CN114929858A - 由多能干细胞生产骨骼肌细胞和骨骼肌组织 - Google Patents

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M·蒂伯西
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Abstract

本申请描述了从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织的方法。还公开了一种从多能干细胞生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法。在所述方法中，多能干细胞定向分化和成熟为骨骼肌管和卫星细胞。本申请还描述了工程化骨骼肌组织，其具有多核骨骼肌纤维与卫星细胞。此外，本发明还涉及中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源性特定的骨骼肌成肌细胞祖细胞、骨骼肌成肌细胞、卫星细胞和骨骼肌管，它们可以通过所公开的方法来生产。本申请还描述了骨骼肌组织或所披露的细胞在药物测试或医学中的用途。最后，本申请涉及到使用骨骼肌组织或所披露的细胞的体外方法。

Description

由多能干细胞生产骨骼肌细胞和骨骼肌组织
背景技术
人体由35-40％的骨骼肌组成，从而能够进行呼吸、作姿势和运动。健康的骨骼肌可以从诸如撕裂伤或割伤等轻伤中完全再生，因为肌肉干细胞，也称为卫星细胞(SC)，可以完全再生受伤的组织。然而，重伤不会愈合，从而留下永久性损伤。
当前的“组织工程”理论包括产生所需的细胞类型并在工程化的环境中使它们分化以生产类体内组织。在组织工程中，重要的是，要注意在解离分化细胞期间，细胞外环境会丢失，因此可能会丢失与发育相关的信息。例如，解离破坏了细胞-细胞互连、细胞几何定位和细胞-细胞外基质连接。这种环境必须在组织工程期间重建(齐默尔曼(ZimMermann)等人，2004,蒂伯西(Tiburcy)等人，2017)。此外，分化的骨骼肌组织不仅由骨骼肌纤维组成，还由基质细胞/结缔组织细胞，尤其是卫星细胞组成，它们根据其环境和化学刺激而形成。
技术人员知道与骨骼肌细胞相关的不同组织工程方法，这些方法使用2D细胞培养、小动物模型或从小动物中提取的肌肉组织(贝尔吉拉利-拉布罗(Beldjilali-Labro)等人，(2018)和霍达布库斯(Khodabukus)等人，(2018))。例如，查尔(Chal)等人，(2016)描述了以2D方法生产肌肉纤维。
过去，小动物模型经常被用于研究生物过程。然而，动物模型通常有一些局限性。对于动物模型，结果是否可以转移到人类身上是个根本性的问题，特别是在疾病/愈合过程和药物功疗方面。
为了克服动物模型的限制，生产工程化骨骼肌细胞和/或骨骼肌组织有望带来极大的好处。
为了支持干细胞分化为骨骼肌细胞，过去常常用肌肉特异性转录因子转染干细胞。例如，拉奥(Rao)等人，(2018)描述了生产工程化骨骼肌组织，其中瞬时过表达Pax7转基因。但是，不同细胞的转染率不同，并且可能因每个实验而异。此外，许多研究人员在分化方案中使用血清。然而，通常不清楚哺乳动物来源的血清中存在哪些因子以及它们是如何影响分化的。因此，使用转基因或血清的分化方案有缺点，原因在于这些方法的可重复性受到严重限制。因此，开发一种方法至关重要，其中人类多能干细胞通过限定的因子分化成熟为骨骼肌细胞和卫星细胞或骨骼肌组织，其中不需要转基因或血清。
此外，越来越多的证据表明，不仅化学刺激而且物理刺激在骨骼肌组织发育中发挥作用。因此，除了表面形貌和结构组成外，化学刺激和物理刺激的组合似乎有可能在体外可靠地产生功能性肌肉组织(廖(Liao)等人，(2008),帕韦西(Pavesi)等人，(2015))。然而，这些不同刺激在细胞分化和成熟过程中的时间顺序、持续时间和特性仍不清楚。
开发强大的分化和成熟方案是实现生产骨骼肌细胞和卫星细胞以及工程化骨骼肌组织非常重要的一步。
专利申请WO 2017/100498A1的发明人公开了以2D方法将人类多能干细胞无血清分化成骨骼肌成肌细胞的方案。然而，此程序需要通过流式细胞术对骨骼肌成肌细胞进行富集步骤，以从细胞池中去除未分化的细胞类型。通过流式细胞术进行的纯化不能规模扩展，与感染风险和细胞损失非常高有关，因此是细胞产品商业应用的关键障碍。
目前尚未成功介绍有效分化多能干细胞的方法—这是转基因和无血清的—其中特定细胞类型不需要进一步的富集步骤。具体而言，尚未成功介绍一种将多能干细胞有效分化为骨骼肌组织的方法，该方法介绍了化学刺激和物理刺激，同时避免使用转基因和血清。
沙里亚里(Shahriyari)等人，(2018)仅报告了初步工程化骨骼肌组织的生产。然而，沙里亚里等人缺乏关于生产本发明的工程化骨骼肌组织所必需的基本特征的信息。克莱默
Figure BDA0003692053310000021
等人，(2014)描述了从大鼠成肌细胞而非多能干细胞生产工程化骨骼肌。
发明内容
本发明描述了用于制备工程化骨骼肌组织以及骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法，其中使用的培养基是无血清的，并且限定了不同的化学物质及其浓度以及物理刺激。此外，本文所述的方法未使用转基因转染人类细胞。所述工程化骨骼肌细胞表现出成肌细胞特异性、肌管特异性或卫星细胞特异性基因标志物，证实了这些细胞类型的有效分化。所述骨骼肌组织尽管经过工程化生产，但具有非常好的刺激依赖的收缩性，并显示出响应于不同刺激频率的收缩。
本发明包括使多能干细胞分化并成熟为骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞或骨骼肌组织的方法。所述骨骼肌组织分散/包埋在细胞外基质中。
本发明涉及一种从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织的方法，包括以下步骤：
(i)通过在包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的基础培养基中培养多能干细胞，诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述无血清添加剂包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(i)中获得的所述细胞，诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，将所述细胞扩增和成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞；
(iv)通过在基础培养基中于机械刺激下培养步骤(iii)中获得的细胞(分散在细胞外基质中)，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)如步骤(i)中的无血清添加剂和(b)另外的无血清添加剂，所述另外的无血清添加剂包括白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)；
从而生产工程化骨骼肌组织。
此外，本发明涉及一种从多能干细胞生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法，包括以下步骤：
(i)通过在包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的基础培养基中培养多能干细胞，诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述无血清添加剂包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(i)中获得的所述细胞，诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的所述细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞，然后
(iv)通过在包含有效量的(a)如步骤(i)中的无血清添加剂和(b)另外的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(iii)中获得的所述细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述另外的无血清添加剂包括白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)
从而生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞。
此外，本发明涉及工程化骨骼肌组织，具有含卫星细胞的多核成熟骨骼肌纤维，并且没有血液供应和/或没有中枢神经系统控制。在这方面，骨骼肌纤维的存在可以通过用DAPI染色辅肌动蛋白检测。
此外，本发明涉及根据步骤(i)制备和获得的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞，其特征在于表达基因MSGN1和/或TBX6，其中MSGN1和/或TBX6的表达可以是通过流式细胞术和/或免疫染色确定。这些细胞表达所述mRNA SP5，其中SP5的表达可以通过RNA测序来确定。
此外，本发明涉及根据步骤(i)至(ii)产生和获得的肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞，其特征在于表达基因PAX3，其中PAX3的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色确定。这些细胞表达mRNA SIM1，其中SIM1的表达可以通过RNA测序来确定。
此外，本发明涉及根据步骤(i)至(iii)生产和获得的骨骼肌成肌细胞，其特征在于辅肌动蛋白的表达，其中辅肌动蛋白的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色骨骼肌成肌细胞来确定。
本发明进一步涉及根据步骤(i)至(iii)制备和获得的卫星细胞，其特征在于所述基因Pax7的表达，其中Pax7的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定，更优选地其中卫星细胞进一步表达Ki67。此外，根据本发明获得了骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，其中获得的卫星细胞在所有可用细胞量中的比例为至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，甚至更优选至少30％，通过流式细胞术检测Pax7的表达来确定；和/或其中获得的骨骼肌成肌细胞在所有可用细胞量中的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，通过流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
此外，本发明涉及根据步骤(i)至(iv)制备和获得的骨骼肌管，其特征在于含辅肌动蛋白的肌节结构的各向异性取向。
本文还公开了根据本发明的骨骼肌组织和/或根据本发明的细胞和/或根据本发明的骨骼肌管在体外药物测定中的用途。药物测试可以是毒性测定或在药理和基因治疗候选药物影响下的骨骼肌组织功能测定。
此外，本发明涉及用于医学的根据本发明的骨骼肌组织和/或细胞，和/或骨骼肌管。
更具体地，本发明涉及根据本发明的卫星细胞，用于治疗受损骨骼肌和/或治疗骨骼肌疾病，优选遗传性骨骼肌缺陷，具体是杜氏肌营养不良症和/或Becker-Kiener肌营养不良症和/或溶酶体贮积症，具体是庞贝氏病，优选其中所述骨骼肌疾病是杜氏肌营养不良症。
最后，本发明涉及以下体外方法：
一种用于测试候选药物对骨骼肌组织功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的骨骼肌组织，
(b)任选地对所述骨骼肌组织造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述骨骼肌组织与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
一种用于测试物质对骨骼肌组织毒性的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的骨骼肌组织，
(b)使步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测物质接触。
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
一种用于测试营养素和膳食补充剂对骨骼肌组织性能影响的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据本发明的骨骼肌组织，
(b)将步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
一种用于测试候选药物对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)任选地对步骤(a)的所述细胞造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述细胞与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
一种测试物质对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物毒性的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测物质接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
一种用于测试营养素和膳食补充剂对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的影响的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本发明的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
具体实施方式
本公开涉及一种从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织的方法，包括以下步骤：
(i)通过在包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的基础培养基中培养多能干细胞，诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述无血清添加剂包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，将所述细胞扩增和成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞；
(iv)通过在基础培养基中于机械刺激下培养步骤(iii)中获得的细胞(分散在细胞外基质中)，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)如步骤(i)中的无血清添加剂和(b)另外的无血清添加剂，所述另外的无血清添加剂包括白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)；
从而生产工程化骨骼肌组织。
在优选的实施方案中，所述多能干细胞来源于灵长类动物来源，特别是人类多能干细胞。在特别优选的实施方案中，所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、通过细胞核移植生产的多能干细胞和通过化学重编程生产的多能细胞，具体是其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。
“多能干细胞”能够分化成机体的任何细胞类型。因此，人类多能干细胞使获得例如骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的可能性很大。目前，最常用的多能细胞是诱导多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。人类ESC系首先由汤姆森(Thomson)等人生产(汤姆森等人，《科学》(Science)282:1145-1147(1998))。如今，人类ESC研究使一项新技术的研发成为可能，将体细胞重编程为类ES细胞。该技术是由山中(Yamanaka)等人在2006年研发的，并且也适用于人类细胞(高桥(Takahashi)和山中《细胞》(Cell)126:663-676(2006)和高桥,一敏(Kazutoshi)等人，《细胞》,131:(5)861-872(2007))。由此得到的诱导多能细胞(iPSC)表现出与ESC非常相似的行为，并且还能够分化成身体的任何细胞。此外，在另一实施方案中，可以使用孤雌生殖干细胞。孤雌生殖干细胞可以来源于哺乳动物，优选小鼠和人类，来源于体外激活未受精卵母细胞后发育的胚泡。这些细胞表现出多能干细胞的关键特征，因此它们能够在体外分化成任何细胞类型(埃斯佩耶(Espejel)S等人，(2014))。因此，所述多能干细胞可以选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞和孤雌生殖干细胞。然而，在本发明的语境中，所述多能干细胞不是通过在种系中改变人类的遗传特性或将人类胚胎用于工业或商业目的的方法生产的。在特别优选的实施方案中，选择诱导多能干细胞。
为了实现所述多能干细胞定向细胞分化成骨骼肌组织，在特定因子或添加剂的帮助下实现分化。通常，根据本发明的分化步骤在“基础培养基”的存在下进行。任何合适的基础培养基都可以用于所述方法。优选地，步骤(i)-(iv)中使用的所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、Hams F-10和Hams F-12。优选地，步骤(i)-(iv)中使用的所述基础培养基是补充有丙酮酸盐的DMEM。甚至更优选地，步骤(i)-(iv)中使用的所述基础培养基是补充有含有1g/l葡萄糖的丙酮酸盐的DMEM。基础培养基是可商购的或可以根据公开可用的配方(例如ATCC的目录)制备。在非常优选的实施方案中，所述基础培养基是含有1g/l葡萄糖和谷氨酰胺制剂(例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或GlutaMAXTM)的DMEM，并且由表3中列出的物质组成。如果认为合适，所述基础培养基可以补充有效浓度的非必需氨基酸。在优选的实施方案中，所述基础培养基补充有单一有效浓度的表2中列出的非必需氨基酸。步骤(ii)、(iii)和(iv)中的所述基础培养基可以独立地选自在步骤(i)中使用的所述基础培养基。然而，在优选实施方案中，步骤(i)-(iv)中的所述基础培养基是相同的。
一般而言，步骤(i)-(iv)的不同分化阶段可以使用具有特定阶段特征的表达基因来检测。一种可以测量基因表达的方法是RNA测序(RNA-Seq)。RNA测序也称为转录组分析。RNA测序是基于高通量方法确定RNA的核苷酸序列。为此，将RNA转换(转录)为cDNA，从而可以应用DNA测序方法。因此，RNA测序提供了有关表达mRNA的信息，并且特征在于低背景噪声、高分辨率和高复制率。本领域技术人员熟悉并能够进行mRNA测序的方法。本发明的实施例1显示了使用RNA测序测量的示例性数据。具体地，图4显示了在本发明分化方案期间0至60天的时间范围内不同基因的mRNA表达的时间过程。
NANOG、POU5F1(OCT4)和ZFP42的mRNA表达是多能干细胞的特征。这意味着表达这些标志物的细胞是多能的。
在根据本发明的多能干细胞分化期间，“中胚层分化”由步骤(i)中的特定因子/添加剂诱导。在所有双侧动物(两侧对称动物)以及人类中，中胚层是非常早期胚胎中的三个主要胚层之一。在双侧动物中，中胚层有三个主要组分：近轴中胚层、间介中胚层和侧板中胚层。双侧动物的所述近轴中胚层会产生骨骼肌等。中胚层分化的诱导以特定基因的基因表达为特征，例如MSGN1、TBX6和MEOX1的mRNA。对近轴中胚层表达特异的这些基因或其他基因的mRNA表达可以通过如本文所述的RNA测序来测量。
如上所述，步骤(i)的所述基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐的无血清添加剂。技术人员已知受体/酶激动剂或抑制剂的有效浓度或量随相应物质的可用性和生物活性而变化。
在一个实施方案中，FGF2的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml。
糖原合酶激酶3(GSK-3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其可选择性地将磷酸盐残基添加到其他蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上。抑制糖原合酶激酶3(GSK3)有助于激活Wnt信号通路以分化多能干细胞。例如，所述基础培养基中的GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐组成的组，优选所述GSK3抑制剂是CHIR99021。然而，可以使用任何适用于本发明所述方法的GSK3抑制剂。当所述GSK3抑制剂为CHIR99021时，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，并且最优选约10μM。
SMAD抑制剂抑制对调节细胞发育和生长至关重要的蛋白质。例如，所述基础培养基中的所述SMAD抑制剂选自由LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1组成的组，其中优选的所述SMAD抑制剂是LDN193189。然而，任何适用于本发明所述方法的SMAD抑制剂都可以使用。当所述SMAD抑制剂为LDN193189时，有效量为0.05-5μM，优选0.1-2.5μM，更优选0.2-1μM，甚至更优选0.25-0.8μM，甚至更优选0.3-0.75μM，甚至更优选0.35-0.7μM，甚至更优选0.4-0.6μM，甚至更优选0.45-0.55μM，并且最优选约0.5μM。技术人员已知抑制剂的有效浓度或量随相应物质的可用性和生物活性而变化，并且这适用于所有物质，例如蛋白质/肽、核苷酸或化合物。
在一个实施方案中，所述方法步骤(i)、(ii)、(iii)和(iv)中提供的无血清添加剂在所述培养基中的终浓度为50-500μg/ml转铁蛋白(优选70-300μg/ml转铁蛋白，更优选80-200μg/ml转铁蛋白，甚至更优选90-150μg/ml转铁蛋白，最优选约100μg/ml转铁蛋白)，
1-25μg/ml胰岛素(更优选2-13μg/ml胰岛素，更优选3-10μg/ml胰岛素，更优选4-6μg/ml胰岛素，最优选约5μg/ml胰岛素)，
0.001-0.1μg/ml黄体酮(优选0.002-0.05μg/ml黄体酮，更优选0.004-0.01μg/ml黄体酮，甚至更优选0.005-0.008μg/ml黄体酮，最优选约0.0063μg/ml黄体酮)，
5-50μg/ml腐胺(优选10-35μg/ml腐胺，更优选12-25μg/ml腐胺，甚至更优选14-18μg/ml腐胺，最优选约16μg/ml腐胺)；和
6-600nM硒(优选12-300nM硒，更优选20-150nM硒，甚至更优选25-50nM硒，最优选约30nM硒)或其生物可利用盐。在优选的实施方案中，硒以亚硒酸盐形式存在，其中在所述培养基中其有效浓度为1-30μg/l亚硒酸盐(优选2-20μg/l亚硒酸盐，更优选3-10μg/l亚硒酸盐，甚至更优选4-6μg/l亚硒酸盐，最优选约5μg/l亚硒酸盐)。
满足上述要求的无血清添加剂可以在市场上购买。例如，可以使用N2添加剂。在优选的实施方案中，所述无血清添加剂是浓度为0.1-10％(v/v)N2添加剂，优选0.3-7.5％(v/v)N2添加剂，更优选0.5-5％的N2添加剂，更优选0.75％-2％(v/v)N2添加剂，更优选0.9％-1.2％(v/v)N2添加剂，并且最优选约1％(v/v)N2添加剂。所述N2添加剂市售浓度是有效浓度的100倍，组成列于表1。这意味着1％(v/v)的所述N2添加剂对应于单一有效浓度。
在优选实施方案中，所述方法的步骤(i)进行24至132小时，优选48至120小时，更优选60至114小时，甚至更优选72至108小时，更优选84至102小时，最优选约96小时。步骤(i)的持续时间和物质(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的浓度可以通过监测诱导中胚层分化的效率来优化。如上所述，中胚层分化的效率可以通过RNA测序来追踪。例如，如果所述基因标志物MSGN1、TBX6和MEOX1中的一个或更多个的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选高至少10倍的表达值，更优选高20倍的表达值，甚至更优选高至少30倍的表达值，最优选高至少50倍的表达值)，则发生诱导中胚层分化，通过RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。
在根据本发明的方法的步骤(ii)中，诱导了“肌源性特化”。这个分化阶段的特征在于特定因子的表达。例如，mRNA Pax3在肌源性特化中表达，其表达可通过RNA测序确定(示意图见图1和图2；有关PAX3表达的实验数据见图4)。例如，如果所述基因标志物Pax3的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选表达值高至少10倍，更优选表达值高20倍，甚至更优选表达值高30倍)，则发生肌源性特化，通过RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。
如上所述，步骤(ii)包括三个培养步骤。具体地，步骤(ii)包括在基础培养基中以有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如在(i)中无血清添加剂培养从步骤(i)获得的细胞，接着在添加有效量的(d)HGF的所述培养基中继续培养，接着在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂，和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞。
如在步骤(i)中，步骤(ii)中的所述基础培养基可以选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、Hams F-10和Hams F-12。此外，所述基础培养基可以补充有非必需氨基酸和/或丙酮酸盐。步骤(ii)中所述基础培养基的示例性和优选实施方案可以类似于步骤(i)中示例性和优选实施方案进行选择。步骤(ii)中的所述基础培养基可以独立地选自步骤(i)中使用的所述基础培养基。然而，在优选实施方案中，步骤(i)和(ii)中的所述基础培养基是相同的。
