DE102019127604A1 - Herstellung von Skelettmuskelzellen und Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen - Google Patents

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Abstract

Die Anmeldung beschreibt Verfahren zur Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen. Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Herstellung von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen aus pluripotenten Stammzellen offenbart. Während der beschriebenen Verfahren findet eine gerichtete Differenzierung und Maturierung der pluripotenten Stammzellen in Skelettmyotuben und Satellitenzellen statt. Die Anmeldung beschreibt darüber hinaus künstliches Skelettmuskelgewebe, das multinukleäre Skelettmuskelfasern mit Satellitenzellen aufweist. Des Weiteren umfasst die Erfindung mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Skelettmyoblastenzellen, Satellitenzellen und Skelettmyotuben, die mithilfe der offenbarten Verfahren erzeugt werden können. Die Anmeldung beschreibt auch die Verwendung von Skelettmuskelgewebe oder der offenbarten Zellen in Arzneimitteltests oder in der Medizin. Schließlich betrifft die Anmeldung in vitro-Verfahren bei denen das Skelettmuskelgewebe oder die offenbarten Zellen verwendet werden.

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Der menschliche Körper besteht zu 35-40% aus Skelettmuskeln, die die Atmung, Haltung und Bewegung ermöglichen. Ein gesunder Skelettmuskel kann kleine Verletzungen wie Riss- oder Schnittwunden vollständig regenerieren, da die Muskelstammzellen, auch Satellitenzellen (engl.: satellite cells (SCs)) genannt, das verletzte Gewebe vollständig regenerieren können. Jedoch verheilen größere Verletzungen nicht, sodass bleibende Schädigungen zurückbleiben.
  • Die aktuelle Theorie des „Tissue Engineering“ besteht darin, die benötigten Zelltypen zu erzeugen und sie in einer künstliche Umgebung zu differenzieren, um ein in vivo ähnliches Gewebe zu erzeugen. Beim Tissue Engineering ist zu beachten, dass bei einer Dissoziation von differenzierenten Zellen die extrazelluläre Umgebung verloren geht und damit entwicklungsrelevante Informationen verloren gehen können. Beispielsweise werden durch eine Dissoziation die Zell-Zell-Interkonnektivität, die geometrische Zellpositionierung und die Zellextrazelluläre-Matrix-Konnektivität aufgebrochen. Diese Umgebung muss beim Tissue Engineering neu aufgebaut werden (Zimmermann et al. 2004, Tiburcy et al. 2017). Darüber hinaus besteht ein differenziertes Skelettmuskelgewebe nicht nur aus Skelettmuskelfasen, sondern auch aus Stroma-/ Bindegewebszellen, insbesondere aus Satellitenzellen, die sich gemäß ihrer Umgebung und den chemischen Reizen ausbilden.
  • Dem Fachmann sind unterschiedliche Tissue Engineering Verfahren in Bezug auf Skelettmuskelzellen bekannt, in denen 2D-Zellkulturen, Kleintiermodelle oder extrahiertes Muskelgewebe von Kleintieren verwendet werden (Beldjilali-Labro et al. (2018) und Khodabukus et al. (2018)).
  • In der Vergangenheit wurden oft Kleintiermodelle verwendet, um die biologischen Prozesse zu untersuchen. Jedoch haben Tiermodelle im Allgemeinen einige Einschränkungen. Bei Tiermodellen ist grundsätzlich fraglich, ob die Ergebnisse auf Menschen übertragen werden können, speziell in Bezug auf Krankheits-/Heilungsprozesse und die Wirksamkeit von Medikamenten.
  • Um die Limitierung von Tiermodellen zu überwinden, verspricht die Herstellung von künstlichem Skelettmuskelzellen und/oder Skelettmuskelgeweben einen hohen Nutzen.
  • Um die Differenzierung von Stammzellen in Skelettmuskelzellen zu unterstützen, wurden Stammzellen in der Vergangenheit oft mit muskelspezifischen Transkriptionsfaktoren transfiziert. Jedoch ist die Transfektionsrate bei unterschiedlichen Zellen unterschiedlich hoch und kann sich bei jedem Experiment unterscheiden. Darüber hinaus verwenden viele Forscher Blutserum während der Differenzierungsprotokolle. Jedoch ist oft unklar, welche Faktoren in dem aus Säugern gewonnenen Blutserum enthalten sind und wie sie sich auf die Differenzierung auswirken. Somit weisen Differenzierungsprotokolle bei denen Transgene oder Serum verwendet werden Schwächen auf, da die Reproduzierbarkeit dieser Verfahren erheblich eingeschränkt ist. Daher ist es essentiell ein Verfahren zu entwickeln, bei dem humane pluripotente Stammzellen durch definierte Faktoren in Skelettmuskelzellen und Satellitenzellen oder Skelettmuskelgewebe differenziert und maturiert werden, wobei keine Transgene oder Serum benötigt werden.
  • Des Weiteren deuten immer mehr Belege darauf hin, dass nicht nur chemische Reize, sondern auch physikalische Reize eine Rolle bei der Skelettmuskelgewebeentwicklung spielen. Somit scheint eine Kombination aus chemischen und physikalischen Stimulationen zusätzlich zur Oberflächentopographie und Strukturzusammensetzung eine Möglichkeit darzustellen, funktionelles Muskelgewebe zuverlässig in vitro herzustellen (Liao et al. (2008), Pavesi et al. (2015)). Jedoch bleibt die Chronologie, Dauer und Identität dieser unterschiedlichen Stimulationen während der Differenzierung und Maturierung der Zellen unklar.
  • Die Entwicklung eines robusten Differenzierungs- und Maturierungsprotokolls ist ein sehr wichtiger Schritt, um eine Herstellung von Skelettmuskelzellen und Satellitenzellen sowie künstlichem Skelettmuskelgewebe zu ermöglichen.
  • Die Erfinder der Patentanmeldung WO 2017/100498A1 offenbaren ein serumfreies Differenzierungsprotokoll von humanen pluripotenten Stammzellen in Skelettmyoblasten in einem 2D-Verfahren. Bei diesem Verfahren ist jedoch ein Anreicherungsschritt der Skelettmyoblasten mittels Durchflusszytometrie nötig, um nicht differenzierte Zelltypen aus dem Zellpool zu entfernen. Eine Aufreinigung über Durchflusszytometrie erlaubt keine Skalierung, ist mit Infektionsrisiken und einem sehr hohen Zellverlust verbunden und stellt daher eine zentrale Barriere für die kommerzielle Anwendung von Zellprodukten dar.
  • Es ist bisher nicht gelungen ein Verfahren zur effizienten Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu beschreiben - das transgen und serumsfrei ist - bei welchem kein weiterer Anreicherungsschritt für einen bestimmten Zelltyp nötig ist. Im Speziellen ist es bisher nicht gelungen, ein Verfahren zur effizienten Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in ein Skelettmuskelgewebe zu beschreiben, das die chemischen und physikalischen Reize unter Vermeidung von Transgenen und Serum beschreibt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe sowie Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen beschrieben, wobei die verwendeten Medien serumfrei sind und die unterschiedlichen chemischen Substanzen und deren Konzentrationen sowie die physikalische Reizung definiert sind. Darüber hinaus kommt das hierin beschriebene Verfahren ohne Transfektion der humanen Zellen mit Transgenen aus. Die künstlichen Skelettmuskelzellen weisen Myoblasten-spezifische, Myotuben-spezifische oder Satellitenzell-spezifische Genmarker auf, die die effiziente Differenzierung dieser Zelltypen belegt. Das Skelettmuskelgewebe weist obgleich seiner künstlichen Herstellung eine sehr gute Stimulus-abhängige Kontraktionskraft auf und zeigt Kontraktionen in Antwort auf unterschiedliche Stimulationsfrequenzen.
  • Die Erfindung umfasst Verfahren, in dem pluripotente Stammzellen in Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben sowie Satellitenzellen oder Skelettmuskelgewebe differenziert und maturiert werden. Das Skelettmuskelgewebe ist in einer extrazellulären Matrix dispergiert/eingebettet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte
    1. (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst;
    2. (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von
      • Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von
      • Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR);
    3. (iii) Expansion und Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR);
    4. (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen, die in einer extrazellulären Matrix dispergiert sind, unter mechanischer Stimulation in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst; dadurch Erzeugen von künstlichem Skelettmuskelgewebe.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte
    1. (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst;
    2. (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR);
    3. (iii) Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einen serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR), gefolgt von
    4. (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst;
    dadurch Erzeugen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen.
  • Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf künstliches Skelettmuskelgewebe, das multinukleäre reife Skelettmuskelfasern mit Satellitenzellen aufweist, und keine Durchblutung und/oder keine Steuerung über das zentrale Nervensystem aufweist. Dabei kann die Gegenwart von Skelettmuskelfasern durch Färbung von Aktinin und mit DAPI festgestellt werden.
  • Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen gerichtet, die gemäß Schritt (i) hergestellt und erhalten werden, und die durch die Expression von den Genen MSGN1 und/oder TBX6 gekennzeichnet sind, wobei die Expression von MSGN1 und/oder TBX6 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann. Diese Zellen exprimieren die mRNA SP5, wobei die Expression von SP5 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
  • Außerdem betrifft die Erfindung eine myogen-spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzelle, die gemäß der Schritte (i) bis (ii) hergestellt und erhalten wird, und die durch die Expression des Gens PAX3 gekennzeichnet ist, wobei die Expression von PAX3 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann. Diese Zellen exprimieren die mRNA SIM1, wobei die Expression von SIM1 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
  • Ferner bezieht sich die Erfindung auf Skelettmyoblastenzellen, die gemäß der Schritte (i) bis (iii) hergestellt und erhalten werden, und die durch die Expression von Aktinin gekennzeichnet sind, wobei die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen in Skelettmyoblasten bestimmt werden kann.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Satellitenzellen, die gemäß der Schritte (i) bis (iii) hergestellt und erhalten werden, die durch die Expression des Gens Pax7 gekennzeichnet sind, wobei die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann, stärker bevorzugt wobei Satellitenzellen ferner Ki67 exprimieren. Erfindungsgemäß ist darüber hinaus ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, wobei ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, noch stärker bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie; und/oder wobei ein Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% erzielt wird, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
  • Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Skelettmyotuben, die gemäß der Schritte (i) bis (iv) hergestellt und erhalten werden, und die durch eine anisotrope Ausrichtung der Aktinin-Protein-enthaltenen Sarkomerstruktur charakterisiert sind.
  • Ferner offenbart ist die Verwendung eines Skelettmuskelgewebes gemäß der Erfindung, und/oder von Zellen gemäß der Erfindung, und/oder von Skelettmyotuben gemäß der Erfindung in einem in vitro Arzneimitteltest. Der Arzneimitteltest kann ein Toxizitätstest oder ein Test auf die Funktion des Skelettmuskelgewebes unter dem Einfluss von pharmakologischen und gentherapeutischen Wirkstoffkandidaten sein.
  • Außerdem betrifft die Erfindung Skelettmuskelgewebe und/oder Zellen, und/oder von Skelettmyotuben gemäß der Erfindung zur Verwendung in der Medizin.
  • Im Speziellen bezieht sich die Erfindung auf Satellitenzellen gemäß der Erfindung zur Verwendung in der Therapie von geschädigtem Skelettmuskel und/oder in der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen, bevorzugt genetischen Skelettmuskeldefekten, insbesondere von Muskeldystrophie Duchenne und/oder Muskeldystrophie Becker-Kiener, und/oder von lysosomalen Speicherkrankheiten, insbesondere von Morbus Pompe, bevorzugt wobei die Skelettmuskelerkrankung Muskeldystrophie Duchenne ist.
  • Schließlich betrifft die Erfindung folgende in-vitro-Verfahren:
    • Ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
      1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß der vorliegenden Erfindung,
      2. (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu dem Skelettmuskelgewebe, und
      3. (c) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten;
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (c) umfasst.
  • Ein in vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
    1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß der vorliegenden Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz.
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
  • Ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf die Leistungsfähigkeit von Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
    1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß der vorliegenden Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel.
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
  • Ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
    1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß der vorliegenden Erfindung,
    2. (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu den Zellen aus Schritt (a), und
    3. (c) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten;
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (c) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Ein in vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
    1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß der vorliegenden Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
    1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß der vorliegenden Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte
    1. (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst;
    2. (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2 und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von
      • Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von
      • Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR);
    3. (iii) Expansion und Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR);
    4. (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen, die in einer extrazellulären Matrix dispergiert sind, unter mechanischer Stimulation in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst;
    dadurch Erzeugen von künstlichem Skelettmuskelgewebe.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die pluripotenten Stammzellen aus Primatenursprung, insbesondere humane pluripotente Stammzellen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die pluripotenten Stammzellen ausgewählt aus induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen, parthenogenetischen Stammzellen, über Kerntransfer hergestellten pluripotenten Stammzellen und über chemische Reprogrammierung hergestellten pluripotente Zellen, insbesondere wobei die pluripotenten Stammzellen induzierte pluripotente Stammzellen sind.
  • „Pluripotente Stammzellen“ sind in der Lage, sich in jeden Zelltyp des Körpers zu differenzieren. Daher bieten menschliche pluripotente Stammzellen die beachtliche Möglichkeit, beispielsweise Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen zu erhalten. Die derzeit am häufigsten verwendeten pluripotenten Zellen sind induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) oder embryonale Stammzellen (ESC). Menschliche ESC-Linien wurden erstmals von Thomson et al. hergestellt (Thomson et al., Science 282: 1145-1147 (1998)). Die menschliche ESC-Forschung ermöglicht heutzutage die Entwicklung einer neuen Technologie zur Umprogrammierung von Körperzellen in eine ES-ähnliche Zelle. Diese Technologie wurde 2006 von Yamanaka et al. entwickelt und ist auch auf menschliche Zellen anwendbar (Takahashi & Yamanaka Cell 126: 663-676 (2006) und Takahashi, Kazutoshi et al. Cell, 131:(5)861 - 872(2007)). Die resultierenden induzierten pluripotenten Zellen (iPSC) zeigen ein sehr ähnliches Verhalten wie ESC und sind auch in der Lage, sich in jede Zelle des Körpers zu differenzieren. Darüber hinaus können in einer weiteren Ausführungsform parthenogenetische Stammzellen verwendet werden. Parthogenetische Stammzellen können bei Säugetieren, bevorzugt bei der Maus als auch beim Menschen, aus Blastozysten gewonnen werden, die sich nach einer in vitro-Aktivierung unbefruchteter Eizellen entwickeln. Diese Zellen weisen die Schlüsselmerkmale pluripotenter Stammzellen auf, sodass sie sich in vitro in jeden Zelltyp differenzieren können (Espejel S et al. (2014)). Dementsprechend können die pluripotenten Stammzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen und parthenogenetischen Stammzellen ausgewählt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die pluripotenten Stammzellen jedoch nicht nach einem Verfahren hergestellt, bei dem die genetische Identität des Menschen in der Keimbahn verändert wird oder bei dem ein menschlicher Embryo für industrielle oder kommerzielle Zwecke verwendet wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden induzierte pluripotente Stammzellen ausgewählt.
