JP2022525616A - 細胞サンプルの評価のための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年3月19日に出願された米国仮特許出願62/820,719号の利益を主張するものであり、それは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、動物、好ましくは、ヒトまたは非ヒトを含む哺乳動物を意味するために使用される。患者、被験体、個体という用語は、交換可能に使用される。これらの用語のいずれも、医療専門家(例えば、医者、看護師、医師助手、看護助手、ホスピスワーカー)の監督を必要とするものであるとは解釈されない。
本明細書に開示されるのは、ある実施形態で、細胞サンプル上での1以上の候補分子の長期間の評価のための方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、1以上の候補化合物を細胞サンプルに投与する工程と、1以上の候補分子の存在下で、細胞サンプルを少なくとも5日間培養する工程と、複数の候補分子の1つに対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、1以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、少なくとも25日間、少なくとも30日間、またはそれ以上培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも5日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも6日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも7日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも8日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも10日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも12日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも15日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも16日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも20日間培養される。
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞サンプル上での1以上の候補分子の長期間の評価のための方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、1以上の候補分子を細胞サンプルに投与する工程と、細胞サンプルを培養する工程と、1以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程と、投与する工程、培養する工程、および評価する工程を、同じ1以上の候補分子または1以上の追加的候補分子の第2の用量で繰り返す工程と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、1以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する前に、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも24時間、またはそれ以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも12時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、反応を評価する前に、少なくとも24時間培養される。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、1以上の候補分子に対する細胞サンプル(例えば細胞)の反応を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、1以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価する工程は、細胞サンプルを破壊すること(例えば、溶解、透過処理、固定等)を含まない。いくつかの実施形態では、反応は、1以上の候補分子への曝露に対する反応である、1以上の細胞条件の変化である。いくつかの実施形態では、反応は、例えば、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である。いくつかの実施形態では、反応は生存率反応である。いくつかの実施形態では、反応は、1以上の候補分子への曝露に対する反応である、細胞の生存率の変化である。
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態で、細胞の生存率を計測する方法である。いくつかの実施形態では、開示された方法は、細胞サンプルが存在しない状態で、細胞の生存率を計測する工程を含む。いくつかの実施形態では、開示された方法は、細胞培養培地で細胞サンプル(例えば細胞)を培養する工程と、細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、細胞サンプルが存在しない状態で代謝産物を計測する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、代謝産物を計測する工程は、代謝産物を励起させること、および結果として生じた螢光を計測すること(例えば蛍光強度および波長を計測すること)とを含む。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、1以上の細胞サンプルの使用を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、1以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍の微小環境からの細胞を含む。腫瘍組織の微小環境からの細胞の例は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、および骨髄由来細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球細胞または骨髄球系細胞である。リンパ球細胞の例としては、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。骨髄球系細胞の例としては、マクロファージ、組織常在性単球(例えばミクログリア細胞)、単球由来抑制細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、および樹状細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、組織サンプルである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍組織に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、被験体(例えば被験体からの組織)に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドである。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、オルガノイドに由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、一次組織(例えば原発性腫瘍組織)に由来する。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、患者由来の異種移植片(PDX)に由来する。いくつかの実施形態では、患者由来(例えば原発性腫瘍組織または患者由来の異種移植片から)の細胞サンプルの使用は、候補分子に対する患者に特異的な反応の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、単一タイプの細胞(例えば癌細胞)を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、複数タイプの細胞(例えば癌細胞、および腫瘍の微小環境からの細胞)を含む。いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、原発性腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、請求項1に記載で、ここで、細胞サンプルは転移性腫瘍サンプルからのものである。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、1以上の候補分子を評価する工程を含む。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、癌治療薬である。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬であるとされる化合物である。いくつかの実施形態では、候補分子は、治療薬ではない。いくつかの実施形態では、候補分子は、細胞サンプルからの反応を引き出すことができるとされる分子である。
いくつかの実施形態では、開示された方法は、1以上の生物アッセイを細胞サンプル上で実行する工程を含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、1以上の候補分子に対する細胞サンプルの反応を評価した後に、細胞サンプル上で実行される。例えば、候補分子が細胞サンプルに提供され、細胞サンプルは候補分子の存在下で少なくとも5日間培養され、細胞サンプルの生存率反応が評価され、そして、生物アッセイが続いて実行される。いくつかの実施形態では、細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程は、細胞サンプルの細胞を破壊すること(例えば、溶解、透過処理、固定等)含む。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、候補分子の長期間の評価の後に、細胞サンプル上で実行される。いくつかの実施形態では、生物アッセイは、候補分子の長期的な評価の後に、細胞サンプル上で実行される。
エクスビボで20日を超えて、無傷の腫瘍組織の継続的成長を可能にするスライス培養システムを開発した。最適培養条件の開発において4つのパラメータをテストし、そこには、5つの培養培地条件、4つの異なる生存率アッセイ、3つの異なる培養条件、および5つの異なる腫瘍サイズが含まれる。これらのパラメータと最終培養条件が、表1に示される。
患者由来の異種移植片
初期継代(P0-P1)の患者由来の異種移植片(PDX)をJax-Westから取得し、そして月齢2-3ヵ月のメスのNSGマウス(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ;株:005557)、NSG-Hprtマウス(NOD.Cg-Prkdcscid Hprtem1Mvw Il2rgtm1Wjl/MvwJ;株:026222)、またはNGS-EGFPマウス(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ;株:021937)で増やした。2つの三種陰性乳癌(TNBC)サンプル、5つの多形神経膠芽腫(GBM)サンプル、3つの膵臓癌サンプル、および3つの結腸癌サンプルをテストした。GBMとTNBCのモデルを、脳または4番目の乳房の脂肪パッドにそれぞれ注入することによって、同所的にそれらを増やした。膵臓腫瘍モデルと結腸腫瘍モデルを、皮下に注射して増殖させた。
腫瘍が500-1000mm3に達した時に、腫瘍組織を回収した。サンプルを、KREB緩衝液またはリン酸緩理食塩水(PBS)中で、4%の低融点アガロース(Bio-Rad(登録商標))に埋め込み、Vibratome VT1200S(Leica Microsystems)を使用して250-350μMの厚さのスライスに精密にカットした。スライス速度と大きさは、腫瘍組織の密度と完全性によって調節した。1mm、2mm、または3mmの直径の組織を、生検針を使用して、壊死領域を回避して、腫瘍含有領域から生成した。各スライスパンチを、1mlまたは0.2mlの無血清スライス培養培地(スライス培地:DMEM/F-12(Hyclone(登録商標))、B27サプリメント(Gibco(登録商標))、100U/mLのペニシリン(Gibco(登録商標))、および100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco(登録商標))を使用して、12ウェルまたは48ウェルの培養皿の、薄い多孔質膜(Nucleopore(商標)Track-Etched-Whatman(登録商標))上で培養した。
5μlのCell-Titer Blue(CTB)(Promega(登録商標))基質を、1mlの培養培地に添加し、そして37°Cで15時間または24時間インキュベートした。100μlの培地を、各サンプル培養物から取り出し、そしてEnspire(登録商標) multimode plate reader (Perkin Elmer(登録商標))を使用して、蛍光を計測した(Ex560/Em590)。培養培地の背景蛍光は、毎日、各サンプルの読み取り値から差し引いた。CTB読み取り直後に培地を変更し、そして、新規培地に薬物を添加して、培養を継続した。望ましい時点で、追加的な生存率計測を行って長期的データを収集し、そして、馴化培地を収集して分析した。最終時点後、組織を、ホルマリン中に固定して、組織学的分析用にパラフィンまたはOCTに埋め込むか、あるいは、RIPA緩衝液またはトリゾール中に溶解させ、そして、馴化培地を冷凍する。各スライスパンチの組織組成におけるばらつきを考慮して、各サンプルの生存率読み取り値を、スライス直後のCTB読み取り値(0日目エクスビボ:1 dex CTB読み取り値)にそれぞれ正規化し、そして、各時点におけるCTB計測値の相対的な倍率変化を分析した。
脳、乳房、結腸、および膵臓からの12の異なるPDXモデルにおいて、13の薬物を、単独でまたは放射線との組み合わせでテストした(表2)。テストした組み合わせとしては、プロカルバジン、ロムスチン、およびビンクリスチン(「PCV」)と5FU、ロイコボリン、イリノテカン、およびOXP(「FLCO」)が挙げられた。
組織学分析と免疫組織化学法