例如，所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂选自由DAPT、RO4929097、司马西特(LY450139)、阿瓦西特(avagacestat，BMS-708163)、二苯并氮杂卓(YO-01027)、LY411575、IMR-1、L685458组成的组，优选其中所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂是DAPT。然而，可以使用适用于本发明所述方法的任何γ-分泌酶/NOTCH抑制剂。当所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂为DAPT时，其有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，并且最优选约10μM。
在步骤(ii)中，FGF2的有效量例如为15-30ng/ml，优选17.5-25ng/ml，更优选18-22ng/ml，甚至更优选19-21ng/ml，并且最优选约20ng/ml。
例如，HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml。
技术人员已知受体/酶激动剂或抑制剂的有效浓度或量随相应物质的可用性和生物活性而变化。
如本文所用，术语“敲除血清替代物”(knockout serum replacement，KSR)是指有效浓度的抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白和白蛋白。在优选的实施方案中，所述KSR另外包含有效浓度的硒或其生物可利用盐、谷胱甘肽和微量元素。在更优选的实施方案中，所述KSR包含有效浓度的表5所列物质。在最优选的实施方案中，所述KSR包含表5中所示浓度的物质。“敲除血清替代物”(KSR)在现有技术中是已知的并且可以根据专利申请WO 98/30679的第27-29页上的配方制备。或者，KSR是可商购的，例如购自吉布科公司(Gibco)。
在优选的实施方案中，所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，最优选约10％(v/v)KSR。在非常优选的实施方案中，所述KSR在还原剂存在下使用。可以使用任何合适的还原剂，还原剂的实例是β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油。β-巯基乙醇的使用浓度通常为0.02-0.5mM，更优选地为0.05-0.02mM，最优选地为0.1mM。或者，可以使用α-硫代甘油，例如使用浓度为0.02-0.5mM，更优选浓度为0.05-0.02mM，最优选浓度为约0.1mM。
在一个实施方案中，步骤(ii)中的所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)所述无血清添加剂存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2、(c)无血清添加剂和(d)HGF存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)存在下进行72至120小时，优选76至114小时，更优选84至108小时，甚至更优选90至102小时，并且最优选约96小时。
在本发明所述方法的步骤(iii)中，所述细胞有利地成熟并扩增成骨骼肌成肌细胞和卫星细胞。骨骼肌成肌细胞的特征在于具有融合能力，因此能够在之后的步骤中融合成骨骼肌管。卫星细胞，也称为肌肉干细胞，是小而多能的细胞。卫星细胞能够产生(i)卫星细胞或(ii)分化的骨骼肌成肌细胞。更具体地说，激活后，卫星细胞可以重新进入细胞周期增殖并分化成成肌细胞。所述方法的这个分化阶段的特征在于特定因子的表达。例如，Pax7的表达是卫星细胞存在的特征。同时，MyoD的表达是骨骼肌成肌细胞的特征，这些细胞各自的表达可以通过RNA测序来确定(示意图见图1和图2；MyoD1和PAX7表达的实验数据见图4)。例如，如果所述基因标志物MyoD的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选高至少10倍，更优选高15倍的表达值，甚至更优选高20倍的表达值)，则存在骨骼肌成肌细胞，通过使用RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。例如，如果所述基因标志物PAX7的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选表达值高至少10倍，更优选表达值高15倍，甚至更优选表达值高20倍)，则存在卫星细胞，通过RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。
如上所述，步骤(iii)的所述基础培养基包含有效量的(a)HGF，(b)如(i)中的无血清添加剂，和(c)敲除血清替代物(KSR)。如在步骤(i)和(ii)中，步骤(iii)中的所述基础培养基可以选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、Hams F-10和Hams F-12，并且所述基础培养基可以补充有非必需氨基酸和/或丙酮酸盐。步骤(iii)中的所述基础培养基的示例性和优选实施方案可以类似于步骤(i)中的示例性和优选实施方案进行选择。步骤(iii)中的所述基础培养基可以独立于步骤(i)和(ii)中使用的基础培养基进行选择。然而，在优选实施方案中，步骤(i)、(ii)和(iii)中的所述基础培养基是相同的。
步骤(iii)中的所述KSR和任选的还原剂包括与步骤(ii)中的所述KSR和任选的还原剂相同的优选实施方案。因此，所述KSR可以由本领域技术人员制备或进行商业购买。
在步骤(iii)中，HGF的有效量例如为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或
所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；具体是其中所述KSR在还原剂(如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油)存在下使用。
本领域技术人员已知受体/酶激动剂或抑制剂的有效量或有效浓度随相应物质的可用性和生物活性而变化。
在根据本发明所述方法的步骤(iv)中，所述细胞有利地成熟为骨骼肌管和卫星细胞。骨骼肌管由骨骼肌成肌细胞融合而成。因此，骨骼肌管是成熟的成肌细胞融合成细长的肌管而形成的多核细胞结构。骨骼肌管也称为肌细胞或肌纤维。图2提供了工程化骨骼肌组织所经历发育阶段的示意图，并且所述工程化骨骼肌组织的形成在现有技术中被称为肌生成。骨骼肌管(肌肉纤维)的特征在于含辅肌动蛋白的肌节结构的各向异性取向。在融合的骨骼肌管附近形成具有再生能力的卫星细胞生态位。所述卫星细胞生态位在所述骨骼肌管的外部，但与骨骼肌管紧密接触。所述卫星细胞生态位具有解剖学特征，也在天然骨骼肌组织中形成。因此，与生成的卫星细胞一起，它是所述工程化骨骼肌组织的另一个理想品质特征。这个分化阶段的特征也在于特定因子的表达。例如，Pax7的表达是卫星细胞存在的特征。同时，肌生成素和辅肌动蛋白的表达是骨骼肌管的特征，它们各自的表达可以通过RNA测序来确定(示意图概览见图1和图2；图4示出了关于PAX7(配对框7)、ACTN2(辅肌动蛋白α2)、DMD(肌营养不良蛋白)和MYH3(肌球蛋白重链3)表达的实验数据)。例如，如果PAX7的mRNA的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选高至少10倍的表达值，更优选高15倍的表达值，甚至更优选高20倍的表达值)，则存在卫星细胞，通过RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。例如，如果所述基因标志物ACTN2的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选表达值高至少50倍，更优选表达值高至少100倍，甚至更优选表达值高150倍)，则存在骨骼肌管，通过RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。事实上，与多能干细胞相比，所述DMD和MYH3基因标志物的表达值通常高至少200倍(优选高至少500倍的表达值，更优选高1000倍的表达值)。
如上所述，步骤(iii)中获得的细胞分散在细胞外基质中并在机械刺激下成熟。例如，可以借助如本领域公知和使用的拉伸装置进行机械刺激。优选地，所述拉伸装置施加静态、阶段性或动态应变。因此，机械应变可以是(a)静态的、(b)阶段性的或(c)动态的。静态应变的实例是等距肌肉收缩，其中肌肉只经历张力变化而长度没有变化。因此，在等距肌肉收缩期间，肌肉中不会发生缩短。阶段性应变可以是准等张肌肉收缩，其中在收缩过程中肌肉缩短，施加在肌肉上的张力保持不变。例如，当肌肉悬挂在柔性支撑物上以促进增张力性收缩时，可能会发生动态应变。在增张力性收缩中，肌肉长度和肌肉张力都会发生变化。优选地，步骤(iv)中的机械刺激为静态机械刺激，即静态张力(静态应变)。这意味着步骤(iii)的所述细胞和细胞外基质受到力和相反力(反作用力)的作用。
如上所述，步骤(iv)的所述基础培养基包含有效量的(a)如(i)中的无血清添加剂，和(b)另外的无血清添加剂，所述另外的无血清添加剂包含白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
步骤(iv)中所述基础培养基的示例性和优选实施方案可以类似于步骤(i)中的示例性和优选实施方案进行选择。
所述方法的步骤(iv)中另外的无血清添加剂被配制使得所述另外的无血清添加剂提供以下物质的最终浓度：0.5-50mg/ml白蛋白(优选1-40mg/ml，更优选2-30mg/ml，甚至更优选3-20mg/ml，甚至更优选4-10mg/ml，最优选4.5-7.5mg/ml，例如约5mg/ml)；
1-100μg/ml转铁蛋白(优选2-90μg/ml，更优选3-80μg/ml，甚至更优选4-70μg/ml，甚至更优选5-60μg/ml，更优选6-50μg/ml，更优选7-40μg/ml，更优选8-30μg/ml，更优选9-20μg/ml，例如约10μg/ml)；
0.1-10μg/ml乙醇胺(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，甚至更优选0.4-7μg/ml，甚至更优选0.5-6μg/ml，更优选0.6-5μg/ml，更优选0.7-4μg/ml，更优选0.8-3μg/ml，最优选1-2.5μg/ml，例如约2μg/ml)；
17.4-1744nM硒或其生物可利用盐(优选35-850nM，更优选70-420nM，甚至更优选120-220μg/ml，最优选约174nM)；
0.4-40μg/ml L-肉碱HCl(优选0.5-30μg/ml，更优选1-20μg/ml，甚至更优选2-10μg/ml，更优选3-5μg/ml，最优选约4μg/ml)；
0.05-5μl/ml脂肪酸添加剂(优选0.1-4μl/ml，更优选0.2-3μl/ml，甚至更优选0.3-3μl/ml，更优选0.4-2μl/ml，最优选0.45-1μl/ml，例如约0.5μl/ml)；和
0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)(优选0.001-0.01μg/ml，更优选0.002-0.0075μg/ml，甚至更优选0.003-0.005μg/ml，最优选约0.004μg/ml)。
所述脂肪酸添加剂可以包括例如亚油酸和/或亚麻酸。
在优选的实施方案中，所述另外的无血清添加剂进一步包括
0.1-10μg/ml氢化可的松(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，甚至更优选0.4-7μg/ml，甚至更优选0.5-6μg/ml，甚至更优选0.6-5μg/ml，甚至更优选0.7-4μg/ml，甚至更优选0.8-3μg/ml，最优选0.9-2μg/ml，例如约1μg/ml)。在同样优选的实施方案中，所述另外的无血清添加剂进一步包含0.3-30μg/ml胰岛素(优选0.5-25μg/ml，更优选1-20μg/ml，甚至更优选1.5-15μg/ml，甚至更优选2-10μg/ml，最优选2.5-5μg/ml，例如约3μg/ml)。例如，硒的生物可利用盐是亚硒酸钠，使得在所述基础培养基中提供的终浓度为0.003-0.3μg/ml(优选0.005-0.2μg/ml，更优选0.01-0.1μg/ml，甚至更优选0.02-0.05μg/ml，并且最优选0.03μg/ml，例如约0.032μg/ml)。
此外，所述另外的无血清添加剂还可包含一种或更多种选自由氢化可的松、抗坏血酸、维生素A、D-半乳糖、亚麻酸、黄体酮和腐胺组成的组。这些组分有利于细胞活力。各组分的合适浓度是本领域技术人员已知的或可以通过常规措施容易地确定。
步骤(iv)中提到所述另外的无血清添加剂的实例可以根据公开的方案制备(也参见布鲁尔(Brewer)等人，1993)或商业购买。例如，可以使用B27(表4)。在优选的实施方案中，所述B27添加剂的用量为0.1-10％B27，优选0.5-8％，更优选1-6％，更优选1.5-4％，甚至更优选1.5-4％，并且最优选约2％B27。
本发明可以在步骤(i)之前进行接种步骤，并且获得的所述工程化骨骼肌组织称为生物工程化骨骼肌(BSM)。在所述接种步骤中，在ROCK抑制剂存在下将所述多能干细胞接种在干细胞培养基中，优选其中所述接种步骤在步骤(i)之前18-30小时进行。例如，所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔，和羟基法舒地尔组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，其中特别优选地所述ROCK抑制剂是Y27632。然而，可以使用任何适用于本发明所述方法的ROCK抑制剂。本领域技术人员应当理解，有效量的ROCK抑制剂的浓度随所讨论抑制剂的可用性和抑制常数而变化。例如，在Y27632的情况下，用于所述接种步骤的培养基的使用浓度可以是0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选约5μM。在所述接种步骤中可以使用干细胞培养基，原则上可以使用任何适合所述方法的干细胞培养基。合适的干细胞培养基是本领域技术人员已知的，其中特别优选iPS-Brew XF干细胞培养基。
此外，在所述接种步骤中，在添加所述干细胞培养基之前，在预混物中存在一种或更多种细胞外基质组分的情况下，可以首先将所述多能干细胞接种成工程化形式。在所述接种步骤中，在步骤(i)之前将所述多能干细胞分散到细胞外基质中，使所述细胞包埋在所述细胞外基质中以分化成熟为三维结构的工程化骨骼肌组织。
所述“细胞外基质”充当支架，为细胞生长和分化提供结构和功能微环境。尽管每种天然组织的细胞外基质的组成都是独特的，但所述细胞外基质的主要组分是胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及各种类型的糖胺聚糖和蛋白聚糖。蛋白聚糖形成一类糖基化特别严重的糖蛋白，可在生物体的细胞之间实现稳定。在这里，它们与其他蛋白聚糖和透明质酸以及诸如胶原蛋白等蛋白质(细胞外基质的主要组分)形成大的复合物。层粘连蛋白是一种类似于胶原蛋白的糖蛋白。纤连蛋白也是一种对细胞外胶原蛋白聚合很重要的糖蛋白，并且可能在组织修复等方面发挥重要作用。所述预混物中细胞外基质的组分优选是胶原蛋白，优选I型胶原蛋白，更优选牛来源、人类来源或海洋来源，特别是牛来源的胶原蛋白。任选地，所述细胞外基质另外包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白。
所述多能干细胞通常以1-6×106个细胞/ml和0.7-1.4mg/ml胶原蛋白的比例接种在培养基中。在一个实施方案中，所述预混物包含5-15％(v/v)，优选7.5％-12.5％(v/v)，更优选9-11％(v/v)，最优选约10％(v/v)作为细胞外基质组分的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞渗出物。在特别优选的实施方案中，所述渗出物是基质胶。所述预混物的pH值通常介于pH 7.2和pH 7.8之间。基质胶是本领域技术人员已知的并且在现有技术中有进一步说明(休斯(Hughes)等人，2010)。
作为EHS小鼠肉瘤细胞渗出物的替代物，所述预混物可包含基质细胞，其中所述基质细胞产生所述细胞外基质组分胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或蛋白聚糖。所述预混物的pH值通常介于pH 7.2和pH 7.8之间。
在优选的实施方案中，在1小时后将所述干细胞培养基添加到工程化形式的预混物中，并且所述干细胞培养基优选包含有效浓度的KSR和FGF2。例如，所述干细胞培养基可包含5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR。
FGF2的有效量通常为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/mlFGF2。
当制备BSM时，步骤(iii)进行7-11天，优选8-10天，并且最优选约9天。
或者，所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞可以在步骤(iii)之后和步骤(iv)之前的额外步骤中接种，并且获得的工程化骨骼肌组织称为工程化骨骼肌(ESM)。在此，在预混物中存在一种或更多种细胞外基质组分的情况下，将所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞接种成工程化形式。优选地，所述预混物中细胞外基质组分是胶原蛋白，优选I型胶原蛋白，更优选地牛来源、人类来源或海洋来源的，特别是牛来源的胶原蛋白，任选地其中所述细胞外基质另外包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白。在步骤(iii)之后和步骤(iv)之前的接种步骤中，将所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞接种在培养基中，例如，以1-10×106个细胞/ml和0.7-1.4mg/ml胶原蛋白的比例接种。
在一个实施方案中，所述预混物包含5-15％(v/v)，优选7.5％-12.5％(v/v)，更优选9-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)作为细胞外基质组分的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞渗出物。在特别优选的实施方案中，所述渗出物是基质胶。所述预混物的pH值通常介于pH 7.2和pH 7.8之间。
作为EHS小鼠肉瘤细胞渗出物的替代物，所述预混物可包含基质细胞，其中所述基质细胞产生细胞外基质组分胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或蛋白聚糖。所述预混物的pH值通常介于pH 7.2和pH 7.8之间。
在优选的实施方案中，大约1小时后，将如在步骤(iii)中使用的所述基础培养基添加到工程化形式的预混物中，其中所述培养基另外包含有效量的ROCK抑制剂。例如，所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组。优选地，所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组。更优选地，所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，其中特别优选地所述ROCK抑制剂是Y27632。然而，可以使用任何适用于本发明方法的ROCK抑制剂。本领域技术人员已知有效量的ROCK抑制剂的浓度随所讨论抑制剂的可用性和抑制常数而变化。例如，在Y27632的情况下，用于接种步骤的所述培养基的使用浓度可以是0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选约5μM。
在制备ESM时，在步骤(iii)和步骤(iv)之间发生的接种步骤后约1天，将所述培养基更换为步骤(iii)中使用的培养基，然后在该培养基中进一步培养所述细胞5-9天，优选6-8天，最优选约7天。
在BSM或ESM的制备中，所述工程化形式可以是，例如，环状、带状、线状、片状、袋状或柱状的形式，任选地其中单个骨骼肌组织可以是融合。这意味着可以融合单个和/或不同的几何形状以形成骨骼肌组织，从而可以实现不同的肌肉形状。尤其是环状、线状或带状的形式可用于体外方法中的应用，例如用于毒性测试。通常，所述工程化形式是通过浇注所述预混物获得的，因此通常可以生产任何所需的可浇注工程化形式。
步骤(iv)可以进行至少19天，优选至少28天，更优选至少56天，甚至更优选至少120天，尤其是至少240天，其中更长时间的培养也是可能的。发明人已经能够进行240天(8个月)的培养，但没有人反对更长的培养时间。
与现有技术中公开的许多方法相比，根据本发明的方法不包括使用分化或成熟相关转基因的转染步骤。优选地，所述方法不包括肌源性转基因，更优选地，所述方法不包括所述Pax7或MyoD转基因。“转基因”是指引入细胞中的基因。这样的转基因可以以DNA(例如，以质粒的形式)或RNA的形式转染到细胞中。然后所述转基因在细胞中表达，从而改变细胞的特性。例如，转录因子可以作为转基因引入所述细胞，然后影响其他基因的表达。因此，肌源性转基因可以提高细胞群中骨骼肌成肌细胞的比例。然而，使用转基因(如Pax7或MyoD)的转染实验具有不同的转染效率，这取决于所述实验和细胞类型。这使得需要转染步骤的方法的可控性降低，因此可重复性降低。因此，无转基因方法优于需要转基因转染的方法。然而，不能排除多能干细胞以另一种形式进行基因修饰，例如，以模拟疾病模式。此外，不排除细胞类型和/或细胞功能(例如钙或电压信号)的基因工程标记或通过例如光遗传学机制(例如收缩频率)控制细胞功能。
根据本发明的方法的另一个优点是无须进一步选择特定细胞类型(例如，骨骼肌成肌细胞)的步骤。优选地，所述方法不包括通过细胞选择进行的富集步骤，更优选地不包括通过基于抗体的细胞选择进行的富集步骤。这是有好利的，因为不需要在另外的步骤中从细胞的环境中提取细胞。一种基于抗体的细胞选择的可能方法是流式细胞术，这是本领域技术人员已知的。通过流式细胞术进行此类细胞选择与显著的细胞损失有关。因此，通过流式细胞术进行纯化不能够进行规模扩展，与感染风险相关，因此是细胞产品商业应用的关键障碍。由于本发明的方法不需要进行细胞选择，因此本发明工程化骨骼肌组织和细胞的生产是规模可扩展的并且适用于商业或医学应用。
此外，所述方法不含血清，因此对于不同种类的血清批次没有差异。这为生产工程化骨骼肌组织提供了一个健全的可重复方案，其中限定了所有必要的化学和物理刺激。
本发明还涉及一种从多能干细胞生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法，包括以下步骤：
(i)通过在包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的基础培养基中培养多能干细胞，诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述无血清添加剂包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞，然后
(iv)通过在包含有效量的(a)如(i)中的无血清添加剂和(b)另外的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(iii)中获得的细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述另外的无血清添加剂包括白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，
从而产生骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞。
例如，在该方法中产生细胞中，骨骼肌成肌细胞在所有可用细胞量的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，通过流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
优选地，所述方法实现的卫星细胞在所有可用细胞量中的比例为至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，最优选至少30％，通过流式细胞术检测Pax7的表达来确定。
“流式细胞术”的方法是技术人员已知的。在流式细胞术中，检测细胞群的物理和/或化学特性。对于本文所述的本发明，可以使用荧光染色检测以分化成骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或卫星细胞为特征的骨骼肌特异性蛋白质的存在。具体来说，蛋白质肌节α-辅肌动蛋白、肌生成素、Pax7和MyoD与初级抗体一起培养，从而进行标记。借助荧光标记的二级抗体，可以检测所述骨骼肌特异性细胞。
所述方法相对于现有技术的主要优点是它不需要富集细胞(例如骨骼肌成肌细胞)的步骤。优选地，所述方法不包含通过细胞选择进行的富集步骤，更优选地不包含通过基于抗体的细胞选择(例如，流式细胞术)进行的富集步骤。这意味着根据本发明的方法不需要细胞选择来获得高纯度的骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和/或卫星细胞。本文公开的细胞选择方法仅用于分析目的，以证明所产生骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的高纯度。(参见图5)。
如上所述，步骤(i)的所述基础培养基包括有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂，和(d)无血清添加剂，包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐。
例如，所述基础培养基中的GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐组成的组，其中优选所述GSK3抑制剂CHIR99021。然而，可以使用任何适用于本发明方法的GSK3抑制剂。当所述GSK3抑制剂为CHIR99021时，有效量为4-18μM，优选5-16μM，更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选8-13μM，甚至更优选9-12μM，甚至更优选9.5-11μM，最优选约10μM。
步骤(i)-(iii)的优选和示例性实施方案在用于制备工程化骨骼肌组织的方法中进行了说明，并且可以类似于用于制备骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法应用。
各个分化阶段可以通过本领域技术人员已知的简单实验证据来确定。例如，发明人已经使用荧光显微镜分析了细胞。这涉及骨骼肌特异性转录因子(Pax7、MyoD和肌生成素)的免疫染色。在所述方法的步骤(iii)之后，荧光图像显示表达Pax7、MyoD和肌生成素的细胞比例很高(图3)。所述方法表明通过所述方法生成卫星细胞(Pax7)以及骨骼肌成肌细胞(MyoD和肌生成素)。