  • Um eine gerichtete Zelldifferenzierung der pluripotenten Stammzellen zu Skelettmuskelgewebe zu erzielen, wird die Differenzierung mithilfe von spezifischen Faktoren oder Zusätzen erzielt. Generell werden die erfindungsgemäßen Differenzierungsschritte in Gegenwart eines „Basalmediums“ durchgeführt. Es kann jedes geeignete Basalmedium für das Verfahren verwendet werden. Bevorzugt ist das in den Schritten (i)-(iv) verwendete Basalmedium ausgewählt aus DMEM , DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10 und Hams F-12. Vorzugsweise ist das in den Schritten (i)-(iv) verwendete Basalmedium DMEM, ergänzt durch Pyruvat. Noch mehr bevorzugt ist das in den Schritten (i)-(iv) verwendete Basalmedium DMEM, ergänzt durch Pyruvat mit 1g/1 Glukose. Basalmedien sind kommerziell erhältlich oder können nach öffentlich zugänglichen Rezepturen hergestellt werden, z.B. aus Katalogen des ATCC. In einer stark bevorzugten Ausführungsform ist das Basalmedium DMEM mit 1 g/l Glukose sowie einer Glutaminzubereitung (z.B. L-Alanyl-L-Glutamin oder GlutaMAX™) und besteht aus den Substanzen, die in Tabelle 3 aufgelistet sind. Wenn es für angemessen erachtet wird, kann das Basalmedium mit einer wirksamen Konzentration an nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Basalmedium mit einer einfachen wirksamen Konzentration der nicht-essentiellen Aminosäuren aus Tabelle 2 ergänzt. Das Basalmedium in den Schritten (ii), (iii) und (iv) kann unabhängig voneinander aus dem in Schritt (i) verwendeten Basalmedium ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Basalmedium in den Schritten (i) -(iv) jedoch gleich.
  • Generell können die verschiedenen Differenzierungsstadien der Schritte (i)-(iv) mithilfe von exprimierten Genen nachgewiesen werden, die für ein bestimmtes Stadium charakteristisch sind. Eine Methode, die die Genexpression messen kann, ist die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq). RNA-Sequenzierung wird auch Transkriptom-Analyse genannt. Als RNA-Sequenzierung wird die Bestimmung der Nukleotidabfolge der RNA bezeichnet, die auf Hochdurchsatzmethoden basiert. Hierfür wird die RNA in cDNA überführt (transkribiert), damit die Methode der DNA-Sequenzierung angewendet werden kann. Dadurch gibt RNA-Sequenzierung Aufschluss darüber, welche mRNAs exprimiert werden und zeichnet sich durch ein geringes Hintergrundrauschen, höhere Auflösung und hohe Reproduktionsraten aus. Dem Fachmann ist die Methode der mRNA-Sequenzierung bekannt und er kann diese ausführen. In Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung werden exemplarische Daten dargestellt, die mithilfe von RNA-Sequenzierung gemessen wurden. Speziell zeigt einen zeitlichen Verlauf der mRNA Expression von unterschiedlichen Genen in einem Zeitfenster von 0 bis 60 Tage während des erfindungsgemäßen Differenzierungsprotokolls.
  • Charakteristisch für pluripotente Stammzellen ist die mRNA Expression von NANOG, POU5F1 (OCT4) und ZFP42. Das heißt, dass Zellen, die diese Marker exprimieren, pluripotent sind. Während der erfindungsgemäßen Differenzierung von pluripotenten Stammzellen wird in Schritt (i) die „Mesodermaldifferenzierung“ durch spezifische Faktoren/Zusätze induziert. Bei allen bilateralen Tieren (Bilateria), wie auch dem Menschen, ist das Mesoderm eine der drei primären Keimschichten im sehr frühen Embryo. In bilateralen Tieren gibt es drei wichtige Komponenten des Mesoderms: das paraxiale Mesoderm, das Zwischenmesoderm und das laterale Plattenmesoderm. Aus dem paraxialen Mesoderm entsteht in bilateralen Tieren unter anderem die Skelettmuskulatur. Die Induktion der Mesodermaldifferenzierung wird durch die Genexpression von spezifischen Genen charakterisiert, wie beispielsweise die mRNAs von MSGN1, TBX6 und MEOX1. Eine mRNA-Expression dieser oder anderer Gene, die spezifisch für die Expression von paraxialem Mesoderm sind, können mit Hilfe von RNA-Sequenzierung, wie hierin beschrieben, gemessen werden.
  • Wie vorstehend ausgeführt, umfasst das Basalmedium von Schritt (i) eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst. Dem Fachmann ist bekannt, dass eine wirksame Konzentration oder Menge eines Rezeptor/Enzym-Agonisten oder -Inhibitors mit der Verfügbarkeit und biologischen Aktivität der jeweiligen Substanz variiert. In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge von FGF2 1-15 ng/ml, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml.
  • Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK-3) ist eine Serin/Threonin-Protein-Kinase, welche selektiv Phosphat-Reste an die Serin- und Threonin-Reste anderer Proteine anfügt. Die Inhibierung der Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3) hilft dabei den Wnt-Signalweg für die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu aktivieren. Der GSK3-Inhibitor im Basalmedium ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, Tideglusib, SB415286, 6-bromoindirubin-3-oxime und einem Valproatsalz, wobei der GSK3-Inhibitor CHIR99021 bevorzugt ist. Es kann jedoch jeder GSK3-Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Wenn der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist, beträgt eine wirksame Menge 1-20 µM, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM.
  • Ein SMAD-Inhibitor inhibiert Proteine, die für die Regulierung der Zellentwicklung und des Wachstums von entscheidender Bedeutung sind. Der SMAD-Inhibitor im Basalmedium ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LDN193189, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, wobei bevorzugt der SMAD Inhibitor LDN193189 ist. Es kann jedoch jeder SMAD-Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Wenn der SMAD-Inhibitor LDN193189 ist, beträgt eine wirksame Menge 0,05-5 µM, bevorzugt 0,1-2,5 µM, stärker bevorzugt 0,2-1 µM, noch stärker bevorzugt 0,25-0,8 µM, noch stärker bevorzugt 0,3-0,75 µM, noch stärker bevorzugt 0,35-0,7 µM, noch stärker bevorzugt 0,4-0,6 µM, noch stärker bevorzugt 0,45-0,55 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 µM. Dem Fachmann ist bekannt, dass eine wirksame Konzentration oder Menge eines Inhibitors mit der Verfügbarkeit und biologischen Aktivität der jeweiligen Substanz variiert und dies gilt für alle Substanzen, wie beispielsweise Proteine/Peptide, Nukleotide oder chemische Verbindungen.
    • In einer Ausführungsform wird der serumfreie Zusatz in den Schritten (i), (ii), (iii) und (iv) des Verfahrens in einer Endkonzentration im Medium bereitgestellt von 50-500 µg/ml Transferrin (bevorzugt 70-300 µg/ml Transferrin, stärker bevorzugt 80-200 µg/ml Transferrin, noch stärker bevorzugt 90-150 µg/ml Transferrin, am stärksten bevorzugt etwa 100 µg/ml Transferrin),
    • 1-25 µg/ml Insulin (bevorzugt 2-13 µg/ml Insulin, stärker bevorzugt 3-10 µg/ml Insulin, noch stärker bevorzugt 4-6 µg/ml Insulin, am stärksten bevorzugt etwa 5 µg/ml Insulin), 0,001-0,1 µg/ml Progesteron (bevorzugt 0,002-0,05 µg/ml Progesteron, stärker bevorzugt 0,004-0,01 µg/ml Progesteron, noch stärker bevorzugt 0,005-0,008 µg/ml Progesteron, am stärksten bevorzugt etwa 0,0063 µg/ml Progesteron),
    • 5-50 µg/ml Putrescin (bevorzugt 10-35 µg/ml Putrescin, stärker bevorzugt 12-25 µg/ml Putrescin, noch stärker bevorzugt 14-18 µg/ml Putrescin, am stärksten bevorzugt etwa 16 µg/ml Putrescin) und
    • 6-600 nM Selen (bevorzugt 12-300 nM Selen, stärker bevorzugt 20-150 nM Selen, noch stärker bevorzugt 25-50 nM Selen, am stärksten bevorzugt etwa 30 nM Selen) oder ein bioverfügbares Salz davon. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt Selen als Selenit vor, wobei eine wirksame Konzentration davon 1-30 µg/l Selenit (bevorzugt 2-20 µg/l Selenit, stärker bevorzugt 3-10 µg/l Selenit, noch stärker bevorzugt 4-6 µg/l Selenit, am stärksten bevorzugt etwa 5 µg/l Selenit) im Medium beträgt.
    • Ein serumfreier Zusatz, der die vorstehenden Anforderungen erfüllt, kann im Handel erworben werden. So kann beispielsweise N2-Supplement verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der serumfreie Zusatz N2-Zusatz in einer Konzentration 0,1-10%
    • (v/v) N2-Zusatz, bevorzugt 0,3-7,5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,5-5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,75%-2% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,9%-1,2% (v/v) N2-Zusatz, und am stärksten bevorzugt etwa 1% (v/v) N2-Zusatz. Der N2-Zusatz ist im Handel in 100-facher wirksamer Konzentration erhältlich und die Zusammensetzung ist in Tabelle 1 aufgelistet. Das bedeutet, dass 1% (v/v) des N2-Zusatzes einer einfachen wirksamen Konzentration entspricht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (i) des Verfahrens für 24 bis 132 Stunden durchgeführt, bevorzugt für 48 bis 120 Stunden, stärker bevorzugt für 60 bis 114 Stunden, noch stärker bevorzugt für 72 bis 108 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 102 Stunden und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden. Die Dauer von Schritt (i) und die Konzentration der Substanzen (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz können durch Überwachung der Effizienz der Induktion der Mesodermdifferenzierung optimiert werden. Wie oben beschrieben, kann die Effizienz der Mesodermdifferenzierung durch RNA-Sequenzierung nachvollzogen werden. Die Induktion der Mesodermdifferenzierung ist gegeben, wenn beispielsweise einer oder mehrere der Genmarker MSGN1, TBX6 und MEOX1 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweisen (bevorzugt einem mindestens 10-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 20-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem mindestens 30-fach höheren Expressionswert, am stärksten bevorzugt einen mindestens 50-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung.
  • In Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die „myogene Spezifikation“ induziert. Dieses Differenzierungsstadium ist durch die Expression von spezifischen Faktoren charakterisiert. Beispielsweise wird bei der myogenen Spezifikation die mRNA Pax3 exprimiert, deren Expression mittels RNA-Sequenzierung bestimmt werden kann (siehe und für eine schematische Übersicht; siehe für experimentelle Daten zur Expression von PAX3). Eine myogene Spezifikation ist gegeben, wenn beispielsweise der Genmarker Pax3 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 10-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 20-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem 30-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung.
  • Wie vorstehend beschrieben schließt Schritt (ii) drei Kultivierungsschritte ein. Insbesondere umfasst Schritt (ii) das Kultivieren der aus Schritt (i) erhaltenen Zellen in Basalmedium in einer wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2 und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR).
  • Wie in Schritt (i) kann das Basalmedium in Schritt (ii) auswählt sein aus DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10 und Hams F-12. Zudem kann das Basalmedium durch nicht-essentielle Aminosäuren und/oder Pyruvat ergänzt werden. Beispielhafte und bevorzugte Ausführungsformen für das Basalmedium in Schritt (ii) können analog zu den beispielhaften und bevorzugten Ausführungsformen in Schritt (i) ausgewählt werden. Das Basalmedium in Schritt (ii) kann unabhängig voneinander aus dem in Schritt (i) verwendeten Basalmedium ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Basalmedium in den Schritten (i) und (ii) jedoch gleich.
  • Der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DAPT, RO4929097, Semagacestat (LY450139), Avagacestat (BMS-708163), Dibenzazepine (YO-01027), LY411575, IMR-1, L685458 , bevorzugt wobei der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist. Es kann jedoch jeder Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Wenn der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist, beträgt dessen wirksame Menge 1-20 µM, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM.
  • In Schritt (ii) beträgt die wirksame Menge von FGF2 beispielsweise 15-30 ng/ml, bevorzugt 17,5 -25 ng/ml, stärker bevorzugt 18-22 ng/ml, noch stärker bevorzugt 19-21 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 20 ng/ml.
  • Eine wirksame Menge von HGF ist beispielsweise 1-15 ng/ml, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml. Dem Fachmann ist bekannt, dass eine wirksame Konzentration oder Menge eines Rezeptor/Enzym-Agonisten oder -Inhibitors mit der Verfügbarkeit und biologischen Aktivität der jeweiligen Substanz variiert.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Knockout serum replacement“ (KSR) eine wirksame Konzentration von Ascorbinsäure, Insulin, Transferrin und Albumin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das KSR zusätzlich eine wirksame Konzentration von Selen oder ein biologisch verfügbares Salz davon, Glutathion, und Spurenelemente. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das KSR eine wirksame Konzentration der in Tabelle 5 aufgelisteten Substanzen. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst das KSR die Substanzen der Tabelle 5 in der angegebenen Konzentration. Das „Knockout serum replacement“ (KSR) ist im Stand der Technik bekannt und kann gemäß der Rezeptur auf Seiten 27-29 der Patentanmeldung WO 98/30679 hergestellt werden. Alternativ, ist KSR im Handel, z.B. von Gibco, erhältlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet. In einer stark bevorzugten Ausführungsform wird das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels verwendet. Jedes geeignete Reduktionsmittel kann verwendet werden und Beispiele für Reduktionsmittel sind beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol. Beta-Mercaptoethanol wird typischerweise in einer Konzentration von 0.02-0.5 mM, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0.05-0.02 mM, am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0.1 mM verwendet. Alternativ kann alpha-Thioglycerol beispielsweise in einer Konzentration von 0.02-0.5 mM, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0.05-0.02 mM, am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0.1 mM verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform wird die Kultivierung in Schritt (ii) in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) dem serumfreien Zusatz für 36 bis 60 Stunden durchgeführt, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt; und/oder
    die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, (c) dem serumfreien Zusatz und (d) HGF für 36 bis 60 Stunden durchgeführt, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) dem serumfreien Zusatz, und (d) Knockout serum replacement (KSR) für 72 bis 120 Stunden durchgeführt, bevorzugt für 76 bis 114 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 108 Stunden, noch stärker bevorzugt für 90 bis 102 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden.
  • In Schritt (iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen vorteilhafter Weise in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen maturiert und expandiert. Skelettmyoblasten zeichnen sich dadurch aus, dass sie fusionskompetent sind und daher in einem weiteren Schritt zu Skelettmyotuben fusionieren können. Satellitenzellen, auch Muskelstammzellen genannt, sind kleine multipotente Zellen. Satellitenzellen sind in der Lage (i) Satellitenzellen oder (ii) differenzierte Skelettmyoblasten hervorzubringen. Genauer gesagt, können nach der Aktivierung Satellitenzellen wieder in den Zellzyklus eintreten, um sich zu vermehren und sich in Myoblasten zu differenzieren. Dieses Differenzierungsstadium des Verfahrens ist durch die Expression von spezifischen Faktoren charakterisiert. Beispielsweise ist die Expression von Pax7 charakteristisch für die Gegenwart von Satellitenzellen. Gleichzeitig ist die Expression von MyoD charakteristisch für Skelettmyoblasten, dessen jeweilige Expression mittels RNA-Sequenzierung bestimmt werden kann (siehe und für eine schematische Übersicht; siehe für experimentelle Daten zur Expression von MyoD1 und PAX7). Skelettmyoblasten liegen vor, wenn beispielsweise der Genmarker MyoD einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 10-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 15-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem 20-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung. Satellitenzellen liegen vor, wenn beispielsweise der Genmarker PAX7 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 10-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 15-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem 20-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung.