ホルマリン固定組織部分、パラフィン-またはOCT-包埋の組織部分を、組織学的評価用に、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色した。増殖に関する特定のマーカー(KI67:Abcam(登録商標)、ab15580、1:300)と、アポトーシスに関する特定のマーカー(切断型カスパーゼ3:Cell Signaling(登録商標)、#9661、1:300)とを、標準免疫組織化学法分析プロトコルを使用して分析した。加えて、ヒトに特異的な抗体(HuNu:EMD Millipore(登録商標)、MAB1281、(クローン235-1)、1:300)を使用することによって、PDX腫瘍がヒト起源のものであることをも確認した。
腫瘍間および腫瘍内の異質性は、薬物反応と薬物耐性の出現に重大な役割を果たす。ちょうど、異なる患者が同じ薬物に対して異なる反応を呈するように、異なるPDXモデルは、同じ薬物に対して示差的感受性を示すことが見込まれる。スライス培養システムが異なるPDXモデルの示差的な薬物感受性を報告できるか否かをテストするために、同じ臨床タイプの別個の腫瘍の処置反応を比較した。例えば、2つの異なる結腸PDX腫瘍を、標準ケア剤オキサリプラチン(OXP)と5-フルオロウラシル(5FU)で処置し、そして、両方の結腸腫瘍モデルは、OXPと5FUに対して異なる反応を呈した(図3Aと図3B)。生存率読み取り値に基づいて、100uMのOXPは、CN0458結腸腫瘍スライスと比較して、CNSTG結腸腫瘍スライスの生存率を抑えるのにより効果的であり、一方で、100uMの5FUは、CNSTG結腸腫瘍スライスと比較して、CN0458腫瘍スライスの生存率を抑えるのにより効果的である(図3Aと図3B)。
FDA認可の腫瘍薬物は100を超えるが、臨床の場における特定の腫瘍タイプの処置のための標準ケアとして使用される薬物の数は、全ての入手可能な薬物の内のほんの一部である。個々の患者の限られた量の腫瘍組織で、偏り無い薬物有効性スクリーンを実施するために、本明細書に記載されたエクスビボスライス培養システムに変更を加えて、高含有量薬物スクリーニングを実施した。119のFDA認可の腫瘍薬物を含む認可腫瘍薬物セットVIを、国立癌研究所(NCI)から取得した。PDX腫瘍スライスを、実施例1に記載されるように取得し、そして直径2mmの腫瘍スライスパンチを96のウェルプレートに播種し、そして200ulのTSC培地に浸した。1日目と3日目に、生存率を、実施例1に記載されるように長期的なCell-Titer Blue (CTB)生存率アッセイを使用して計測し、そして、1日目に、培地を、CTB計測後に交換した。薬物を、1日目に、100μMの最終濃度で添加した。3日目(つまり2日の薬物曝露)のサンプルの生存率読み取り値を、各ウェルの1日目の生存率読み取り値に正規化し、そして、1日目の読み取り値と比較した3日目の倍数変化として表した。
腫瘍スライスシステムの臨床的有用性を検証するために、臨床試験に登録された4人の患者(CN1571、CN1572、CN1573、およびCN1574)から生成されたmCRC PDXモデルからの組織サンプルを取得し、培養し、実施例1に記載される方法を使用して評価した。図5Aは、示された日のエクスビボ(dev)における、ダブラフェニブ(Dab)、プラス、トラメチニブ(Tra)の併用療法またはDMSO対照に反応する、組織サンプルの生存率分析を示す。腫瘍スライス反応を、表3に概説されている修正を加えたRECIST基準を使用して、患者の反応に関して以前に公表されているデータ、および同じ4人の患者からのインビボPDXモデルの反応と比較し、腫瘍スライス反応の相互関係を示した。この比較の結果を図5Bに示す。腫瘍スライス反応は、対応するPDXと患者の反応に一致した。
同じ患者の腫瘍の2つの位置からの腫瘍組織サンプルを、実施例1に記載されるように、取得し培養した。各サンプルを、シスプラチン(Cis)、ドキソルビシン(Dox)、またはパクリタキセル(Taxol)で処置する。生存率計測を、インビトロで0日目、3日目、5日目、9日目、および12日目に取得する。2つのサンプルの各々の生存率計測値間の有意差を観察し、これは腫瘍組織内の薬物反応における異質性を実証している。
自然発症のMMTV-PyMTマウスの乳腺腫瘍とCT26マウスの大腸腫瘍からの、腫瘍組織標本を、18ゲージコアの生検針を使用して抽出した。サンプルは、Vibratome VT1200S(Leica Microsystems)を使用して、250-350μMの厚さのスライスに精密にカットした。各スライスを、200μlの無血清腫瘍様塊培養培地(serum free tumorsphere culture medium)(TSC培地:DMEM/F-12(Hyclone(登録商標))、B27サプリメント(Gibco(登録商標))、100U/mLのペニシリン(Gibco(登録商標))、および100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco(登録商標))を使用して、48ウェルの培養皿の、薄い多孔質膜(Nucleopore(商標)Track-Etched-Whatman(登録商標))上で培養した。
実施例1に記載される通り、結果を、生存率計測を介して観察した。代表的な結果を図7に示す。生存率アッセイによる読み取り値は、MMTV-PyMT腫瘍が、Dox処置とCCP+Dox+Taxol処置に感受性が高く、そしてCPP処置に感受性が無いことを示し、このことは、12日目を0日目と比較して、CCP処置スライスで生存率読み取り値が上がっていること、および、Dox処置スライスと、CCP+Dox+Taxol処置スライスとで生存率読み取り値が下がっていることよって実証されている。追加的に、生存率アッセイによる読み取り値は、CT26腫瘍が、IgG+OX+5FU処置と抗-PD1+OX+5FU処置とに感受性がより高く、そして抗-PD1+DMSO処置に感受性が低いことを示す。
臨床試験中の患者から、ヒトの転移性の大腸癌(mCRC)のコア針生検のサンプルを取得した。サンプルを、実施例7に記載されるように、スライス上に精密にカットして培養した。サンプルを、標的療法-エンコラフェニブ(enco)、BRAFV600E阻害剤;セツキシマブ(cetux)(EGFR阻害剤);ビニメチニブ(bini)(MEK阻害剤);およびそれらの組み合わせで処置し、当該組み合わせとしては、エンコラフェニブとセツキシマブの組み合わせ(enco+cetux)、およびエンコラフェニブ、セツキシマブ、およびビニメチニブ(enco+cetux+bini)の組み合わせが挙げられる。薬物を腫瘍スライス培養物に、1日目に、以下の最終濃度で添加し、各培地変更を-4日目、8日目、12日目、および16日目に行った:100nMのエンコラフェニブ、10μg/mLのセツキシマブ、および100nMのビニメチニブ(binitetinib)。
抗-CD45、CD3、CD8、およびCD4抗体で分析された自然発症のMMTV-PyMTマウスの乳腺腫瘍スライス培養物のフローサイトメトリー分析を実施し、本明細書に記載される培養条件にさらされた腫瘍スライス中の常在性免疫細胞の長期的な維持を評価した。MMTV-PyMTマウスの乳腺腫瘍からの組織標本を、エクスビボで4日間、IL2有りと無しとで、培養した。エクスビボの4日目に、MMTV-PyMT腫瘍スライスを、9:1の比のアキュターゼ:コラゲナーゼ+ヒアルロニダーゼ(hyaloruronidase)を含むカクテルを使用して、分離した。分離された単一の細胞を洗浄し、遮断抗体(抗CD16/32)に再懸濁し、そして、氷の上で30分間、2%のBSA/PBS中で希釈した。その後、細胞を洗浄し、Brilliant Violet染色緩衝液中で、抗-CD45、CD3、CD8、およびCD4抗体(PE-CY7、PE、APC、FITC、BV650、およびBV711)を含む、45μlの抗体カクテルに再懸濁し、そして、氷の上で30分間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、室温で30分間固定可能な生存率染料で染色した。染色後、細胞を洗浄し、ICfix溶液で固定し、そしてその後、LSRIIフローサイトメーターで分析した。