在本发明方法的步骤(iv)中，所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞。骨骼肌管由骨骼肌成肌细胞融合而成。因此，骨骼肌管是由成熟的成肌细胞融合成细长肌管形成的多核细胞结构。如用于生产骨骼肌组织方法的步骤(iv)中所述，该分化阶段的特征还在于特定因子的表达。例如，Pax7的表达是卫星细胞存在的特征。同时，肌生成素和辅肌动蛋白的表达是骨骼肌管的特征，它们各自的表达可以通过RNA测序来确定(示意图见图1和图2；PAX7、ACTN2、DMD和MYH3表达的实验数据见图4)。例如，如果所述基因标志物PAX7的表达值比所述多能干细胞高至少5倍(优选高至少10倍的表达值，更优选高20倍的表达值)，则存在卫星细胞，使用RNA测序以“每千碱基百万读数”来测量。例如，如果所述基因标志物ACTN2的表达值比多能干细胞高至少5倍(优选表达值高至少50倍，更优选表达值高100倍，甚至更优选表达值高150倍)，则存在骨骼肌管，通过RNA测序以“每千碱基百万读数”测量。与所述多能干细胞相比，所述基因标志物DMD和MYH3甚至表现出高至少200倍的表达值(优选高至少500倍的表达值，更优选高1000倍的表达值)。
如上所述，步骤(iv)的所述基础培养基包含有效量的(a)如(i)中的无血清添加剂，和(b)另外的无血清添加剂，包含白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
配制所述方法步骤(iv)中的所述另外无血清添加剂，使得所述另外的无血清添加剂提供以下物质的最终浓度：0.5-50mg/ml白蛋白(优选1-40mg/ml，更优选2-30mg/ml，甚至更优选3-20mg/ml，甚至更优选4-10mg/ml，并且最优选4.5-7.5mg/ml，例如约5mg/ml)；
1-100μg/ml转铁蛋白(优选2-90μg/ml，更优选3-80μg/ml，甚至更优选4-70μg/ml，甚至更优选5-60μg/ml，更优选6-50μg/ml，更优选7-40μg/ml，更优选8-30μg/ml，更优选9-20μg/ml，例如约10μg/ml)；
0.1-10μg/ml乙醇胺(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，甚至更优选0.4-7μg/ml，甚至更优选0.5-6μg/ml，更优选0.6-5μg/ml，更优选0.7-4μg/ml，更优选0.8-3μg/ml，最优选1-2.5μg/ml，例如约2μg/ml)；
17.4-1744nM硒或其生物可利用盐(优选35-850nM，更优选70-420nM，甚至更优选120-220μg/ml，最优选约174nM)；
0.4-40μg/ml L-肉碱HCl(优选0.5-30μg/ml，更优选1-20μg/ml，甚至更优选2-10μg/ml，更优选3-5μg/ml，最优选约4μg/ml)；
0.05-5μl/ml脂肪酸添加剂(优选0.1-4μl/ml，更优选0.2-3μl/ml，甚至更优选0.3-3μl/ml，更优选0.4-2μl/ml，并且最优选0.45-1μl/ml，例如约0.5μl/ml)；和
0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)(优选0.001-0.01μg/ml，更优选0.002-0.0075μg/ml，甚至更优选0.003-0.005μg/ml，最优选约0.004μg/ml)。
在优选的实施方案中，所述另外的无血清添加剂进一步包括
0.1-10μg/ml氢化可的松(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，甚至更优选0.4-7μg/ml，甚至更优选0.5-6μg/ml，甚至更优选0.6-5μg/ml，甚至更优选0.7-4μg/ml，甚至更优选0.8-3μg/ml，最优选0.9-2μg/ml，例如约1μg/ml)。在同样优选的实施方案中，所述另外的无血清添加剂进一步包含0.3-30μg/ml胰岛素(优选0.5-25μg/ml，更优选1-20μg/ml，甚至更优选1.5-15μg/ml，甚至更优选2-10μg/ml，最优选2.5-5μg/ml，例如约3μg/ml)。例如，硒的生物可利用盐是亚硒酸钠，使得在所述基础培养基中提供的终浓度为0.003-0.3μg/ml(优选0.005-0.2μg/ml，更优选0.01-0.1μg/ml，甚至更优选0.02-0.05μg/ml，最优选0.03μg/ml，例如约0.032μg/ml)。
此外，所述另外的无血清添加剂还可包含一种或更多种组分，选自由维生素A、氢化可的松、D-半乳糖、亚麻酸、黄体酮和腐胺组成的组。这些组分有利于细胞活力。各组分的合适浓度是本领域技术人员已知的或可以通过常规措施容易地确定。
步骤(iv)中提到的所述另外的无血清添加剂也是市售的。例如，可以使用B27。在优选的实施方案中，所述B27添加剂的用量为0.1-10％B27，优选0.5-8％，优选1-6％，更优选1.5-4％，甚至更优选1.5-4％，最优选约2％B27。
此外，该方法的步骤(iv)可以进行至少30天，优选至少35天，更优选至少40天，甚至更优选至少至50天。
该方法的步骤(i)之前可以是接种步骤，其中在ROCK抑制剂存在下将所述多能干细胞接种在干细胞培养基中，优选其中所述接种步骤在步骤(i)之前18-30小时进行，优选20-28小时，更优选22-26小时，甚至更优选23-25小时，最优选约24小时。例如，所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，其中特别优选地所述ROCK抑制剂是Y27632。然而，可以使用任何适用于本发明方法的ROCK抑制剂。本领域技术人员理解有效量的ROCK抑制剂的浓度随所讨论抑制剂的可用性和抑制常数而变化。例如，在Y27632的情况下，用于接种步骤的培养基的使用浓度可以是0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选约5μM。在所述接种步骤中可以使用干细胞培养基，原则上可以使用任何适合该方法的干细胞培养基。合适的干细胞培养基是本领域技术人员已知的，特别优选iPS-Brew XF干细胞培养基。优选地，所述干细胞培养基包含有效浓度的KSR和FGF2。具体地，所述干细胞培养基包含例如5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；和/或
1-15ng/ml FGF2，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml FGF2。
与骨骼肌组织的生产方法一样，用于生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞方法步骤(i)-(iv)的分化阶段可以使用具有特定阶段特征的被表达基因来检测。在该方法(类似于生产骨骼肌组织的方法)中使用的RNA测序方法。因此，可以根据分化阶段检测相同的被表达基因(即MSGN1、TBX6、MEOX1、PAX3、PAX7、MYOD1、ACTN2、DMD、MYH3)。
现有技术中公开的用于获得骨骼肌细胞的传统方法通常需要大量的消化方案和/或通过流式细胞术进行的细胞选择步骤。消化方案将细胞转移到不同的环境，使得它们失去细胞-细胞连接以及细胞-基质连接。这破坏了细胞外环境和发育过程中形成的细胞类型的空间分布，并可能对难以控制的骨骼肌分化过程产生抑制作用。本发明最大限度地减少消化步骤的数量，并且不需要细胞选择来富集例如骨骼肌成肌细胞，因为复杂的方案产生了高纯度的骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞(示例性细胞群显示在至少70％辅肌动蛋白阳性和至少30％PAX7阳性的实例中，另请参见图5)。
通过根据本发明的方法，可以获得以工程化方式生产的具有有利特性的骨骼肌组织。在以工程化方式生产的骨骼肌组织中，可以通过染色辅肌动蛋白来检测骨骼肌管的存在(见图8)。具体地，所述骨骼肌组织不包含分化或成熟相关的转基因，优选其中所述骨骼肌组织不包含肌源性转基因，更优选其中所述骨骼肌组织不包含转基因Pax7或MyoD。与天然骨骼肌组织相比，所述工程化骨骼肌组织，例如所述BSM或ESM，没有血液供应或中枢神经系统控制。中枢神经系统是本领域技术人员已知的，并且由脊椎动物的脑和脊髓组成。例如，所述工程化骨骼肌组织也不受神经细胞的神经支配。血液供应是指肌肉的血管形成，这为肌肉提供血液。与天然骨骼肌组织的另一个区别是，工程化骨骼肌组织没有通过肌腱部分或骨骼的肌肉骨骼附着，而是完全离体发育成工程化骨骼肌。因此，所述工程化骨骼肌组织与天然骨骼肌组织明显不同。尽管是由工程化生产的，但根据本发明的骨骼肌组织表现出天然骨骼肌的许多特征。这些特征包括融合肌细胞(肌肉纤维、多核骨骼肌管)合胞体的形态特征和收缩性能(正向力-频率比和强直性收缩)。与现有技术的组织不同，卫星细胞生态位与骨骼肌纤维直接接触。此外，根据本发明生产的骨骼肌组织表现出典型的横纹骨骼肌纤维，骨骼肌组织由许多肌纤维(合胞体)组成。本领域技术人员已知天然骨骼肌组织具有多核骨骼肌纤维，每条骨骼肌纤维由串在一起的肌节组成。因此，在肌动蛋白染色或辅肌动蛋白染色中，多核骨骼肌纤维可以通过其特征性横纹骨骼肌图案来识别，因为所述肌动蛋白/辅肌动蛋白在肌节内染色。所述肌节具有严格、规则的结构；它们排成一排，共同形成多核肌纤维。这意味着特征性横纹骨骼肌图案证明多核骨骼肌纤维已经形成。在辅肌动蛋白或肌动蛋白和Pax7染色后，可以通过荧光显微镜观察特征性骨骼肌组织结构(具有卫星细胞生态位的骨骼肌纤维)。在本发明中，发明人对工程化骨骼肌组织中的结构蛋白肌动蛋白进行了染色，图8中的荧光图像示例性说明了特征性条纹图案。
工程化骨骼肌组织的一个关键功能特征是所述组织响应于电刺激而收缩，因此它产生力。例如，可以通过测量收缩输出来确定这种产生力的特征。这些收缩实验测量工程化骨骼肌组织响应电刺激的收缩频率和收缩力。在37℃、5％CO2和95％O2下连续充气的条件下，在含有Tyrode溶液(例如，以mmol/L计：120NaCl、1MgCl2、1.8CaCl2、5.4KCl、22.6NaHCO3、4.2NaH2PO4、5.6葡萄糖和0.56抗坏血酸盐)的器官浴(弗尔医疗器械公司(
Figure BDA0003692053310000191
MedicalInstruments))中测试了环状形式的骨骼肌组织。工程化骨骼肌组织被机械拉伸，并且通常在1-100Hz(4ms矩形脉冲；200mA)范围内的电场刺激频率下测量最大力幅值(收缩力＝FOC)。根据本发明组织的示例性测量方法在图6B、图6C、图7B和图7C中示出。这些收缩实验表明，工程化骨骼肌组织在响应于电刺激产生力时表现出特别优越的特性。工程化骨骼肌组织响应于1Hz和100Hz之间的刺激频率显示出可重复的收缩频率和收缩力。通常，在1Hz的单次刺激下，收缩和完全松弛大约需要0.5秒。因为收缩和松弛时间大约需要0.5秒，所以在较高的刺激频率下会形成初期或完全的强直收缩。在增加的刺激频率下，天然骨骼肌组织中也形成强直收缩，因此即使在这方面，所述工程化骨骼肌组织的行为也类似于天然骨骼肌组织。此外，发明人能够证明肌肉组织的收缩力随着收缩频率的增加而增加(正向力-频率关系)。这些特性与天然骨骼肌组织一致，后者也表现出单次收缩和强直性收缩，以及响应电刺激的正向力-频率关系。不像所述工程化骨骼肌组织，天然肌肉组织中的电脉冲由神经元的动作电位产生，而所述工程化骨骼肌组织可以自发并响应电刺激而收缩。
如图6B、图6C、图7B、图7C和图8所示，通过本发明所述方法产生的工程化骨骼肌组织特征性形成多核肌纤维(骨骼肌管)并且响应于电刺激而产生力。通常，所述工程化骨骼肌组织在200mA的100Hz刺激下可产生的收缩力为至少0.3毫牛顿(mN)，优选至少0.4mN，更优选至少0.5mN，更优选至少0.6mN，更优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，并且最优选至少2mN。
原则上，所述工程化骨骼肌组织可以具有任何所需的形式。例如，它可以具有的工程化形式为环状、带状、线状、片状、袋状或柱状，其中任选地融合了单个骨骼肌组织。例如，在本文的实例中，所述骨骼肌组织的形式为环状。然而，单个和/或不同的几何形状也可以根据需要融合到骨骼肌组织中，从而实现许多其他不同的肌肉形式。尤其是环状、线状、片状或带状的形式可用于体外方法中的应用，例如用于测试毒性或用于体内肌肉修复的治疗应用。通常，工程化形式已经通过浇注预混物获得，因此通常可以生产任何可浇注的工程化形式。
此外，本发明包括根据本发明的步骤(i)获得的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞，其特征在于所述MSGN1和/或TBX6基因的表达，其中MSGN1和/或TBX6的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。这些细胞的特征还在于它们表达SP5的mRNA，其中SP5的表达可以通过RNA测序来确定。
此外，本发明涉及根据本发明的步骤(ii)获得的、由本发明的步骤(i)和(ii)产生的肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞，其特征在于所述基因PAX3的表达，其中PAX3的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。这些细胞的特征在于它们表达SIM1的mRNA，其中SIM1的表达可以通过RNA测序来确定。
此外，本发明涉及根据本发明的步骤(iii)获得的、由本发明的步骤(i)至(iii)产生的骨骼肌成肌细胞，其特征在于辅肌动蛋白的表达，其中辅肌动蛋白的表达可以在骨骼肌成肌细胞中通过流式细胞术和/或免疫染色确定。
本公开进一步提供了卫星细胞，其可根据本文公开的方法的步骤(iii)获得并且可通过本文公开方法的步骤(i)至(iii)生产，其特征在于所述基因Pax7的表达。在这方面，Pax7的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。卫星细胞的特征在于活性或可激活的细胞周期，然后表达Pax7和Ki67。在特别优选的实施方案中，所述卫星细胞因此进一步表达Ki67。在组织损伤(例如，通过压力损伤、心脏毒素处理、辐照或冻伤造成的组织损伤)后更频繁地观察到工程化骨骼肌组织中的细胞周期激活，并在内源性再生意义上修复组织损伤。
本文还公开了一种骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，其中卫星细胞占所有可用细胞的比例达到至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，甚至更优选至少30％，通过流式细胞术检测Pax7的表达来确定；和/或其中获得的骨骼肌成肌细胞在所有可用细胞量的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，通过流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
此外，本发明涉及根据本发明的步骤(iv)获得、由本发明的步骤(i)至(iv)产生的骨骼肌管，其特征在于含辅肌动蛋白的肌节结构的各向异性取向。
有利地，所述工程化骨骼肌组织、所述中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、所述肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、所述骨骼肌成肌细胞、所述卫星细胞和/或所述骨骼肌管可用于体外药物测定。所述药物测定优选是毒性测定或在药理和基因治疗候选药物影响下的骨骼肌组织功能测定。药理学候选药物通常是包含小分子化合物以及基于蛋白质的分子的候选药物。基因治疗候选药物通常通过引入相应的核酸来改变所述骨骼肌组织的基因组。
此外，所述工程化骨骼肌组织、中胚层分化的骨骼成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼成肌细胞祖细胞、骨骼肌成肌细胞、卫星细胞和/或骨骼肌管可用于医学。
这里特别重要的是所述卫星细胞。考虑将它们用于治疗受损骨骼肌和/或治疗骨骼肌疾病，优选用于治疗遗传性骨骼肌缺陷，具体是杜氏肌营养不良症和/或Becker-Kiener肌营养不良症，和/或溶酶体贮积病，具体是庞贝氏病，优选其中所述骨骼肌疾病是杜氏肌营养不良症。本领域技术人员从现有技术知道，卫星细胞已经应用于临床研究以治疗肌营养不良症(泰德斯科(Tedesco)FS等人，2010)。此外，正在考虑将卫星细胞用于治疗骨骼肌疾病，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症、重症肌无力或肌强直。肌强直包含各种肌肉疾病，这些疾病表现出延迟松弛并因此出现病理性伸长的强直性肌肉收缩。卫星细胞特别适用于治疗受损骨骼肌和/或用于治疗骨骼肌疾病，因为它们不断地再生骨骼肌组织。术语“受损的骨骼肌组织”是指由外力引起的组织损伤和创伤。根据本发明所述方法的步骤(iii)或(iv)获得的人类卫星细胞表现出特征性标志物Pax7。因此，根据本发明的卫星细胞是基于细胞治疗受损骨骼肌组织的有希望的候选物，因为卫星细胞使骨骼肌组织的再生得到增强(尹(Yin)等人，(2013))。类似地，根据本发明的工程化骨骼肌组织是基于细胞治疗受损骨骼肌组织的有希望的候选物；特别适用于大肌肉缺损的治疗。尤其是在创伤或大量肌肉破坏的情况下，直接植入替代组织，例如工程化骨骼肌组织，是一种很有希望的方法。骨骼肌植入物可以通过电刺激或光遗传学激活在功能上进行整合和控制，从而恢复或治疗支持肌肉功能。工程化骨骼肌组织中的卫星细胞比例保证了骨骼肌的长期内源性再生能力。
所述工程化骨骼肌组织，以及所述中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，也是用于研究对分化和成熟很重要的细胞机制的合适模型系统。因此，它们是基础研究的重要科学工具。因此，例如，可以在人体细胞或工程化骨骼肌组织上于人体外部测试化学物质和可选的物理刺激，例如拉伸或损伤。根据本发明的细胞、骨骼肌管和工程化骨骼肌组织能够进行药理安全性和功效实验，从而可以测试对细胞和组织的影响。与动物实验(例如小鼠或大鼠组织/细胞)相比，这是一个明显的优势，因为药理作用可以在例如人体组织上进行测试，并且在具体实施方案中，在患者特异性组织进行测试。由于与天然骨骼组织高度相似，根据上述公开的方法生产的骨骼组织可以有利地用于各种体外程序中。
一种此类可能应用是用于测试候选药物对骨骼肌组织功效的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据本文所述发明的骨骼肌组织，
(b)任选地对所述骨骼肌组织造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述骨骼肌组织与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
收缩力和/或骨骼肌组织结构可通过本文所述的收缩实验和本文所述的荧光显微实验测量。例如，代谢功能可以通过使用本领域技术人员已知的海马代谢通量分析仪(Seahorse Metabolic Flux Analyzer)来测量。例如，海马代谢通量分析仪可测量活细胞的耗氧量和细胞外酸生成率，并可进一步测量重要的细胞功能，如线粒体呼吸和糖酵解。例如，可以通过转录组分析(PCR或RNA测序)测量分子参数(标志物)。例如，通过质谱法或常见的临床化学测量方法(例如，ELISA或其他抗体和/或色谱方法和/或电泳方法和/或基于亲和力的方法)可以测量蛋白质生化参数(标志物)。这些分子和蛋白质生化参数也称为标志物或生物标志物，与骨骼肌相关的常见生物标志物是本领域技术人员已知的。例如，肌酸激酶(也称为肌酸激酶CK、CPK或肌酸磷酸激酶)和L-乳酸脱氢酶(LDH)就是这样的生物标志物。
候选药物包括药理候选药物，例如包含小分子化合物和基于蛋白质或基于核酸的分子的候选药物。此外，候选药物包括基因治疗候选药物，其通常通过引入相应的核酸来修饰本发明细胞的基因组。此外，候选药物也可以是人体自身的物质，因此可以测试例如激素或类激素信号物质的作用。类激素信号物质的实例是肌细胞因子，例如肌肉抑制素、卵泡抑素、鸢尾素、内脂素和肌联素。
考虑了用于测试物质对骨骼肌组织的毒性的另一体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本文所述发明的骨骼肌组织，
(b)使来自步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测物质接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
所述收缩力和/或骨骼肌组织结构可通过本文所述的收缩实验和本文所述的荧光显微实验测量。例如，可以通过使用本领域技术人员已知的海马代谢通量分析仪来测量代谢功能。
例如，用于毒性测试的物质可以是但不限于候选药物。相反，可以测试任何要评估其毒性的物质。
其他可能的应用涉及用于测试营养素和膳食补充剂对骨骼肌组织性能影响的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据本文所述发明的骨骼肌组织，
(b)使步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测试的营养素和营养补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
这种体外方法提供了测量临床相关浓度的营养素和膳食补充剂对骨骼肌组织影响的机会。在测量这些物质对肌肉生长、恶病质或糖尿病的影响时，这种方法特别有意义。恶病质被理解为一种病态的、非常严重的消瘦。许多患有诸如癌症或自身免疫性疾病等慢性疾病的患者患有恶病质的额外病症。所述体外方法为测量物质对体外骨骼肌组织的影响提供了可能。
然而，类似地，根据本文公开方法制备的各种细胞也可用于此类体外方法。例如，本文描述了用于测试候选药物对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本文所述发明的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，
(b)任选地对步骤(a)的所述细胞造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述细胞与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
另一种可能的应用涉及用于测试物质对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的毒性的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本文所述发明的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测物质接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
另一种可能的应用涉及用于测试营养素和膳食补充剂对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的影响的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据本文所述发明的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
在另一优选实施方案中，所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下可产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选产生至少1.8mN，更优选至少1.9mN，并且最优选至少2mN。所述收缩力通常在刺激阈值以上测量。用于确定刺激阈值的合适方法是本领域技术人员已知的。例如，可以在200mA的电场刺激下记录收缩力(参见图6、图7、图9和图10)。在更优选的实施方案中，骨骼肌组织在100Hz的刺激下可以产生的收缩力为至少2毫牛顿(mN)，优选至少2.3mN，更优选至少2.6mN，甚至更优选至少3mM，甚至更优选至少3.3mN，甚至更优选至少3.6mN，最优选至少4mN。这通常发生在所述方法步骤(iv)进行至少50天时，例如56天。本文所述的工程化骨骼肌组织的典型特征是收缩力随着成熟的持续时间而增加。
在另一优选的实施方案中，所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下的收缩速度为至少3mN/秒，优选至少4mN/秒，更优选至少5mN/秒，更优选至少6mN/秒，甚至更优选至少6.5mN/秒，甚至更优选至少7mN/秒。例如，可以在100Hz和200mA(5ms，单相或双相)的刺激下记录收缩速度。收缩速度，也称为力产生速度，是工程骨骼肌组织分别积聚一定张力量所需的时间，或张力增加的速率。在等距收缩实验的情况下，收缩速度被确定为收缩力增加最大的时间点(+dFOC/dt)。
在另一优选的实施方案中，所述骨骼肌组织在100Hz的刺激终止时的松弛速度为至少0.5mN/秒，优选至少0.7mN/秒，更优选至少0.9mN/秒，更优选至少1mN/秒，甚至更优选至少1.2mN/秒，甚至更优选至少1.5mN/秒。在所述骨骼肌的松弛阶段，松弛速度确定为在等距收缩实验的情况下收缩力降低最多的时间点(-dFOC/dt)。
在特别优选的实施方案中，步骤(iv)中的所述基础培养基可以包含有效量的肌酸和/或三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。例如，如果肌酸以有效量存在于成熟培养基的基础培养基中，则所述工程化骨骼肌的收缩力与无有效量肌酸的步骤(iv)中的成熟过程相比可能增加。这种收缩力的增加显示在实施例4和图9中，并附有实验数据。例如，步骤(iv)的基础培养基中有效量肌酸的最终浓度是0.1-10mM肌酸。更优选的浓度是例如0.2-6mM肌酸，更优选0.4-4mM肌酸，甚至更优选0.6-3mM肌酸，甚至更优选0.7-2.5mM肌酸，甚至更优选0.8-2mM肌酸，甚至更优选0.85-1.5mM肌酸，甚至更优选0.9-1.2mM肌酸，并且最优选约1mM肌酸。
此外，步骤(iv)中的所述成熟培养基的T3量也可以有所增加。与在步骤(iv)中T3量没有增加而制备的工程化骨骼肌组织相比，T3的这种增加量可以降低工程化骨骼肌的收缩速度和/或松弛速度。步骤(iv)中所述基础培养基中T3的示例性增加量为0.001-1μM三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，优选0.005-0.7μM T3，更优选0.01-0.35μM T3，甚至更优选0.04-0.02μM T3，甚至更优选0.05-0.18μM T3，甚至更优选0.06-0.15μM T3，甚至更优选0.08-0.12μM T3，甚至更优选约0.1μM T3。此外，实施例4以及图10通过T3浓度增加的实验数据显示了有利效果。
在特别非常优选的实施方案中，步骤(iv)中的所述基础培养基可以包含有效量的肌酸和/或增加量的三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)用于给定的成熟时间段。如实施例4所示，这样的时间段可以是4周，例如步骤(iv)的第1周至第5周，或步骤(iv)的第5周至第9周。然而，可以在任何成熟期间选择其他时间段，例如1-9周。例如，该时间段可以是至少1周，优选至少2周，更优选至少3周，更优选至少4周，甚至更优选至少5周，甚至更优选至少6周，甚至更优选至少7周，甚至更优选至少8周。此外，该时间段可以是例如至多9周，更优选至多8周，更优选至多7周，甚至更优选至多6周，甚至更优选至多5周，甚至更优选至多4周。根据本公开，本领域技术人员可以自由组合示例性时间段端点。
