KR102577816B1 - 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 췌장암 오가노이드 및 상기 췌장암 오가노이드를 이용한 항암제의 효능 평가 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법은 암 미세환경을 완벽히 모사하는 췌장암 오가노이드를 제조할 수 있다. 따라서, 상기 방법으로 제조된 췌장암 오가노이드는 암세포 증식/전이 및 항암제 내성 등에 미치는 영향을 직접 관찰할 수 있으며, 약물 스크리닝 플랫폼의 개발에 활용되어 환자 특이적인 항암제 저항성을 미리 확인하는데 이용될 수 있다. 또한, 약물 처리에 따른 유전자 발현 조절 등을 관찰함으로써 암치료 목적의 분자기전 연구에 기여할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 암 미세환경을 완벽히 모사하는 췌장암 오가노이드를 제조할 수 있다. 따라서, 상기 방법으로 제조된 췌장암 오가노이드는 암세포 증식/전이 및 항암제 내성 등에 미치는 영향을 직접 관찰할 수 있으며, 약물 스크리닝 플랫폼의 개발에 활용되어 환자 특이적인 항암제 저항성을 미리 확인하는데 이용될 수 있다. 또한, 약물 처리에 따른 유전자 발현 조절 등을 관찰함으로써 암치료 목적의 분자기전 연구에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 췌장암 오가노이드 및 상기 췌장암 오가노이드를 이용한 항암제의 효능 평가 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
현재 신약개발을 위한 약물평가는 세포주(Cell-line) 또는 동물 모델을 통해 이루어지고 있다. 세포주 이용 방법은 기 확립된 세포주를 활용하므로 가장 손쉽게 사용할 수 있는 방법이며, 예를 들어 췌장암 세포주로는 HPAC, PANC-1, Capan-2, CFPAC-1 등이 이용되고 있다. 다만, 환자 개개인 별로 다른 유전적 특성을 갖고 있기 때문에 특이 병인기전 및 약물반응 등을 관찰할 수 없다는 단점이 있다. 동물 모델로는 종양 조직을 마우스에 이식하여 만드는 모델인 환자유래 암 조직 이식 모델(PDX; Patient-derived mouse xenograft)이 사용되고 있다. 이는 환자의 특성을 가장 잘 반영하지만 모델 제작까지 많은 시간이 소요되고, 실패율이 높고, 노동집약적이라는 실용적인 측면에서 단점이 있다.
이에 따라, 환자 유래 암 오가노이드 모델(PDO; Patient-derived organoid)이 새로운 대안으로 제시되고 있다. PDO는 환자의 암 조직에서 유래한 오가노이드를 3차원으로 배양함으로써 실제 암 조직과 매우 유사하게 제작한 모델이며, 환자 고유의 유전형 및 표현형이 잘 유지되는 장점이 있다. 다만, PDO는 암세포만으로 구성되기 때문에 암 미세환경을 반영하지 못한다는 단점이 있고, 종양 미세환경과 암세포간의 상호작용을 관찰할 수 없으며, 생체 내 암 조직을 완전히 재현하지 못하는 한계가 있었다.
전술한 암 미세환경은 종양 미세환경(TME; tumor microenvironment)으로도 불리는데, 암세포가 증식하고 진화하는 환경적 총체로서, 암세포 외에도 암 조직 내에 존재하는 섬유아세포(fibroblast), 면역세포, 세포외기질(extracellular matrix) 등을 모두 포함하는 개념이다. 기존의 암 치료제 개발 연구는 암세포 자체를 사멸시키는 원리로 진행되고 있었다. 그러나, 암세포의 발생, 성장 및 침윤뿐만 아니라 항암제 내성도 암 미세환경과의 상호작용으로 일어난다는 연구 결과가 지속적으로 발표되고 있음에 따라, 기존 항암제의 한계를 극복하기 위하여 암 미세환경을 타겟하는 시도가 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자들은 암 미세환경을 모사하는 췌장암 오가노이드를 개발하기 위한 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 췌장암 오가노이드 및 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)를 특정 비율 또는 특정 세포수로 혼합하여 배양하는 경우, 실제 인간의 췌장암 미세환경과 매우 유사한 조직 및 세포학적 특성을 나타낼 수 있는 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드를 제조할 수 있음을 실험적으로 입증하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)의 제조방법을 제공한다: (a) 췌장암(PDAC; pancreatic ductal adenocarcinoma) 조직에서 췌장암 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포를 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid) 및 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)로 각각 배양하는 단계; 및 (c) 상기 췌장암 오가노이드 및 암관련 섬유아세포를 혼합하여 배양하는 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어, "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포덩어리를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득, 채취하지 않고 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 것으로서, 축소되고 단순화된 버전의 기관으로 정의된다. 오가노이드는 장기배양, 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점을 가진다. 동시에 불멸화가 필요 없어 그에 따른 세포의 본래 특성이 유지됨은 물론 생체 내에서만 볼 수 있었던 세포의 계층적, 조직학적 구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험 모델이다. 이러한 특성으로 인해 오가노이드는 세포의 내재적 특성이 변화된 불멸화된 세포주, 또는 인체와 구조가 다른 동물 모델에 비해 높은 정확도로 약물 평가를 할 수 있고, 특히 환자 유래 조직을 이용하므로 인간을 대상으로 한 임상에 앞서 약물의 안전성은 물론 효능까지 미리 확인할 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid)"는 췌장암 세포에서 유래된 오가노이드를 의미한다. 본 발명의 PCO는 췌장암 세포의 특성을 그대로 나타낼 수 있으며, 조직 염색, 사이토카인 분석, 면역형광분석 등의 분석 방법을 통하여 췌장암 세포의 특성을 나타내는 것으로 공지된 마커(예를 들어, CK19 등)가 발현됨을 확인할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "췌장암 오가노이드"는 "PCO"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)"는 암 병변의 내부 및/또는 주변에 존재하는 섬유아세포로서, 암세포가 성장할 수 있도록 특성이 변화한 섬유아세포를 의미한다. 이러한 CAF는 FGF2, HGF, TGF-beta, SDF-1, VEGF, IL-6 등의 여러가지 성장인자를 세포 밖으로 분비하여 암세포에 호의적인 미세 환경을 형성하는데, 암세포의 성장과 침윤을 촉진하기 때문에 암세포의 전이를 직접 유발하며, 항암제 내성의 주요 원인으로 작용한다. 