  • Wie vorstehend beschrieben, umfasst das Basalmedium von Schritt (iii) eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR). Wie in Schritt (i) und (ii) kann das Basalmedium in Schritt (iii) auswählt sein aus DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10 und Hams F-12 und das Basalmedium kann durch nicht-essentielle Aminosäuren und/oder Pyruvat ergänzt werden. Beispielhafte und bevorzugte Ausführungsformen für das Basalmedium in Schritt (iii) können analog zu den beispielhaften und bevorzugten Ausführungsformen in Schritt (i) ausgewählt werden. Das Basalmedium in Schritt (iii) kann unabhängig von dem in Schritt (i) und (ii) verwendeten Basalmedium ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Basalmedium in den Schritten (i), (ii) und (iii) jedoch gleich.
  • Das KSR und das optionale Reduktionsmittel in Schritt (iii) umfassen die gleichen bevorzugten Ausführungsformen wie das KSR und das optionale Reduktionsmittel in Schritt (ii). Somit kann das KSR entweder vom Fachmann selbst hergestellt oder im Handel käuflich erworben werden.
  • In Schritt (iii) beträgt die wirksame Menge von HGF beispielsweise 1-15 ng/ml, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder
    das KSR wird in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass eine wirksame Menge oder wirksame Konzentration eines Rezeptor/Enzym-Agonisten oder -Inhibitors mit der Verfügbarkeit und biologischen Aktivität der jeweiligen Substanz variiert.
  • In Schritt (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen vorteilhafter Weise in Skelettmyotuben und Satellitenzellen maturiert. Skelettmyotuben entstehen durch die Fusion von Skelettmyoblasten. Daher sind Skelettmyotuben mehrkernige zelluläre Gebilde, die durch Verschmelzung von reifen Myoblasten zu langen dünnen Myotuben entstehen. Skelettmyotuben werden auch Myozyten oder Muskelfasern genannt. gibt einen schematischen Überblick über die durchlaufenen Entwicklungsstadien des künstlichen Skelettmuskelgewebes und die Bildung von künstlichem Skelettmuskelgewebe ist im Stand der Technik als Myogenese bekannt. Skelettmyotuben (Muskelfasern) sind durch eine anisotrope Ausrichtung der Aktinin enthaltenen Sarkomerstruktur charakterisiert. Neben den fusionierten Skelettmyotuben bildet sich eine regenerations-kompetente Satellitenzellnische aus. Die Satellitenzellnische ist außerhalb der Skelettmyotuben, aber in engem Kontakt mit den Skelettmyotuben. Die Satellitenzellnische ist anatomisch charakteristisch und bildet sich auch in natürlichen Skelettmuskelgeweben aus. Folglich stellt sie zusammen mit den erzeugten Satellitenzellen ein weiteres wünschenswertes Qualitätsmerkmal für das künstlich erzeugte Skelettmuskelgewebe dar. Auch dieses Differenzierungsstadium ist durch die Expression von spezifischen Faktoren charakterisiert. Beispielsweise ist die Expression von Pax7 charakteristisch für die Gegenwart von Satellitenzellen. Gleichzeitig ist die Expression von Myogenin und Aktinin charakteristisch für Skelettmyotuben, dessen jeweilige Expression mittels RNA-Sequenzierung bestimmt werden kann (siehe und für eine schematische Übersicht; siehe für experimentelle Daten zur Expression von PAX7 (Paired Box 7), ACTN2 (Aktinin Alpha 2), DMD (Dystrophin) und MYH3 (Myosin Heavy Chain 3). Satellitenzellen liegen vor, wenn beispielsweise die mRNA von PAX7 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 10-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 15-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem 20-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung. Skelettmyotuben liegen vor, wenn beispielsweise der Genmarker ACTN2 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 50-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 100-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem 150-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung. Die Genmarker DMD und MYH3 weisen sogar typischerweise einen mindestens 200-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle auf (bevorzugt einem mindestens 500-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 1000-fach höheren Expressionswert).
  • Wie vorstehend beschrieben sind die in Schritt (iii) erhaltenen Zellen in eine extrazelluläre Matrix dispergiert und werden unter mechanischer Simulation maturiert. Eine mechanische Simulation kann beispielsweise mithilfe einer Streckvorrichtung erfolgen, wie sie im Fachgebiet allgemein bekannt ist und verwendet wird. Vorzugsweise übt die Streckvorrichtung eine statische, phasische oder dynamische Dehnung aus. Somit kann die mechanische Dehnung (a) statisch, (b) phasisch oder (c) dynamisch sein. Ein Beispiel für eine statische Dehnung ist eine isometrische Muskelkontraktion, bei der der Muskel ausschließlich eine Spannungsänderung und keine Längenänderung durchführt. Somit findet bei einer isometrischen Muskelkontraktion keine Verkürzung im Muskel statt. Eine phasische Dehnung kann eine quasi-isotone Muskelkontraktion sein, bei der sich der Muskel bei der Kontraktion verkürzt und die Spannung, die auf den Muskel wirkt, gleich bleibt. Eine dynamische Dehnung kann beispielsweise erfolgen, wenn der Muskel auf flexiblen Halterungen aufgehängt wird und so die auxotone Kontraktion gefördert wird. Bei einer auxotonischen Kontraktion ändert sich sowohl die Muskellänge, als auch die Muskelspannung. Vorzugsweise ist die mechanische Stimulation in Schritt (iv) eine statische mechanische Stimulation, also ein statischer Zug (statische Dehnung). Das bedeutet, dass die Zellen aus Schritt (iii) und die extrazelluläre Matrix unter einer Kraft und einer entgegen gerichteten Kraft (Gegenkraft) stehen.
  • Wie vorstehend dargelegt umfasst das Basalmedium von Schritt (iv) eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einen zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3).
  • Beispielhafte und bevorzugte Ausführungsformen für das Basalmedium in Schritt (iv) können analog zu den beispielhaften und bevorzugten Ausführungsformen in Schritt (i) ausgewählt werden.
    • Der zusätzliche serumfreie Zusatz in Schritt (iv) des Verfahrens wird so formuliert, dass der zusätzliche serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von folgenden Substanzen bereitstellt: 0,5-50 mg/ml Albumin (bevorzugt 1-40 mg/mi, stärker bevorzugt 2-30 mg/ml, noch stärker bevorzugt 3-20 mg/ml, noch stärker bevorzugt 4-10 mg/ml und stärksten bevorzugt 4,5-7,5 mg/ml, wie etwa 5 mg/ml);
    • 1-100 µg/ml Transferrin (bevorzugt 2-90 µg/ml, stärker bevorzugt 3-80 µg/ml, noch stärker bevorzugt 4-70 µg/ml, noch stärker bevorzugt 5-60 µg/ml, stärker bevorzugt 6-50 µg/ml, stärker bevorzugt 7-40 µg/ml, stärker bevorzugt 8-30 µg/ml, stärker bevorzugt 9-20 µg/ml, wie etwa 10 µg/ml);
    • 0,1-10 µg/ml Ethanolamin (bevorzugt 0,2-9 µg/ml, stärker bevorzugt 0,3-8 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,4-7 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,5-6 µg/ml, stärker bevorzugt 0,6-5 µg/ml, stärker bevorzugt 0,7-4 µg/ml, stärker bevorzugt 0,8-3 µg/ml, am stärksten bevorzugt 1-2,5 µg/ml, wie etwa 2 µg/ml);
    • 17.4-1744 nM Selen oder ein bioverfügbaren Salz davon (bevorzugt 35-850 nM, stärker bevorzugt 70-420 nM, noch stärker bevorzugt 120-220 µg/ml, am stärksten bevorzugt etwa 174 nM);
    • 0,4-40 µg/ml L-Carnitin HCl (bevorzugt 0,5-30 µg/ml, stärker bevorzugt 1-20 µg/ml, noch stärker bevorzugt 2-10 µg/ml, stärker bevorzugt 3-5 µg/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 4 µg/ml);
    • 0,05-5 µl/ml Fettsäure-Zusatz (bevorzugt 0,1-4 µl/ml, stärker bevorzugt 0,2-3 µl/ml, noch stärker bevorzugt 0,3-3 µl/ml, stärker bevorzugt 0,4-2 µl/ml, und am stärksten bevorzugt 0,45-1 µl/ml, wie etwa 0,5 µl/ml); und
    • 0,0001-0,1 µg/ml Triodo-L-Thyronin (T3) (bevorzugt 0,001-0,01 µg/ml, stärker bevorzugt 0,002-0,0075 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,003-0,005 µg/ml, am stärksten bevorzugt etwa 0,004 µg/ml).
  • Der Fettsäurezusatz kann beispielsweise Linolsäure und/oder Linolensäure umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der zusätzliche serumfreie Zusatz außerdem 0,1-10 µg/ml Hydrokortison (vorzugsweise 0,2-9 µg/ml, stärker bevorzugt 0,3-8 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,4-7 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,5-6 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,6-5 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,7-4 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,8-3 µg/ml, am stärksten bevorzugt 0,9-2 µg/ml, wie etwa 1 µg/ml). In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform umfasst der zusätzliche serumfreie Zusatz außerdem 0,3-30 µg/ml Insulin (vorzugsweise 0,5-25 µg/ml, stärker bevorzugt 1-20 µg/ml, noch stärker bevorzugt 1,5-15 µg/ml, noch stärker bevorzugt 2-10 µg/ml, am stärksten bevorzugt 2,5-5 µg/ml, wie etwa 3 µg/ml). Ein bioverfügbares Salz von Selen ist beispielsweise Natriumselenit, sodass eine Endkonzentration von 0,003-0,3 µg/ml (vorzugsweise 0,005-0,2 µg/ml, bevorzugter 0,01-0,1 µg/ml, noch bevorzugter 0,02-0,05 µg/ml, und am bevorzugten 0,03 µg/ml, wie etwa 0,032 µg/ml) im Basalmedium bereitgestellt wird.
  • Darüber hinaus kann der zusätzliche serumfreie Zusatz weiterhin eine oder mehrere Komponenten umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydrokortison, Ascorbinsäure Vitamin A, D-Galaktose, Linolensäure, Progesteron und Putrescin besteht. Diese Komponenten sind für die Lebensfähigkeit der Zellen förderlich. Geeignete Konzentrationen der jeweiligen Komponenten sind dem Fachmann bekannt oder können durch Routinemaßnahmen leicht bestimmt werden.
  • Ein Beispiel eines in Schritt (iv) genannten zusätzlichen serumfreien Zusatzes kann gemäß publizierter Protokolle (siehe auch Brewer et al. 1993) hergestellt werden oder im Handel erworben werden. So kann beispielsweise B27 (Tabelle 4) verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der B27-Zusatz in einer Menge von 0,1-10 % B27, vorzugsweise 0,5-8 %, stärker bevorzugt 1-6 %, stärker bevorzugt 1,5-4 %, noch stärker bevorzugt 1,5-4 % und am meisten bevorzugt etwa 2 % B27 verwendet.
  • Der Erfindung kann vor Schritt (i) ein Saatschritt vorausgehen und das erzielte künstliche Skelettmuskelgewebe wird bioengineered skeletal muscle (BSM) genannt. Bei dem Saatschritt werden die pluripotenten Stammzellen in einem Stammzellmedium in der Gegenwart eines ROCK-Inhibitors ausgesät, bevorzugt wobei der Saatschritt 18-30 Stunden vor Schritt (i) ausgeführt wird. Der ROCK-Inhibitor ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist. Es kann jedoch jeder ROCK-Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Der Fachmann versteht, dass die Konzentration einer wirksamen Menge eines ROCK-Inhibitors mit der Verfügbarkeit und Inhibitionskonstante des betreffenden Inhibitors variiert. Im Falle von Y27632 kann beispielsweise das im Saatgutschritt verwendete Medium 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet werden. Bei dem Saatschritt kann ein Stammzellmedium verwendet werden, wobei prinzipiell jedes für das Verfahren geeignete Stammzellmedium verwendet werden kann. Dem Fachmann sind geeignete Stammzellmedien bekannt, wobei das Stammzellmedium iPS-Brew XF besonders bevorzugt ist.
  • Darüber hinaus können die pluripotenten Stammzellen in dem Saatschritt zunächst in der Gegenwart von einem oder mehreren Bestandteilen einer extrazellulären Matrix in einem Mastermix in eine künstliche Form ausgesät werden, bevor das Stammzellmedium hinzugefügt wird. Beim Saatschritt werden die pluripotenten Stammzellen vor Schritt (i) in eine extrazelluläre Matrix dispergiert, sodass die Zellen in der extrazellulären Matrix eingebettet sind und so in einer dreidimensionalen Struktur zu einem künstlichen Skelettmuskelgewebe differenzieren und maturieren können.
  • Die „extrazeliuiäre Matrix“ fungiert als Gerüst und bietet eine strukturelle und funktionelle Mikroumgebung für Zellwachstum und Differenzierung. Obwohl die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix für jedes natürliche Gewebe einzigartig ist, sind die Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix Kollagene, Fibronektin, Laminin und verschiedene Arten von Glykoaminoglykanen und Proteoglykanen. Proteoglykane bilden eine Klasse besonders stark glykosylierter Glykoproteine, die die Stabilisierung zwischen den Zellen eines Organismus bewerkstelligen. Hier bilden sie große Komplexe, sowohl zu anderen Proteoglykanen, als auch zu Hyaluronsäure, sowie zu Proteinen wie Kollagen - dem Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix. Laminin ist ein kollagenähnliches Glykoprotein. Fibronektin ist auch ein Glykoprotein, das für die extrazelluläre Kollagen-Polymerisierung wichtig ist und unter anderem in der Gewebsreparatur eine wichtige Rolle spielen kann. Der Bestandteil einer extrazellulären Matrix in dem Mastermix ist bevorzugt Kollagen, bevorzugt Typ I Kollagen, stärker bevorzugt aus Rinderursprung, humanen Ursprung oder marinem Ursprung, insbesondere Kollagen aus Rinderursprung. Gegebenenfalls umfasst die extrazelluläre Matrix zusätzlich Laminin und/oder Fibronektin.
  • Die pluripotenten Stammzellen werden typischerweise in einem Verhältnis von 1-6 × 106 Zellen/ml und 0,7-1,4 mg/ml Kollagen in Medium ausgesät. In einer Ausführungsform umfasst der Mastermix 5-15% (v/v), bevorzugt 7.5%-12.5% (v/v), stärker bevorzugt 9-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10 % (v/v) eines Exsudats von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkomzellen als extrazellulären Matrixbestandteil. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Exsudat Matrigel. Der pH-Wert des Mastermixes liegt typischerweise zwischen pH 7,2 und pH 7,8. Matrigel ist dem Fachmann bekannt und ist ferner im Stand der Technik beschrieben (Hughes et al. 2010).