在另一优选的实施方案中，通过本文所述方法生产的所述骨骼肌组织具有再生特性。所述再生特性的特征在于自然恢复先前存在的状态。例如，可以恢复工程化骨骼肌组织的收缩性。因此，可以恢复收缩性和/或重建肌肉。在非常优选的实施方案中，所述再生特性的特征在于恢复的收缩性和/或肌肉重建，优选其中恢复收缩性和/或肌肉重建的能力是在接触心脏毒素和/或肌肉重建24小时后测量的，更优选地，其中所述恢复的收缩性和/或肌肉重建是在接触心脏毒素后10-30天测量的。心脏毒素是一种多肽毒素，通过诱导永久性去极化破坏骨骼肌细胞。在功能上，与心脏毒素一起培养会导致工程化骨骼肌失去收缩性。在结构上，观察到不可逆破坏了工程化骨骼肌中形成的肌管。即使在例如2天之后，本文描述的实施例5中也没有记录到收缩。如图11所示，具有再生特性的工程化骨骼肌组织可以恢复此类收缩性。例如，如实施例5中所述，肌肉可以在心脏毒素处理21天后再次收缩。然而，例如，用γ辐照(X射线)处理的工程化骨骼肌未表现出再生特性，甚至在心脏毒素培养21天后也不能收缩。这个实例表明，在工程化骨骼肌组织中，当骨骼肌细胞被不可逆地破坏时，具有再生能力的骨骼肌细胞祖细胞被保留下来，可以通过细胞分裂和分化成新形成的骨骼肌细胞在所述工程化骨骼肌组织中再生或重建具有收缩功能的骨骼肌结构。如图11所示，具有再生特性的工程化骨骼肌组织可以完成这种肌肉重建。图11B显示了收缩力的重建，图11C(上部)显示了骨骼肌的结构重建。γ辐照后再生失败表明，能够进行细胞分裂再生的骨骼肌祖细胞(例如卫星细胞)在心脏毒素处理中存活下来。
如实施例4所示，所述程序的步骤(iv)可以延长数周。在非常优选的实施方案中，步骤(iv)进行至少50天，更优选至少60天，甚至更优选至少70天，甚至更优选至少80天。就发明人的现有知识而言，步骤(iv)的持续时间没有上限。例如，步骤(iv)的最长持续时间可以是365天，优选300天，更优选250天。本领域技术人员可以根据本公开自由组合步骤(iv)的示例性时间段限制。
此外，本发明包括通过本文所述方法生产的工程化骨骼肌组织。在优选实施方案中，所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，更优选至少2mN，更优选至少2.3mN，更优选至少2.6mN，甚至更优选至少3mM，甚至更优选至少3.3mN，甚至更优选至少3.6mN，最优选至少4mN。例如，可以在200mA的刺激下记录所述收缩力。
在特别优选的实施方案中，所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下的收缩速度为至少3mN/秒，优选至少4mN/秒，更优选至少5mN/秒，更优选至少6mN/秒，甚至更优选至少6.5mN/秒，甚至更优选至少7mN/秒。在另一优选的实施方案中，所述骨骼肌组织在终止100mN/秒的刺激时的松弛速度为至少0.5mN/秒，优选至少0.7mN/秒，更优选至少0.9mN/秒，更优选在至少1mN/秒，甚至更优选至少1.2mN/秒，甚至更优选至少1.5mN/秒。
本发明通过以下实施方案作进一步说明：
1.一种从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织的方法，包括以下步骤
(i)通过在基础培养基中培养多能干细胞来诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂，所述无血清添加剂包括转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中无血清添加剂的基础培养基中，培养步骤(i)获得的细胞来诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，将所述细胞扩增和成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞；
(iv)通过在基础培养基中于机械刺激下培养步骤(iii)中获得的细胞(分散在细胞外基质中)，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)如步骤(i)无血清添加剂，和(b)另外的无血清添加剂，包含白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)；
从而生产工程化骨骼肌组织。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述多能干细胞来源于灵长类动物，特别是人类多能干细胞；和/或其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、通过细胞核移植生产的多能干细胞和通过化学重编程生产的多能细胞，特别是其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中步骤(i)进行24至132小时，优选48至120小时，更优选60至114小时，甚至更优选72至108小时，更优选84至102小时，最优选约96小时。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐组成的组，优选地其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021；和/或
其中在步骤(i)中，所述SMAD抑制剂选自由LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1组成的组，优选地其中所述SMAD抑制剂是LDN193189。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中步骤(i)中，FGF2的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml；和/或
所述无血清添加剂在所述培养基中提供的终浓度为50-500μg/ml转铁蛋白、1-20μg/ml胰岛素、0.001-0.1μg/ml黄体酮、5-50μg/ml腐胺和6-600nM硒或其生物可利用盐，特别是亚硒酸钠，和/或
所述GSK3抑制剂为CHIR99021，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM；和/或
所述SMAD抑制剂为LDN193189，有效量为0.05-5μM，优选0.1-2.5μM，更优选0.2-1μM，甚至更优选0.25-0.8μM，甚至更优选0.3-0.75μM，甚至更优选0.35-0.7μM，甚至更优选0.4-0.6μM，甚至更优选0.45-0.55μM，最优选约0.5μM。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述无血清添加剂是0.1-10％(v/v)N2添加剂，更优选0.3-7.5％(v/v)N2添加剂，更优选0.5-5％(v/v)N2添加剂，更优选0.75％-2％(v/v)N2添加剂，更优选0.9％-1.2％(v/v)N2添加剂，最优选约1％(v/v)N2添加剂。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中步骤(i)、步骤(ii)、步骤(iii)和/或步骤(iv)中的所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、HamsF-10、Hams F-12，其中所述基础培养基优选为DMEM，特别是其中所述基础培养基补充有丙酮酸盐和/或非必需氨基酸，和/或包含1g/l葡萄糖。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)所述无血清添加剂存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2、(c)所述无血清添加剂和(d)HGF存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)所述无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)存在下进行72至120小时，优选76至114小时，更优选84至108小时，甚至更优选90至102小时，最优选约96小时。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂选自由DAPT、RO4929097、司马西特(LY450139)、阿瓦西特(BMS-708163)、二苯并氮杂卓(YO-01027)、LY411575、IMR-1、L685458，优选其中所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂是DAPT。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，FGF2的有效量为15-30ng/ml，优选17.5-25ng/ml，更优选18-22ng/ml，甚至更优选19-21ng/ml，最优选约20ng/ml；和/或
HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml；和/或
所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂为DAPT，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM；
所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中步骤(iii)中，HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或
所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述另外的无血清添加剂在所述培养基中提供的终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、17.4-1744nM硒或其生物可利用盐(具体是亚硒酸钠)、0.4-40μg/ml L-肉碱、0.05-5μl/ml脂肪酸添加剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中，所述另外的无血清添加剂为0.1-10％(v/v)B27，优选0.5-8％(v/v)，更优选1-6％(v/v)，甚至更优选1.5-4％(v/v)，并且最优选约2％(v/v)B27。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述机械刺激是静态张力或动态刺激或增张力性刺激，优选地其中所述机械刺激是静态张力。
15.根据实施方案1-14中任一项的方法，包括在步骤(i)之前接种步骤，其中在ROCK抑制剂存在下将所述多能干细胞接种在干细胞培养基中，优选地其中所述接种步骤在步骤(i)之前18-30小时进行。
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，特别优选地其中所述ROCK抑制剂是Y27632。
17.根据实施方案15或16所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632并且使用浓度是0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选的4-6μM，最优选浓度为约5μM；和/或
其中所述干细胞培养基是iPS-Brew XF。
18.根据实施方案15-17中任一项所述的方法，其中，在添加所述干细胞培养基之前，首先将所述接种步骤中的所述多能干细胞在预混物中存在细胞外基质的一种或更多种组分的情况下接种成工程化形式。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述预混物中的细胞外基质组分是胶原蛋白，优选I型胶原蛋白，更优选牛来源、人类来源或海洋来源的胶原蛋白，特别是牛来源的胶原蛋白，任选地其中所述细胞外基质另外包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白。
20.根据实施方案19所述的方法，其中所述多能干细胞以1-6×106个细胞/ml和0.7-1.4mg/ml胶原蛋白的比例接种在培养基中。
21.根据实施方案18-20中任一项所述的方法，其中所述预混物包含5-15％(v/v)的作为细胞外基质组分的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的渗出物，优选7.5％-12.5％(v/v)，更优选9-11％(v/v)，并且最优选包含约10％(v/v)，特别是其中所述渗出物是基质胶；和/或其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
22.根据实施方案18-20中任一项所述的方法，其中所述预混物包含基质细胞，其中所述基质细胞产生所述细胞外基质组分胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或蛋白聚糖；和/或其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
23.根据实施方案18-22中任一项所述的方法，其中在约1小时后将所述干细胞培养基添加到工程化形式的所述预混物中，其中所述干细胞培养基包含KSR和FGF2。
24.根据实施方案23所述的方法，其中所述干细胞培养基包含5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；和/或
其中所述干细胞培养基包含1-15ng/ml FGF2，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml FGF2。
25.根据实施方案18-24中任一项所述的方法，其中步骤(iii)进行7-11天，优选8-10天，并且最优选约9天。
26.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之后，在预混物中存在一种或更多种细胞外基质组分的情况下，在步骤(iv)之前的另外步骤中，将所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞接种成工程化形式。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述预混物中的细胞外基质组分是胶原蛋白，优选I型胶原蛋白，更优选牛来源、人类来源或海洋来源的胶原蛋白，特别是牛来源的胶原蛋白，任选地其中所述细胞外基质另外包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白。
28.根据实施方案27所述的方法，其中将所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞以1-10×106个细胞/ml和0.7-1.4mg/ml胶原蛋白的比例接种在培养基中。
29.根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中所述预混物包含5-15％(v/v)的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的渗出物作为细胞外基质组分，优选7.5％-12.5％(v/v)，更优选9-11％(v/v)，最优选约10％(v/v)，特别是其中所述渗出物是基质胶；和/或
其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
30.根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中所述预混物包含基质细胞，其中所述基质细胞生产所述细胞外基质组分胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或蛋白聚糖；和/或其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
31.根据实施方案26-30中任一项所述的方法，其中在约1小时后，将步骤(iii)中使用的培养基添加到工程化形式的预混物中，其中所述培养基另外包含有效量的ROCK抑制剂；
具体地，其中所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，特别优选地所述ROCK抑制剂是Y27632。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632并且使用浓度为0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选浓度为约5μM。
33.根据实施方案26-32中任一项所述的方法，其中在约1天后，将所述培养基更换为步骤(iii)中使用的培养基，然后将所述细胞在该培养基中进一步培养5-9天，优选6-8天，最优选约7天。
34.根据实施方案18-33中任一项所述的方法，其中所述工程化形式具有环状、带状、线状、片状、袋状或柱状的形式，其中任选地融合了单个骨骼肌组织。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行至少19天，优选至少28天，更优选至少56天，甚至更优选进行至少120天，特别是进行至少240天。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述方法不包括分化或成熟相关转基因，优选其中所述方法不包括肌源性转基因，更优选其中所述方法不包括转基因Pax7或MyoD。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述方法不包括骨骼肌成肌细胞富集步骤，优选不包括通过细胞选择的富集步骤，更优选不包括通过基于抗体的细胞选择的富集步骤。
38.一种从多能干细胞生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法，包括以下步骤
(i)通过在包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的基础培养基中培养多能干细胞，诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述无血清添加剂包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞，然后
(iv)通过在包含有效量的(a)如(i)中的无血清添加剂和(b)另外的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(iii)中获得的细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述另外的无血清添加剂包括白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，
从而生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞。
39.根据实施方案38所述的方法，其中通过所述方法实现的骨骼肌成肌细胞在可利用所有细胞量中的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，由流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
40.根据实施方案38或39所述的方法，其中通过所述方法实现的卫星细胞在所有可用细胞量中的比例为至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，最优选达到至少30％，由流式细胞术检测Pax7的表达来确定。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的方法，其中所述方法不包括骨骼肌成肌细胞富集步骤，优选不包括通过细胞选择的富集步骤，更优选不包括通过基于抗体的细胞选择的富集步骤。
42.根据实施方案38-41中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞来源于灵长类动物，特别是人类多能干细胞；和/或其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、通过细胞核移植生产的多能干细胞和通过化学重编程生产的多能细胞，特别是其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。
43.根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中步骤(i)进行48至132小时，优选48至120小时，更优选60至114小时，甚至更优选72至108小时，更优选84至102小时，并且最优选约96小时。
44.根据实施方案38-43中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐，优选其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021；和/或
其中在步骤(i)中，所述SMAD抑制剂选自由LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1组成的组，优选其中所述SMAD抑制剂是LDN193189。
45.根据实施方案38-44中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，FGF2的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或
所述无血清添加剂在所述培养基中提供的最终浓度为50-500mg/l转铁蛋白、1-20mg/l胰岛素、1-30μg/l黄体酮、5-50μg/ml腐胺和6-600nM硒或其生物可利用盐，具体是亚硒酸钠，和/或
所述GSK3抑制剂为CHIR99021，有效量为4-18μM，优选5-16μM，更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选8-13μM，甚至更优选9-12μM，甚至更优选9.5-11μM，并且最优选约10μM；和/或
所述SMAD抑制剂为LDN193189，有效量为0.05-5μM，优选0.1-2.5μM，更优选0.2-1μM，甚至更优选0.25-0.8μM，甚至更优选0.3-0.75μM，甚至更优选0.35-0.7μM，甚至更优选0.4-0.6μM，甚至更优选0.45-0.55μM，并且最优选约0.5μM。
46.根据实施方案38-45中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述无血清添加剂是0.1-10％(v/v)N2添加剂，优选0.3-7.5％(v/v)N2添加剂，更优选0.5-5％(v/v)N2添加剂，更优选0.75％-2％(v/v)N2添加剂，更优选0.9％-1.2％(v/v)N2添加剂，并且最优选约1％(v/v)N2添加剂。
47.根据实施方案38-46中任一项所述的方法，其中步骤(i)、步骤(ii)、步骤(iii)和/或步骤(iv)中的所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、Hams F-10、Hams F-12，其中所述基础培养基优选为DMEM，特别是其中所述基础培养基补充有丙酮酸盐和/或非必需氨基酸，和/或包含1g/l葡萄糖。
48.根据实施方案38-47中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)所述无血清添加剂存在下进行36至60小时，优选42至54小时，并且最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2、(c)所述无血清添加剂和(d)HGF存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)所述无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)存在下进行72至120小时，优选76至114小时，更优选84至108小时，甚至更优选90至102小时，并且最优选约96小时。
49.根据实施方案38-48中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂选自由DAPT、RO4929097、司马西特(LY450139)、阿瓦西特(BMS-708163)、二苯并氮杂卓(YO-01027)、LY411575、IMR-1、L685458，其中所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂优选为DAPT。
50.根据实施方案38-49中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，FGF2的有效量为15-30ng/ml，优选17.5-25ng/ml，更优选18-22ng/ml，甚至更优选19-21ng/ml，并且最优选约20ng/ml；和/或
HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或
所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂为DAPT，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM；
所述KSR的用量为6-14％(v/v)，优选7-13％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
51.根据实施方案38-50中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml；
所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
52.根据实施方案38-51中任一项所述的方法，其中步骤(iii)进行7-11天，优选8-10天，并且最优选约9天。
53.根据实施方案38-52中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述另外的无血清添加剂在所述培养基中提供的终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、17.4-1744nM硒或其生物可利用盐(具体是亚硒酸钠)、0.4-40μg/mlL-肉碱、0.05-5μl/ml脂肪酸添加剂，0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
54.根据实施方案38-53中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中所述另外的无血清添加剂为0.1-10％(v/v)B27，优选0.5-8％(v/v)，更优选1-6％(v/v)，甚至更优选1.5-4％(v/v)，并且最优选约2％(v/v)B27。