또한, CAF가 집중적으로 분포하는 암종의 경우 항암제에 반응하지 않으며, 항암제에 반응하여 종양의 크기가 감소하는 암세포 사멸 효과가 나타나더라도 CAF를 중심으로 한 암 미세환경이 건재한 경우 암세포의 성장이 쉽게 이루어져 재발 가능성이 높아진다. 이러한 특성때문에 암 미세환경을 구성하는 다양한 요소 중에서도 CAF는 필수 구성 요소로서 인정되고 있다(Erik Sahai et al. Nat Rev Cancer. 2020 Mar;20(3):174-186.; Leilei Tao et al. Oncol Lett. 2017 Sep; 14(3): 2611-2620.). 본 명세서에서, 상기 "암관련 섬유아세포"는 "CAF"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)"는 췌장암 오가노이드(PCO)와 암관련 섬유아세포(CAF)가 혼합되어 제조된 오가노이드 모델을 의미하며, 생체 내 암 미세환경을 인비트로(in vitro)에서 재현한 것이다. 생체 내 암 미세환경은 암세포 주위에 혈관, 면역세포, 섬유아세포(CAF), 림프구, 신호전달분자, 세포외 기질(ECM) 등이 둘러 싸여 있는 세포환경이다. 암세포는 이러한 주변 세포와 상호작용함으로써 미세환경을 변화시키기도 하고, 미세환경이 암세포의 성장 또는 전이에 영향을 미치기도 하는데, 그 중에서도 특히 CAF와의 상호 작용에 의한 영항이 크다. 따라서, PCO와 CAF를 포함하는 CIPCO는 생체 내 암 미세환경에서 존재하는 췌장암의 특성을 그대로 나타낼 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드"는 "CIPCO"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 (a) 단계는 개체에서 분리된 췌장암(PDAC; pancreatic ductal adenocarcinoma) 조직에서 췌장암 세포를 수득하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 췌장암이 발병된 적이 없는 개체, 발병될 가능성이 있는 개체, 발병된 개체, 또는 발병된 후 완치된 개체를 모두 포함하며, 인간 또는 임의의 비인간 동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 비인간 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 췌장암 조직에서 수득되는 췌장암 세포는 줄기세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 췌장암 세포는 췌장암 조직을 절단하는 과정 및 효소 분해 과정을 통해 수득될 수 있다. 구체적으로, 상기 절단은 물리적인 절단 또는 기계적인 절단을 모두 포함하며, 당업계에 알려진 일반적인 조직 절단 방법으로 수행될 수 있다. 상기 효소 분해는 당업계에 알려진 일반적인 효소 분해 조건으로 수행될 수 있으며, 예로서 콜라게나제 Ⅱ(collagenase Ⅱ) 효소를 사용하여 수행될 수 있고, 더욱 구체적인 예로 콜라게나제 Ⅱ(collagenase Ⅱ), HEPES 및 글루타맥스(GlutaMAX)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 분리 버퍼로 수행될 수 있다.
상기 (b) 단계는 상기 단계 (a)에서 분리한 췌장암 세포를 마트리겔 내에서 배양하는 단계로서, 마트리겔을 이용하여 상기 췌장암 세포를 3차원으로 배양함으로써 조직과 유사한 형태의 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid)를 형성시키는 단계이다. 이때, 상기 배양은 췌장암 세포와 마트리겔이 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 1.5로 혼합되어 수행될 수 있으며, 구체적으로 1 : 1로 혼합되어 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "마트리겔(matrigel)"은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체(BD Bioscience사의 제품명)를 의미한다. 상기 마트리겔은 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스(ECM; extracellular matrix), 및 섬유아세포 성장인자(FGF; fibroblast growth factor), 상피세포 성장인자(EFG; epiderma growth factor), 인슐린 성장인자(IGF; insulin-like growth factor), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β; transforming growth factor-beta), 혈소판 유래 성장인자(PDGF; platelet-derived growth factor)와 같은 성장인자를 포함하고 있다.
또한, 상기 PCO의 배양은 Wnt, R-스폰딘(R-spondin), B-27, 니코틴아마이드(Nicotinamide), HEPES, 글루타맥스(GlutaMAX), FGF10, N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), EGF, 가스트린 1(Gastrin 1) 및 플라모신(Plasmocin)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배양 배지로 수행될 수 있다.
동시에, 상기 (b) 단계는 상기 단계 (a)에서의 조직을 잘게 조각내어 배양 플레이트에 분주한 후 슬라이드 글라스를 이용하여 누른 상태에서 배양하는 단계로서, 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)를 형성시키는 단계이다. 상기 CAF의 배양은 FBS 및 GlutaMAX로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배양 배지로 수행될 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 단계 (b)에서 배양한 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid) 및 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)를 혼합하여 배양하는 단계로서, 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드를 제조하는 단계이다.
구체적으로, 상기 혼합은 PCO 및 CAF를 1 : 1 내지 10의 비율로 혼합하여 수행될 수 있고, 더욱 구체적으로 1 : 3 내지 5의 비율로 혼합하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 : 3 내지 4의 비율로 혼합하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 혼합은 PCO 및 CAF를 3.3×104 및 1×105의 세포수로 혼합하여 수행될 수 있다.
이때, 상기 PCO 및 CAF 혼합물의 배양은 Wnt, R-스폰딘(R-spondin), B-27, 니코틴아마이드(Nicotinamide), HEPES, 글루타맥스(GlutaMAX), FGF10, N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), EGF, 가스트린 1(Gastrin 1) 및 플라모신(Plasmocin) 포함하는 배양 배지로 수행될 수 있다.