  • Alternativ zu einem Exsudat von EHS Maus-Sarkomzellen kann der Mastermix Stromazellen umfassen, wobei die Stromazellen die extrazellulären Matrixbestandteile Kollagene, Laminin, Fibronektin und/oder Proteoglykane erzeugen. Der pH-Wert des Mastermixes liegt typischerweise zwischen pH 7,2 und pH 7,8.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Stammzellmedium nach etwa einer Stunde zu dem Mastermix in der künstlichen Form hinzugefügt und das Stammzellmedium umfasst vorzugsweise eine wirksame Konzentration an KSR und FGF2. Beispielsweise kann das Stammzellmedium 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR umfassen.
  • Eine wirksame Menge von FGF2 beträgt typischerweise 1-15 ng/ml, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml FGF2.
  • Beim Herstellen von BSM wird Schritt (iii) für 7-11 Tage, bevorzugt für 8-10 Tage, und am stärksten bevorzugt für etwa 9 Tage durchgeführt.
  • Alternativ können die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in einem zusätzlichen Schritt nach Schritt (iii) und vor Schritt (iv) ausgesät werden und das erzielte künstliche Skelettmuskelgewebe wird engineered skeletal muscle (ESM) genannt. Dabei werden die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in der Gegenwart von einem oder mehreren Bestandteilen einer extrazellulären Matrix in einem Mastermix in eine künstliche Form ausgesät. Vorzugweise ist der Bestandteil einer extrazellulären Matrix in dem Mastermix Kollagen, bevorzugt Typ I Kollagen, stärker bevorzugt aus Rinderursprung, humanem Ursprung oder marinem Ursprung, insbesondere Kollagen aus Rinderursprung, gegebenenfalls wobei die extrazelluläre Matrix zusätzlich Laminin und/oder Fibronektin umfasst. Bei einem Saatschritt nach Schritt (iii) und vor Schritt (iv) werden die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen zum Beispiel in einem Verhältnis von 1-10 × 106 Zellen/ml und 0,7-1,4 mg/ml Kollagen in Medium ausgesät.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Mastermix 5-15% (v/v), bevorzugt 7.5%-12.5% (v/v), stärker bevorzugt 9-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10 % (v/v) eines Exsudats von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkomzellen als extrazellulären Matrixbestandteil. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Exsudat Matrigel. Der pH-Wert des Mastermixes liegt typischerweise zwischen pH 7,2 und pH 7,8.
  • Alternativ zu einem Exsudat von EHS Maus-Sarkomzellen kann der Mastermix Stromazellen umfassen, wobei die Stromazellen die extrazellulären Matrixbestandteile Kollagene, Laminin, Fibronektin und/oder Proteoglykane erzeugen. Der pH-Wert des Mastermixes liegt typischerweise zwischen pH 7,2 und pH 7,8.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach etwa einer Stunde das wie in Schritt (iii) verwendete Basalmedium zum Mastermix in der künstlichen Form hinzugefügt, wobei das Medium zusätzlich eine wirksame Menge eines ROCK-Inhibitors umfasst. Der ROCK-Inhibitor ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447. Bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil. Stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist. Es kann jedoch jeder ROCK-Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Der Fachmann weiß, dass die Konzentration einer wirksamen Menge eines ROCK-Inhibitors mit der Verfügbarkeit und Inhibitionskonstante des betreffenden Inhibitors variiert. Im Falle von Y27632 kann beispielsweise das im Saatgutschritt verwendete Medium eine Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt von etwa 5 µM verwendet werden.
  • Beim Herstellen von ESM wird etwa ein Tag nach dem Saatschritt, der zwischen Schritt (iii) und Schritt (iv) erfolgt, das Medium gegen ein wie in Schritt (iii) verwendetes Medium ausgetauscht, und die Zellen anschließend in diesem Medium für weitere 5-9 Tage, bevorzugt 6-8 Tage, am stärksten bevorzugt etwa 7 Tage weiterkultiviert.
  • Bei der Herstellung eines BSM oder eines ESM, kann die künstliche Form beispielsweise die Form eines Ringes, eines Bandes, eines Stranges, eines Flickens, eines Beutels, oder eines Zylinders haben, wobei optional einzelne Skelettmuskelgewebe fusioniert werden können. Das bedeutet, dass einzelne und/oder unterschiedliche Geometrien zu einem Skelettmuskelgewebe fusioniert werden und somit unterschiedliche Muskelformen erzielt werden können. Speziell die Form eines Rings, eines Strangs oder eines Bandes ist für Anwendungen in In-Vitro Verfahren z.B. zum Testen der Toxizität nützlich. Normalerweise wird die künstliche Form durch das Gießen des Mastermixes erzielt, sodass generell jede gewünschte gießbare künstliche Form hergestellt werden kann.
  • Schritt (iv) kann für mindestens 19 Tage, bevorzugt mindestens 28 Tage, stärker bevorzugt für mindestens 56 Tage durchgeführt wird, noch stärker bevorzugt für mindestens 120 Tage durchgeführt wird und insbesondere für mindestens 240 Tage durchgeführt wird, wobei eine längere Kultivierung möglich ist. Eine Kultivierung von 240 Tagen (8 Monaten) konnten die Erfinder bereits durchführen, wobei nichts gegen eine längere Kultivierungsdauer spricht.
  • Im Unterschied zu vielen im Stand der Technik offenbarten Verfahren umfasst das erfindungsgemäße Verfahren keinen Transfektionsschritt mit einem differenzierungs- oder maturierungsbezogenes Transgen. Vorzugsweise umfasst das Verfahren kein myogenes Transgen und stärker bevorzugt umfasst das Verfahren nicht das Transgen Pax7 oder MyoD. Eine „Transgen“ bezeichnet ein eingeschleustes Gen in eine Zelle. Ein solches Transgen kann in Form von DNA (z.B. in Form eines Plasmids) oder RNA in die Zelle transfiziert werden. Das Transgen wird dann in der Zelle exprimiert und verändert dadurch die Eigenschaft der Zelle. Zum Beispiel können Transkriptionsfaktoren als Transgene in die Zelle eingeschleust werden, die dann die Expression anderer Gene beeinflussen. So kann ein myogenes Transgen den Anteil an Skelettmyoblasten in einer Zellpopulation erhöhen. Jedoch weisen Transfektionsexperimente mit einem Transgen, wie z.B. Pax7 oder MyoD, je nach Experiment und Zelltyp eine unterschiedliche Transfektionseffizienz auf. Dadurch sind Verfahren, die einen Transfektionsschritt benötigen weniger kontrollierbar und dadurch weniger reproduzierbar. Somit ist ein transgenfreies Verfahren vorteilhaft gegenüber einem Verfahren, das die Transfektion mit einem Transgen benötigt. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass die pluripotenten Stammzellen in einer anderen Form gentechnisch verändert sind, um beispielsweise ein Krankheitsbild zu simulieren. Außerdem ist das gentechnische Markieren von Zelltypen und/oder Zellfunktionen (z.B. Calcium oder Spannungssignale) oder die Steuerung der Zellfunktion über z.B. optogenetische Mechanismen (z.B. der Kontraktionsfrequenz) nicht ausgeschlossen.
  • Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass kein weiterer Selektionsschritt von bestimmten Zelltypen benötigt wird, wie z.B. Skelettmyoblasten. Vorzugsweise enthält das Verfahren keinen Anreicherungsschritt durch Zellselektion, stärker bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Antikörper-basierte Zellselektion. Dies ist vorteilhaft, da die Zellen nicht in einem zusätzlichen Schritt aus ihrer Umgebung extrahiert werden müssen. Eine mögliche Methode der Antikörper-basierten Zellselektion ist die Durchflusszytometrie, die dem Fachmann bekannt ist. Eine solche Zellselektion mittels Durchflusszytometrie ist mit einem erheblichen Zellverlust verbunden. Daher erlaubt eine Aufreinigung über Durchflusszytometrie keine Skalierung, ist mit Infektionsrisiken verbunden und stellt daher eine zentrale Barriere für die kommerzielle Anwendung von Zellprodukten dar. Da die erfindungsgemäßen Verfahren keine Zellselektion erfordern, ist die Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe und der erfindungsgemäßen Zellen skalierbar und für kommerzielle oder medizinische Anwendungen geeignet.
  • Darüber hinaus ist das Verfahren serumfrei, sodass keine Variabilität in Bezug auf eine andersgeartete Serumcharge besteht. Daraus ergibt sich ein robustes reproduzierbares Protokoll zur Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe, bei dem alle nötigen chemischen und physikalischen Reize definiert sind.
  • Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zum Herstellen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte
    • (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst;
    • (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR);
    • (iii) Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR), gefolgt von
    • (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst;
    dadurch Erzeugen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen.
  • Die in diesem Verfahren erzeugten Zellen weisen beispielsweise einen Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% auf, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
  • Vorzugweise wird durch das Verfahren ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, am stärksten bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie.
  • Die Methode der „Durchflusszytometrie“ ist dem Fachmann bekannt. Bei der Durchflusszytometrie werden physikalische und/oder chemische Eigenschaften einer Zellpopulation nachgewiesen. Für die hierin beschriebene Erfindung kann die Anwesenheit von skelettmuskel-spezifischen Proteinen, die für die Differenzierung in Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben oder Satellitenzellen charakteristisch sind, mittels Fluoreszentfärbung nachgewiesen werden. Insbesondere werden die Proteine sarkomerisches α-Aktinin, Myogenin, Pax7, und MyoD mit primären Antikörpern inkubiert und dadurch markiert. Mithilfe eines fluoreszenz-markierten sekundären Antikörpers können die skelettmuskel-spezifischen Zellen nachgewiesen werden.
  • Ein großer Vorteil des Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik ist, dass kein Schritt zur Anreicherung von Zellen, wie z.B. Skelettmyoblasten, nötig ist. Vorzugsweise enthält das Verfahren keinen Anreicherungsschritt durch Zellselektion, stärker bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Antikörper-basierte Zellselektion, wie z.B. Durchflusszytometrie. Das bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren keine Zellselektion benötigt, um Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und/oder Satellitenzellen in hoher Reinheit zu erzielen. Methoden zur Zellselektion sind hier lediglich zu analytischen Zwecken offenbart, um die hohe Reinheit der hergestellten Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen zu belegen. (siehe ).
  • Wie vorstehend beschrieben, umfasst das Basalmedium von Schritt (i) eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst.
  • Der GSK3-Inhibitor im Basalmedium ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, Tideglusib, SB415286, 6-bromoindirubin-3-oxime und einem Valproatsalz, wobei der GSK3-Inhibitor CHIR99021 bevorzugt ist. Es kann jedoch jeder GSK3-Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Wenn der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist, beträgt eine wirksame Menge 4-18 µM, bevorzugt 5-16 µM, stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 8-13 µM, noch stärker bevorzugt 9-12 µM, noch stärker bevorzugt 9,5-11 µM und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM.
  • Bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen der Schritte (i)-(iii) sind im Verfahren zum Herstellen von künstlichem Skelettmuskelgewebe beschrieben und können analog auf das Verfahren zum Herstellen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen angewendet werden.
  • Die jeweiligen Differenzierungsstadien können durch einfache experimentelle Nachweise, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Beispielsweise haben die Erfinder die Zellen mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Dabei werden Skelettmuskel-spezifischen Transkriptionsfaktoren (Pax7, MyoD und Myogenin) immunologisch eingefärbt. Nach Schritt (iii) des Verfahrens zeigen die Fluoreszenzbilder einen hohen Anteil von Zellen mit einer Expression von Pax7, MyoD und Myogenin ( ). Diese Methode zeigt, dass durch das Verfahren Satellitenzellen (Pax7) sowie Skelettmyoblasten (MyoD und Myogenin) erzeugt werden.
  • In Schritt (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen in Skelettmyotuben und Satellitenzellen maturiert. Skelettmyotuben entstehen durch die Fusion von Skelettmyoblasten. Daher sind Skelettmyotuben mehrkernige zelluläre Gebilde, die durch Verschmelzung von reifen Myoblasten zu langen Myotuben entstehen. Wie in Schritt (iv) des Verfahrens zum Herstellen von Skelettmuskelgewebe beschrieben, ist auch dieses Differenzierungsstadium durch die Expression von spezifischen Faktoren charakterisiert. Beispielsweise ist die Expression von Pax7 charakteristisch für die Gegenwart von Satellitenzellen. Gleichzeitig ist die Expression von Myogenin und Aktinin charakteristisch für Skelettmyotuben, dessen jeweilige Expression mittels RNA-Sequenzierung bestimmt werden kann (siehe und für eine schematische Übersicht; siehe für experimentelle Daten zur Expression von PAX7, ACTN2, DMD und MYH3). Satellitenzellen sind gegeben, wenn beispielsweise der Genmarker PAX7 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 10-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 20-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung. Skelettmyotuben sind gegeben, wenn beispielsweise der Genmarker ACTN2 einen mindestens 5-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle aufweist (bevorzugt einem mindestens 50-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 100-fach höheren Expressionswert, noch stärker bevorzugt einem 150-fach höheren Expressionswert), gemessen durch „Reads per kilobase million“ mittels RNA-Sequenzierung. Die Genmarker DMD und MYH3 weisen sogar einen mindestens 200-fach höheren Expressionswert im Vergleich zur pluripotenten Stammzelle auf (bevorzugt einem mindestens 500-fach höheren Expressionswert, stärker bevorzugt einem 1000-fach höheren Expressionswert).
  • Wie vorstehend dargelegt umfasst das Basalmedium von Schritt (iv) eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3).