コア針生検を使用して、臨床試験中の2人の患者から、ヒトの転移性の大腸癌(mCRC)生検コアのサンプルを取得した。サンプルを、実施例7に記載されるように、スライス上に精密にカットして培養した。その後、各患者からのサンプルは、対照(DMSO)と、エンコラフェニブおよびセツキシマブ(E+C)と、免疫チェックポイント阻害剤ニボルマブ(N)と、エンコラフェニブ、セツキシマブ、およびニボルマブの組み合わせ(E+C+N)と、で処置された。薬物を腫瘍スライス培養物に、1日目、4日目、8日目、12日目、および16日目に、以下の最終濃度で添加した:100nMのエンコラフェニブ、10μg/mLのセツキシマブ、100nMのビニメチニブ、および10μg/mLのニボルマブ。サンプルを14日間培養した。
Claims (153)
- 候補分子を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記細胞サンプルを前記候補分子の存在下で少なくとも1日間培養する工程と、
(c)前記候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。 - 工程(b)において、前記細胞サンプルは、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、または少なくとも20日間、培養される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、前記細胞サンプルは12日間培養される、請求項2に記載の方法。
- (d)追加的候補分子を前記細胞サンプルに投与し、そして前記細胞サンプルを少なくとも24時間培養する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)において、前記細胞サンプルは、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、または少なくとも20日間、培養される、請求項4に記載の方法。
- 工程(d)において、前記細胞サンプルは12日間培養される、請求項5に記載の方法。
- (e)前記追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- (d)前記追加的候補分子の第2の用量を前記細胞サンプルに投与し、そして前記細胞サンプルを少なくとも24時間培養する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)において、前記細胞サンプルは、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、または少なくとも20日間、培養される、請求項8に記載の方法。
- 工程(d)において、前記細胞サンプルは12日間培養される、請求項9に記載の方法。
- (e)前記追加的候補分子の第2の用量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは複数の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは無傷組織である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルはオルガノイドである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは前記腫瘍組織から単離される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは癌細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記リンパ球細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である、請求項19に記載の方法。
- 前記骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは無血清条件で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは液体-空気界面で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている、請求項1に記載の方法。
- 前記反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である、請求項1に記載の方法。
- 生存率反応を評価する工程は、前記細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物を計測することは、細胞培養培地から前記代謝産物を単離し、そして前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物である、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来する、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンである、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来する、請求項26に記載の方法。
- 前記テトラゾールは、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)またはその塩、2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド(XTT)またはその塩、および3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)またはその塩、から成る群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記原発性腫瘍サンプルは被験体からの外科サンプルである、請求項35に記載の方法。
- 前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである、請求項35に記載の方法。
- 前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項37に記載の方法。
- 前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物分子は、組み換えタンパク質、酵素、抗体、成長因子、受容体、およびそれらの任意の一部、から成る群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 工程(a)は1以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、工程(c)は前記候補分子と前記1以上の追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの前記反応を評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1以上の追加的候補分子は前記候補分子と同時に提供される、請求項43に記載の方法。