전술한 (a) 내지 (c) 단계를 통해 제조된 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)는 CK19 및 비멘틴(Vimentin)을 발현하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "CK19(cytokeratin-19)"는 KRT19 유전자에 의해 발현되는 케라틴 또는 케라틴-19 단백질을 의미하며, 주로 위장 및 간담도 상피(gastroenteropancreatic and hepatobiliary epithelial)의 마커 또는 췌장암(PDAC; pancreatic ductal adenocarcinoma)의 마커로 사용된다. 본 발명에서, 상기 CK19는 PDAC 또는 PCO의 마커로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "비멘틴(Vimentin)"은 VIM 유전자에 의해 발현되는 단백질을 의미하며, 세포 모양, 세포 골격의 안정화를 유지하는 역할을 수행한다. 본 발명에서, 상기 CK19는 CAF의 마커로 사용될 수 있다.
따라서, CK19 및 비멘틴(Vimentin)을 발현하는, 본 발명에 따른 CIPCO는 PCO의 특성 및 CAF 특성을 모두 나타낼 수 있고, 생체 내 존재하는 암 미세환경을 완벽히 모사할 수 있다.
또한, 전술한 (a) 내지 (c) 단계를 통해 제조된 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드는 췌장암 오가노이드에 비하여 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition), 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 및 항암제 저항성이 증가하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition)"은 상피세포 성질로부터 간엽세포 성질로의 전환을 뜻하며, 암세포의 이동, 전이에 있어 중요한 과정이다. EMT가 증가되는 경우, 간엽세포 마커 유전자인 비멘틴(Vimentin), 피브로넥틴(Fibronectin) 및 ZEB-1의 발현은 증가하게 된다. 본 발명에 따른 CIPCO는 CAF를 포함하지 않는 일반적인 PCO에 비하여 EMT가 증가하는데, 이에 따라 PCO에 비하여 이동능 및 전이능이 증가할 수 있다. 또한, CIPCO가 이식된 개체에서는, PCO가 이식된 개체에 비하여 암 오가노이드의 사멸 감소, 암 오가노이드의 부피 증가, 이식된 개체의 몸무게 감소 및/또는 이식된 개체의 생존율 감소 등의 특징을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "암 오가노이드의 증식능"은 암 오가노이드의 세포 분열 능력을 의미하며, 암 오가노이드가 스스로 분열하여 절대적인 수 및 양을 늘리는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "암 오가노이드의 전이능"은 "암 오가노이드의 이동능"으로도 불리며, 암 오가노이드가 이를 둘러싸고 있는 세포외기질을 침윤하여 다른 부분으로 이동하거나, 또는 다른 장기로 전이하는 것을 의미한다. 암 오가노이드의 증식능 또는 전이능은 암 오가노이드를 둘러 싸고 있는 암 미세환경에 의해 조절되는데, 특히 CAF에 의해 증식능 또는 전이능이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 CIPCO는 CAF를 포함하지 않는 일반적인 PCO에 비하여 암 오가노이드의 전이능 및 이동능이 증가할 수 있다. 이 경우, CIPCO가 이식된 개체에서는, PCO가 이식된 개체에 비하여 암 오가노이드의 사멸 감소, 암 오가노이드의 부피 증가, 이식된 개체의 몸무게 감소, 및/또는 이식된 개체의 생존율 감소 등의 특징을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제 저항성"은 "항암제 내성" 또는 "항암제 불응성"으로도 불리며, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때 치료 초기부터 효과가 없거나, 초기에는 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 효과가 감소 또는 상실되거나, 또는 치료에 대한 반응이 장기간 동안 지속되지 않는 것을 의미한다. 암세포의 항암제 저항성은 암세포를 둘러 싸고 있는 암 미세환경에 의해 조절되는데, 특히 CAF에 의해 항암제 저항성이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 CIPCO는 CAF를 포함하지 않는 일반적인 PCO에 비하여 암 오가노이드의 항암제 저항성이 증가할 수 있다. 이 경우, CIPCO가 이식된 개체에서는, 항암제 처리 시, PCO가 이식된 개체에 비하여 암 오가노이드의 사멸 감소, 암 오가노이드의 부피 증가, 이식된 개체의 몸무게 감소 및/또는 이식된 개체의 생존율 감소 등의 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 제조방법으로 제조된 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)를 제공한다.
본 발명에 따른 CIPCO에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 CIPCO의 제조방법에서 설명한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 따른 CIPCO는 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid) 및 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)를 포함하는 오가노이드 모델로서, 생체 내 존재하는 췌장암의 미세환경과 매우 유사한 조직/세포학적 특성 및 기능을 가지고 있다. 또한, 상기 CIPCO는 CAF를 포함하지 않는 PCO에 비하여, EMT, 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 및 항암제 저항성이 증가하는 특징을 나타낸다.
따라서, 상기 CIPCO는 인비보(in vivo)의 암 미세환경을 인비트로(in vitro)에서 매우 유사하게 구현해낼 수 있는 장점이 있는바, 악성 종양에 대한 치료제 또는 항암제 저항성을 극복할 수 있는 치료제의 스크리닝, 효능 평가 등에 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 상기 CIPCO가 환자 유래의 세포 또는 조직을 사용하여 제조되는 경우, 환자 특이적인 항암제 저항성을 미리 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 항암제의 효능 평가 방법을 제공한다: (a) 상기 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 항암제 후보물질이 처리된 CIPCO에서 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition), 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 및 항암제 저항성으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에 따라 CIPCO에서 측정한 수준이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우, 상기 항암제 후보물질을 항암제로 판단하는 단계.
상기 항암제의 효능 평가 방법은 항암제의 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명에 따른 항암제의 효능 평가 방법 또는 항암제의 스크리닝 방법에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 CIPCO의 제조방법에서 설명한 바와 동일한 의미를 갖는다.
