Oral fail
200513 이** M 01332096 84 Glottic cancer Laryngeal P6
200605 김** M 01785279 51 Pharynx cancer Pharyngeal fail
200710 박** F 00487841 74 Supraglottic cancer Laryngeal P2
200722 조** M 00442013 87 RMT cancer(recur) Oral P3
200724 곽** M 01794164 65 Glottic cancer Laryngeal fail
200729 유** M 01786621 57 Hypopharynx cancer Pharyngeal fail
200902 정** M 00251090 66 Larynx cancer Laryngeal P2
201125 조** M 01824950 77 Supraglottic cancer Laryngeal P5
201218 임** M 00582534 88 Glottic cancer Laryngeal P1
201218 김** M 00951461 39 Oral cancer Oral fail
210108 이** M 01394715 64 Glottic cacner (recur) Laryngeal fail
210113 김** M 01129865 79 Oral cancer (recur) Oral P5
210113 홍** M 01008044 77 Oropharynx cancer Pharyngeal P2
210121 황** F 00848943 20 Tongue cancer Oral P1
210203 김** M 00718997 76 Glottic cancer Laryngeal fail
210205 장** M 01845692 69 Supraglottic cancer Laryngeal P5
210205 박** M 01831730 53 Tongue cancer Oral fail
210205 김** M 01641723 83 Supraglottic cancer (recur) Laryngeal fail
210210 조** M 01573009 76 Supraglottic cancer Laryngeal P3
210317 김** M 01853532 61 Hypopharynx cancer Pharyngeal P2
M/F: male/female, Process: 오가노이드 성공 여부, P숫자: passage 횟수
두경부암 오가노이드 배양 성공률
Cancer subtype Formation rate Success rate
Laryngeal 67% (8/12) 42% (5/12)
Pharyngeal 50% (2/4) 25% (1/4)
Oral 50% (3/6) 33% (2/6)
Total 59% (13/22) 36% (8/22)
Formation rate: 세포를 마트리겔과 함께 seeding 후 오가노이드 형태가 생성됨.
Success rate: 오가노이드 형태 생성 후 계대배양이 지속적으로 이루어짐(계대 2회 이상).
본 발명자는 제조된 두경부암 오가노이드에 대해서 조직 염색을 진행하였다. 간단하게, 조직 염색은 Trevigen technical tips (https://trevigen.com/helpful-resources/technical-tips/)에 공지된 방법을 참고하여 수행하였다. 간단하게, 오가노이드를 PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 20%(w/v) 수크로스 용액으로 동결보존한 뒤 OCT(optimal cutting temperature) 용액으로 포매(embedding)한 후 -80℃에서 동결시켰다. 그 후, 5μm 두께로 cyosection을 진행하고, 각 박편은 UltraVision Quanto Detection System HRP를 이용하여 IHC (immunohistochemistry)를 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 배지 조성을 이용하여 배양된 두경부암 오가노이드는 유래된 암 조직과 분자 마커 발현 특성이 유사한 것을 알 수 있었다(도 6).
실시예 3. 제작된 두경부암 오가노이드를 이용한 항암제 효과 검증
본 발명의 배지 조성(표 2)를 이용하여 배양된 두 개의 환자 유래 두경부암 오가노이드(#65: oral cancer 및 #92: laryngeal cancer)에 시스플라틴을 처리하여 항암 효과를 분석하였다. 배양 5~6일째의 두경부암 오가노이드를 회수하여 트립신 처리로 단일 세포화한 후, 세포수를 계수하여 동일한 세포수로 유래가 동일한 오가노이드를 배양하였다. 그 후, 시스플라틴을 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 Log (각각 5, 25, 50 및 100 μM)로 각각 처리하였으며, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay 키트(Promega, cat no. G968A)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 세포 생존율을 분석하였다.
그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 시스플라틴 처리 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소되는 것이 확인되어, 본 발명에서 제조한 두경부암 오가노이드가 항암제의 효과를 검증할 수 있는 모델로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (10)

  1. 혈청 대체제, 글루타민 대체제, 간세포성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF), 종양증식인자-베타 (transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 억제제, 섬유아세포성장인자-10 (fibroblast growth factor 10, FGF10), 염기성 섬유아세포성장인자 (bFGF), 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2, PGE2), R-spondin 및 골형성단백질 (bone morphogenetic protein, BMP) 신호전달 억제제로 이루어진, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid) 형성용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 1X의 혈청 대체제, 1.5~2.5 mM의 글루타민 대체제, 40~60 ng/㎖의 HGF, 15~25 nM의 TGF-β 신호전달 억제제, 5~15 ng/㎖의 FGF10, 3~7 ng/㎖의 bFGF, 0.5~1.5 μM의 PGE2, 0.5~1.5 ㎍/㎖의 R-spondin 및 90~110 ng/㎖의 BMP 신호전달 억제제를 함유하는 것을 특징으로 하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혈청 대체제는 B27 보충물 (B27 supplement)이며, 글루타민 대체제는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드 (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)이며, 상기 TGF-β 신호전달 억제제는 3-(6-메틸피리딘-2-닐)-N-페닐-4-(퀴놀린-4-닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드 [3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-(quinolin-4-yl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide]이며, 상기 BMP 신호전달 억제제는 노긴 (Noggin)인 것을 특징으로 하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드 형성용 배지.
  5. (a) 두경부암 환자로부터 분리된 두경부암 조직을 용해하여 얻은 세포와 세포배양 기질을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 혼합물에 제4항의 배지를 첨가하여 배양하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드(organoid)의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포배양 기질은 마트리겔(matrigel)인 것을 특징으로 하는, 환자 유래 두경부암 오가노이드의 제조 방법.
  7. 제5항의 방법으로 제조된 환자 유래 두경부암 오가노이드.
  8. 제7항의 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델.
  9. 제7항의 오가노이드 또는 제8항의 동물 모델에 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 항암제의 치료 효능 분석 방법.
  10. 제7항의 오가노이드 또는 제8항의 동물 모델에 항암제 후보 물질을 투여하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
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