- 前記候補分子と前記1以上の追加的候補分子は連続して提供される、請求項43に記載の方法。
- (d)前記候補分子を、前記被験体に由来する前記腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、
(e)少なくとも5日間、前記候補分子の存在下で前記追加的細胞サンプルを培養する工程と、
(f)前記候補分子に対する前記追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(g)前記追加的細胞サンプルの前記反応を前記細胞サンプルの前記反応と比較する工程と、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の第1の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第2の位置に由来する、請求項46に記載の方法。
- 前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項46に記載の方法。
- 前記異なる時は、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、10日、15日、または20日離れている、請求項48に記載の方法。
- 前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項46に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを固定することを含む、請求項51に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを透過処理することを含む、請求項51に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを溶解させることを含む、請求項51に記載の方法。
- 前記生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項51に記載の方法。
- 候補分子を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記候補分子を 被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも1日間培養する工程と、
(c)前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を繰り返す工程と、
を含む、方法。 - 工程(b)において、前記細胞サンプルは、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、または少なくとも20日間、培養される、請求項56に記載の方法。
- 工程(b)において、前記細胞サンプルは4日間培養される、請求項57に記載の方法。
- 工程(d)は、(a)-(c)を少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、または少なくとも6回繰り返すことを含む、請求項56に記載の方法。
- 工程(d)は、(a)-(d)を3回繰り返すことを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは複数の細胞を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは無傷組織である、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞サンプルはオルガノイドである、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは前記腫瘍組織から単離される、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは癌細胞を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項66に記載の方法。
- 前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項67に記載の方法。
- 前記リンパ球細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である、請求項68に記載の方法。
- 前記骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項68に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは無血清条件で培養される、請求項56に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは液体-空気界面で培養される、請求項56に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている、請求項56に記載の方法。
- 前記反応は、生存率反応、遺伝子発現反応、タンパク質発現反応、タンパク質修飾反応、細胞シグナル伝達反応、形態的反応、または代謝反応である、請求項56に記載の方法。
- 前記反応を評価する工程は、前記細胞サンプルからの代謝産物を計測することを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物を計測することは、細胞培養培地から前記代謝産物を単離し、そして前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測することを含む、請求項75に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物である、請求項75に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来する、請求項75に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンである、請求項78に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来する、請求項77に記載の方法。
- 前記テトラゾールは、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)またはその塩、2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド(XTT)またはその塩、および3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)またはその塩、から成る群から選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項80に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである、請求項56に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項56に記載の方法。
- 前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された外科サンプルである、請求項84に記載の方法。
- 前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである、請求項84に記載の方法。