상기 (a) 단계는 상기 제조방법에 따라 제조된 CIPCO에 항암제 후보물질을 처리하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "후보물질"은 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질을 의미한다. 구체적으로, 암세포의 성장, 이동, 전이를 억제 또는 호전시키거나, 또는 암세포의 사멸을 증가시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능 예상물질을 모두 포함한다.
상기 항암제 후보물질의 처리는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 CIPCO에 항암제 후보물질을 처리하여 함께 배양하거나, 또는 상기 CIPCO를 포함하는 생체 내에 항암제 후보물질을 투여함으로써 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계는 상기 후보물질이 처리된 CIPCO의 EMT, 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 및 항암제 저항성으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 단계이다.
구체적으로, 상기 EMT, 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 또는 항암제 저항성의 수준은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 EMT는 비멘틴(Vimentin), 피브로넥틴(Fibronectin) 및/또는 ZEB-1의 발현 수준을 측정함으로써 분석될 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 증식능, 전이능 및/또는 항암제 저항성은 암 오가노이드의 사멸 증감, 부피 증감, 이식된 개체의 몸무게 증감 및/또는 이식된 개체의 생존율 증감 등을 측정함으로써 분석될 수 있다.
또한, 측정을 위한 수단으로서, 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), PCR(Polymerase chain reaction), 역전사 PCR(RT-PCR; Reverse transcription PCR), 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR; Quantitative Reverse transcription PCR), H&E, Masson's trichrome 등의 조직 염색, 조직 면역염색(Immunostaining), 조직 면역화학염색(immunocytochemistry), 유세포분석법(Flowcytometry analysis), 형광 기반 어세이(Fluorescence-based assays), 전자 현미경 분석법(electron microscopic analysis) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에 따라 CIPCO에서 측정한 EMT, 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 및/또는 항암제 저항성의 수준이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우, 상기 항암제 후보물질을 항암제로 판단하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "대조군"은 항암제 후보물질이 처리되지 않은 CIPCO 또는 항암제가 처리된 CIPCO를 의미하며, 상기 항암제 후보물질이 처리된 CIPCO와 EMT, 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 또는 항암제 저항성의 수준을 비교하기 위해 사용된다.
구체적인 예로, CIPCO에서 측정한 EMT가 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우는 CIPCO에서 측정한 비멘틴(Vimentin), 피브로넥틴(Fibronectin) 및/또는 ZEB-1의 발현이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우일 수 있다.
또 다른 구체적인 예로, CIPCO에서 측정한 암 오가노이드의 증식능이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우는 1) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 암 오가노이드의 부피가 대조군에서 측정한 수준보다 감소하거나, 2) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 개체의 몸무게가 대조군에서 측정한 수준보다 증가하거나, 및/또는 3) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 개체의 생존율이 대조군에서 측정한 수준보다 증가하는 경우일 수 있다.
또 다른 구체적인 예로, CIPCO에서 측정한 암 오가노이드의 전이능이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우는 1) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 암 오가노이드의 부피가 대조군에서 측정한 수준보다 감소하거나, 2) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 개체의 몸무게가 대조군에서 측정한 수준보다 증가하거나, 및/또는 3) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 개체의 생존율이 대조군에서 측정한 수준보다 증가하는 경우일 수 있다.
또 다른 구체적인 예로, CIPCO에서 측정한 암 오가노이드의 항암제 저항성이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우는, 개체에 항암제 또는 항암제 후보물질 처리 시, 1) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 암 오가노이드의 사멸이 대조군에서 측정한 수준보다 증가하거나, 및/또는 2) CIPCO가 이식된 개체에서 측정한 개체의 생존율이 대조군에서 측정한 수준보다 증가하는 경우일 수 있다.
전술한 EMT, 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 또는 항암제 저항성의 수준은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 EMT는 비멘틴(Vimentin), 피브로넥틴(Fibronectin) 및/또는 ZEB-1의 발현 수준을 측정함으로써 분석될 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 증식능, 전이능 및/또는 항암제 저항성은 암 오가노이드의 사멸 증감, 부피 증감, 이식된 개체의 몸무게 증감 및/또는 이식된 개체의 생존율이 증감 등을 측정함으로써 분석될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 암 미세환경을 모사하는 췌장암 오가노이드를 제조할 수 있다. 따라서, 상기 방법으로 제조된 췌장암 오가노이드는 암세포 증식/전이 및 항암제 내성 등에 미치는 영향을 직접 관찰할 수 있으며, 약물 스크리닝 플랫폼의 개발에 활용되어 환자 특이적인 항암제 저항성을 미리 확인하는데 이용될 수 있다. 또한, 약물 처리에 따른 유전자 발현 조절 등을 관찰함으로써 암치료 목적의 분자기전 연구에 기여할 수 있다.
도 1은 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)의 제조에 관한 것이다. A는 CIPCO 제조방법의 개략도이고, B는 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid)와 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)의 혼합 비율에 따른 CIPCO의 형성 정도를 보여주는 이미지이고, C는 PCO, CAF, CIPCO에서 CAF의 융합 정도를 보여주는 이미지이다. BF(bright field)는 광학 현미경으로 찍은 사진을 보여준다.
도 2는 CIPCO의 제조에 관한 것으로서, PCO와 CAF의 혼합 비율에 따른 CIPCO의 형성 정도를 보여주는 이미지이다. PCO 및 CAF를 각각 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 또는 1 : 5의 세포수 비율로 혼합하여 배양한 결과이다.
도 3은 배양 기간에 따른 CIPCO의 성장에 관한 것이다. A는 PCO, CAF, CIPCO의 배양 기간에 따른 모습을 보여주는 이미지이고, B는 PCO, CIPCO에서 발현되는 CK19, 비멘틴(Vimentin)을 보여주는 이미지이다.