    • Der zusätzliche serumfreie Zusatz in Schritt (iv) des Verfahrens wird so formuliert, dass der zusätzliche serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von folgenden Substanzen bereitstellt: 0,5-50 mg/ml Albumin (bevorzugt 1-40 mg/ml, stärker bevorzugt 2-30 mg/ml, noch stärker bevorzugt 3-20 mg/ml, noch stärker bevorzugt 4-10 mg/ml und stärksten bevorzugt 4,5-7,5 mg/ml, wie etwa 5 mg/ml);
    • 1-100 µg/ml Transferrin (bevorzugt 2-90 µg/ml, stärker bevorzugt 3-80 µg/ml, noch stärker bevorzugt 4-70 µg/ml, noch stärker bevorzugt 5-60 µg/ml, stärker bevorzugt 6-50 µg/ml, stärker bevorzugt 7-40 µg/ml, stärker bevorzugt 8-30 µg/ml, stärker bevorzugt 9-20 µg/ml, wie etwa 10 µg/ml);
    • 0,1-10 µg/ml Ethanolamin (bevorzugt 0,2-9 µg/ml, stärker bevorzugt 0,3-8 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,4-7 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,5-6 µg/ml, stärker bevorzugt 0,6-5 µg/ml, stärker bevorzugt 0,7-4 µg/ml, stärker bevorzugt 0,8-3 µg/ml, am stärksten bevorzugt 1-2,5 µg/ml, wie etwa 2 µg/ml);
    • 17.4-1744 nM Selen oder ein bioverfügbaren Salz davon (bevorzugt 35-850 nM, stärker bevorzugt 70-420 nM, noch stärker bevorzugt 120-220 µg/ml, am stärksten bevorzugt etwa 174 nM);
    • 0,4-40 µg/ml L-Carnitin HCl (bevorzugt 0,5-30 µg/ml, stärker bevorzugt 1-20 µg/ml, noch stärker bevorzugt 2-10 µg/ml, stärker bevorzugt 3-5 µg/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 4 µg/ml);
    • 0,05-5 µl/ml Fettsäure-Zusatz(bevorzugt 0,1-4 µl/ml, stärker bevorzugt 0,2-3 µl/ml, noch stärker bevorzugt 0,3-3 µl/ml, stärker bevorzugt 0,4-2 µl/ml, und am stärksten bevorzugt 0,45-1 µl/ml, wie etwa 0,5 µl/ml); und
    • 0,0001-0,1 µg/ml Triodo-L-Thyronin (T3) (bevorzugt 0,001-0,01 µg/ml, stärker bevorzugt 0,002-0,0075 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,003-0,005 µg/ml, am stärksten bevorzugt etwa 0,004 µg/ml).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der zusätzliche serumfreie Zusatz außerdem 0,1-10 µg/ml Hydrokortison (vorzugsweise 0,2-9 µg/ml, stärker bevorzugt 0,3-8 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,4-7 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,5-6 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,6-5 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,7-4 µg/ml, noch stärker bevorzugt 0,8-3 µg/ml, am stärksten bevorzugt 0,9-2 µg/ml, wie etwa 1 µg/ml). In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform umfasst der zusätzliche serumfreie Zusatz außerdem 0,3-30 µg/ml Insulin (vorzugsweise 0,5-25 µg/ml, stärker bevorzugt 1-20 µg/ml, noch stärker bevorzugt 1,5-15 µg/ml, noch stärker bevorzugt 2-10 µg/ml, am stärksten bevorzugt 2,5-5 µg/ml, wie etwa 3 µg/ml). Ein bioverfügbares Salz von Selen ist beispielsweise Natriumselenit, sodass eine Endkonzentration von 0,003-0,3 µg/ml (vorzugsweise 0,005-0,2 µg/ml, bevorzugter 0,01-0,1 µg/ml, noch bevorzugter 0,02-0,05 µg/ml, und am bevorzugten 0,03 µg/ml, wie etwa 0,032 µg/ml) im Basalmedium bereitgestellt wird.
  • Darüber hinaus kann der zusätzliche serumfreie Zusatz weiterhin eine oder mehrere Komponenten umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Vitamin A, Hydrokortison, D-Galaktose, Linolensäure, Progesteron und Putrescin besteht. Diese Komponenten sind für die Lebensfähigkeit der Zellen förderlich. Geeignete Konzentrationen der jeweiligen Komponenten sind dem Fachmann bekannt oder können durch Routinemaßnahmen leicht bestimmt werden.
  • Der in Schritt (iv) genannte zusätzliche serumfreie Zusatz ist ebenfalls im Handel erhältlich. So kann beispielsweise B27 verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der B27-Zusatz in einer Menge von 0,1-10 % B27, vorzugsweise 0,5-8 %, vorzugsweise 1-6 %, stärker bevorzugt 1,5-4 %, noch stärker bevorzugt 1,5-4 % und am meisten bevorzugt etwa 2 % B27 verwendet.
  • Darüber hinaus kann Schritt (iv) dieses Verfahrens für mindestens 30 Tage, bevorzugt mindestens 35 Tage, stärker bevorzugt für mindestens 40 Tage, und noch stärker bevorzugt für mindestens zu 50 Tage durchgeführt.
  • Schritt (i) dieses Verfahrens kann ein Saatschritt vorausgehen, bei dem die pluripotenten Stammzellen in einem Stammzellmedium in der Gegenwart eines ROCK-Inhibitors ausgesät werden, bevorzugt wobei der Saatschritt 18-30 Stunden vor Schritt (i) ausgeführt wird, bevorzugt 20-28 Stunden, stärker bevorzugt 22-26 Stunden, noch stärker bevorzugt 23-25 Stunden und am stärksten bevorzugt etwa 24 Stunden. Der ROCK-Inhibitor ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist. Es kann jedoch jeder ROCK-Inhibitor verwendet werden, der für das Verfahren der Erfindung geeignet ist. Der Fachmann versteht, dass die Konzentration einer wirksamen Menge eines ROCK-Inhibitors mit der Verfügbarkeit und Inhibitionskonstante des betreffenden Inhibitors variiert. Im Falle von Y27632 kann beispielsweise das im Saatgutschritt verwendete Medium eine Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt von etwa 5 µM verwendet werden. Bei dem Saatschritt kann ein Stammzellmedium verwendet werden, wobei prinzipiell jedes für das Verfahren geeignete Stammzellmedium verwendet werden kann. Dem Fachmann sind geeignete Stammzellmedien bekannt, wobei das Stammzellmedium iPS-Brew XF besonders bevorzugt ist. Das Stammzellmedium umfasst vorzugsweise eine wirksame Konzentration an KSR und FGF2. Insbesondere umfasst das Stammzellmedium beispielsweise 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR; und/oder 1-15 ng/ml FGF2, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml FGF2.
  • Wie auch im Verfahren zum Herstellen von Skelettmuskelgewebe können die Differenzierungsstadien der Schritte (i)-(iv) des Verfahrens zum Herstellen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen mithilfe exprimierter Gene nachgewiesen werden, die für ein bestimmtes Stadium charakteristisch sind. Die Methode der RNA-Sequenzierung wird in diesem Verfahren analog zum Verfahren zum Herstellen von Skelettmuskelgewebe angewendet. Entsprechend können die gleichen exprimierten Gene (also MSGN1, TBX6, MEOX1, PAX3, PAX7, MYOD1, ACTN2, DMD, MYH3) in Abhängigkeit des Differenzierungsstadiums nachgewiesen werden.
  • Die im Stand der Technik offenbarten traditionellen Verfahren zur Gewinnung von Skelettmuskelzellen erfordern oft umfangreiche Verdauprotokolle und/oder Zellselektionsschritte mittels Durchflusszytometrie. Durch Verdauprotokolle werden die Zellen in eine andere Umgebung transferiert und verlieren dadurch ihre Zell-Zell-Konnektivität sowie die Zell-Matrix Konnektivität. Dadurch wird die während der Entwicklung gebildete extrazelluläre Umgebung und räumliche Verteilung der Zelltypen zerstört und dies kann eine schwer zu kontrollierende hemmende Wirkung auf den Skelettmuskeldifferenzierungsprozess haben. Die vorliegende Erfindung minimiert die Anzahl der Verdauschritte und benötigt keine Zellselektion, um z.B. Skelettmyoblasten anzureichern, da das ausgefeilte Protokoll eine hohe Reinheit an Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen erzeugt (Exemplarisch sind in den Beispielen Zellpopulation gezeigt, die mindestens 70% Aktinin positiv und mindestens 30% PAX7 positiv sind, siehe auch ).
  • Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann ein künstlich hergestelltes Skelettmuskelgewebe mit vorteilhaften Eigenschaften erhalten werden. Im künstlich hergestellten Skelettmuskelgewebe kann die Gegenwart von Skelettmyotuben durch Färbung von Aktinin nachgewiesen werden (siehe ). Insbesondere umfasst das Skelettmuskelgewebe kein differenzierungs- oder maturierungsbezogenes Transgen, bevorzugt wobei das Skelettmuskelgewebe kein myogenes Transgen umfasst, stärker bevorzugt wobei das Skelettmuskelgewebe nicht das Transgen Pax7 oder MyoD umfasst. Im Vergleich zu natürlichem Skelettmuskelgewebe weist das künstliche Skelettmuskelgewebe, z.B. das BSM oder ESM, keine Durchblutung oder Steuerung über das zentrale Nervensystem auf. Das zentrale Nervensystem ist dem Fachmann bekannt besteht bei Wirbeltieren aus Gehirn und Rückenmark. Beispielsweise weist das künstliche Skelettmuskelgewebe auch keine Innervation durch Nervenzellen auf. Mit Durchblutung ist eine Vaskularisierung des Muskels gemeint, die den Muskel mit Blut versorgt. Ein weiterer Unterschied zum natürlichen Skelettmuskelgewebe ist, dass das künstliche Skelettmuskelgewebe keine muskuloskeletale Aufhängung über Sehnenanteile oder Knochen besitzt und sich vollständig ex vivo zu einem künstlichen Skelettmuskel entwickelt. Somit ist das künstliche Skelettmuskelgewebe klar vom natürlichen Skelettmuskelgewebe unterscheidbar.Trotz seiner artifiziellen Herstellung weist das erfindungsgemäße Skelettmuskelgewebe viele Eigenschaften eines nativen Skelettmuskels auf. Darunter fallen morphologische Merkmale eines Syncytiums aus fusionierten Myozyten (Muskelfasern, mehrkernige Skelettmyotuben) und kontraktile Leistung (positives Kraft-Frequenz-Verhältnis und tetanische Kontraktionen). Anders als in Geweben im Stand der Technik bilden sich Satellitenzellnischen in direktem Kontakt zu den Skelettmuskelfasern aus. Zudem weist das erfindungsgemäß hergestellte Skelettmuskelgewebe die typischen Fasern der quergestreiften Skelettmuskulatur auf, wobei das Skelettmuskelgewebe aus vielen Muskelfasern (Synzytien) besteht. Dem Fachmann ist bekannt, dass natürliches Skelettmuskelgewebe multinukleäre Skelettmuskelfasern aufweist, wobei jede Skelettmuskelfaser aus aneinandergereihten Sarkomeren besteht. Daher sind multinukleäre Skelettmuskelfasern bei Aktinfärbung oder Aktininfärbung durch ihr charakteristisches quergestreiftes Skelettmuskulaturmuster zu erkennen, da das Aktin/Aktinin innerhalb der Sarkomere eingefärbt wird. Die Sarkomere haben einen strengen, regelmäßigen Aufbau, sie sind hintereinander gereiht und bilden zusammen eine multinukleäre Muskelfaser. Das bedeutet, dass ein charakteristisches quergestreiftes Skelettmuskulaturmuster belegt, dass sich multinukleäre Skelettmuskelfasern ausgebildet haben. Die charakteristische Skelettmuskelgewebestruktur (Skelettmuskelfasern mit Satellitenzellnischen) lassen sich per Fluoreszenzmikroskopie nach Färbung für Aktinin oder Aktin und Pax7 darstellen. In der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder das Strukturprotein Aktin im künstlichen Skelettmuskelgewebe eingefärbt und die Fluoreszenzbilder in zeigen beispielhaft das charakteristische Streifenmuster.
  • Ein entscheidendes funktionelles Merkmal für künstliche Skelettmuskelgewebe ist, dass das Gewebe in Antwort auf elektrische Stimulation kontrahiert, sodass es krafterzeugend ist. Dieser krafterzeugende Charakter kann beispielsweise durch Messung der kontraktilen Leistung festgestellt werden. Diese Kontraktionsexperimente messen die Kontraktionsfrequenz und die Kontraktionskraft des künstlichen Skelettmuskelgewebes in Antwort auf elektrische Stimulation. Das Skelettmuskelgewebe in Form eines Ringes wurde in Organbädern (Föhr Medical Instruments) mit Tyrode-Lösung (z.B. in mmol/L: 120 NaCI, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 5,4 KCl, 22,6 NaHCO3, 4,2 NaH2PO4, 5,6 Glucose und 0,56 Ascorbat) bei 37°C und ständiger Begasung mit 5% CO2 und 95% O2 getestet. Das künstliche Skelettmuskelgewebe wird mechanisch gedehnt und die maximale Kraftamplitude (Kontraktionskraft; engl.: force of contraction=FOC) wird typischerweise bei elektrischen Feld-Stimulationsfrequenzen im Bereich von 1-100 Hz (4 ms Rechteckimpulse; 200 mA) gemessen. Beispielhafte Messmethoden für das erfindungsgemäße Gewebe sind in den , , und dargestellt. Diese Kontraktionsexperimente zeigen, dass das künstliche Skelettmuskelgewebe besonders vorteilhafte Eigenschaften aufweist, wenn es in Antwort auf elektrische Stimulation Kraft erzeugt. Die künstlichen Skelettmuskelgewebe zeigen eine reproduzierbare Kontraktionsfrequenz und Kontraktionskraft in Antwort auf Stimulationsfrequenzen zwischen 1 Hz und 100 Hz. Typischerweise dauert bei einer Einzelstimulation von 1 Hz eine Kontraktion und vollständige Relaxation ungefähr 0.5 Sekunden. Da die Kontraktions- und Relaxationszeit ungefähr 0.5 Sekunden dauert, bildet sich bei höheren Stimulationsfrequenzen ein beginnender oder vollständiger Tetanus aus. Auch in natürlichen Skelettmuskelgebeweben wird bei einer erhöhten Stimulationsfrequenz ein Tetanus ausgebildet, sodass sich das künstliche Skelettmuskelgewebe selbst in dieser Hinsicht analog zu natürlichem Skelettmuskelgewebe verhält. Des Weiteren können die Erfinder zeigen, dass die Kontraktionskraft des Muskelgewebes mit zunehmender Kontraktionsfrequenz steigt (positives Kraft-Frequenz-Verhältnis). Diese Eigenschaften sind im Einklang mit nativem Skelettmuskelgewebe, das auch Einzelkontraktionen und tetanische Kontraktionen sowie eine positive Kraft-Frequenz-Verhältnis als Reaktion auf elektrische Stimulation zeigt. Im Unterschied zu dem künstlichen Skelettmuskelgewebe entstehen bei natürlichen Muskelgeweben die elektrischen Impulse durch die Aktionspotenziale der Nervenzellen, wobei das künstliche Skelettmuskelgewebe spontan und in Antwort auf elektrische Stimulation kontrahieren kann.
  • Wie in den , , , und beispielhaft gezeigt, weist das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte künstliche Skelettmuskelgewebe eine charakteristische Ausbildung von multinukleären Muskelfasern (Skelettmyotuben) auf und erzeugt in Antwort auf elektrische Stimulation Kraft. Typischerweise kann das künstliche Skelettmuskelgewebe bei einem Stimulus von 100 Hz bei 200 mA mindestens eine Kontraktionskraft von 0,3 Millinewton (mN) erzeugen, bevorzugt mindestens 0,4 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,5 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,6 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,7 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,8 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,9 mN, stärker bevorzugt mindestens 1 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,2 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,3 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,4 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,5 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,6 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,7 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,8 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,9 mN, und am stärksten bevorzugt mindestens 2 mN erzeugen.
  • Das künstliche Skelettmuskelgewebe kann prinzipiell jede gewünschte Form aufweisen. Beispielsweise kann es die künstliche Form eines Ringes, eines Bandes, eines Stranges, eines Flickens, eines Beutels, oder eines Zylinders haben, wobei optional einzelne Skelettmuskelgewebe fusioniert werden können. In den Beispielen hierin wies das Skelettmuskelgewebe beispielsweise die Form eines Ringes auf. Jedoch können auch einzelne und/oder unterschiedliche Geometrien zu einem Skelettmuskelgewebe beliebig fusioniert werden, wodurch viele weitere unterschiedliche Muskelformen erzielt werden können. Speziell die Form eines Rings, eines Strangs, eines Flickens oder eines Bandes ist für Anwendungen in In-Vitro Verfahren z.B. zum Testen der Toxizität oder für eine therapeutische Applikation zur Muskelreparatur in vivo nützlich. Normalerweise wird die künstliche Form bereits durch das Gießen des Mastermixes erzielt, sodass generell jede gießbare künstliche Form hergestellt werden kann.