55.根据实施方案38-54中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行至少30天，优选至少35天，更优选至少40天，甚至更优选至少50天。
56.根据实施方案38-55中任一项的方法，包括在步骤(i)之前的接种步骤，其中在ROCK抑制剂存在下将所述多能干细胞接种在干细胞培养基中，优选地其中所述接种步骤在步骤(i)之前18-30小时进行。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，其中特别优选地所述ROCK抑制剂是Y27632。
58.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632并且使用浓度为0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选浓度为约5μM；和/或
其中所述干细胞培养基是iPS-Brew XF。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述干细胞培养基包含5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；和/或
其中所述干细胞培养基包含1-15ng/ml FGF2，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml FGF2。
60.一种工程化骨骼肌组织，具有含卫星细胞的多核成熟骨骼肌纤维，并且没有血液供应和/或没有中枢神经系统控制；具体是其中所述骨骼肌纤维的存在是通过用DAPI染色辅肌动蛋白确定的。
61.根据实施方案60所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织是无血清的和/或不包含分化或成熟相关转基因，优选其中所述骨骼肌组织不包含肌源性转基因，更优选其中所述骨骼肌组织不包含所述转基因Pax7或MyoD。
62.根据实施方案60或实施方案61所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在200mA的100Hz刺激下产生的收缩力为至少0.3毫牛顿(mN)，优选至少0.4mN，更优选至少0.5mN，更优选至少0.6mN，更优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN；更优选至少1.8mN；更优选至少1.9mN；并且最优选产生至少2mN。
63.根据实施方案60-62中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织通过工程化形成，优选其中它具有的工程化形式为环状、带状、线状、片状、袋状或柱状，任选地其中融合了单个骨骼肌组织，特别是其中所述骨骼肌组织的形式为环状。
64.根据实施方案1或实施方案38的步骤(i)获得的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞，通过实施方案1(i)或实施方案38(i)的方法制备，其特征在于基因MSGN1和/或TBX6的表达，其中MSGN1和/或TBX6的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定；和/或表达mRNASP5，其中SP5的表达可以通过RNA测序来确定。
65.根据实施方案1或实施方案38的步骤(ii)获得的肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞，通过实施方案1(i)至(ii)或实施方案38(i)至(ii)的方法生产，其特征在于所述基因PAX3的表达，其中PAX3的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定；和/或表达mRNA SIM1，其中SIM1的表达可以通过RNA测序来确定。
66.根据实施方案1或实施方案38的步骤(iii)获得的骨骼肌成肌细胞，通过实施方案1(i)至(iii)或实施方案38(i)至(iii)的方法生产，其特征在于辅肌动蛋白的表达，优选其中辅肌动蛋白的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
67.一种卫星细胞，根据实施方案1或实施方案38的步骤(iii)获得，通过根据实施方案1(i)至(iii)或根据实施方案38(i)至(iii)的方法生产，其特征在于所述基因Pax7的表达，其中Pax7的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定，更优选其中所述卫星细胞进一步表达Ki67。
68.一种根据实施方案66的骨骼肌成肌细胞和根据实施方案67的卫星细胞的混合物，其中获得的卫星细胞在所有可用细胞量中的比例为至少10％，优选至少15％，更优选为至少20％，甚至更优选至少30％，通过流式细胞术检测Pax7的表达来确定；和/或其中获得的骨骼肌成肌细胞在所有存在细胞量的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，通过流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
69.根据实施方案1或实施方案38的步骤(iv)获得骨骼肌管，通过根据实施方案1(i)至(iv)或根据实施方案38(i)至(iv)的方法制备，其特征在于含辅肌动蛋白的肌节结构的各向异性取向。
70.根据实施方案60-63的骨骼肌组织和/或根据实施方案64-68中任一项的细胞和/或根据实施方案69的骨骼肌管在体外药物测定中的用途；具体是其中所述药物测定是毒性测定，或在药理和基因治疗候选药物影响下的骨骼肌组织功能测定。
71.根据实施方案60-63的骨骼肌组织和/或根据实施方案64-68中任一项的细胞，和/或根据实施方案69的骨骼肌管用于医学。
72.根据实施方案67的卫星细胞，用于治疗受损骨骼肌和/或用于治疗骨骼肌疾病，优选遗传性骨骼肌缺陷，具体是杜氏肌营养不良症和/或Becker-Kiener肌营养不良症，和/或溶酶体贮积症，具体是庞贝氏病，优选其中所述骨骼肌疾病是杜氏肌营养不良症。
73.一种用于测试候选药物对骨骼肌组织功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据实施方案60-63中任一项的骨骼肌组织，
(b)任选地对所述骨骼肌组织造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述骨骼肌组织与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
74.一种用于测试物质对骨骼肌组织毒性的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据实施方案60-63中任一项的骨骼肌组织，
(b)使步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测物质接触。
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
75.一种用于测试营养素和膳食补充剂对骨骼肌组织性能影响的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据实施方案60-63中任一项的骨骼肌组织，
(b)使步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
76.一种测试候选药物对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据实施方案64-69中任一项的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管，或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，
(b)任选地对步骤(a)的所述细胞造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述细胞与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
77.一种用于测试物质对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的毒性的体外方法，包括步骤：
(a)提供根据实施方案64-69中任一项的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管，或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测物质接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
78.一种测试营养素和膳食补充剂对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的影响的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据实施方案64-69中任一项的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管，或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
79.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，并且最优选产生至少2mN。
80.根据实施方案1-59或79中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少2毫牛顿(mN)，优选至少2.3mN，更优选至少2.6mN，甚至更优选至少3mM，甚至更优选至少3.3mN，甚至更优选至少3.6mN，最优选至少4mN。
81.根据实施方案1-59、79或80中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下的收缩速度为至少3mN/秒，优选至少4mN/秒，更优选至少5mN/秒，更优选至少6mN/秒，甚至更优选至少6.5mN/秒，甚至更优选至少7mN/秒。
82.根据实施方案1-59或79-81中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激终止时的松弛速度为至少0.5mN/秒，优选至少0.7mN/秒，更优选至少0.9mN/秒，更优选至少1mN/秒，甚至更优选至少1.2mN/秒，甚至更优选至少1.5mN/秒。
83.根据实施方案1-59或79-82中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述基础培养基包含有效量的肌酸和/或三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
84.根据实施方案83所述的方法，其中与步骤(iv)中无有效量肌酸的成熟过程相比，所述基础培养基中有效量的肌酸增强了所述工程化骨骼肌的收缩力。
85.根据实施方案83或84所述的方法，其中与步骤(iv)中无有效量的T3的成熟过程相比，所述基础培养基中有效量的T3提升所述工程化骨骼肌的收缩速度和/或松弛速度。
86.根据实施方案1-59或79-85中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述基础培养基提供的终浓度为0.1-10mM肌酸，优选0.2-6mM肌酸，更优选0.4-4mM肌酸，甚至更优选0.6-3mM肌酸，甚至更优选0.7-2.5mM肌酸，甚至更优选0.8-2mM肌酸，甚至更优选0.85-1.5mM肌酸，甚至更优选0.9-1.2mM肌酸，并且最优选约1mM肌酸。
87.根据实施方案1-59或79-86中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述基础培养基提供的终浓度为0.001-1μM三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，优选0.005-0.7μM T3，更优选0.01-0.35μM T3，甚至更优选0.04-0.0.2μM T3，甚至更优选0.05-0.18μM T3，甚至更优选0.06-0.15μM T3，甚至更优选0.08-0.12μM T3，甚至更优选约0.1μM T3。
88.根据实施方案1-59或79-87中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织具有自我再生的特性。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述再生特性的特征在于恢复的收缩性和/或肌肉恢复，优选其中所述恢复的收缩性和/或肌肉恢复是在心脏毒素造成不可逆的肌肉损伤后测量的，更优选其中所述恢复的收缩性和/或肌肉恢复在与心脏毒素一起培养10-30天后测量。
90.根据实施方案1-59或79-89中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行至少50天，更优选至少60天，甚至更优选至少70天，甚至更优选至少80天。
91.通过根据实施方案1-59或79-90中任一项的方法生产的工程化骨骼肌组织。
92.根据实施方案60-63或91中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选地至少0.7mN，更优选地至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选在至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，更优选至少2mN，更优选至少2.3mN，更优选至少2.6mN，甚至更优选至少3mM，甚至更优选至少3.3mN，甚至更优选至少3.6mN，并且最优选至少4mN。
93.根据实施方案60-63或91-92中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下收缩速度为至少3mN/秒，优选至少4mN/秒，更优选至少5mN/秒，更优选至少6mN/秒，甚至更优选至少6.5mN/秒，甚至更优选至少7mN/秒。
94.根据实施方案60-63或91-93中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激终止时的松弛速度为至少0.5mN/秒，优选至少0.7mN/秒，更优选至少0.9mN/秒，更优选至少1mN/秒，甚至更优选至少1.2mN/秒，甚至更优选至少1.5mN/秒。
95.根据实施方案60-63或91-94的骨骼肌组织和/或根据实施方案64-68中任一项的细胞和/或根据实施方案69的骨骼肌管在体外药物测定中的用途；特别是其中所述药物测定是毒性测定或在药理和基因治疗候选药物的影响下骨骼肌组织功能测定。
96.根据实施方案60-63和91-94的骨骼肌组织，和/或根据实施方案64-68中任一项的细胞，和/或根据实施方案69的骨骼肌管用于医学。
附图说明
图1. 2D细胞培养中分化方案的示意图。用于将人类多能干细胞(hPSC)定向分化为2D骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的分化方案。hPSC在前一天接种。对于中胚层诱导，细胞从第0天到第4天在含有CHIR-99021、LDN193189和FGF-2的中胚层诱导培养基(含有1g/l葡萄糖的DMEM，补充有丙酮酸盐)中培养。对于肌源性特化，细胞从第4天到第6天在含有DAPT和FGF-2的培养基中培养，然后从第6天到第8天在含有DAPT、FGF-2和HGF的培养基中培养，然后从第8天到第12天在含有DAPT、HGF和“敲除血清替代物”(KSR)的培养基中培养。对于肌源性扩增和成熟，细胞从第12天到第21天在含有HGF和KSR的培养基中培养。对于肌源性成熟，细胞从第21天开始在含有白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒、肉碱、脂肪酸和T3的培养基中培养。此外，从第0天到第21天培养基包含无血清添加剂N-2。
图2.多能干细胞分化为肌管和卫星细胞的示意图。多能干细胞分化为肌管的示意图，包括以下阶段：(i)多能干细胞、(ii)体前中胚层细胞、(iii)带有卫星细胞的成肌细胞、(iv)带有卫星细胞的肌管，和(v)带有卫星细胞生态位的肌管。此外，还显示了不同分化阶段标志物基因的表达序列。Oct4的表达是多能干细胞的特征。MSGN1和Tbx6的表达是体前中胚层细胞的特征。Pax3主要在从体前中胚层细胞到成肌细胞的转变过程中表达。Pax7表达是卫星细胞存在的特征，并且首先在体前中胚层阶段结束和成肌细胞阶段开始时表达。虽然Pax7表达在成肌细胞阶段最高，Pax7表达在肌管细胞阶段变缓，但仍然是卫星细胞生态位形成的标志。MyoD的表达在成肌细胞中最强，并且在肌管中也可检测到。肌生成素和辅肌动蛋白的表达是肌管的特征，在成肌细胞中几乎不表达。肌管形成卫星细胞生态位，即肌肉干细胞生态位。卫星细胞生态位是Pax7阳性和休眠的。细胞周期在肌肉损伤时被激活，此时细胞也是Ki67阳性。
图3.骨骼肌细胞和卫星细胞的荧光显微显示。21天后对代表性细胞培养中的肌源性细胞进行免疫染色(实施例1)。荧光图像显示骨骼肌特异性转录因子PAX7(左上排)、MyoD(左中排)和肌生成素(左下排)的表达。PAX7检测卫星细胞；MyoD和肌生成素检测骨骼肌成肌细胞和/或骨骼肌管。此外，荧光图像显示细胞核(细胞核，右列)和肌动蛋白的表达(中列)。比例尺：100μM。
图4.通过RNA测序分析人类多能干细胞(hPSC)分化为骨骼肌细胞期间的基因表达模式。定向分化显示类似于胚胎骨骼肌发育的基因表达模式。多能性和近轴中胚层典型基因的表达值(“每千碱基百万读数，RPKM”)在分化和成熟期间以图形方式显示(图4A和图4B)。在RNA测序中，诸如NANOG、POU5F1和ZFP42等多能性的典型基因在第0天和第1天表现出高表达。NANOG和POU5F1在第0天表现出最高表达；ZFP42在第1天表现出最高表达。近轴中胚层的典型基因，如MSGN1、TBX6和MEOX1，在第1-8天表现出高表达。MSGN1在第1天表现出最高的表达；TBX6在第4天表现出最高表达；并且MEOX在第8天显示最高表达。骨骼肌特异性转录因子和肌节的典型基因在分化和成熟期间的表达值(“每千碱基百万读数，RPKM”)以图形方式显示(图4C和图4D)。骨骼肌特异性转录因子，如PAX3、PAX7和MYOD1，分别在第8、29和60天显示最高表达。肌节的典型基因，如ACTN2、DMD和MYH3，在第60天表现出最高的表达。
图5.人类多能干细胞(hPSC)定向分化为骨骼肌细胞的效率分析。流式细胞术测定四种独立多能干细胞系(iPSC(WT1)、iPSC(WT 2)、DMD iPSC、修正的DMD iPSC)的肌肉细胞(辅肌动蛋白以及肌生成素或MyoD阳性)和卫星细胞(PAX7阳性)的比例。四种细胞系中辅肌动蛋白阳性细胞的比例为71％～77.6％；四种细胞系中肌生成素阳性细胞的比例为41.4％～60.4％；四种细胞系中MyoD阳性细胞的比例为40％～54.1％；四种细胞系中PAX7阳性细胞的比例为33.4％～43.8％。
图6.由hPSC衍生的骨骼肌成肌细胞生产工程化骨骼肌组织(ESM)。(A)ESM培养方案示意图。将实施例1的21天大的细胞池倒入细胞外基质(胶原蛋白/基质胶)中，并在扩增条件下在环状模具(左图)中培养7天。随后将形成的环转移到拉伸装置(中间图像)并在成熟条件下进一步培养。再过4周后，在器官浴中测量ESM功能(右图)；比例尺：5mM。(B)工程化骨骼肌组织在不同刺激频率下的代表性收缩力曲线：1Hz(虚线：8次单次收缩，单次持续时间约为500毫秒，每次收缩力(“FOC”)约为0.5毫牛顿)，10Hz(实线：初期强直收缩，收缩力(“FOC”)约为1毫牛顿，单个收缩在图形上可区分)，100Hz(点划线：完全成形的强直收缩，收缩力(“FOC”)约2.2毫牛顿)。(C)以毫牛顿(mN)为单位的骨骼肌组织的收缩力(FOC)取决于电刺激频率；n＝3。对于1Hz的刺激，收缩力平均为0.5毫牛顿；对于10Hz的刺激，收缩力平均为0.9毫牛顿；对于20Hz的刺激，收缩力平均为1.1毫牛顿；对于40Hz的刺激，收缩力平均为1.4毫牛顿；对于60Hz的刺激，收缩力平均为1.55毫牛顿；对于80Hz的刺激，收缩力平均为1.6毫牛顿；对于100Hz的刺激，收缩力平均为2.1毫牛顿。
图7.由hPSC生产生物工程化骨骼肌(BSM)。(A)BSM培养方案示意图。人类诱导的多能干细胞在胶原蛋白/基质胶水凝胶中被浇注在环状模具中，并分化成3D骨骼肌组织。在第21天将形成的环转移到拉伸装置中，并在成熟条件下进一步培养。再过4周后，通常在器官浴中测量BSM功能。具体而言，为此目的，首先将人类诱导的多能干细胞分散在胶原蛋白/基质胶水凝胶中，并在含有Y-27632和KSR的Brew XF中调节24小时(第-1天)。然后从第0天到第4天在含有CHIR-99021、LDN193189和FGF-2的培养基中培养细胞。细胞从第4天到第6天在含有DAPT和FGF-2的培养基中培养，然后从第6天到第8天在含有DAPT、FGF-2和HGF的培养基中培养，然后从第8天到第12天在含有DAPT、HGF和“敲除血清替代物”(KSR)的培养基中培养。细胞从第12天到第21天在含有HGF和KSR的培养基中培养。从第21天到第50天，细胞在成熟培养基中在静态拉伸装置上(即在机械拉伸下)培养。此外，从第0天到第50天，培养基包含无血清添加剂N-2。(B)工程化骨骼肌组织在不同刺激频率下的代表性收缩力曲线：1Hz(虚线：8次单次收缩，单次持续时间约为600毫秒，每次收缩力(“FOC”)约为0.7毫牛顿)和100Hz(实线：完全成形的强直收缩，收缩力(“FOC”)约为1.1毫牛顿)。(C)以毫牛顿(mN)为单位的骨骼肌组织的收缩力(FOC)取决于电刺激频率；n＝3。对于1Hz的刺激，收缩力平均为0.3毫牛顿；对于10Hz的刺激，收缩力平均为0.5毫牛顿；对于20Hz的刺激，收缩力平均为0.55毫牛顿；对于40Hz的刺激，收缩力平均为0.6毫牛顿；对于60Hz的刺激，收缩力平均为0.65毫牛顿；对于80Hz的刺激，收缩力平均为0.72毫牛顿；对于100Hz的刺激，收缩力平均为0.9毫牛顿。
图8.ESM和BSM方法生产的骨骼肌组织的荧光显微显示。免疫染色通过ESM(实施例1和2)和BSM(实施例3)方法制备的代表性骨骼肌组织中肌动蛋白和DNA。荧光图像显示多核成熟骨骼肌纤维，其特征在于特征性的条纹图案(染色的肌动蛋白)。比例尺：50μM(ESM)和10μM(BSM)。
图9.肌酸处理增强ESM功能。A)ESM在5或9周内成熟的实验程序，在4周内另外施用1mM肌酸。B)在培养5周和9周后，ESM响应100Hz电场刺激的收缩力(FOC)；培养如A所示，加入肌酸(右柱)或不加入肌酸(左柱)；每组n＝3；通过学生t检验*p<0.05。
图10.甲状腺激素处理增强ESM功能。(A)ESM在5或9周内成熟的实验方案，在4周内另外施用0.1μMol/L三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。(B)具有代表性曲线的100Hz电场刺激时和之后的最高拉伸速度(+dFOC/dt)和最高松弛速度(-dFOC/dt)。比较第5周(第56天)和第9周(第84天)用(灰色)和不用(黑色)T3处理的ESM；每组n＝4-11；通过学生t检验*p<0.05。(C)9周ESM培养物(有T3(灰色)以及没有T3(黑色))中肌球蛋白重链蛋白质2(MYH2；快速亚型)、肌球蛋白重链蛋白质7(MYH7；慢速亚型)和肌球蛋白重链蛋白质3(MYH3；胚胎亚型)的蛋白质含量；每组n＝3；学生t检验*p<0.05。
图11.工程化骨骼肌的再生能力。A)在培养第22天和第60天的2D培养物中，以及在培养第60天的ESM(ESM是在第22天由2D培养物制备的)中，通过对骨骼肌祖细胞/干细胞标志物的RNA测序(每千碱基百万读数，RPKM)进行RNA检测。通过单因素方差分析(1-wayANOVA)和Tukey的多重比较检验，*p<0.05。B)ESM中(Pax7)的免疫荧光染色：在培养第60天，ESM(左)和2D(右)培养物中的Pax7(亮细胞核)、层粘连蛋白、f-肌动蛋白(伸长的肌肉细胞体)和细胞核；标尺：20μM。放大图像表示ESM和2D培养物中卫星细胞生态位(骨骼肌细胞前体)。C)心脏毒素(CTX)损伤的实验方案。ESM与25μg/ml CTX一起培养24小时。照射组在CTX损伤前24小时接受30Gy(γ辐照)的处理以抑制细胞增殖和与之相关的再生。D)在CTX损伤(25μg/ml)或载体处理(Veh.)后的指定时间点，ESM(没有γ辐照(左柱)或γ辐照(右柱))的100Hz强直收缩的收缩力(FOC)；n＝3-4，*p<0.05与第+2天对照，*p<0.05，均通过单因素方差分析和Tukey的多重比较检验。E)根据A中的方案，在CTX损伤后21天，在γ辐照和没有γ辐照的组中，免疫染色ESM中肌节辅肌动蛋白和细胞核，非辐照对照组的肌肉生长是由于ESM中新的肌肉细胞从肌肉细胞前体增殖和分化。标尺：50μM
实施例
以下实施例旨在进一步说明而非限制本发明。实施例描述了技术特征，并且本发明还涉及组合本部分提出的技术特征。在所有实施例中使用的方法和材料在实施例之后描述。
实施例1：人类多能干细胞(hPSC)在2D细胞培养中定向分化为骨骼肌细胞和卫星细胞
研发了一种在二维细胞培养中将诱导多能干细胞定向分化为骨骼肌细胞和卫星细胞的方法。这里描述的方法是无转基因的和无血清的。通过这种方法可以产生高纯度的人类骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞。在该方法中，使用特定时间序列的药剂(小分子、抑制剂和刺激物)来诱导人类多能干细胞的分化。在多能干细胞的不同分化阶段表达不同的基因。在分化期间典型基因表达也称为基因表达模式。这些基因表达模式也在人体胚胎骨骼肌发育过程中发生。分化方案的示意图如图1所示，它显示了添加到培养基中不同药剂的顺序。此外，图1显示了在分化为骨骼肌成肌细胞/肌管和卫星细胞期间经历的分化阶段，即中胚层分化的诱导、肌源性特化的诱导、(肌源性)扩增和成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞，以及成熟为骨骼肌管和卫星细胞。
为实施所述方法，前一天将人类多能干细胞以1.7×104个细胞/cm2的密度铺板在基质胶包被板上，并在12ml含有5μM Rock抑制剂(Stemolecule Y27632)的StemMACSTM iPS-Brew XF培养基存在下培养(实施例1结束时用基质胶包被细胞培养板的方法)，使细胞培养物在第二天(第0天)达到约30％的汇合度。但是，必须为每个细胞系单独确定用于铺板的最佳细胞数。
在N2-FCL培养基中培养诱导所述多能干细胞的中胚层分化。分别在第0、1、2和3天，用15ml N2-FCL培养基更换所述培养基并每天更换。N2-FCL培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司(Gibco))、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司(Invitrogen))、1％无血清添加剂N-2(100×)(赛默飞科技公司(Thermo Scientific))、1％非必需氨基酸(100×)(MEM-NEAA,英杰公司)、10ng/ml重组bFGF(佩普罗泰克公司(Peprotech))、10μM CHIR-99021(斯坦金特公司(Stemgent))、0.5μMLDN193189(斯坦金特公司)。