도 4는 CIPCO의 조직 유사성에 관한 것이다. A는 PCO, CIPCO, 인간 췌장암 조직(Human cancer)에 대하여 H&E 염색한 결과와 발현된 비멘틴을 보여주는 이미지이고, B는 PCO, CIPCO, 인간 췌장암 조직(Human cancer)에 대하여 Masson's trichrome 염색한 결과를 보여주는 이미지이고, C는 PCO, CIPCO에 대하여 핵(Nuclei), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 Ⅰ(Collagen Ⅰ)을 면역조직화학염색한 결과를 보여주는 이미지이고, D는 PCO 및 CIPCO에서 발현된 콜라겐 Ⅰ의 양을 분석한 그래프이다.
도 5는 CIPCO의 CAF subtype에 관한 것이다. A는 인간 췌장암 조직(Tissue), CAF, PCO, CIPCO에서 발현되는 비멘틴, IL-6, CK19, α-SMA, MHC Ⅱ의 발현 정도를 보여주는 이미지이고, B는 인간 췌장암 조직(hPCT), CIPCO에 존재하는 CAF subtype의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 6은 CIPCO의 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition)에 관한 것이다. A는 PCO, CIPCO, 인간 췌장암 조직(Human cancer)에 대하여 H&E 염색한 결과와 CK19, 비멘틴의 발현 정도를 보여주는 이미지이고, B는 ATRA가 처리되지 않은 CIPCO(Control) 또는 ATRA가 처리된 CIPCO(ATRA)에서의 ZEB-1, 피브로넥틴(Fibronectin) 및 비멘틴의 발현 정도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 제노그래프트(Xenograft) 마우스 모델을 이용한 CIPCO의 EMT 및 전이능에 관한 것이다. A는 PCO 또는 CIPCO가 이식된 마우스의 몸무게를 보여주는 그래프이고, B는 마우스에 이식된 PCO 또는 CIPCO에 대하여 H&E, Masson's trichrome 염색한 결과와 α-SMA, 비멘틴, 핵, CK19, Twist-1을 면역조직화학염색한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 8은 CIPCO의 항암제 저항성에 관한 것이다. A는 항암제(젬시타빈)를 농도별로 처리한 PCO 또는 CIPCO에 대하여 PI(Propidium iodide)로 면역조직화학염색한 결과를 보여주는 이미지이고, B는 상기 A의 이미지에서 PI 영역이 차지하는 비율을 나타낸 그래프이다. Vehicle은 아무것도 처리하지 않은 대조군, collagenase는 콜라게나제(collagenase)를 함께 처리한 실험군을 의미한다.
도 2는 CIPCO의 제조에 관한 것으로서, PCO와 CAF의 혼합 비율에 따른 CIPCO의 형성 정도를 보여주는 이미지이다. PCO 및 CAF를 각각 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 또는 1 : 5의 세포수 비율로 혼합하여 배양한 결과이다.
도 3은 배양 기간에 따른 CIPCO의 성장에 관한 것이다. A는 PCO, CAF, CIPCO의 배양 기간에 따른 모습을 보여주는 이미지이고, B는 PCO, CIPCO에서 발현되는 CK19, 비멘틴(Vimentin)을 보여주는 이미지이다.
도 4는 CIPCO의 조직 유사성에 관한 것이다. A는 PCO, CIPCO, 인간 췌장암 조직(Human cancer)에 대하여 H&E 염색한 결과와 발현된 비멘틴을 보여주는 이미지이고, B는 PCO, CIPCO, 인간 췌장암 조직(Human cancer)에 대하여 Masson's trichrome 염색한 결과를 보여주는 이미지이고, C는 PCO, CIPCO에 대하여 핵(Nuclei), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 Ⅰ(Collagen Ⅰ)을 면역조직화학염색한 결과를 보여주는 이미지이고, D는 PCO 및 CIPCO에서 발현된 콜라겐 Ⅰ의 양을 분석한 그래프이다.
도 5는 CIPCO의 CAF subtype에 관한 것이다. A는 인간 췌장암 조직(Tissue), CAF, PCO, CIPCO에서 발현되는 비멘틴, IL-6, CK19, α-SMA, MHC Ⅱ의 발현 정도를 보여주는 이미지이고, B는 인간 췌장암 조직(hPCT), CIPCO에 존재하는 CAF subtype의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 6은 CIPCO의 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition)에 관한 것이다. A는 PCO, CIPCO, 인간 췌장암 조직(Human cancer)에 대하여 H&E 염색한 결과와 CK19, 비멘틴의 발현 정도를 보여주는 이미지이고, B는 ATRA가 처리되지 않은 CIPCO(Control) 또는 ATRA가 처리된 CIPCO(ATRA)에서의 ZEB-1, 피브로넥틴(Fibronectin) 및 비멘틴의 발현 정도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 제노그래프트(Xenograft) 마우스 모델을 이용한 CIPCO의 EMT 및 전이능에 관한 것이다. A는 PCO 또는 CIPCO가 이식된 마우스의 몸무게를 보여주는 그래프이고, B는 마우스에 이식된 PCO 또는 CIPCO에 대하여 H&E, Masson's trichrome 염색한 결과와 α-SMA, 비멘틴, 핵, CK19, Twist-1을 면역조직화학염색한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 8은 CIPCO의 항암제 저항성에 관한 것이다. A는 항암제(젬시타빈)를 농도별로 처리한 PCO 또는 CIPCO에 대하여 PI(Propidium iodide)로 면역조직화학염색한 결과를 보여주는 이미지이고, B는 상기 A의 이미지에서 PI 영역이 차지하는 비율을 나타낸 그래프이다. Vehicle은 아무것도 처리하지 않은 대조군, collagenase는 콜라게나제(collagenase)를 함께 처리한 실험군을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)의 제조방법
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 약물 스크리닝 및 효능 평가 시스템을 확립하고자 하였다. 이를 위하여, 췌장암 조직으로부터 유래한 암 오가노이드 및 암관련 섬유아세포를 사용하여 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)를 제조하였다.