  • Des Weiteren umfasst die Erfindung mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen erhalten nach Schritt (i) der Erfindung, die durch die Expression von den Genen MSGN1 und/oder TBX6 gekennzeichnet sind, wobei die Expression von MSGN1 und/oder TBX6 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann. Diese Zellen sind auch dadurch gekennzeichnet, dass sie die mRNA von SP5 exprimieren, wobei die Expression von SP5 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
  • Außerdem betrifft die Erfindung myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen erhalten nach Schritt (ii) der Erfindung, hergestellt durch die Schritte (i) und (ii) der Erfindung, die durch die Expression des Gens PAX3 gekennzeichnet sind, wobei die Expression von PAX3 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann. Diese Zellen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die mRNA von SIM1 exprimieren, wobei die Expression von SIM1 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
  • Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Skelettmyoblastenzellen erhalten nach Schritt (iii) der Erfindung, hergestellt durch die Schritte (i) bis (iii) der Erfindung, die durch die Expression von Aktinin gekennzeichnet sind, wobei die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen in Skelettmyoblasten bestimmt werden kann.
  • Ferner werden durch die vorliegende Offenbarung Satellitenzellen bereitgestellt, die nach Schritt (iii) der hierin offenbarten Verfahren erhalten und durch die Schritte (i) bis (iii) der hierin offenbarten Verfahren hergestellt werden können, die durch die Expression des Gens Pax7 gekennzeichnet sind. Dabei kann die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden. Satellitenzellen sind durch einen aktiven oder aktivierbaren Zellzyklus gekennzeichnet und exprimieren dann Pax7 und Ki67. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform exprimieren die Satellitenzellen daher darüber hinaus Ki67. Die Zellzyklusaktivierung in künstlichem Skelettmuskelgewebe wird vermehrt nach Gewebeschädigung (z.B. durch Druckverletzung, Cardiotoxin-Behandlung, Bestrahlung oder Erfrierung) beobachtet und führt zu einer Reparatur der Gewebeschädigung im Sinne einer endogenen Regeneration.
  • Außerdem wird ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen offenbart, wobei ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, noch stärker bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie; und/oder wobei ein Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% erzielt wird, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
  • Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Skelettmyotuben erhalten nach Schritt (iv) der Erfindung, hergestellt durch die Schritte (i) bis (iv) der Erfindung, die durch eine anisotrope Ausrichtung der Aktinin Protein enthaltenen Sarkomerstruktur charakterisiert sind.
  • Vorteilhafterweise können das künstliche Skelettmuskelgewebe, die mesodermal differenzierten Skelettmyoblastenvorläuferzellen, die myogen spezifizierten Skelettmyoblastenvorläuferzellen, die Skelettmyoblastenzellen, die Satellitenzellen und/oder die Skelettmyotuben in einem in vitro Arzneimitteltest verwendet werden. Der Arzneimitteltest ist vorzugweise ein Toxizitätstest oder ein Test auf die Funktion des Skelettmuskelgewebes unter dem Einfluss von pharmakologischen und gentherapeutischen Wirkstoffkandidaten. Pharmakologische Wirkstoffkandidaten sind typischerweise Arzneimittelkandidaten, die niedermolekulare Substanzen sowie proteinbasierte Moleküle umfassen. Gentherapeutische Wirkstoffkandidaten verändern üblicherweise das Genom des Skelettmuskelgewebes durch Einschleusen von entsprechenden Nukleinsäuren.
  • Des Weiteren können das künstliche Skelettmuskelgewebe, die mesodermal differenzierten Skelettmyoblastenvorläuferzellen, die myogen spezifizierten Skelettmyoblastenvorläuferzellen, die Skelettmyoblastenzellen, die Satellitenzellen und/oder die Skelettmyotuben in der Medizin verwendet werden.
  • Von besonderer Bedeutung sind hier die Satellitenzellen. Sie werden zur Verwendung in der Therapie von geschädigtem Skelettmuskel und/oder in der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen in Betracht gezogen, bevorzugt bei genetischen Skelettmuskeldefekten, insbesondere von Muskeldystrophie Duchenne und/oder Muskeldystrophie Becker-Kiener, und/oder von lysosomalen Speicherkrankheiten, insbesondere von Morbus Pompe, bevorzugt wobei die Skelettmuskelerkrankung Muskeldystrophie Duchenne ist. Dem Fachmann ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass Satellitenzellen bereits in klinischen Studien in der Therapie von muskulären Dystrophien angewendet wurden (Tedesco FS et al. 2010). Darüber hinaus kommen Satellitenzellen zur Verwendung in der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen, wie zum Beispiel amyotrophen Lateralsklerose, Mysthenia gravis oder Myotonien in Betracht. Myotonien fassen verschiedene Muskelerkrankungen zusammen, die eine verzögerte Entspannung und dadurch krankhaft verlängerte, tonische Muskelanspannung aufweisen. Satellitenzellen sind besonders für die Therapie von geschädigtem Skelettmuskel und/oder für die Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen geeignet, da sie das Skelettmuskelgewebe kontinuierlich regenerieren. Mit dem Begriff „geschädigtes Skelettmuskelgewebe“ sind Verletzungen und Verwundungen eines Gewebes gemeint, die durch Gewalteinwirkung von außen entsteht. Humane Satellitenzellen, die nach Schritt (iii) oder (iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen werden, weisen den charakteristischen Marker Pax7 auf. Daher sind die erfindungsgemäßen Satellitenzellen vielversprechende Kandidaten für die zellbasierte Therapie bei geschädigtem Skelettmuskelgewebe, da Satellitenzellen zu einer gesteigerten Regeneration von Skelettmuskelgewebe führen (Yin et al. (2013)). Ebenso sind erfindungsgemäße künstliche Skelettmuskelgewebe vielversprechende Kandidaten für die zellbasierte Therapie bei geschädigtem Skelettmuskelgewebe; besonders für die Behandlung großer Muskeldefekte. Speziell bei einem Trauma oder einer massiven Muskelzerstörung ist eine direkte Implantation von Ersatzgewebe, wie beispielsweise einem künstlichen Skelettmuskelgewebe, ein vielversprechender Ansatz. Skelettmuskelimplantate können über elektrische Stimulation oder optogenetische Aktivierung funktionell integriert und steuerbar sein und so die Muskelfunktion wieder herstellen oder therapeutisch unterstützen. Durch den Satellitenzellanteil in künstlichem Skelettmuskelgewebe wird die endogene Regenerationsfähigkeit des Skelettmuskels langfristig sichergestellt.
  • Das künstliche Skelettmuskelgewebe, sowie die mesodermal differenzierten Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierten Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben, oder ein Gemisch aus Skelettmyoblasten und Satellitenzellen, sind zudem geeignete Modellsysteme für die Untersuchung von zellulären Mechanismen, die für die Differenzierung und Maturierung wichtig sind. Sie stellen somit wichtige wissenschaftliche Werkzeuge für die Grundlagenforschung dar. Somit können beispielsweise chemische Substanzen und gegebenenfalls physikalische Reize, wie Dehnung oder Schädigung außerhalb des menschlichen Körpers an menschlichen Zellen oder an künstlichem Skelettmuskelgewebe getestet werden. Die erfindungsgemäßen Zellen, Skelettmyotuben und das künstliche Skelettmuskelgewebe ermöglicht pharmakologische Sicherheits- und Wirksamkeitsexperimente, wobei die Wirkung auf Zellen und Gewebe getestet werden kann. Dies ist ein klarer Vorteil gegenüber Tierexperimenten (z.B. Maus- oder Rattengewebe/- zellen), da die pharmakologische Wirkung auf z.B. menschlichem Gewebe und in einer besonderen Ausführungsform auf Patienten-spezifische Gewebe getestet werden kann. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit zu natürlichem Skelettgewebe lässt sich das gemäß dem vorstehend offenbarten Verfahren hergestellte Skelettgewebe vorteilhafter Weise in diversen in vitro-Verfahren einsetzen.
  • Eine solche Anwendungsmöglichkeit ist ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
    1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß der hierin beschriebenen Erfindung,
    2. (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu dem Skelettmuskelgewebe, und
    3. (c) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten; bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funkti-on und/oder molekularer und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (c) umfasst.
  • Die Kontraktionskraft und/oder die Struktur des Skelettmuskelgewebes kann durch die hierin beschriebenen Kontraktionsexperimente und durch die hierin beschriebenen Fluoreszenzmikroskopie-Experimente gemessen werden. Die metabolische Funktion kann beispielsweise durch mit Hilfe eines Seahorse Metabolic Flux Analyzers gemessen werden, der dem Fachmann bekannt ist. Ein Seahorse Metabolic Flux Analyzers misst beispielsweise den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Säurebildungsrate lebender Zellen und kann darüber hinaus wichtige Zellfunktionen wie die mitochondriale Atmung und Glykolyse messen. Molekulare Parameter (Marker) können beispielsweise über Transkriptomanalysen (PCR oder RNA-Sequenzierung) gemessen werden. Proteinbiochemische Parameter (Marker) können beispielsweise über Massenspektrometrie oder gängige klinisch chemische Messmethoden (z.B. ELISA oder andere Antikörper und/oder chromatographische und/oder elektrophoretische und/oder Affinitäts-basierte Methoden) gemessen werden. Diese molekularen und proteinbiochemischen Parameter werden auch Marker oder Biomarker genannt und gängige Biomarker in Bezug auf Skelettmuskeln sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind Kreatinkinase (auch als Creatin-Kinase CK, CPK, oder Creatin-Phosphokinase bekannt) und L-Lactatdehydrogenase (LDH) solche Biomarker.
  • Wirkstoffkandidaten umfassen pharmakologische Wirkstoffkandidaten wie Arzneimittelkandidaten, die niedermolekulare Substanzen sowie proteinbasierte oder nukleinsäurebasierte Moleküle umfassen. Des Weiteren umfassen Wirkstoffkandidaten auch gentherapeutische Wirkstoffkandidaten, die üblicherweise das Genom der erfindungsgemäßen Zellen durch Einschleusen von entsprechenden Nukleinsäuren verändern. Darüber hinaus können Wirkstoffkandidaten auch körpereigene Substanzen sein, sodass die Wirkung von z.B. Hormonen oder hormonartige Signalstoffe getestet werden kann. Beispiele für hormonartige Signalstoffe sind Myokine, wie beispielsweise Myostatin, Follistatin, Irisin, Visfatin und Myonectin
  • Ein weiteres in vitro-Verfahren wird zum Testen der Toxizität einer Substanz auf ein Skelettmuskelgewebe in Betracht gezogen, umfassend die Schritte
    1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß der hierin beschriebenen Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz.
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
  • Die Kontraktionskraft und/oder die Struktur des Skelettmuskelgewebes kann durch die hierin beschriebenen Kontraktionsexperimente und durch die hierin beschriebenen Fluoreszenzmikroskopie-Experimente gemessen werden. Die metabolische Funktion kann beispielsweise durch mit Hilfe eines Seahorse Metabolic Flux Analyzers gemessen werden, der dem Fachmann bekannt ist.
  • Die Substanzen, die beim Testen der Toxizität verwendet werden, können beispielsweise Wirkstoffkandidaten sein, sind aber nicht darauf begrenzt. Vielmehr kann jede Substanz getestet werden, deren Toxizität bewertet werden soll.
  • Andere Anwendungsmöglichkeiten betreffen ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf die Leistungsfähigkeit von Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
    1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß der hierin beschriebenen Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einer zu testenden Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln.
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
  • Dieses in vitro-Verfahren bietet die Möglichkeit die Auswirkungen von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf das Skelettmuskelgewebe in klinisch relevanten Konzentrationen zu messen. Von besonderem Interesse ist dieses Verfahren, wenn die Auswirkungen dieser Substanzen beim Muskelaufbau, bei Kachexie oder bei Diabetes mellitus gemessen werden. Unter Kachexie versteht man eine krankhafte, sehr starke Abmagerung. Viele Patienten mit chronischen Krankheiten wie Krebs oder Autoimmunerkrankungen leiden an der Zusatzerkrankung Kachexie. Das in vitro-Verfahren bietet die Möglichkeit die Auswirkung der Substanzen auf Skelettmuskelgewebe außerhalb des Körpers zu messen.
  • Gleichsam können jedoch auch die nach dem hierin offenbarten Verfahren hergestellten unterschiedlichen Zellen in solchen in vitro Verfahren verwendet werden. So wird beispielsweise ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen hierin beschrieben, umfassend die Schritte:
    1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung,
    2. (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu den Zellen aus Schritt (a), und
    3. (c) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten;
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (c) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Eine weitere Anwendungsmöglichkeit betrifft ein in vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
    1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Eine zusätzliche Anwendungsmöglichkeit betrifft ein in vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
    1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung,
    2. (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel,
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsformen näher beschrieben:
    1. 1. Verfahren zum Herstellen von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte
      1. (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst;
      2. (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR);
      3. (iii) Expansion und Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR);
      4. (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen, die in einer extrazellulären Matrix dispergiert sind, unter mechanischer Stimulation in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst; dadurch Erzeugen von künstlichem Skelettmuskelgewebe.
    2. 2. Verfahren nach Ausführungsform 1, wobei die pluripotenten Stammzellen aus Primatenursprung, insbesondere humane pluripotente Stammzellen sind; und/oder wobei die pluripotenten Stammzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen, parthenogenetischen Stammzellen, über Kerntransfer hergestellten pluripotenten Stammzellen und über chemische Reprogrammierung hergestellten pluripotente Zellen ausgewählt sind, insbesondere wobei die pluripotenten Stammzellen induzierte pluripotente Stammzellen sind.
    3. 3. Verfahren nach Ausführungsform 1 oder 2, wobei Schritt (i) für 24 bis 132 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 48 bis 120 Stunden, stärker bevorzugt für 60 bis 114 Stunden, noch stärker bevorzugt für 72 bis 108 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 102 Stunden und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
    4. 4. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-3, wobei in Schritt (i) der GSK3-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, Tideglusib, SB415286, 6-bromoindirubin-3-oxime und einem Valproatsalz, bevorzugt wobei der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist; und /oder wobei in Schritt (i) der SMAD-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus LDN193189, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, ausgewählt ist, bevorzugt wobei der SMAD Inhibitor LDN193189 ist.
    5. 5. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-4, wobei in Schritt (i) die wirksame Menge von FGF2 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder der serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 50-500 µg/ml Transferrin, 1-20 µg/ml Insulin, 0,001-0,1 µg/ml Progesteron, 5-50 µg/ml Putrescin und 6-600 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, in dem Medium bereitstellt, und/oder der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist, und die wirksame Menge 1-20 µM beträgt, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt; und/oder der SMAD-Inhibitor LDN193189 ist, und die wirksame Menge 0,05-5 µM beträgt, bevorzugt 0,1-2,5 µM, stärker bevorzugt 0,2-1 µM, noch stärker bevorzugt 0,25-0,8 µM, noch stärker bevorzugt 0,3-0,75 µM, noch stärker bevorzugt 0,35-0,7 µM, noch stärker bevorzugt 0,4-0,6 µM, noch stärker bevorzugt 0,45-0,55 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 µM beträgt.