通过在N2-FD、N2-FHD和N2-HKD培养基中培养诱导肌源性特化。在第4天和第5天，将所述培养基更换为N2-FD培养基并每天更换。N2-FD培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％无血清添加剂N-2(100×)(赛默飞科技公司)、1％非必需氨基酸(100×)(MEM-NEAA，英杰公司)、20ng/ml重组bFGF(佩普罗泰克公司)、10uM DAPT(托克里斯公司(TOCRIS))。
在第6天和第7天，将所述培养基更换为N2-FHD培养基并每天更换。N2-FHD培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％无血清添加剂N-2(100×)(赛默飞科技公司)、1％非必需氨基酸(100×)(MEM-NEAA，英杰公司)、20ng/ml重组bFGF(佩普罗泰克公司)、10μM DAPT(托克里斯公司)、10ng/ml重组HGF(佩普罗泰克公司)。
在第8、9、10和11天，将所述培养基更换为N2-HKD培养基并每天更换。N2-HKD培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％无血清添加剂N-2(100×)(赛默飞科技公司)、1％非必需氨基酸(100×)(MEM-NEAA，英杰公司)、0.1mM 2-巯基乙醇(英杰公司)、10μM DAPT(托克里斯公司)、10ng/ml重组HGF(佩普罗泰克公司)、10％敲除血清替代物(生命科技公司(Life Technologies))。
通过在N2-HK培养基中培养，所述细胞被肌源性扩增并成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞。在第12至20天，将所述培养基更换为N2-HK培养基(扩增培养基)并每隔一天更换一次。N2-HK培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％无血清添加剂N-2(100×)(赛默飞科技公司)、1％非必需氨基酸(100×)(MEM-NEAA，英杰公司)、0.1mM 2-巯基乙醇(英杰公司)、10ng/ml重组HGF(佩普罗泰克公司)、10％敲除血清替代物(生命科技公司)。
从第21天开始，细胞要么在细胞培养板上进一步培养、冷冻，要么用于实施例2的方法。在进一步培养时，将所述培养基更换为分化培养基(成熟培养基)。成熟培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％无血清添加剂N-2(赛默飞科技公司)、1％B27无血清添加剂(英杰公司)。通过在细胞培养板上进一步培养产生骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞。
为了跟踪所述培养步骤期间的定向分化，使用RNA测序在60天的时间内确定了细胞的基因表达模式。RNA测序用于确定特定基因表达的增加和减少，即分析特定分化阶段或成熟阶段的开始和结束。
具体来说，测量了多能性、近轴中胚层、骨骼肌特异性转录因子和肌节的特定基因的表达。多能性的典型基因，如NANOG、POU5F1和ZFP42，在第0天和第1天(在接种步骤后的次日和第二天)显示出高表达(图4a)。NANOG和POU5F1在第0天表现出最高的表达；ZFP42在第1天表现出最高的表达(图4a)。近轴中胚层的典型基因，如MSGN1、TBX6和MEOX1，在第1-8天显示出高表达(图4b)。MSGN1在第1天表现出最高的表达；TBX6在第4天表现出最高的表达；并且MEOX在第8天显示最高表达(图4b)。骨骼肌特异性转录因子，如PAX3、PAX7和MYOD1，分别在第8、29和60天显示最高的表达(图4c)。肌节的典型基因，如ACTN2、DMD和MYH3，在第60天表现出最高的表达(图4d)。此外，基因表达模式显示不同标志物的急剧增加或减少，尤其是在最初的21天。例如，TBX6和MEOX1分别仅在第4天和第8天强烈表达，而其他天的表达弱化了至少3/4(图4d)。这个时间过程表明分化过程是均匀进展的。
为了使用第二种独立方法确定分化，发明人使用荧光显微镜分析了21天分化方法后的细胞。这涉及用Hoechst对所述细胞的DNA进行染色，并对肌动蛋白和骨骼肌特异性转录因子(Pax7、MyoD和肌生成素)进行免疫染色。21天后，荧光图像显示表达Pax7、MyoD和肌生成素的细胞比例很高(图3)。因此，使用另一种方法，表明通过分化方案产生了肌源性细胞的细胞群。
为了通过第三种独立方法确定分化，通过流式细胞术分析所述细胞。此处使用的流式细胞术使用免疫染色测量骨骼肌特异性因子的表达。具体而言，确定四种独立的多能干细胞系(iPSC(WT 1)、iPSC(WT 2)、DMD iPSC、修正的DMD iPSC)中骨骼肌成肌细胞和骨骼肌管(标志物辅肌动蛋白、肌生成素、MyoD的表达)和卫星细胞(标志物PAX7的表达)的比例(图5)。所述四种细胞系中辅肌动蛋白阳性细胞的百分比在71％和77.6％之间；所述四种细胞系中肌生成素阳性细胞的百分比在41.4％和60.4％之间；所述四种细胞系中MyoD阳性细胞的百分比在40％到54.1％之间；所述四种细胞系中PAX7阳性细胞的百分比在33.4％和43.8％之间(图5)。
流式细胞术还显示，分析的细胞生产了高纯度的骨骼肌成肌细胞特异性标志物和骨骼肌管特异性标志物，以及卫星细胞特异性标志物(>70％辅肌动蛋白阳性和>30％P3AX7阳性肌细胞)。
因此，使用三种不同的方法来测量多能干细胞分化成含有骨骼肌成肌细胞的细胞池，从而进行中胚层诱导、肌源性特化和肌源性成熟。
材料和方法
使用了以下多能干细胞系：TC1133(iPSC WT1；巴格巴德拉尼(Baghbaderani)等人，《干细胞报告》(Stem Cell Reports)2015)、iPSC WT2、DMD iPSC(DMD Del；隆(Long)等人，《科学进步》(Sci Adv)2018)、修正的DMD iPSC(隆等人，《科学进步》2018)。在DMD iPSC干细胞系中，X连锁肌营养不良蛋白基因(DMD)发生突变，该基因在杜氏肌营养不良症(DMD)疾病中也发生突变并导致该疾病。
为了制备基质胶包被的细胞培养板，BD基质胶(基底膜基质生长因子降低)在冰冷的PBS中以1:30的比例稀释，并立即储存在4℃。为了制备基质胶包被板，用冰冷的PBS制成1:120的基质胶稀释液。将0.1ml/cm2的稀释液加入细胞培养瓶中。将所述培养瓶在4℃下保存至少过夜，最多保存2周。使用前，将包被板置于37℃培养箱中至少半小时。
对于传代(例如，分离细胞进行冷冻保存)，用3ml TrypLE(英杰公司)洗涤细胞一次，然后在室温下在5ml TrypLE中培养约7分钟。然后将TrypLE洗掉并用10ml含有5uM Rock抑制剂的N2-HK培养基停止消化。为了诱导结块，使用10-ml移液管移取细胞悬液。分离细胞必须足够温和，以免降低细胞活力。使用CASY计数器对细胞进行计数(将20μl细胞悬液加入10ml CASY缓冲液中)。细胞在室温下以100×g的速度沉淀10分钟。去除上清液，将沉淀轻轻重新悬浮于含有5uM Rock抑制剂的N2-HK培养基中。在含有5μM Rock抑制剂的N2-HK培养基中，将细胞以60-70 000个细胞/cm2的密度铺板在基质胶包被板上。从第二天开始，N2-HK培养基每隔一天更换一次，共9天。
对于细胞冷冻(例如，在第21天，冷冻保存)，用3ml TrypLE(英杰公司)洗涤细胞一次，然后在室温下于5ml TrypLE中培养约7分钟。之后，洗去TrypLE，用10ml含有5μM Rock抑制剂的N2-HK培养基停止消化。为了诱导结块，使用10-ml移液管吸取所述细胞悬液。分离细胞必须足够温和，以免降低细胞活力。使用CASY计数器对细胞进行计数(将20μl细胞悬液加入10ml CASY缓冲液中)。细胞在室温下以100×g的速度沉淀10分钟。去除上清液，将沉淀轻轻重新悬浮于4℃下含有5μM Rock抑制剂和10％DMSO(西格玛公司(Sigma))的N2-HK培养基中。使用Mr Frosty(Thermo(美国热电公司))在-80℃下将10×106个细胞以2ml每个冷冻小瓶冷冻过夜。然后将细胞转移至-150℃下。
对于RNA提取，包埋在Trizol试剂(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))中的细胞裂解物通过涡旋匀浆。对于每1ml Trizol试剂，添加200μl氯仿(应用化学公司(AppliChem))。将试剂管紧紧封闭并倒置五次，然后在室温下培养5分钟。然后将样品以10,000-12,000×g离心15分钟。将含有RNA的水相转移到新的试剂管中，然后加入500μl异丙醇(罗特公司(Roth))以沉淀RNA。将所述试剂管涡旋，在室温下静置10分钟，然后在12,000×g的速率下再离心10分钟。去除上清液并加入1ml的70％EtOH/焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O以洗涤沉淀。轻轻敲击试剂管以溶解并洗涤沉淀后，将样品以12,000×g的速率再离心5分钟，并去除上清液。将沉淀散开5-10分钟，直到剩余液体蒸发，然后将RNA重新悬浮在DEPC H2O中。使用Nanodrop ND-1000测定RNA浓度和质量。在测序之前，使用高级分析公司(AdvancedAnalytical)的片段分析器(Fragment Analyzer)(标准灵敏度RNA分析试剂盒(DNF-471))进一步分析质量和RNA完整性。RNA-Seq文库是使用修改后的链特异性大规模平行cDNA测序(RNA-Seq)方案(因美纳公司(Illumina)：TruSeq链总RNA(Cat.No.RS-122-2301))生成的。该方案经过优化，可将数据集中的rRNA含量保持在5％以下(RiboMinusTM技术)。剩余的全转录组RiboMinusTMRNA适用于直接测序。优化连接步骤以提高连接效率(>94％)，并且PCR方案针对所述文库的最佳最终产物进行了调整。为了准确定量cDNA文库，使用了基于荧光的系统，即普罗米加公司(Promega)的quantiFluorTM dsDNA系统。使用dsDNA 905试剂盒(高级生物分析公司(Advanced Bioanalytical)的片段分析仪)确定最终cDNA文库的大小，平均大小为300bp。
汇集(合并)所述文库并在Illumina HiSeq 4000(因美纳公司)上测序，从而产生50bp单端读数(30-40×10^6读数/样本)。使用因美纳公司软件BaseCaller将序列图像转换为BCL文件，使用bcl2fastq v2.17.1.14将其解复用为fastq文件。使用FastQC 0.11.5版(安德鲁斯(Andrews),2014)评估质量。序列读数被映射到人类基因组参考文库(通过Bowtie 2.0使用UCSC版本hg19(朗米德(Langmead)和萨尔茨贝格(Salzberg),2012))。然后，计算每个已识别基因的映射读数的数量，并使用DESeq2软件评估基因差异表达(安德斯(Anders)和胡贝尔(Huber),2010)。基于从biomaRt(v2.24)中提取的Ensembl转录本长度计算每千碱基转录百万读数(RPKM)。
对于流式细胞术，通过用TrypLE Select(赛默飞世尔公司)消化细胞制备单细胞悬液。将细胞重新悬浮在培养基中，以300g的速率离心5分钟，然后固定在4％福尔马林(Histofix，罗特公司)中。固定后，将细胞再次离心并重新悬浮在封闭缓冲液(含有1mg/mlBSA(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、5％FCS(赛默飞世尔公司)和0.1％Triton100×(西格玛公司)的PBS)中。封闭10分钟后，通过离心使细胞沉淀，并在4℃下重新悬浮于含初级抗体(肌节-a辅肌动蛋白1:4,000(西格玛奥德里奇公司)、Pax7 1:50(DSHB)、MyoD1:100(达科公司(Dako))、肌生成素1:50(DSHB))或适当的IgG1亚型对照的封闭缓冲液中45分钟。
细胞用PBS洗涤两次，然后在封闭缓冲液中进行洗涤步骤，随后在二级抗体(1:1000抗小鼠488[A-11001]或633[A-21052]，赛默飞世尔公司)和Hoechst(10ng/ml；赛默飞世尔公司)中于4℃下培养30分钟。细胞用PBS洗涤，最后重新悬浮在PBS中进行分析。针对每个样品分析了10,000个活细胞情况。在LSRII SORP细胞仪上进行测量并使用DIVA软件(BD生物科学公司(BD Biosciences))进行分析。
实施例2：从衍生自多能干细胞的骨骼肌成肌细胞和卫星细胞(实施例1的细胞)生产工程化骨骼肌(ESM)组织
对于工程化骨骼肌组织的构建，将实施例1中获得的细胞(第21天的细胞)用作起始材料并与细胞外基质混合。通过与细胞外基质混合，将所述细胞分散到基质中以生成三维骨骼肌组织。这种方法也是无血清和无转基因的。因此，提高了生产骨骼肌组织的可重复性，因为所有需要的物质及其浓度都已确定。通过这种方法，可以产生产生力的骨骼肌组织，该骨骼肌组织响应于电刺激以受控方式收缩。在图6A中示意性地显示并在下面详细描述使用药剂和物理刺激的特定时间序列。
为了构建所述工程化骨骼肌组织，将实施例1的细胞(第21天的细胞)与细胞外基质混合并浇注到环状模具中以支持细胞自组装成可收缩的骨骼肌。这意味着所述细胞(a)根据实施例1从分化的细胞培养物中解离，或(b)使用实施例1的冷冻细胞。(有关如何解冻细胞的详细说明，请参见下文)。
为了将实施例1的细胞与所述细胞外基质混合，将预混物在冰上于50-ml反应管中混合。使用2-ml移液器添加胶原蛋白。遵循以下精确的移取顺序：
Figure BDA0003692053310000431
或者，根据以下体积对预混物进行移取：
Figure BDA0003692053310000441
将所述预混物倒入环状模具中，并将环状模具小心地转移到培养箱中，使所述混合物在37℃下静置1小时。在培养期结束后，每个模具小心加入8ml含有5μM Rock抑制剂的扩增培养基(图6A，左图)。扩增培养基(N2-HK培养基)：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％无血清添加剂N-2(赛默飞科技公司)、1％非必需氨基酸(MEM-NEAA，英杰公司)、0.1mM 2-巯基乙醇(英杰公司)、10ng/ml重组HGF(佩普罗泰克公司)、10％敲除血清替代物(生命科技公司)。
因此细胞在扩增培养基中培养7天。在第1、3和5天，将所述培养基更换为新鲜的扩增培养基(N2-HK培养基；不含Rock抑制剂)。浇注后，将混合物在环状模具中压缩，因此所述混合物在24小时后完全压缩。
7天后，将模制环转移到6孔板的扩增盘中(图6A，中图)。因此，所述细胞在物理刺激(即机械拉伸)下进一步培养。此外，通过每孔加入5ml成熟培养基，由成熟培养基诱导细胞成熟。成熟培养基：DMEM含有1g/l葡萄糖和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)，补充有丙酮酸盐(吉布科公司)、1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)(英杰公司)、1％N无血清添加剂N-2(赛默飞科技公司)、2％B27无血清添加剂(英杰公司)。
为了使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，在随后的6周成熟期间中每隔一天更换一次成熟培养基。
为了实验性地测试工程化骨骼肌组织的产生，使用荧光显微镜分析生成的骨骼肌组织。特征性的条纹图案证明多核骨骼肌纤维已经形成以产生产生力的骨骼肌。
发明人使用免疫染色使真核细胞骨架的结构蛋白肌动蛋白可视化，并用染料DAPI对细胞核中的DNA进行染色。荧光图像显示特征性的条纹图案，表明所述方法形成了多核成熟骨骼肌纤维(图8A)。免疫染色表明，工程化骨骼肌组织表现出成熟多核肌纤维的结构。
此外，为了还在功能上测试人工生成的肌肉组织，发明人进行了收缩实验(图6A，右图)。器官浴中的这些收缩实验测量了生产的骨骼肌组织响应电刺激的收缩频率和收缩力。
为此，在37℃、5％CO2和95％O2下连续充气的条件下，将环状形式的骨骼肌组织等距地转移到含有Tyrode溶液(以mmol/L计：120NaCl、1MgCl2、1.8CaCl2、5.4KCl、22.6NaHCO3、4.2NaH2PO4、5.6葡萄糖和0.56抗坏血酸盐)的器官浴(弗尔医疗器械公司)中。以125μM的间隔对ESM进行机械拉伸，直到观察到最大力幅值(收缩力＝FOC)。FOC测量是在1-100Hz(4ms矩形脉冲；200mA)范围内的电场刺激频率下进行的。
所述收缩实验的结果如图6B和图6C所示。图6B显示了所述工程化骨骼肌组织在不同刺激频率下的代表性收缩力曲线。在1Hz(虚线)的刺激下，记录了8次单次收缩，单次持续时间约为0.5秒；在10Hz(实线)的刺激下，测量了初期强直收缩；在100Hz(点划线)的刺激下，检测到完全成形的强直收缩。图6C显示了所述工程化骨骼肌组织的收缩力作为刺激频率的函数。根据电刺激频率(n＝3)，以骨骼肌组织的毫牛顿(mN)为单位测量收缩力(“FOC”)。在1Hz的刺激下，收缩力平均为0.5毫牛顿；在10Hz的刺激下，收缩力平均为0.9毫牛顿；在20Hz的刺激下，收缩力平均为1.1毫牛顿；在40Hz的刺激下，收缩力平均为1.4毫牛顿；在60Hz的刺激下，收缩力平均为1.55毫牛顿；在80Hz的刺激下，收缩力平均为1.6毫牛顿；在100Hz的刺激下，收缩力平均为2.1毫牛顿。
测试的骨骼肌组织响应于1Hz和100Hz之间的刺激频率显示出可重复的收缩频率和收缩力。在1Hz的单次刺激下，收缩和完全松弛大约需要0.5秒。因为收缩和松弛时间约为0.5秒，在较高的刺激频率下记录开始或完整的强直收缩。在增加的刺激频率下，天然骨骼肌组织中也形成强直收缩，因此所述工程化骨骼肌组织在这方面的行为类似于天然骨骼肌组织。此外，发明人能够表明肌肉组织的收缩力随着收缩频率的增加而增强。这些特性与天然骨骼肌组织一致，后者也表现出响应电刺激的单次收缩和强直性收缩，以及正向力-频率关系。与所述工程化骨骼肌组织相比，在天然肌肉组织中，电脉冲由运动终板的神经递质刺激(乙酰胆碱)触发。
因此，所描述的方法产生了一种工程化的肌肉组织，该组织显示出特征性形成多核肌纤维(肌管)，并且响应于电刺激而产生力。
材料和方法
为了从细胞培养物中解离细胞(T75细胞培养瓶规定的体积)，用3ml TrypLE(英杰公司)洗涤细胞一次，然后于室温下在5ml TrypLE中培养约7分钟。洗掉TrypLE，用含有5μMRock抑制剂的10ml扩增培养基停止消化。为了诱导结块，使用10-ml移液管研磨细胞悬液。细胞的分离必须足够温和，以免降低细胞活力。使用CASY计数器对细胞进行计数(通过将20μl细胞悬液加入10ml CASY缓冲液中)。细胞在室温下以100×g的速率沉淀10分钟。去除上清液，根据ESM的量(参见预混物)，将沉淀轻轻地重新悬浮在适当体积的含有5μM Rock抑制剂的扩增培养基中。将细胞悬液置于冰上。
对于解冻细胞，从-152℃冷冻机中取出小瓶。细胞在37℃的水浴中快速解冻2分钟。用酒精喷洒小瓶并转移到细胞培养罩下。使用2ml血清移液管将冷冻小瓶的内容物转移到15ml反应管中。在室温下用1ml含有5μM Rock抑制剂的扩增培养基洗涤冷冻小瓶，然后将扩增培养基逐滴添加到所述细胞中以避免渗透压冲击。缓慢加入另外8ml含有5μM Rock抑制剂的扩增培养基。在细胞计数之前将悬浮液上下移取不超过两次以避免细胞损伤。使用CASY计数器对细胞进行计数(通过将20μl细胞悬液加入10ml CASY缓冲液中)。细胞在室温下以100×g的速率沉淀10分钟。去除上清液，将沉淀轻轻重新悬浮于适当体积的含有5μMRock抑制剂的扩增培养基中；根据ESM的量，制备限定体积的细胞悬液(参见预混物)。将细胞悬液置于冰上。
实施例3：从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织(生物工程化骨骼肌，BSM)
在此实施例中，多能干细胞和细胞外基质用于构建工程化骨骼肌组织(BSM)。与实施例1和实施例2相反，在BSM生产中没有发生从基质胶包被的细胞培养板到细胞外基质的转变。相反，人类诱导的多能干细胞被直接分散/包埋到限定的细胞外基质中。在化学和物理刺激存在的情况下，所述细胞外基质支持多能干细胞自组装成骨骼肌组织。该方法也是无血清和无转基因的，因此所有必需的物质及其浓度已限定。因此，人类多能干细胞分化和成熟成骨骼肌管和卫星细胞(骨骼肌纤维)受到控制。
分化方案的示意图如图7A所示，并示出了添加到培养基中不同药剂的顺序以及拉伸装置上的物理刺激。在图7A中描述的方法中，诱导中胚层分化(第0-4天)，诱导肌源性特化(第4-12天)，所述细胞成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞(第12-21天)，最后成熟为骨骼肌管和卫星细胞(第21-50天)。
为了实施该方法，诱导多能干细胞在前一天从细胞培养物中解离，计数，并将沉淀轻轻重新悬浮于适当体积的培养基中(iPS-Brew XF含有5uM Rock抑制剂、含10ng/ml bFGF(佩普罗泰克公司(Peptrotech))的10％KO血清替代物(生命科技公司))。将干细胞作为细胞悬液置于冰上。
为了将所述人类多能干细胞与胶原蛋白/基质胶混合并倒入环状模具中，将所述预混物在冰上于50-ml反应管中混合。使用2-ml移液器添加胶原蛋白，并遵循以下精确的移取顺序。
Figure BDA0003692053310000461
将所述预混物倒入环状模具中。将所述环状模具小心地转移到培养箱中，使混合物在37℃下静置1小时。在培养期后，每个模具小心添加8ml培养基(iPS-Brew XF含有5μMRock抑制剂、含10ng/ml bFGF(佩普罗泰克公司)的10％KO血清替代物(生命科技公司))。
在N2-FCL培养基中培养诱导多能干细胞的中胚层分化。浇注后24小时，将所述培养基更换为N2-FCL培养基。在第1、2和3天，每天用新鲜的N2-FCL培养基更换培养基。(组成参见实施例1)。
通过在N2-FD、N2-FHD和N2-HKD培养基中培养诱导肌源性特化。在第4天和第5天，将培养基更换为N2-FD培养基并每天更换(组成参见实施例1)。在第6天和第7天，培养基更换为N2-FHD培养基并每天更换。(组成参见实施例1)。在第8、9、10和11天，将培养基更换为N2-HKD培养基并每天更换(组成参见实施例1)。
在第12-20天，将培养基更换为N2-HK培养基(扩增培养基)，每隔一天更换一次(组成参见实施例1)。通过在扩增培养基中培养，所述细胞成熟为骨骼肌成肌细胞。
在第21天，将形成的环转移到6孔板中的拉伸装置上，并在成熟条件下进一步培养。因此，所述细胞在物理刺激(即机械拉伸)下进一步培养。此外，通过每孔加入5ml的成熟培养基，由成熟培养基诱导细胞成熟(成熟培养基的组成参见实施例2)。为了使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，在随后的4周成熟阶段中每隔一天更换一次成熟培养基。
为了实验性地测试由诱导多能干细胞生产工程化骨骼肌组织，如实施例2，使用荧光显微镜分析生成的骨骼肌组织。如实施例2，使用免疫染色使真核细胞骨架的结构蛋白辅肌动蛋白可视化，细胞核中的DNA被染料DAPI染色。荧光图像显示特征性的条纹图案，如实施例2，表明多核成熟骨骼肌纤维的形成(图8b)。因此，BSM还呈现出由所述方法形成的多核成熟骨骼肌纤维。
此外，为了在功能上测试人工生成的肌肉组织，本发明人进行了如实施例2的收缩实验。器官浴中的这些收缩实验测量了生产的骨骼肌组织响应电刺激的收缩频率和收缩力。
收缩实验的结果如图7B和图7C所示。图7B显示了所述工程化骨骼肌组织在不同刺激频率下的代表性收缩力曲线。在1Hz(虚线)的刺激下，记录了8次单次收缩，单次持续时间约为0.5秒；在100Hz(实线)的刺激下，检测到完全成形的强直收缩。图7C显示了工程化骨骼肌组织根据刺激频率的收缩力。以毫牛顿(mN)为单位测量骨骼肌组织收缩力(“FOC”)(n＝3)。在1Hz的刺激下，收缩力平均为0.3毫牛顿；在10Hz的刺激下，收缩力平均为0.5毫牛顿；在20Hz的刺激下，收缩力平均为0.55毫牛顿；在40Hz的刺激下，收缩力平均为0.6毫牛顿；在60Hz的刺激下，收缩力平均为0.65毫牛顿；在80Hz的刺激下，收缩力平均为0.72毫牛顿；在100Hz的刺激下，收缩力平均为0.9毫牛顿。
这些收缩实验表明，BSM也会响应电刺激而产生力。测试的骨骼肌组织在1Hz和100Hz之间的刺激频率下显示出可重复的收缩频率和收缩力，单次刺激后的收缩和松弛时间约为0.6秒。此外，ESM和BSM在强直收缩形成和收缩力增加方面表现出相同的特征。与实施例2中描述的ESM一样，BSM在增加的刺激频率(例如100Hz)下形成强直收缩。同样与实施例2一样，BSM的收缩力随着刺激频率的增加而增加。
这两种特性都类似于天然肌肉组织的收缩行为，因为在天然骨骼肌中，也会形成强直收缩，并且收缩力随着刺激频率的增加而增加。与天然骨骼肌相似，工程化骨骼肌组织显示出响应电刺激的单次收缩和强直性收缩，以及正向力-频率关系。
因此，实施例2和3的工程化骨骼肌组织(ESM和BSM)响应电刺激的行为类似于天然骨骼肌组织。
实施例4：增强工程化骨骼肌组织的功能
进一步增强工程化骨骼肌的功能(例如收缩力)，可以通过添加特定分子来增强。在这个实施例中，我们专门测试了响应于添加肌酸和甲状腺激素T3浓度的增加(三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)；在步骤iv的成熟培养基中从3增加到100nmol/L)收缩力，以及收缩和松弛时间的提升。这里，首先进行根据实施例1和2的程序。与实施例2相反，在所述方法的第28天和第56天之间或第56天和第84天之间，向成熟培养基补充肌酸或增加浓度的T3。
肌酸补充：当成熟培养基从所述程序的第28天到第56天补充1mM肌酸时，在100Hz刺激下的强直性收缩期间，收缩力(FOC)从1.8mN增加到2.5mN(图9B，上部)。因此，这种培养基的添加使收缩力增加了39％。此外，测试了延长的方法中收缩力可能增加的情况。为此，如实施例2所述，将该方法再延长4周，并在此期间向培养基补充1mM肌酸。从程序的第56天到第84天，用1mM肌酸补充所述成熟培养基，在100Hz刺激下于强直性收缩期间，收缩力(单收缩张力)从4.0mN增加到5.2mN(图9B，下部)。因此，这种培养基添加剂将收缩力提高了30％。
由此可见，向所述成熟培养基中添加肌酸显著增加了两个实验中的收缩力。
补充T3：从所述方法的第28天到第56天，用0.1μM T3补充所述成熟培养基，收缩和松弛速度显著降低，这通过学生T检验确定(图10B)。此外，当如实施例2中所述延长所述方法时，收缩和松弛速度降低，其中在第56天和第84天之间所述培养基补充了0.1μM T3(图10B)。因此，工程化骨骼肌对强直性刺激的反应更快，并且在刺激终止后松弛得更快。
可以假定，一般而言，T3浓度增加的成熟培养基使骨骼肌收缩性得以改善，这意味着收缩和松弛时间的加快。
为了研究这种改善肌肉功能的分子原因，通过蛋白质印迹法分析了不同蛋白质的表达。MYH2是快速肌球蛋白的重链(MYH2；肌球蛋白重链)；MYH7是慢速肌球蛋白的重链(MYH7；慢肌球蛋白重链)；MYH3是胚胎肌球蛋白的重链(MYH3；胚胎肌球蛋白重链)。在第84天分析蛋白质表达。如图10C所示，MYH2的蛋白质表达在添加0.1μM T3的4周显著增加。基于三个独立的实验，表达增加了至少5倍。添加0.1μM T3后，MYH7的表达保持不变。MYH3表达平均减少了大约一半。这些蛋白质表达数据支持图10B的功能数据，因为工程化骨骼肌的响应时间减少可以通过T3增加快速肌球蛋白(MYH2)亚型的表达来解释。