구체적으로, 췌장암 환자의 암조직(PDAC; pancreatic ductal adenocarcinoma)을 잘게 자른 후 37℃에서 총 1시간 동안 분리 버퍼를 이용하여 배양하였다. 이후, 상기 췌장암 조직으로부터 분리한 클럼프 형태의 췌장암 세포를 마트리겔(Matrigel)과 1:1의 비율로 혼합하였고, 이를 PCO 배양 배지를 이용하여 배양함으로써 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid)를 제조하였다. 또한, 상기 췌장암 조직을 12웰 플레이트에 넣고 슬라이드 글라스로 조직을 누른 상태에서, CAF 배양 배지를 이용하여 배양함으로써 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)를 제조하였다. 이때 사용한 버퍼 및 배지의 조성은 하기에 나타내었다.
- 분리 버퍼 조성: 5 ㎎/㎖의 콜라게나제 Ⅱ(collagenase Ⅱ), 10 mM HEPES, 1X 글루타맥스(GlutaMAX) 및 1X P/S(penicillin-streptomycin)를 포함하는, DMEM/F12 배지
- PCO 배양 배지 조성: 50% 조건화-Wnt 배지(conditioned-Wnt medium), 10% 조건화-R-스폰딘 배지(conditioned-R-spondin medium), 1X B-27, 10 mM 니코틴아마이드(Nicotinamide), 10 mM HEPES, 1X 글루타맥스(GlutaMAX), 1X P/S, 100 ng/㎖ FGF10, 1 mM N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), 50 ng/㎖ EGF, 10 nM 가스트린 1(Gastrin 1) 및 25 ㎍/㎖ 플라모신(Plasmocin)을 포함하는, 어드밴스드 DMEM/F12(advanced DMEM/F12) 배지
- CAF 배양 배지 조성: 10% FBS, 1X 글루타맥스(GlutaMAX) 및 1X P/S를 포함하는, 고포도당(high glucose) DMEM 배지
이후, 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)를 제조하기 위하여, 위의 방법으로 제조한 PCO 및 CAF를 1 : 1 내지 5의 다양한 비율로 혼합하여 배양하였고, 이때 PCO 배양 배지를 사용하였다. 또한, 혼합비율에 따른 CIPCO의 형성 정도, PCO와 CAF의 융합 정도 등을 분석함으로써 PCO와 CAF의 최적 비율을 규명하였다. 이러한 제조방법에 대한 개략도는 도 1의 A에 나타내었다.
그 결과, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 공배양 시 CAF의 비율이 PCO에 비해 낮거나 유사하면 CAF에 의해 유도되는 기질(CAF-induced stroma)의 형성이 이루어지지 않음을 확인하였다. 구체적으로, 3.3×104 세포수의 PCO에 대하여 1×104 세포수의 CAF를 혼합하는 경우(즉, PCO 및 CAF의 혼합비가 3.3 : 1인 경우) 또는 3.3×104 세포수의 PCO에 대하여 5×104 세포수의 CAF를 혼합하는 경우(즉, PCO 및 CAF의 혼합비가 1 : 1.5인 경우)에는 CAF에 의해 유도되는 기질이 형성되지 않아 CIPCO가 적절한 형태를 유지하지 못함을 확인하였다(도 1의 B).
반면, CAF의 비율이 PCO에 대하여 높은 경우에는 CAF에 의해 유도되는 기질에 의해 CIPCO의 형태가 잘 유지됨을 확인하였다(도 1의 B). 구체적으로, 3.3×104 세포수의 PCO 및 1×105 세포수의 CAF를 혼합하는 경우(즉, PCO 및 CAF의 혼합비가 1 : 3인 경우)에 CAF 기질에 의한 조직형성이 잘 유지되고, 배양이 계속되더라도 그 형태가 일정하게 유지되며(도 1의 B), 배양 기간이 길어질수록 PCO와 CAF의 융합이 점차 증가하는 것을 확인하였다(도 1의 C).
특히, 도 2에 나타난 바와 같이, PCO의 혼합비가 1:1 또는 1:2인 경우 CAF에 의한 기질이 잘 형성되지 않아 돔(dome)의 형태를 유지하지 못하거나 돔 내에서 오가노이드가 한쪽으로 치우치는 등 PCO와 CAF가 잘 융합되지 않음을 확인하였다. 반면, PCO 및 CAF의 혼합비가 1:3 내지 1:5의 비율인 경우 CIPCO의 형태가 잘 유지되었고, 돔 내에서 오가노이드와 CAF의 밀도가 한쪽으로 치우치지 않고 일정하게 분포되어 있음을 확인하였다. 특히, CAF와의 혼합비율이 높아짐에 따라 낭포성 (Cystic) 오가노이드는 주변 CAF 유도 기질에 의해 둘러싸여 작은 크기로 내강(Lumen)이 밀집한 형태의 오가노이드로 변함을 확인하였고, 이는 실제 고형암의 종류인 췌장암의 CAF 및 기질 특성을 반영한다.
나아가, 도 3에 나타낸 바와 같이, PCO 및 CAF의 혼합비가 1 : 3인 경우, CIPCO는 배양기간이 증가함에 따라 계속해서 성장하며, 배양 기간이 10일 이상의 장기로 진행되는 경우에도 성장이 이루어짐을 확인하였다(도 3의 A). 또한, CIPCO는 PCO 마커인 CK19, CAF 마커인 비멘틴(Vimentin)을 발현하며, 특히 비멘틴의 경우에는 PCO 주변에 골고루 발현됨을 확인함으로써, CAF는 CIPCO 주변에 전체적으로 분포되어 있음을 확인하였다(도 3의 B).
상기 결과를 통해, 췌장암 오가노이드(PCO)를 CAF와 1 : 3 내지 5의 세포수 비율로 혼합하여 제조한 CIPCO는 췌장암의 미세환경을 모사할 수 있으므로, 약물 스크리닝 및 효능 평가 시스템으로써 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2. CIPCO의 조직 유사성
상기 실시예 1을 통해 제조한 CIPCO에 대하여, 실제 인간의 췌장암 조직과의 유사성을 분석하였다.