- 前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項86に記載の方法。
- 前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記候補分子は、生物分子と化学分子から成る群から選択される、請求項56に記載の方法。
- 工程(a)は1以上の追加的候補分子を提供することをさらに含み、工程(c)は前記候補分子と前記1以上の追加的候補分子に対する前記細胞サンプルの前記反応を評価することを含む、請求項56に記載の方法。
- 前記1以上の追加的候補分子は前記候補分子と同時に提供される、請求項91に記載の方法。
- 前記候補分子と前記1以上の追加的候補分子は連続して提供される、請求項91に記載の方法。
- (e)前記候補分子を、前記被験体に由来する前記腫瘍組織の追加的細胞サンプルに投与する工程と、
(f)前記腫瘍組織の前記追加的細胞サンプルを少なくとも1日間培養する工程と、
(g)前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記追加的細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(h)工程(e)-(g)を繰り返す工程と、
(i)前記追加的細胞サンプルの前記反応を前記細胞サンプルの前記反応と比較する工程と、
をさらに含む、請求項56に記載の方法。 - 前記細胞サンプルは前記腫瘍組織の第1の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第2の位置に由来する、請求項94に記載の方法。
- 前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項94に記載の方法。
- 前記異なる時は、少なくとも1日、2日、3日、4日、または5日離れている、請求項96に記載の方法。
- 前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項95に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で生物アッセイを実行する工程をさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを固定することを含む、請求項99に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを透過処理することを含む、請求項99に記載の方法。
- 前記細胞サンプル上で前記生物アッセイを実行する工程は、前記細胞サンプルを溶解させることを含む、請求項99に記載の方法。
- 前記生物アッセイは、フローサイトメトリー、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、組織学的分析、免疫組織化学的検査法、免疫蛍光検査法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、質量分析法、およびその任意の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項99に記載の方法。
- 細胞生存率を評価する方法であって、前記方法は、
(a)細胞培養培地で腫瘍の細胞サンプルを培養する工程と、
(b)前記細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、
(c)前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測する工程であって、それによって前記細胞サンプルの前記細胞生存率を評価する、工程と、
を含む、方法。 - 前記細胞サンプルは細胞株からのものである、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは複数の細胞を含む、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは無傷組織である、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルはオルガノイドである、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは腫瘍から単離される、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは癌細胞を含む、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは腫瘍組織の微小環境からの細胞を含む、請求項104に記載の方法。
- 前記腫瘍組織の前記微小環境からの前記細胞は、免疫細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、または骨髄由来細胞である、請求項111に記載の方法。
- 前記免疫細胞はリンパ球細胞または骨髄球系細胞である、請求項112に記載の方法。
- 前記リンパ球細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞である、請求項113に記載の方法。
- 前記骨髄球系細胞は、好塩基球、好酸球、マスト細胞、好中球、単球、赤血球、マクロファージ、骨髄性抑制性細胞、または樹状細胞である、請求項113に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは無血清条件で培養される、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは液体-空気界面で培養される、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは細胞培養培地に浸されている、請求項104に記載の方法。
- 前記代謝産物を計測する工程は、蛍光計測または化学発光計測を含む、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、または少なくとも20日間、培養される、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは12日間培養される、請求項120に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物は還元反応の産物である、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレサズリンに由来する、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はレゾルフィンである、請求項123に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はテトラゾールに由来する、請求項104に記載の方法。
- 前記テトラゾールは、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)またはその塩、2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド(XTT)またはその塩、および3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)またはその塩、から成る群から選択される、請求項125に記載の方法。
- 前記細胞サンプルからの前記代謝産物はホルマザンである、請求項125に記載の方法。