总之，结果表明在成熟过程中添加肌酸和/或T3增强了工程化骨骼肌的功能。具体而言，结果表明添加肌酸大大增强了收缩力。此外，已证实添加T3可提高工程化骨骼肌的反应速度。这种功能的增强得到了MYH2表达增加的证明。
还可以假设，当根据实施例3制备工程化骨骼肌组织(BSM)，然后将肌酸和/或T3添加到成熟培养基中时，工程化骨骼肌的功能将以相同的方式增强。
实施例5：工程化骨骼肌组织的再生能力
为了能够使用工程化骨骼肌组织，例如，作为植入物或作为用于测试诱导再生或肌肉生长药物的模型，工程化骨骼肌组织理想地具有再生特性。这种再生特性的特征在于可以修复工程化骨骼肌组织的损伤。对于这个修复过程，工程化骨骼肌组织需要具有再生特性的细胞，例如卫星细胞(骨骼肌祖细胞)。在图11A中，分析了在骨骼肌细胞前体中表达的标志物(PAX7、PAX3、MYF5和BARX2)的蛋白质表达。与2D培养相比，在所述方法的培养第60天，所有四个标志物都在ESM中清晰地表达。此外，PAX3、MYF5和BARX2在工程化骨骼肌中的表达比在2D板中培养骨骼肌细胞中的表达更高。这表明在工程化骨骼肌组织中，与平行2D培养物相比，骨骼肌细胞前体得以维持并额外增殖。图11B还显示了ESM中分化良好的卫星细胞生态位；在类似于本文所述方法的2D培养物中也看到了零星和分化程度较低的卫星细胞生态位。
为了测试再生特性，将工程化骨骼肌组织(60天龄)与肌肉毒素心脏毒素(25μg/ml)一起培养24小时。在培养后第2天和第21天测量收缩力(图11C)。如图11D所示，工程化骨骼肌组织在与CTX培养后2天未显示收缩，并且在培养后21天，工程化骨骼肌再次收缩，收缩力为1mM。因此，工程化骨骼肌能够再生。相比之下，另外用γ辐照(30Gy)处理的骨骼肌没有从CTX培养中恢复。这表明工程化骨骼肌的再生依赖于所含骨骼肌细胞祖细胞的激活。辐照抑制这些和所有其他具有细胞分裂活性的细胞。该实验进一步证明在分子尺度上和显微镜下可检测的骨骼肌细胞祖细胞(图11A-B)是功能性的。相比之下，图11E还通过荧光显微镜显示了与辐照ESM相比，未辐照ESM中的肌肉重建。在CTX诱导的肌肉细胞破坏后第21天检测到具有肌节辅肌动蛋白的细胞表明，ESM中通过骨骼肌细胞祖细胞的细胞分裂和分化激活的肌肉重建。在辐照的ESM中没有检测到再生活性。这些形态观察结果与图11D中的功能观察结果一致。这些表明，工程化骨骼肌在CTX介导的肌肉细胞破坏后21天再次收缩，收缩力为约1mN。
实施例4和5的方法
成熟条件
每隔一天更换一次成熟培养基，并在机械拉伸下培养长达9周。所述成熟培养基包含DMEM、其包含低葡萄糖、GlutaMAXTM补充剂、丙酮酸盐(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))、1％N-2补充剂(赛默飞世尔科技公司)、2％B-27补充剂(赛默飞世尔科技公司)和可选的抗生素(例如,1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)-赛默飞世尔科技)。当有成熟的迹象时(例如，第28-56天或第56-84天)，将0.1μM T3(西格玛奥德里奇公司)或1mM一水肌酸(西格玛奥德里奇公司)添加到成熟培养基中，持续4周。
等距力测量
在37℃下，工程化骨骼肌组织的收缩功能在等距条件于充气(5％CO2/95％O2)Tyrode溶液的器官浴(以mmol/L计的120NaCl、1MgCl2、0.2CaCl2、5.4KCl、22.6NaHCO3、4.2NaH2PO4、5.6葡萄糖和0.56抗坏血酸盐)中测量。为了验证力-长度关系——当ESM以1Hz和200mA的5ms矩形脉冲进行电刺激时——通过间隔为125μM的机械拉伸来增加肌肉长度，直到观察到最大收缩力。在产生最大力的长度，于限定的刺激频率(10、20、40、60、80和100Hz的4秒刺激)下评估强直性收缩力。
心脏毒素损伤模型。
对照的工程化骨骼肌与辐照的ESM并行地受心脏毒素损伤处理(CTX)。为了诱导损伤，所述组织在含有25μg/ml CTX(拉托克星公司(Latoxan))的成熟培养基中保持24小时(蒂伯西等人，2019)。然后冲洗损伤的组织并置于由DMEM、低葡萄糖、GlutaMAXTM补充剂、丙酮酸盐(赛默飞世尔科技公司)、1％N-2补充剂(赛默飞世尔科技公司)、1％MEM非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔科技公司)、10ng/ml HGF(佩普罗泰克公司)和10％敲除血清替代物(赛默飞世尔科技公司)组成的扩增培养基中1周，然后在由DMEM、低葡萄糖、GlutaMAXTM补充剂、丙酮酸盐(赛默飞世尔科技公司)、1％N-2补充剂(赛默飞世尔科技公司)、2％B-27补充剂(赛默飞世尔科技公司)和1mM肌酸一水合物(西格玛奥德里奇公司)组成的成熟培养基中再培养2周进行再生。每隔一天更新一次培养基。或者，可以添加抗生素(例如，1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)-赛默飞世尔科技公司)。
ESM辐照
在CTX处理前24小时，将ESM置于STS Biobeam 8000γ辐照器中的培养皿中，并受单剂量30Gy辐照10分钟(蒂伯西等人，2019年)。
免疫染色和共聚焦成像。
2D细胞培养物在室温下在4％甲醛(卡尔罗特公司(Carl Roth))的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定15分钟。在4℃下，工程化骨骼肌固定在4％多聚甲醛的PBS中过夜。固定后，将工程化骨骼肌浸入70％乙醇(卡尔罗特公司)中1分钟，然后包埋在1×Tris乙酸盐-EDTA(TAE)缓冲液的2％琼脂糖(peqGOLD)中。使用Leica Vibrotome(LEICAVT1000S)在400μM下切割切片并储存在冷的1×PBS中。染色前，2D细胞培养物和ESM切片均用1×PBS洗涤。为了诱导封闭和透化作用，将样品在封闭缓冲液(含有5％胎牛血清、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.5％Triton-X的1×PBS)中培养。所有初级抗体和二级抗体染色均在相同的封闭溶液中进行。以下抗体用于进行初步染色，在室温下进行4小时或在4℃下进行24-72小时：Pax3(1:100，DSHB)、Pax7(1:100，DSHB)、MyoD(1:100，达科公司)和肌生成素(1:10，DSHB)。肌节-a辅肌动蛋白(1:500，西格玛奥德里奇公司)、层粘连蛋白(1:50，西格玛奥德里奇公司)。3×PBS洗涤后，在室温下应用适当的Alexa荧光染料标记的二级抗体(1:1000，赛默飞世尔科技公司)2小时。与二级抗体同步，Alexa 633缀合的鬼笔环肽(1:100，赛默飞世尔科技公司)和Hoechst 33342(1:1000，分子探针公司(Molecular Probes))分别用于f-肌动蛋白和细胞核染色。用PBS洗涤3次后，样品在Fluoromount-G(南方生物技术公司(Southern Biotech))中染色。所有图像均使用Zeiss LSM 710/NLO共聚焦显微镜获得。为了量化标记的细胞，使用ImageJ细胞计数器工具就3个不同实验中每个样品选择3个随机焦平面进行分析。
蛋白质印迹分析
对于蛋白质分离，将工程化骨骼肌置于Eppendorf管中并在液氮中快速冷冻。对于工程化骨骼肌，添加150μl冰冷的蛋白质裂解缓冲液(2.38g HEPES、10.20g NaCl、100ml甘油、102mg MgCl2、93mg EDTA、19mg EGTA、5ml NP-40，总体积为500ml ddH2O，该缓冲液含有1/10磷酸酶抑制剂(罗氏公司(Roche))和1/7蛋白酶抑制剂(罗氏公司)。将7mM不锈钢球(凯杰公司(Qiagen))添加到所述Eppendorf管中，使用TissueLyser II(凯杰公司)在30Hz和4℃下将样品匀浆30秒，然后在冰上培养2小时，然后以12,000rpm的速率且在4℃下离心30分钟。收集上清液作为蛋白质样品，并通过布拉德福德蛋白测定(Bradford protein assay)测量蛋白质浓度。将30μg蛋白质样品上样到4至15％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(伯乐公司(Bio-Rad))上，在100V下电泳分离约2.5小时，然后在30V下转移到在装满冰的盒中的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，冷藏过夜。为了使总蛋白可视化，PVDF膜用丽春红染色。在含有5％牛奶的1×Tris缓冲盐水(TBS)和0.1％吐温20的封闭溶液中进行初级抗体(室温下4小时)和二级抗体(室温下1小时)染色。ESM中的蛋白质表达使用以下初级抗体通过蛋白质印迹法分析：单克隆胚胎肌球蛋白重链3(1:500，F1.652，DSHB)、慢速肌球蛋白型重链7(1:500，A4.951，DSHB)和快速肌球蛋白类型重链2(1:100，A4.74，DSHB)。蛋白质上样由纽蛋白(VCL)抗体(1:5000，V3131，西格玛奥德里奇公司)控制。用1×Tris缓冲盐水(TBS)和0.1％吐温20洗涤所述膜5分钟。辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(1:10,000，P0260，达科公司)用于二级染色。用1×Tris缓冲盐水(TBS)和0.1％吐温20洗涤所述膜5分钟后，用Femto LUCENTTMLuminol试剂(G生物科学公司(Gbiosciences))覆盖印迹，并使用伯乐公司ChemiDocT mMP系统对蛋白质条带进行成像。使用ImageJ对蛋白质印迹进行蛋白质定量。
定量实时PCR
使用Trizol试剂(赛默飞世尔科技公司)从2D细胞培养物和工程化骨骼肌中分离总RNA。将Trizol添加到培养板的2D细胞中，刮去所述细胞，并通过涡旋匀浆细胞裂解物。将工程化骨骼肌置于聚丙烯管(Eppendorf)中并在液氮中快速冷冻。在存在7-mM不锈钢球(凯杰公司)的情况下，将1ml Trizol添加到工程化骨骼肌中，并使用TissueLyser II(凯杰公司)在30Hz和4℃下裂解样品2分钟。根据制造商的方案进行RNA分离。使用Nanodrop分光光度计(赛默飞世尔科技公司)定量RNA浓度。根据制造商的说明，用DNase I(罗氏公司)处理1μg RNA样品，然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))将样品反转录成互补DNA(cDNA)。使用快速SYBR Green预混液(赛默飞世尔科技公司)和AB7900 HT快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行定量PCR。或者，使用因美纳公司平台通过RNA测序进行转录组分析。
所有实施例中使用的材料
除非另有说明，否则本文使用的材料是可商购的。例如，青霉素/链霉素、B27无血清添加剂、必需氨基酸(MEM-NEAA)和2-巯基乙醇可从英杰公司获得。使用的每种材料都标有公司名称。
N2和B27无血清添加剂溶液的原液储存在-20℃。解冻后，将它们添加到培养基中并在4℃下最多保存一周。敲除血清替代物原液也储存在-20℃。解冻后，它们在4℃下最多保存两周。LDN193189原液在DMSO中的浓度为10mM，并在-20℃下储存。DAPT原液在DMSO中的浓度为20mM，并储存在-20℃。bFGF原液在含有0.1％人类重组白蛋白的PBS中浓度为10μg/ml，并在-20℃下储存。HGF原液在含有0.1％人类重组白蛋白的PBS中浓度为10μg/ml，并在-20℃下储存。Rock抑制剂在DMSO中的浓度为10mM，储存在-20℃。
一旦生长因子和小分子的原液解冻，它们在4℃下最多保存一周。
表1：100×有效浓度的无血清添加剂N-2(液体形式)的组成，即1％(v/v)对应于单一(1×)有效浓度
组分 分子量 浓度(μg/ml) 浓度(mM)
人类转铁蛋白(Holo) 10000.0 10000.0 1.0
胰岛素，重组全链 5807.7 500.0 0.0860926
黄体酮 314.47 0.63 0.0020033708
腐胺 161.0 1611.0 10.006211
亚硒酸盐 173.0 0.52 0.0030057803
表2:100×有效浓度(100×)的非必需氨基酸组成
组分 分子量 浓度(mg/L) 浓度(mM)
甘氨酸 75.0 750.0 10.0
L-丙氨酸 89.0 890.0 10.0
L-天冬酰胺 132.0 1320.0 10.0
L-天冬氨酸 133.0 1330.0 10.0
L-谷氨酸 147.0 1470.0 10.0
L-脯氨酸 115.0 1150.0 10.0
L-丝氨酸 105.0 1050.0 10.0
表3：DMEM、1g/l的低葡萄糖、GlutaMAXTM，补充有丙酮酸盐(吉布科公司，目录号：10567014)
Figure BDA0003692053310000521
Figure BDA0003692053310000531
表4：50×有效浓度另外的无血清B27添加剂(液体形式)的组成
每500ml培养基10ml的50×B27添加剂相当于2％(v/v)
组分 50×B27中的浓度
μg/ml
无IgG低脂肪酸的BSA级分V 125000
过氧化氢酶 125
还原的谷胱甘肽 50
人类胰岛素 156,25
超氧化物歧化酶 125
人类Holo-铁转铁蛋白 250
T3 0,1
L-肉碱 100
乙醇胺 50
D+-半乳糖 750
腐胺 805
亚硒酸钠 0,625
皮质酮 1
亚油酸 50
亚麻酸 50
黄体酮 0,315
乙酸视黄酯 5
DL-α生育酚(Vit E) 50
DL-α生育酚乙酸酯 50
生物素 125
表5：敲除血清替代物(KSR)的组成
Figure BDA0003692053310000532
Figure BDA0003692053310000541
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Claims (96)

1.一种从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织的方法，包括以下步骤
(i)通过在基础培养基中培养多能干细胞来诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂，所述无血清添加剂包括转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中无血清添加剂的基础培养基中，培养步骤(i)获得的细胞来诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，将所述细胞扩增和成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞；
(iv)通过在基础培养基中于机械刺激下培养步骤(iii)中获得的细胞，其分散在细胞外基质中，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)如步骤(i)无血清添加剂，和(b)另外的无血清添加剂，包含白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)；
从而生产工程化骨骼肌组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，并且最优选产生至少2mN。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多能干细胞来源于灵长类动物，特别是人类多能干细胞；和/或其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、通过细胞核移植生产的多能干细胞和通过化学重编程生产的多能细胞，特别是其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。
4.根据权利要求1-3中所述的方法，其中步骤(i)进行24至132小时，优选48至120小时，更优选60至114小时，甚至更优选72至108小时，更优选84至102小时，最优选约96小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐组成的组，优选地其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021；和/或
其中在步骤(i)中，所述SMAD抑制剂选自由LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1组成的组，优选地其中所述SMAD抑制剂是LDN193189。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(i)中，FGF2的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml；和/或
所述无血清添加剂在所述培养基中提供的终浓度为50-500μg/ml转铁蛋白、1-20μg/ml胰岛素、0.001-0.1μg/ml黄体酮、5-50μg/ml腐胺和6-600nM硒或其生物可利用盐，特别是亚硒酸钠，和/或
所述GSK3抑制剂为CHIR99021，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM；和/或
所述SMAD抑制剂为LDN193189，有效量为0.05-5μM，优选0.1-2.5μM，更优选0.2-1μM，甚至更优选0.25-0.8μM，甚至更优选0.3-0.75μM，甚至更优选0.35-0.7μM，甚至更优选0.4-0.6μM，甚至更优选0.45-0.55μM，最优选约0.5μM。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述无血清添加剂是0.1-10％(v/v)N2添加剂，更优选0.3-7.5％(v/v)N2添加剂，更优选0.5-5％(v/v)N2添加剂，更优选0.75％-2％(v/v)N2添加剂，更优选0.9％-1.2％(v/v)N2添加剂，最优选约1％(v/v)N2添加剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(i)、步骤(ii)、步骤(iii)和/或步骤(iv)中的所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、Hams F-10、Hams F-12，其中所述基础培养基优选为DMEM，特别是其中所述基础培养基补充有丙酮酸盐和/或非必需氨基酸，和/或包含1g/l葡萄糖。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)所述无血清添加剂存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2、(c)所述无血清添加剂和(d)HGF存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)所述无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)存在下进行72至120小时，优选76至114小时，更优选84至108小时，甚至更优选90至102小时，最优选约96小时。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂选自由DAPT、RO4929097、司马西特(LY450139)、阿瓦西特(BMS-708163)、二苯并氮杂卓(YO-01027)、LY411575、IMR-1、L685458，优选其中所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂是DAPT。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，FGF2的有效量为15-30ng/ml，优选17.5-25ng/ml，更优选18-22ng/ml，甚至更优选19-21ng/ml，最优选约20ng/ml；和/或
HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml；和/或
所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂为DAPT，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM；
所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(iii)中，HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述另外的无血清添加剂在所述培养基中提供的终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、17.4-1744nM硒或其生物可利用盐(具体是亚硒酸钠)、0.4-40μg/ml L-肉碱、0.05-5μl/ml脂肪酸添加剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中，所述另外的无血清添加剂为0.1-10％(v/v)B27，优选0.5-8％(v/v)，更优选1-6％(v/v)，甚至更优选1.5-4％(v/v)，并且最优选约2％(v/v)B27。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述机械刺激是静态张力或动态刺激或增张力性刺激，优选地其中所述机械刺激是静态张力。
16.根据权利要求1-15中任一项的方法，包括在步骤(i)之前接种步骤，其中在ROCK抑制剂存在下将所述多能干细胞接种在干细胞培养基中，优选地其中所述接种步骤在步骤(i)之前18-30小时进行。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，特别优选地其中所述ROCK抑制剂是Y27632。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632并且使用浓度是0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选的4-6μM，最优选浓度为约5μM；和/或
其中所述干细胞培养基是iPS-Brew XF。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中，在添加所述干细胞培养基之前，首先将所述接种步骤中的所述多能干细胞在预混物中存在细胞外基质的一种或更多种组分的情况下接种成工程化形式。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述预混物中的细胞外基质组分是胶原蛋白，优选I型胶原蛋白，更优选牛来源、人类来源或海洋来源的胶原蛋白，特别是牛来源的胶原蛋白，任选地其中所述细胞外基质另外包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多能干细胞以1-6×106个细胞/ml和0.7-1.4mg/ml胶原蛋白的比例接种在培养基中。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述预混物包含5-15％(v/v)的作为细胞外基质组分的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的渗出物，优选7.5％-12.5％(v/v)，更优选9-11％(v/v)，并且最优选包含约10％(v/v)，特别是其中所述渗出物是基质胶；和/或其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
23.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述预混物包含基质细胞，其中所述基质细胞产生所述细胞外基质组分胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或蛋白聚糖；和/或其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中在约1小时后将所述干细胞培养基添加到工程化形式的所述预混物中，其中所述干细胞培养基包含KSR和FGF2。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述干细胞培养基包含5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；和/或
其中所述干细胞培养基包含1-15ng/ml FGF2，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml FGF2。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中步骤(iii)进行7-11天，优选8-10天，并且最优选约9天。
27.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之后，在预混物中存在一种或更多种细胞外基质组分的情况下，在步骤(iv)之前的另外步骤中，将所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞接种成工程化形式。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述预混物中的细胞外基质组分是胶原蛋白，优选I型胶原蛋白，更优选牛来源、人类来源或海洋来源的胶原蛋白，特别是牛来源的胶原蛋白，任选地其中所述细胞外基质另外包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中将所述骨骼肌成肌细胞和卫星细胞以1-10×106个细胞/ml和0.7-1.4mg/ml胶原蛋白的比例接种在培养基中。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述预混物包含5-15％(v/v)的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的渗出物作为细胞外基质组分，优选7.5％-12.5％(v/v)，更优选9-11％(v/v)，最优选约10％(v/v)，特别是其中所述渗出物是基质胶；和/或
其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
31.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述预混物包含基质细胞，其中所述基质细胞生产所述细胞外基质组分胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或蛋白聚糖；和/或其中所述预混物的pH为pH 7.2至pH 7.8。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中在约1小时后，将步骤(iii)中使用的培养基添加到工程化形式的预混物中，其中所述培养基另外包含有效量的ROCK抑制剂；