구체적으로, H&E, Masson's Trichrome 등의 염색을 시행하여 조직 유사성을 분석하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, CIPCO는 인간 췌장암 조직과 매우 유사한 조직학적 특징을 나타냄을 확인하였다. 또한, CIPCO와 인간 췌장암 조직 모두에서, 암의 기질 부분에는 섬유아세포의 마커인 비멘틴이 발현되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 상기 기질은 CAF 유래의 기질임을 확인하였다(도 4의 A). 또한, 췌장암과 같은 고형암에서 나타나는 대표적인 기질은 CAF에서 분비되는 콜라겐으로 알려져 있는데, 상기 실시예 1에서 확립된 CIPCO 또한 CAF에 의해 형성된 대부분의 기질은 콜라겐임을 확인하였다(도 4의 B 내지 D).
나아가, 인간 췌장암 조직에서 유래한 CAF, PCO 및 CIPCO에서 관찰되는 CAF의 subtype을 면역조직화학적 분석을 통해 분석하였다. 일반적으로, CAF는 3개의 하위 그룹으로 나뉠 수 있는데, 이는 각각 α-SMA를 발현하는 MyoCAFs (Myofibroblast), IL-6를 발현하는 iCAFs (Inflammatory fibroblast), MHC Ⅱ를 발현하는 apCAFs (Antigen pregenting fibroblast)이다.
구체적으로, CAF, PCO 및 CIPCO를 각각 배양하였고, 배양 10일째에 4% PFA를 처리하여 고정시킨 후, 파라핀 블록을 생성하고, 절편으로 만들었다. 이후, CAF subtype의 마커인 α-SMA, IL-6, MHC Ⅱ에 대한 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, CIPCO는 인간 췌장암 조직과 매우 유사한 패턴으로 CAF subtype의 마커를 발현하는 것을 확인하였다(도 5의 A). 또한, CIPCO에서는 CAF subtype을 인간 췌장암 조직과 유사한 비율로 나타내고 있는 것을 확인하였다(도 5의 B). 상기 CAF subtype 중에서 myoCAF는 암세포에 직접 붙어있거나 인접하여 위치하는 CAF이고, iCAF는 암세포에서 떨어져 위치하는 CAF로서, 생체 내 췌장암 미세환경에서는 myoCAF, iCAF 및 ap-CAF의 여러 CAF subtype이 암세포 주변을 다양한 형태로 구성하고 있다.
한편, 췌장암 조직에서 분리한 췌장암 세포를 오가노이드(PCO)로 형성시키고, 그 이후 상기 오가노이드를 disassociation하여 다시 단일 세포(single cell)의 췌장암 세포로 만든 후, 이를 CAF와 융합하는 경우에는 암세포와 인접해 있는 CAF만이 존재하는 것을 확인하였다. 따라서, CIPCO의 제조에는 단일세포 형태의 췌장암세포를 사용하는 것보다 췌장암 오가노이드를 사용하는 것이 암 미세환경을 더 효과적으로 모사할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 실시예 1에서 제조한 CIPCO는 췌장암 조직의 CAF 특성을 반영하는 등의 암 미세환경을 모사할 수 있으므로, 약물 스크리닝 및 효능 평가 시스템으로써 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. CIPCO의 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition)
상기 실시예 1을 통해 제조한 CIPCO에 대하여, 상피간엽이행의 정도를 분석하였다. EMT는 상피세포 성질로부터 간엽세포 성질로의 전환을 뜻하며, 종양 세포의 이동, 전이에 있어 중요한 과정이다.
구체적으로, EMT가 진행되는 경우, 간엽세포 마커 유전자인 비멘틴(Vimentin), 피브로넥틴(Fibronectin) 및 ZEB-1의 발현은 증가하게 된다. 이에 따라, 상기 유전자의 발현 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 6의 A에서 볼 수 있듯이, CIPCO는 PCO에 비하여 비멘틴의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 이러한 CIPCO의 EMT 관련 유전자의 발현 변화는 인간 췌장암 조직과 매우 유사한 패턴을 나타냄을 확인하였다.
상기와 같은 EMT 관련한 인자의 발현 패턴 변화가 CAF의 영향인지 여부를 확인하기 위하여, CAF를 비활성시키는 약물인 ATRA(all-trans-retinoic acid)를 공배양 전의 CAF에 처리하였고, ATRA가 처리된 CAF를 PCO와 공배양하여 CIPCO를 제조하였다. 이후, FACS를 이용하여 CIPCO로부터 단일 세포를 분리하였고, qRT-PCR을 통해 EMT 관련 유전자의 발현 수준을 분석하였다.
그 결과, 도 6의 B에서 볼 수 있듯이, CIPCO는 ATRA 처리에 의하여 모든 EMT 관련 유전자(ZEB-1, 피브로넥틴, 비멘틴)의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 공배양에서의 증가된 암세포의 EMT 마커 발현의 차이는 CAF에 의한 것임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 실시예 1에서 제조한 CIPCO는 암의 이동, 전이 등에 관여하는 EMT를 유도할 수 있는바, 췌장암의 미세환경을 완벽히 모사할 수 있으므로, 약물 스크리닝 및 효능 평가 시스템으로써 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. 제노그래프트(Xenograft) 마우스 모델을 이용한 CIPCO의 EMT 및 전이능
상기 실시예 1을 통해 제조한 CIPCO에 대하여, EMT 및 전이능을 제노그래프트(Xenograft) 마우스 모델을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 7의 A에서 볼 수 있듯이, CIPCO가 이식된 경우에는 PCO가 이식된 경우에 비하여 마우스의 생존율이 급격히 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 7의 B에서 볼 수 있듯이, PCO 및 CIPCO 유래의 암세포에서 인간 핵(nuclei) 및 인간 CK19이 발현됨을 확인하였는데, 이를 통해 상기 암세포는 마우스가 내재하고 있던 것이 아닌, 이식된 PCO 및 CIPCO에서 유래한 것임을 확인할 수 있었다.