    6. 6. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-5, wobei der serumfreie Zusatz in Schritt (i) 0,1-10% (v/v) N2-Zusatz, bevorzugt 0,3-7,5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,5-5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,75%-2% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,9%-1,2% (v/v) N2-Zusatz, und am stärksten bevorzugt etwa 1% (v/v) N2-Zusatz ist.
    7. 7. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-6, wobei das Basalmedium in Schritt (i), Schritt (ii), Schritt (iii) und/oder in Schritt (iv) ausgewählt ist aus DMEM , DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10, Hams F-12, wobei das Basalmedium bevorzugt DMEM ist, insbesondere wobei das Basalmedium mit Pyruvat und/oder nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt ist, und/oder 1 g/l Glukose umfasst.
    8. 8. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-7, wobei in Schritt (ii) die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) dem serumfreien Zusatz für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, (c) dem serumfreien Zusatz und (d) HGF für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) dem serumfreien Zusatz, und (d) Knockout serum replacement (KSR) für 72 bis 120 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 76 bis 114 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 108 Stunden, noch stärker bevorzugt für 90 bis 102 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
    9. 9. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-8, wobei in Schritt (ii) der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe DAPT, RO4929097, Semagacestat (LY450139), Avagacestat (BMS-708163), Dibenzazepine (YO-01027), LY411575, IMR-1, L685458 , bevorzugt wobei der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist.
    10. 10. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-9, wobei in Schritt (ii)
      • die wirksame Menge von FGF2 15-30 ng/ml beträgt, bevorzugt 17,5-25 ng/ml, stärker bevorzugt 18-22 ng/ml, noch stärker bevorzugt 19-21 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 20 ng/ml beträgt; und/oder
      • die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder
      • der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist, und die wirksame Menge 1-20 µM beträgt, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt;
      • das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
    11. 11. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-10, wobei in Schritt (iii) die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
    12. 12. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-11, wobei in Schritt (iv) der zusätzliche serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 0,5-50 mg/ml Albumin, 1-100 µg/ml Transferrin, 0,1-10 µg/ml Ethanolamin, 17.4-1744 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, 0,4-40 µg/ml L-Carnitin, 0,05-5 µl/ml Fettsäure- Zusatz, 0,0001-0,1 µg/ml Triod-L-Thyronin (T3) in dem Medium bereitstellt.
    13. 13. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-12, wobei der zusätzliche serumfreie Zusatz in Schritt (iv) 0,1-10 % (v/v) B27, bevorzugt 0,5-8 % (v/v), stärker bevorzugt 1-6 % (v/v), sogar stärker bevorzugt 1,5-4% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 2% (v/v) B27 ist.
    14. 14. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-13, wobei in Schritt (iv) die mechanische Stimulation ein statischer Zug oder eine dynamische Stimulation oder eine auxotone Stimulation ist, bevorzugt wobei die mechanische Stimulation ein statischer Zug ist.
    15. 15. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-14, das vor Schritt (i) einen Saatschritt umfasst, in dem die pluripotenten Stammzellen in einem Stammzellmedium in der Gegenwart eines ROCK-Inhibitors ausgesät werden, bevorzugt wobei der Saatschritt 18-30 Stunden vor Schritt (i) ausgeführt wird.
    16. 16. Verfahren nach Ausführungsform 15, wobei der ROCK-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist.
    17. 17. Verfahren nach Ausführungsform 15 oder 16, wobei der ROCK-Inhibitor Y27632 ist und in einer Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet wird; und/oder wobei das Stammzellmedium iPS-Brew XF ist.
    18. 18. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 15-17, wobei die pluripotenten Stammzellen in dem Saatschritt zunächst in der Gegenwart von einem oder mehreren Bestandteilen einer extrazellulären Matrix in einem Mastermix in eine künstliche Form ausgesät werden, bevor das Stammzellmedium hinzugefügt wird.
    19. 19. Verfahren nach Ausführungsform 18, wobei der Bestandteil einer extrazellulären Matrix in dem Mastermix Kollagen ist, bevorzugt Typ I Kollagen, stärker bevorzugt aus Rinderursprung, humanem Ursprung oder marinem Ursprung, insbesondere Kollagen aus Rinderursprung, gegebenenfalls wobei die extrazelluläre Matrix zusätzlich Laminin und/oder Fibronektin umfasst.
    20. 20. Verfahren nach Ausführungsform 19, wobei die pluripotenten Stammzellen in einem Verhältnis von 1-6 × 106 Zellen/ml und 0,7-1,4 mg/ml Kollagen in Medium ausgesät werden.
    21. 21. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 18-20, wobei der Mastermix 5-15% (v/v) eines Exsudats von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkomzellen als extrazellulären Matrixbestandteil umfasst, bevorzugt 7.5%-12.5% (v/v), stärker bevorzugt 9-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10 % (v/v) umfasst, insbesondere wobei das Exsudat Matrigel ist; und/oder wobei der pH-Wert des Mastermix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
    22. 22. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 18-20, wobei der Mastermix Stromazellen umfasst, wobei die Stromazellen die extrazellulären Matrixbestandteile Kollagene, Laminin, Fibronektin und/oder Proteoglykane erzeugen; und/oder wobei der pH-Wert des Master mix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
    23. 23. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 18-22, wobei das Stammzellmedium nach etwa 1 Stunde zu dem Mastermix in der künstlichen Form hinzugefügt wird, wobei das Stammzellmedium KSR und FGF2 umfasst.
    24. 24. Verfahren nach Ausführungsform 23, wobei das Stammzellmedium 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR umfasst; und/oder wobei das Stammzellmedium 1-15 ng/ml FGF2 umfasst, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml FGF2 umfasst.
    25. 25. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 18-24, wobei Schritt (iii) für 7-11 Tage, bevorzugt für 8-10 Tage, und am stärksten bevorzugt für etwa 9 Tage durchgeführt wird.
    26. 26. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-17, wobei nach Schritt (iii) die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in einem zusätzlichen Schritt vor Schritt (iv) in der Gegenwart von einem oder mehreren Bestandteilen einer extrazellulären Matrix in einem Mastermix in eine künstliche Form ausgesät werden.
    27. 27. Verfahren nach Ausführungsform 26, wobei der Bestandteil einer extrazellulären Matrix in dem Mastermix Kollagen ist, bevorzugt Typ I Kollagen, stärker bevorzugt aus Rinderursprung, humane Ursprung oder marinem Ursprung, insbesondere Kollagen aus Rinderursprung, gegebenenfalls wobei die extrazelluläre Matrix zusätzlich Laminin und/oder Fibronektin umfasst.
    28. 28. Verfahren nach Ausführungsform 27, wobei die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in einem Verhältnis von 1-10 × 106 Zellen/ml und 0,7-1,4 mg/ml Kollagen in Medium ausgesät werden.
    29. 29. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 26-28, wobei der Mastermix 5-15% (v/v) eines Exsudats von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkomzellen als extrazellulären Matrixbestandteil umfasst, bevorzugt 7.5%-12.5% (v/v), stärker bevorzugt 9-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10 % (v/v) umfasst, insbesondere wobei das Exsudat Matrigel ist; und/oder wobei der pH-Wert des Mastermix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
    30. 30. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 26-28, wobei der Mastermix Stromazellen umfasst, wobei die Stromazellen die extrazellulären Matrixbestandteile Kollagene, Laminin, Fibronektin und/oder Proteoglykane erzeugen; und/oder wobei der pH-Wert des Master mix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
    31. 31. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 26-30, wobei nach etwa einer Stunde ein wie in Schritt (iii) verwendetes Medium zu einem Mastermix in einer künstlichen Form hinzugefügt wird, wobei das Medium zusätzlich eine wirksame Menge eines ROCK-Inhibitors umfasst; insbesondere wobei der ROCK-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist.
    32. 32. Verfahren nach Ausführungsform 31, wobei der ROCK-Inhibitor Y27632 ist und in einer Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet wird.
    33. 33. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 26-32, wobei nach etwa einem Tag das Medium gegen ein wie in Schritt (iii) verwendetes Medium ausgetauscht wird, und die Zellen anschließend in diesem Medium für weitere 5-9 Tage, bevorzugt 6-8 Tage, am stärksten bevorzugt etwa 7 Tage weiterkultiviert werden.
    34. 34. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 18-33, wobei die künstliche Form die Form eines Ringes, eines Bandes, eines Stranges, eines Flickens, eines Beutels, oder eines Zylinders hat, wobei optional einzelne Skelettmuskelgewebe fusioniert werden.
    35. 35. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-34, wobei Schritt (iv) für mindestens 19 Tage, bevorzugt mindestens 28 Tage, stärker bevorzugt für mindestens 56 Tage durchgeführt wird, noch stärker bevorzugt für mindestens 120 Tage durchgeführt wird und insbesondere für mindestens 240 Tage durchgeführt wird.
    36. 36. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-35, wobei das Verfahren kein differenzierungs- oder maturierungsbezogenes Transgen umfasst, bevorzugt wobei das Verfahren kein myogenes Transgen umfasst, stärker bevorzugt wobei das Verfahren nicht das Transgen Pax7 oder MyoD umfasst.
    37. 37. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 1-36, wobei das Verfahren keinen Schritt zur Anreicherung von Skelettmyoblasten enthält, bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Zellselektion, stärker bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Antikörper-basierte Zellselektion.
    38. 38. Verfahren zum Herstellen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte
      1. (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend einer wirksamen Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst;
      2. (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend einer wirksamen Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend einer wirksamen Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR);
      3. (iii) Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellendurch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend einer wirksamen Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR), gefolgt von
      4. (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst; dadurch Erzeugen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen.
    39. 39. Verfahren nach Ausführungsform 38, wobei durch das Verfahren ein Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% erzielt wird, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
    40. 40. Verfahren nach Ausführungsform 38 oder 39, wobei durch das Verfahren ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, am stärksten bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie.
    41. 41. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-40, wobei das Verfahren keinen Schritt zur Anreicherung von Skelettmyoblasten enthält, bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Zellselektion, stärker bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Antikörper-basierte Zellselektion.
    42. 42. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-41, wobei die pluripotenten Stammzellen aus Primatenursprung, insbesondere humane pluripotente Stammzellen sind; und/oder wobei die pluripotenten Stammzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen, parthenogenetischen Stammzellen, über Kerntransfer hergestellten pluripotenten Stammzellen und über chemische Reprogrammierung hergestellten pluripotente Zellen ausgewählt sind, insbesondere wobei die pluripotenten Stammzellen induzierte pluripotente Stammzellen sind.
    43. 43. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-42, wobei Schritt (i) für 48 bis 132 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 48 bis 120 Stunden, stärker bevorzugt für 60 bis 114 Stunden, noch stärker bevorzugt für 72 bis 108 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 102 Stunden und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
    44. 44. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-43, wobei in Schritt (i) der GSK3-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, Tideglusib, SB415286, 6-bromoindirubin-3-oxime und einem Valproatsalz, bevorzugt wobei der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist; und /oder wobei in Schritt (i) der SMAD-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus LDN193189, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, ausgewählt ist, bevorzugt wobei der SMAD Inhibitor LDN193189 ist.
    45. 45. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-44, wobei in Schritt (i) die wirksame Menge von FGF2 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder der serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 50-500 mg/l Transferrin, 1-20 mg/l Insulin, 1-30 µg/l Progesteron, 5-50 µg/ml Putrescin und 6-600 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, in dem Medium bereitstellt, und/oder der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist, und die wirksame Menge 4-18 µM beträgt, bevorzugt 5-16 µM, stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 8-13 µM, noch stärker bevorzugt 9-12 µM, noch stärker bevorzugt 9,5-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt; und/oder der SMAD-Inhibitor LDN193189 ist, und die wirksame Menge 0,05-5 µM beträgt, bevorzugt 0,1-2,5 µM, stärker bevorzugt 0,2-1 µM, noch stärker bevorzugt 0,25-0,8 µM, noch stärker bevorzugt 0,3-0,75 µM, noch stärker bevorzugt 0,35-0,7 µM, noch stärker bevorzugt 0,4-0,6 µM, noch stärker bevorzugt 0,45-0,55 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 µM beträgt.
    46. 46. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-45, wobei der serumfreie Zusatz in Schritt (i) 0,1-10% (v/v) N2-Zusatz, bevorzugt 0,3-7,5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,5-5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,75%-2% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,9%-1,2% (v/v) N2-Zusatz, und am stärksten bevorzugt etwa 1% (v/v) N2-Zusatz ist.
    47. 47. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-46, wobei das Basalmedium in Schritt (i), Schritt (ii), Schritt (iii) und/oder Schritt (iv) ausgewählt ist aus DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10, Hams F-12, wobei das Basalmedium bevorzugt DMEM ist, insbesondere wobei das Basalmedium mit Pyruvat und/oder nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt ist, und/oder 1 g/l Glukose umfasst.
    48. 48. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-47, wobei in Schritt (ii) die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) dem serumfreien Zusatz für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, (c) dem serumfreien Zusatz und (d) HGF für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) dem serumfreien Zusatz, und (d) Knockout serum replacement (KSR) für 72 bis 120 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 76 bis 114 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 108 Stunden, noch stärker bevorzugt für 90 bis 102 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
    49. 49. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-48, wobei in Schritt (ii) der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe DAPT, RO4929097, Semagacestat (LY450139), Avagacestat (BMS-708163), Dibenzazepine (YO-01027), LY411575, IMR-1, L685458 , wobei der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor bevorzugt DAPT ist.
    50. 50. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-49, wobei in Schritt (ii) die wirksame Menge von FGF2 15-30 ng/ml beträgt, bevorzugt 17,5-25 ng/ml, stärker bevorzugt 18-22 ng/ml, noch stärker bevorzugt 19-21 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 20 ng/ml beträgt; und/oder
      • die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder
      • der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist, und die wirksame Menge 1-20 µM beträgt, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt;
      • das KSR in einer Menge von 6-14% (v/v), bevorzugt 7-13% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa
      • 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
    51. 51. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-50, wobei in Schritt (iii) die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt;
      • das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
    52. 52. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-51, wobei Schritt (iii) für 7-11 Tage, bevorzugt 8-10 Tage, und am stärksten bevorzugt für etwa 9 Tage durchgeführt wird.
    53. 53. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-52, wobei in Schritt (iv) der zusätzliche serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 0,5-50 mg/ml Albumin, 1-100 µg/ml Transferrin, 0,1-10 µg/ml Ethanolamin, 17.4-1744 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, 0,4-40 µg/ml L-Carnitin, 0,05-5 µl/ml Fettsäure- Zusatz, 0,0001-0,1 µg/ml Triod-L-Thyronin (T3) in dem Medium bereitstellt.