具体地，其中所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，特别优选地其中所述ROCK抑制剂是Y27632。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632并且使用浓度为0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选浓度为约5μM。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中在约1天后，将所述培养基更换为步骤(iii)中使用的培养基，然后将所述细胞在该培养基中再培养5-9天，优选6-8天，最优选约7天。
35.根据权利要求19-34中任一项所述的方法，其中所述工程化形式具有环状、带状、线状、片状、袋状或柱状的形式，其中任选地融合了单个骨骼肌组织。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行至少19天，优选至少28天，更优选至少56天，甚至更优选进行至少120天，特别是进行至少240天。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述方法不包括分化或成熟相关转基因，优选其中所述方法不包括肌源性转基因，更优选其中所述方法不包括转基因Pax7或MyoD。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述方法不包括骨骼肌成肌细胞富集步骤，优选不包括通过细胞选择的富集步骤，更优选不包括通过基于抗体的细胞选择的富集步骤。
39.一种从多能干细胞生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞的方法，包括以下步骤
(i)通过在包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂的基础培养基中培养多能干细胞，诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述无血清添加剂包含转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；
(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，诱导肌源性特化，然后
继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后
在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；
(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞，然后
(iv)通过在包含有效量的(a)如(i)中的无血清添加剂和(b)另外的无血清添加剂的基础培养基中培养步骤(iii)中获得的细胞，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述另外的无血清添加剂包括白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，
从而生产骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管和卫星细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中通过所述方法实现的骨骼肌成肌细胞在可利用所有细胞量中的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，由流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中通过所述方法实现的卫星细胞在所有可用细胞量中的比例为至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，最优选达到至少30％，由流式细胞术检测Pax7的表达来确定。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述方法不包括骨骼肌成肌细胞富集步骤，优选不包括通过细胞选择的富集步骤，更优选不包括通过基于抗体的细胞选择的富集步骤。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞来源于灵长类动物，特别是人类多能干细胞；和/或其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、通过细胞核移植生产的多能干细胞和通过化学重编程生产的多能细胞，特别是其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其中步骤(i)进行48至132小时，优选48至120小时，更优选60至114小时，甚至更优选72至108小时，更优选84至102小时，并且最优选约96小时。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐，优选其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021；和/或
其中在步骤(i)中，所述SMAD抑制剂选自由LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1组成的组，优选其中所述SMAD抑制剂是LDN193189。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，FGF2的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或
所述无血清添加剂在所述培养基中提供的最终浓度为50-500mg/l转铁蛋白、1-20mg/l胰岛素、1-30μg/l黄体酮、5-50μg/ml腐胺和6-600nM硒或其生物可利用盐，具体是亚硒酸钠，和/或
所述GSK3抑制剂为CHIR99021，有效量为4-18μM，优选5-16μM，更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选8-13μM，甚至更优选9-12μM，甚至更优选9.5-11μM，并且最优选约10μM；和/或
所述SMAD抑制剂为LDN193189，有效量为0.05-5μM，优选0.1-2.5μM，更优选0.2-1μM，甚至更优选0.25-0.8μM，甚至更优选0.3-0.75μM，甚至更优选0.35-0.7μM，甚至更优选0.4-0.6μM，甚至更优选0.45-0.55μM，并且最优选约0.5μM。
47.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述无血清添加剂是0.1-10％(v/v)N2添加剂，优选0.3-7.5％(v/v)N2添加剂，更优选0.5-5％(v/v)N2添加剂，更优选0.75％-2％(v/v)N2添加剂，更优选0.9％-1.2％(v/v)N2添加剂，并且最优选约1％(v/v)N2添加剂。
48.根据权利要求39-47中任一项所述的方法，其中步骤(i)、步骤(ii)、步骤(iii)和/或步骤(iv)中的所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、αMEM、培养基199、HamsF-10、Hams F-12，其中所述基础培养基优选为DMEM，特别是其中所述基础培养基补充有丙酮酸盐和/或非必需氨基酸，和/或包含1g/l葡萄糖。
49.根据权利要求39-48中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)所述无血清添加剂存在下进行36至60小时，优选42至54小时，并且最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2、(c)所述无血清添加剂和(d)HGF存在下进行36至60小时，优选42至54小时，最优选约48小时；和/或
所述培养在(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)所述无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)存在下进行72至120小时，优选76至114小时，更优选84至108小时，甚至更优选90至102小时，并且最优选约96小时。
50.根据权利要求39-49中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂选自由DAPT、RO4929097、司马西特(LY450139)、阿瓦西特(BMS-708163)、二苯并氮杂卓(YO-01027)、LY411575、IMR-1、L685458，其中所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂优选为DAPT。
51.根据权利要求39-50中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，FGF2的有效量为15-30ng/ml，优选17.5-25ng/ml，更优选18-22ng/ml，甚至更优选19-21ng/ml，并且最优选约20ng/ml；和/或
HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，更优选9-11ng/ml，并且最优选约10ng/ml；和/或
所述γ-分泌酶/NOTCH抑制剂为DAPT，有效量为1-20μM，优选2-19μM，更优选3-18μM，甚至更优选4-17μM，甚至更优选5-16μM，甚至更优选6-15μM，甚至更优选7-14μM，甚至更优选7.5-13μM，甚至更优选8-12μM，甚至更优选9-11μM，最优选约10μM；
所述KSR的用量为6-14％(v/v)，优选7-13％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
52.根据权利要求39-49中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，HGF的有效量为1-15ng/ml，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/ml；
所述KSR的用量为5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，最优选约10％(v/v)KSR；特别是其中所述KSR在还原剂如β-巯基乙醇和/或α-硫代甘油存在下使用。
53.根据权利要求39-52中任一项所述的方法，其中步骤(iii)进行7-11天，优选8-10天，并且最优选约9天。
54.根据权利要求39-53中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述另外的无血清添加剂在所述培养基中提供的终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、17.4-1744nM硒或其生物可利用盐(具体是亚硒酸钠)、0.4-40μg/ml L-肉碱、0.05-5μl/ml脂肪酸添加剂，0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
55.根据权利要求39-54中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中所述另外的无血清添加剂为0.1-10％(v/v)B27，优选0.5-8％(v/v)，更优选1-6％(v/v)，甚至更优选1.5-4％(v/v)，并且最优选约2％(v/v)B27。
56.根据权利要求39-55中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行至少30天，优选至少35天，更优选至少40天，甚至更优选至少50天。
57.根据权利要求39-56中任一项的方法，包括在步骤(i)之前的接种步骤，其中在ROCK抑制剂存在下将所述多能干细胞接种在干细胞培养基中，优选地其中所述接种步骤在步骤(i)之前18-30小时进行。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔、羟基法舒地尔、GSK429286A和RKI1447组成的组，优选地所述ROCK抑制剂选自由Y27632、H-1152P、噻托维汀、法舒地尔和羟基法舒地尔组成的组，更优选所述ROCK抑制剂选自由Y27632和H-1152P组成的组，其中特别优选地所述ROCK抑制剂是Y27632。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y27632并且使用浓度为0.5-10μM，优选1-9μM，更优选2-8μM，更优选3-7μM，更优选4-6μM，并且最优选浓度为约5μM；和/或
其中所述干细胞培养基是iPS-Brew XF。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述干细胞培养基包含5-20％(v/v)，优选6-17.5％(v/v)，更优选7-15％(v/v)，更优选8％-12％(v/v)，更优选9％-11％(v/v)，并且最优选约10％(v/v)KSR；和/或
其中所述干细胞培养基包含1-15ng/ml FGF2，优选2.5-14ng/ml，更优选5-13ng/ml，甚至更优选7.5-12.5ng/ml，甚至更优选8-12ng/ml，甚至更优选9-11ng/ml，最优选约10ng/mlFGF2。
61.一种工程化骨骼肌组织，具有含卫星细胞的多核成熟骨骼肌纤维，并且没有血液供应和/或没有中枢神经系统控制；具体是其中所述骨骼肌纤维的存在是通过用DAPI染色辅肌动蛋白检测的。
62.根据权利要求61所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织是无血清的和/或不包含分化或成熟相关转基因，优选其中所述骨骼肌组织不包含肌源性转基因，更优选其中所述骨骼肌组织不包含所述Pax7或MyoD转基因。
63.根据权利要求61或权利要求62所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在200mA的100Hz刺激下产生的收缩力为至少0.3毫牛顿(mN)，优选产生至少0.4mN，更优选至少0.5mN，更优选至少0.6mN，更优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN；更优选至少1.8mN；更优选至少1.9mN；并且最优选至少2mN。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织通过工程化形成，优选其中它具有的工程化形式为环状、带状、线状、片状、袋状或柱状，任选地其中融合了单个骨骼肌组织，特别是其中所述骨骼肌组织的形式为环状。
65.根据权利要求1或权利要求39的步骤(i)获得的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞，通过权利要求1(i)或权利要求39(i)的方法制备，其特征在于基因MSGN1和/或TBX6的表达，其中MSGN1和/或TBX6的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定；和/或表达mRNASP5，其中SP5的表达可以通过RNA测序来确定。
66.根据权利要求1或权利要求39的步骤(ii)获得的肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞，通过权利要求1(i)至(ii)或权利要求39(i)至(ii)的方法生产，其特征在于所述基因PAX3的表达，其中PAX3的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定；和/或表达mRNASIM1，其中SIM1的表达可以通过RNA测序来确定。
67.根据权利要求1或权利要求39的步骤(iii)获得的骨骼肌成肌细胞，通过权利要求1(i)至(iii)或权利要求39(i)至(iii)的方法生产，其特征在于辅肌动蛋白的表达，优选其中辅肌动蛋白的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
68.一种卫星细胞，根据权利要求1或权利要求39的步骤(iii)获得，通过根据权利要求1(i)至(iii)或根据权利要求39(i)至(iii)的方法生产，其特征在于所述基因Pax7的表达，其中Pax7的表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定，更优选其中所述卫星细胞进一步表达Ki67。
69.一种根据权利要求67的骨骼肌成肌细胞和根据权利要求68的卫星细胞的混合物，其中获得的卫星细胞在所有可用细胞量中的比例为至少10％，优选至少15％，更优选为至少20％，甚至更优选至少30％，通过流式细胞术检测Pax7的表达来确定；和/或其中获得的骨骼肌成肌细胞在所有可用细胞量的比例为至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％，通过流式细胞术检测辅肌动蛋白的表达来确定。
70.根据权利要求1或权利要求39的步骤(iv)获得骨骼肌管，通过根据权利要求1(i)至(iv)或根据权利要求39(i)至(iv)的方法制备，其特征在于含辅肌动蛋白的肌节结构的各向异性取向。
71.根据权利要求61-64的骨骼肌组织和/或根据权利要求65-69中任一项的细胞和/或根据权利要求69的骨骼肌管在体外药物测定中的用途；具体是其中所述药物测定是毒性测定，或在药理和基因治疗候选药物影响下的骨骼肌组织功能测定。
72.根据权利要求61-64的骨骼肌组织和/或根据权利要求65-69中任一项的细胞，和/或根据权利要求70的骨骼肌管用于医学。
73.根据权利要求68的卫星细胞，用于治疗受损骨骼肌和/或用于治疗骨骼肌疾病，优选遗传性骨骼肌缺陷，具体是杜氏肌营养不良症和/或Becker-Kiener肌营养不良症，和/或溶酶体贮积症，具体是庞贝氏病，优选其中所述骨骼肌疾病是杜氏肌营养不良症。
74.一种用于测试候选药物对骨骼肌组织功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求60-63中任一项的骨骼肌组织，
(b)任选地对所述骨骼肌组织造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述骨骼肌组织与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
75.一种用于测试物质对骨骼肌组织毒性的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据权利要求61-64中任一项的骨骼肌组织，
(b)使步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测物质接触。
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
76.一种用于测试营养素和膳食补充剂对骨骼肌组织性能影响的体外方法，包括以下步骤
(a)提供根据权利要求61-64中任一项的骨骼肌组织，
(b)使步骤(a)的所述骨骼肌组织与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定收缩力和/或骨骼肌组织结构和/或代谢功能和/或分子参数和/或蛋白质生化参数。
77.一种测试候选药物对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的功效的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求65-70中任一项的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管，或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞的混合物，
(b)任选地对步骤(a)的所述细胞造成损伤，和
(c)使步骤(a)或(b)的所述细胞与候选药物接触；
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
78.一种用于测试物质对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的毒性的体外方法，包括步骤：
(a)提供根据权利要求65-70中任一项的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管，或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测物质接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
79.一种测试营养素和膳食补充剂对中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物的影响的体外方法，包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求65-70中任一项的中胚层分化的骨骼肌成肌细胞祖细胞、肌源特异性骨骼肌成肌细胞祖细胞、卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨骼肌管，或骨骼肌成肌细胞和卫星细胞混合物，
(b)将步骤(a)的所述细胞与待测试的营养素或膳食补充剂接触，
优选地，其中所述方法进一步包括在步骤(b)之前和/或之后确定辅肌动蛋白和/或Pax7的表达，其中所述表达可以通过流式细胞术和/或免疫染色来确定。
80.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少2毫牛顿(mN)，优选至少2.3mN，更优选至少2.6mN，甚至更优选至少3mM，甚至更优选至少3.3mN，甚至更优选至少3.6mN，最优选至少4mN。
81.根据权利要求1-60或80中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下的收缩速度为至少3mN/秒，优选至少4mN/秒，更优选至少5mN/秒，更优选至少6mN/秒，甚至更优选至少6.5mN/秒，甚至更优选至少7mN/秒。
82.根据权利要求1-60、80或81中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激终止时的松弛速度为至少0.5mN/秒，优选至少0.7mN/秒，更优选至少0.9mN/秒，更优选至少1mN/秒，甚至更优选至少1.2mN/秒，甚至更优选至少1.5mN/秒。
83.根据权利要求1-60或80-82中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述基础培养基包含有效量的肌酸和/或三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)。
84.根据权利要求83所述的方法，其中与步骤(iv)中无有效量肌酸的成熟过程相比，所述基础培养基中有效量的肌酸增强了所述工程化骨骼肌的收缩力。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中与步骤(iv)中无有效量的T3的成熟过程相比，所述基础培养基中有效量的T3提升所述工程化骨骼肌的收缩速度和/或松弛速度。
86.根据权利要求1-60或80-85中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述基础培养基提供的终浓度为0.1-10mM肌酸，优选0.2-6mM肌酸，更优选0.4-4mM肌酸，甚至更优选0.6-3mM肌酸，甚至更优选0.7-2.5mM肌酸，甚至更优选0.8-2mM肌酸，甚至更优选0.85-1.5mM肌酸，甚至更优选0.9-1.2mM肌酸，并且最优选约1mM肌酸。
87.根据权利要求1-60或80-86中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述基础培养基提供的终浓度为0.001-1μM三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，优选0.005-0.7μM T3，更优选0.01-0.35μM T3，甚至更优选0.04-0.02μM T3，甚至更优选0.05-0.18μM T3，甚至更优选0.06-0.15μM T3，甚至更优选0.08-0.12μM T3，甚至更优选约0.1μM T3。
88.根据权利要求1-60或80-87中任一项所述的方法，其中所述骨骼肌组织具有自我再生的特性。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述再生特性的特征在于恢复的收缩性和/或肌肉恢复，优选其中所述恢复的收缩性和/或肌肉恢复是在心脏毒素造成不可逆的肌肉损伤后测量的，更优选其中所述恢复的收缩性和/或肌肉恢复在与心脏毒素一起培养10-30天后测量。
90.根据权利要求1-60或80-89中任一项所述的方法，其中步骤(iv)进行至少50天，更优选至少60天，甚至更优选至少70天，甚至更优选至少80天。
91.通过根据权利要求1-60或80-90中任一项的方法生产的工程化骨骼肌组织。
92.根据权利要求61-64或91中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选地至少0.7mN，更优选地至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选在至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，更优选至少2mN，更优选至少2.3mN，更优选至少2.6mN，甚至更优选至少3mM，甚至更优选至少3.3mN，甚至更优选至少3.6mN，并且最优选至少4mN。
93.根据权利要求61-64或91-92中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下收缩速度为至少3mN/秒，优选至少4mN/秒，更优选至少5mN/秒，更优选至少6mN/秒，甚至更优选至少6.5mN/秒，甚至更优选至少7mN/秒。
94.根据权利要求61-64或91-93中任一项所述的工程化骨骼肌组织，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激终止时的松弛速度为至少0.5mN/秒，优选至少0.7mN/秒，更优选至少0.9mN/秒，更优选至少1mN/秒，甚至更优选至少1.2mN/秒，甚至更优选至少1.5mN/秒。
95.根据权利要求61-64或91-94的骨骼肌组织和/或根据权利要求65-69中任一项的细胞和/或根据权利要求69的骨骼肌管在体外药物测定中的用途；特别是其中所述药物测定是毒性测定或在药理和基因治疗候选药物的影响下骨骼肌组织功能测定。
96.根据权利要求61-64和91-94的骨骼肌组织，和/或根据权利要求65-69中任一项的细胞，和/或根据权利要求70的骨骼肌管用于医学。
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