또한, CIPCO 유래 암세포는 PCO 유래 암세포에 비하여 α-SMA 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다. α-SMA/비멘틴의 발현은 CAF와 같은 섬유아세포를 대변하는데, PCO 유래 암세포보다 CIPCO 유래 암세포에서 발현량이 더 많은 것으로 보아 CIPCO 유래의 암세포에서는 CAF가 함께 조직을 구성하고 있음을 확인하였고, CIPCO 내 ECM의 형성이 더 증가됨을 확인하였다.
또한, CIPCO 유래 암세포는 PCO 유래 암세포에 비하여 종양이 전이될 때 발현하는 Twist-1의 양이 더 높은 것을 확인하였고, 이를 통해 CIPCO에서는 EMT가 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 실시예 1에서 제조한 CIPCO는 생체 내에서 암의 증식, 이동 및 전이 등을 공격적으로 유도할 수 있는바, 췌장암의 미세환경을 완벽히 모사할 수 있으므로, 약물 스크리닝 및 효능 평가 시스템으로써 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. CIPCO의 항암제 저항성
상기 실시예 1을 통해 제조한 CIPCO에 대하여, 항암제 저항성을 분석하였다. 췌장암의 치료제로는 주로 젬시타빈(Gemcitabine)이 사용되고 있으나, 실제 췌장암 환자에 적용 시 약물에 대한 저항성 때문에 항암 효과가 떨어지는 경우가 있다. 항암제 저항성에 대한 기전은 종양 미세환경에 의한 1) 물리적 장애에 따른 비효율적인 약물전달 또는 2) 종양세포의 EMT에 의한 분자적 방어 등이 제시되고 있다.
구체적으로, 항암제 저항성은 항암제 처리에 의한 CIPCO의 생존 정도를 확인함으로써 분석하였다. 세포의 핵을 PI(Propidium iodide)로 염색하는 면역조직화학적 분석을 수행하였으며, PI 영역의 비율을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 8의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, CIPCO는 PCO에 비하여 항암제를 높은 농도로 처리하더라도 PI 영역이 감소하지 않는 것을 확인하였고, 이를 통해 항암제 저항성이 증가하여 생존하는 CIPCO의 수가 유지됨을 확인하였다. 다만, CIPCO의 주요 세포외기질 중 하나인 교원질을 분해하는 콜라게나제(collagenase)를 항암제와 함께 처리하는 경우에는 PI 영역이 급격하게 감소함을 확인하였고, 이를 통해 항암제 저항성이 감소하여 (즉, 항암제 감수성이 증가하여), CIPCO의 사멸이 현저히 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 실시예 1에서 제조한 CIPCO는 항암제 저항성을 나타내는 췌장암의 미세환경을 모사할 수 있으므로, 환자에게 존재하는 약물 내성이나 약물의 효과 등을 미리 파악할 수 있는 환자맞춤형 치료에 유용하게 활용될 수 있으며, 항암제 평가 및 감수성 조절을 위한 병용제제 개발에 있어 효과적인 in vitro 모델로 활용될 수 있음을 알 수 있다.
Claims (12)
- 하기 단계를 포함하는, 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)의 제조방법:
(a) 개체에서 분리된 췌장암(PDAC; pancreatic ductal adenocarcinoma) 조직에서 췌장암 세포를 수득하는 단계;
(b) 상기 분리된 세포를 췌장암 오가노이드(PCO; pancreatic cancer organoid) 및 암관련 섬유아세포(CAF; cancer-associated fibroblast)로 각각 배양하는 단계; 및
(c) 상기 췌장암 오가노이드 및 암관련 섬유아세포를 1 : 3 내지 5의 세포수 비율로 혼합하여 배양하는 단계로서,
상기 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드는 췌장암 오가노이드에 비하여 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition) 및 항암제 저항성이 증가하는 것인, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)는 콜라게나제 Ⅱ(collagenase Ⅱ), HEPES 및 글루타맥스(GlutaMAX)를 포함하는 분리 버퍼를 이용하여 수행되는 것인, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 췌장암 오가노이드의 배양은 췌장암 세포 및 마트리겔이 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 1.5의 부피비로 혼합되어 수행되는 것인, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 췌장암 오가노이드의 배양은 Wnt, R-스폰딘(R-spondin), B-27, 니코틴아마이드(Nicotinamide), HEPES, 글루타맥스(GlutaMAX), FGF10, N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), EGF, 가스트린 1(Gastrin 1) 및 플라모신(Plasmocin)을 포함하는 배양 배지에서 수행되는 것인, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 암관련 섬유아세포의 배양은 FBS 및 GlutaMAX를 포함하는 배양 배지로 수행되는 것인, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (c)의 배양은 Wnt, R-스폰딘(R-spondin), B-27, 니코틴아마이드(Nicotinamide), HEPES, 글루타맥스(GlutaMAX), FGF10, N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), EGF, 가스트린 1(Gastrin 1) 및 플라모신(Plasmocin) 포함하는 배양 배지에서 수행되는 것인, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드는 CK19 및 비멘틴(Vimentin)을 발현하는 것인, 제조방법. - 제1항의 제조방법으로 제조된, 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드.
- 하기 단계를 포함하는, 항암제의 효능 평가 방법:
(a) 제8항의 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드(CIPCO; CAF-integrated pancreatic cancer organoid)에 항암제 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 항암제 후보물질이 처리된 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드에서 상피간엽이행(EMT; epithelial to mesenchymal transition), 암 오가노이드의 증식능, 암 오가노이드의 전이능 및 항암제 저항성으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에 따라 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드에서 측정한 수준이 대조군에서 측정한 수준보다 감소하는 경우, 상기 항암제 후보물질을 항암제로 판단하는 단계. - 제9항에 있어서,
상기 대조군은 항암제 후보물질을 처리하지 않은 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드 또는 항암제 후보물질을 처리한 췌장암 오가노이드인, 방법. - 삭제
- 삭제
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