- 候補分子を前記細胞サンプルに投与する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは患者に由来する異種移植片からのものである、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞サンプルは原発性腫瘍サンプルからのものである、請求項104に記載の方法。
- 前記原発性腫瘍サンプルは外科サンプルである、請求項130に記載の方法。
- 前記原発性腫瘍サンプルは患者から取得された生検サンプルである、請求項130に記載の方法。
- 前記生検サンプルはコア針生検によって取得される、請求項132に記載の方法。
- 前記候補分子での被験体の処置を推奨する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
- 前記候補分子で被験体を処置しないことを推奨する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
- (d)追加的細胞培養培地で追加的細胞サンプルを培養する工程と、
(e)前記追加的細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、
(f)前記追加的細胞サンプルが存在しない状態で前記追加的細胞培養培地からの前記代謝産物を計測する工程であって、それによって、前記追加的細胞サンプルの細胞生存率を評価する、工程と、
(g)前記追加的細胞サンプルの前記細胞生存率を前記細胞サンプルの前記細胞生存率と比較する工程と、
をさらに含む、請求項104に記載の方法。 - 前記細胞サンプルは腫瘍組織の第1の位置に由来し、そして、前記追加的細胞サンプルは前記腫瘍組織の第2の位置に由来する、請求項136に記載の方法。
- 前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは異なる時に前記腫瘍組織から取得される、請求項136に記載の方法。
- 前記異なる時は、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、10日、15日、または20日離れている、請求項138に記載の方法。
- 前記細胞サンプルと前記追加的細胞サンプルは実質的に同時に前記腫瘍組織から取得される、請求項136に記載の方法。
- 前記腫瘍組織は被験体に由来する組織サンプルである、請求項104に記載の方法。
- 放射線量を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記細胞サンプルを少なくとも1日間培養する工程と、
(c)前記放射線量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。 - 腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、
(a)被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
(b)前記細胞サンプルを少なくとも1日間培養する工程と、
(c)前記腫瘍処置照射野に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。 - 放射線量を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも1日間培養する工程と、
(c)前記放射線量に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を繰り返す工程と、
を含む、方法。 - 腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、
(a)被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも1日間培養する工程と、
(c)前記腫瘍処置照射野に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を繰り返す工程と、
を含む、方法。 - 候補分子を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記細胞サンプルを前記候補分子の存在下で少なくとも12日間培養する工程と、
(c)前記候補分子に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。 - 候補分子を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも12日間培養する工程と、
(c)前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を繰り返す工程と、
を含む、方法。 - 細胞生存率を評価する方法であって、前記方法は、
(a)細胞培養培地で腫瘍の細胞サンプルを少なくとも4日間培養する工程と、
(b)前記細胞培養培地から代謝産物を単離する工程と、
(c)前記細胞サンプルが存在しない状態で前記代謝産物を計測する工程であって、それによって前記細胞サンプルの前記細胞生存率を評価する、工程と、
を含む、方法。 - 候補分子を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記候補分子を、被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも4日間培養する工程と、
(c)前記候補分子に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を少なくとも3回繰り返す工程と、
を含む、方法。 - 放射線量を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記細胞サンプルを少なくとも12日間培養する工程と、
(c)前記放射線量に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。 - 腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、
(a)被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
(b)前記細胞サンプルを少なくとも12日間培養する工程と、
(c)前記腫瘍処置照射野に対する前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
を含む、方法。 - 放射線量を評価する方法であって、前記方法は、
(a)前記放射線量を被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルに投与する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも12日間培養する工程と、
(c)前記放射線量に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を繰り返す工程と、
を含む、方法。 - 腫瘍処置照射野を評価する方法であって、前記方法は、
(a)被験体に由来する腫瘍組織の細胞サンプルを腫瘍処置照射野に曝露する工程と、
(b)前記腫瘍組織の前記細胞サンプルを少なくとも12日間培養する工程と、
(c)前記腫瘍処置照射野に対する前記腫瘍組織の前記細胞サンプルの反応を評価する工程と、
(d)工程(a)-(c)を繰り返す工程と、
を含む、方法。
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