    54. 54. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-53, wobei der zusätzliche serumfreie Zusatz in Schritt (iv) 0,1-10 % (v/v) B27, bevorzugt 0,5-8 % (v/v), stärker bevorzugt 1-6 % (v/v), sogar stärker bevorzugt 1,5-4% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 2% (v/v) B27 ist.
    55. 55. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-54, wobei Schritt (iv) für mindestens 30 Tage, bevorzugt mindestens 35 Tage, stärker bevorzugt für mindestens 40 Tage, und noch stärker bevorzugt für mindestens zu 50 Tage durchgeführt wird.
    56. 56. Verfahren nach einem beliebigen der Ausführungsformen 38-55, das vor Schritt (i) einen Saatschritt umfasst, in dem die pluripotenten Stammzellen in einem Stammzellmedium in der Gegenwart eines ROCK-Inhibitors ausgesät werden, bevorzugt wobei der Saatschritt 18-30 Stunden vor Schritt (i) ausgeführt wird.
    57. 57. Verfahren nach Ausführungsform 56, wobei der ROCK-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist.
    58. 58. Verfahren nach Ausführungsform 56 oder 57, wobei der ROCK-Inhibitor Y27632 ist und in einer Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet wird; und/oder wobei das Stammzellmedium iPS-Brew XF ist.
    59. 59. Verfahren nach Ausführungsform 58, wobei das Stammzellmedium 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR umfasst; und/oder wobei das Stammzellmedium 1-15 ng/ml FGF2 umfasst, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml FGF2 umfasst.
    60. 60. Künstliches Skelettmuskelgewebe, das multinukleäre reife Skelettmuskelfasern mit Satellitenzellen aufweist, und keine Durchblutung und/oder keine Steuerung über das zentrale Nervensystem aufweist; insbesondere wobei die Gegenwart von Skelettmuskelfasern durch Färbung von Aktinin und mit DAPI festgestellt wird.
    61. 61. Künstliches Skelettmuskelgewebe nach Ausführungsform 60, wobei das Skelettmuskelgewebe serumfrei ist und/oder kein differenzierungs- oder maturierungsbezogenes Transgen umfasst, bevorzugt wobei das Skelettmuskelgewebe kein myogenes Transgen umfasst, stärker bevorzugt wobei das Skelettmuskelgewebe nicht das Transgen Pax7 oder MyoD umfasst.
    62. 62. Künstliches Skelettmuskelgewebe nach Ausführungsform 60 oder Ausführungsform 61, wobei das Skelettmuskelgewebe bei einem Stimulus von 100 Hz bei 200 mA mindestens eine Kontraktionskraft von 0,3 Millinewton (mN) erzeugt, bevorzugt mindestens 0,4 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,5 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,6 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,7 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,8 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,9 mN, stärker bevorzugt mindestens 1 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,2 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,3 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,4 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,5 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,6 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,7 mN; stärker bevorzugt mindestens 1,8 mN; stärker bevorzugt mindestens 1,9 mN; und am stärksten bevorzugt mindestens 2 mN erzeugt.
    63. 63. Künstliches Skelettmuskelgewebe nach einem beliebigen der Ausführungsformen 60-62, wobei das Skelettmuskelgewebe künstlich geformt ist, bevorzugt wobei es die künstliche Form eines Ringes, eines Bandes, eines Stranges, eines Flickens, eines Beutels, oder eines Zylinders hat, wobei optional einzelne Skelettmuskelgewebe fusioniert werden, insbesondere wobei das Skelettmuskelgewebe die Form eines Ringes aufweist.
    64. 64. Mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen erhalten nach Schritt (i) gemäß Ausführungsform 1 oder Ausführungsform 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Ausführungsform 1(i) oder gemäß Ausführungsform 38(i), die durch die Expression von den Genen MSGN1 und/oder TBX6 gekennzeichnet sind, wobei die Expression von MSGN1 und/oder TBX6 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann; und/oder die mRNA SP5 exprimiert wird, wobei die Expression von SP5 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
    65. 65. Myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen erhalten nach Schritt (ii) gemäß Ausführungsform 1 oder Ausführungsform 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Ausführungsform 1(i) bis (ii) oder gemäß Ausführungsform 38(i) bis (ii), die durch die Expression des Gens PAX3 gekennzeichnet ist, wobei die Expression von PAX3 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann; und/oder die mRNA SIM1 exprimiert wird, wobei die Expression von SIM1 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
    66. 66. Skelettmyoblastenzellen erhalten nach Schritt (iii) gemäß Ausführungsform 1 oder Ausführungsform 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Ausführungsform 1(i) bis (iii) oder gemäß Ausführungsform 38(i) bis (iii), die durch die Expression von Aktinin gekennzeichnet sind, bevorzugt wobei die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
    67. 67. Satellitenzelle erhalten nach Schritt (iii) gemäß Ausführungsform 1 oder Ausführungsform 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Ausführungsform 1(i) bis (iii) oder gemäß Ausführungsform 38(i) bis (iii), die durch die Expression des Gens Pax7 gekennzeichnet ist, wobei die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann, stärker bevorzugt wobei Satellitenzellen ferner Ki67 exprimieren.
    68. 68. Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen gemäß Ausführungsform 66 und Satellitenzellen gemäß Ausführungsform 67, wobei ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, noch stärker bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie; und/oder wobei ein Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% erzielt wird, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
    69. 69. Skelettmyotuben erhalten nach Schritt (iv) gemäß Ausführungsform 1 oder Ausführungsform 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Ausführungsform 1(i) bis (iv) oder gemäß Ausführungsform 38(i) bis (iv), die durch eine anisotrope Ausrichtung der Aktinin Protein enthaltenen Sarkomerstruktur charakterisiert sind.
    70. 70. Verwendung eines Skelettmuskelgewebes gemäß den Ausführungsformen 60-63, und/oder von Zellen gemäß einem beliebigen der Ausführungsformen 64-68, und/oder von Skelettmyotuben gemäß Ausführungsform 69 in einem in vitro Arzneimitteltest; insbesondere wobei der Arzneimitteltest ein Toxizitätstest ist, oder ein Test auf die Funktion des Skelettmuskelgewebes unter dem Einfluss von pharmakologischen und gentherapeutischen Wirkstoffkandidaten.
    71. 71. Skelettmuskelgewebe gemäß den Ausführungsformen 60-63 und/oder Zellen gemäß einem beliebigen der Ausführungsformen 64-68, und/oder von Skelettmyotuben gemäß Ausführungsform 69 zur Verwendung in der Medizin.
    72. 72. Satellitenzellen gemäß dem Ausführungsform 67 zur Verwendung in der Therapie von geschädigtem Skelettmuskel und/oder in der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen, bevorzugt genetischen Skelettmuskeldefekten, insbesondere von Muskeldystrophie Duchenne und/oder Muskeldystrophie Becker-Kiener, und/oder von lysosomalen Speicherkrankheiten, insbesondere von Morbus Pompe, bevorzugt wobei die Skelettmuskelerkrankung Muskeldystrophie Duchenne ist.
    73. 73. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
      1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß einem beliebigen der Ausführungsformen 60-63,
      2. (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu dem Skelettmuskelgewebe, und
      3. (c) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten;
      bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (c) umfasst.
    74. 74. In vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
      1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß einem beliebigen der Ausführungsformen 60-63,
      2. (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz.
      bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
    75. 75. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf die Leistungsfähigkeit von Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte
      1. (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß einem beliebigen der Ausführungsformen 60-63,
      2. (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel.
      bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
    76. 76. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
      1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß einer beliebigen der Ausführungsformen 64-69,
      2. (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu den Zellen aus Schritt (a), und
      3. (c) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten;
      bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (c) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
    77. 77. In vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
      1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß einer beliebigen der Ausführungsformen 64-69,
      2. (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
    78. 78. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte:
      1. (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß einem beliebigen der Ausführungsformen 64-69,
      2. (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel,
    bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  • Beschreibung der Abbildungen
  • . Schema des Differenzierungsprotokolls in 2D-Zellkultur. Differenzierungsprotokoll für die gerichtete Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in 2D. Die hPSCs werden am Vortag ausgesät. Für die mesodermale Induktion werden die Zellen von Tag 0 bis Tag 4 in mesodermalem Induktionsmedium (DMEM mit 1 g/l Glukose ergänzt mit Pyruvat) mit CHIR-99021, LDN193189 und FGF-2 kultiviert. Für die myogene Spezifikation werden die Zellen von Tag 4 bis Tag 6 in Medium mit DAPT und FGF-2 kultiviert, gefolgt von einer Kultivierung von Tag 6 bis Tag 8 in Medium mit DAPT, FGF-2 und HGF, gefolgt von einer Kultivierung von Tag 8 bis Tag 12 in einem Medium mit DAPT, HGF und „Knockout-serum replacement“ (KSR). Für die myogene Expansion und Maturierung werden die Zellen von Tag 12 bis Tag 21 in Medium mit HGF und KSR kultiviert. Für die myogene Maturierung werden die Zellen ab Tag 21 in Medium mit Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen, Carnitin, Fettsäuren und T3 kultiviert. Zusätzlich umfasst das Medium von Tag 0 bis Tag 21 den serumfreien Zusatz N-2.
  • . Schema der Zelldifferenzierung von pluripotenten Stammzellen zu Myotuben und Satellitenzellen. Schematische Darstellung der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in Myotuben, die folgende Stadien umfasst: (i) pluripotente Stammzellen, (ii) presomitische mesodermale Zellen, (iii) Myoblasten mit Satellitenzellen, (iv) Myotuben mit Satellitenzellen, und (v) Myotuben mit Satellitenzellnische. Darüber hinaus ist die Expressionsabfolge von Markergenen während der verschiedenen Differenzierungsstadien dargestellt. Die Expression von Oct4 ist charakteristisch für pluripotente Stammzellen. Die Expression von MSGN1 und Tbx6 sind für presomitische mesodermale Zellen charakteristisch. Pax3 wird hauptsächlich während dem Übergang von presomitischen mesodermalen Zellen zu Myoblasten exprimiert. Die Expression von Pax7 ist charakteristisch für das Vorhandensein von Satellitenzellen und wird am Ende des presomitischen mesodermalen Stadiums und am Anfang des Myoblastenstadiums erstmals exprimiert. Während die Pax7 Expression im Myoblastenstadium am höchsten ist, flacht die Pax7 Expression bis zum Myotubenstadium ab, bleibt jedoch als Zeichen einer Satellitenzellnischenbildung erhalten. Die Expression von MyoD ist am stärksten in Myoblasten vorhanden und ist auch in Myotuben nachweisbar. Die Expression von Myogenin und Aktinin ist charakteristisch für Myotuben und wird kaum in Myoblasten exprimiert. Myotuben bilden eine Satellitenzellnischen aus, die Muskelstammzellnische. Satellitenzellnischen sind Pax7 positiv und ruhend. Der Zellzyklus wird bei Muskelschäden aktiviert, wobei die Zellen dann auch Ki67 positiv sind.
  • . Fluoreszenzmikroskopie der Skelettmuskelzellen und Satellitenzellen. Immunfärbung von myogenen Zellen in repräsentativer Zellkultur nach 21 Tagen (Beispiel 1). Die Fluoreszenzbilder zeigen die Expression skelettmuskelspezifischer Transkriptionsfaktoren PAX7 (obere Zeile links), MyoD (mittlere Zeile links) und Myogenin (untere Zeile links). PAX7 weist Satellitenzellen nach; MyoD und Myogenin weisen Skelettmyoblasten und/oder Skelettmyotuben nach. Des Weiteren zeigen die Fluoreszenzbilder Zellkerne (Nuclei, rechte Spalte) und die Expression von Actin (mittlere Spalte). Maßstab: 100 µm.
  • . Genexpressionsmuster während der Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in Skelettmuskelzellen analysiert durch RNA-Sequenzierung. Die gerichtete Differenzierung zeigt Genexpressionsmuster wie bei der embryonalen Skelettmuskelentwicklung. Expressionswerte („Reads per kilobase million, RPKM“) von Genen, die typisch für eine Pluripotenz und ein paraxiales Mesoderm sind, sind über die Zeit der Differenzierung und Maturierung graphisch dargestellt ( und . Bei der RNA-Sequenzierung zeigen Gene, die typisch für Pluripotenz sind, wie NANOG, POU5F1 und ZFP42, an den Tagen 0 und 1 eine hohe Expression. NANOG und POU5F1 zeigen die höchste Expression an Tag 0; ZFP42 zeigt die höchste Expression an Tag 1. Gene, die typisch für das paraxiale Mesoderm sind, wie MSGN1, TBX6 und MEOX1, zeigen an den Tagen 1-8 eine hohe Expression. MSGN1 zeigt die höchste Expression an Tag 1; TBX6 zeigt die höchste Expression an Tag 4; und MEOX zeigt die höchste Expression an Tag 8. Expressionswerte („Reads per kilobase million, RPKM“) von typischen Genen für skelettmuskelspezifische Transkriptionsfaktoren und Sarkomere über die Zeit der Differenzierung und Maturierung graphisch dargestellt ( und ). Skelettmuskelspezifische Transkriptionsfaktoren, wie PAX3, PAX7 und MYOD1, zeigen an den Tagen 8, 29, bzw. 60 die höchste Expression. Gene, die typisch für Sarkome sind, wie ACTN2, DMD und MYH3, zeigen am Tag 60 die höchste Expression.
  • . Analyse der Effizienz bei gerichteter Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) zu Skelettmuskelzellen. Durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils von Muskelzellen (Aktinin-, sowie Myogenin oder MyoD-positiv) sowie Satellitenzellen (PAX7-positiv) von vier unabhängigen pluripotenten Stammzellinien (iPSC (WT 1), iPSC (WT 2), DMD iPSC, korrigierte DMD iPSC). Der Anteil der Aktinin-positiven Zellen liegt zwischen 71 und 77.6% in den vier Zelllinien; der Anteil der Myogenin-positiven Zellen liegt zwischen 41.4% und 60.4% in den vier Zelllinien; der Anteil der MyoD-positiven Zellen liegt zwischen 40% und 54.1% in den vier Zelllinien; der Anteil der PAX7-positiven Zellen liegt zwischen 33.4% und 43.8% in den vier Zelllinien.
  • . Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe (engl: Engineered Skeletal Muscle, ESM) aus Skelettmyoblasten, die aus hPSCs abgeleitet sind. (A) Schema des ESM-Kultivierungsprotokolls. Der 21 Tage alte Zellpool aus Beispiel 1 wird in eine extrazelluläre Matrix (Kollagen/Matrigel) gegossen und für 7 Tage in ringförmigen Formen (linkes Bild) unter Expansionsbedingungen kultiviert. Die geformten Ringe werden darauffolgend auf Dehnapparaturen überführt (Bild in der Mitte) und unter Maturierungsbedingungen weiterkultiviert. Nach weiteren 4 Wochen wird die Funktion des ESM in Organbädern (rechtes Bild) gemessen; Maßstab: 5 mm. (B) Repräsentative Kontraktionskraftkurven des künstlichen Skelettmuskelgewebes bei unterschiedlichen Stimulationsfrequenzen: 1 Hz (Strichlinie: acht Einzelkontraktionen mit einer einzelnen Dauer von ungefähr 500 ms mit einer Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) von jeweils ungefähr 0.5 Millinewton), 10 Hz (durgezogene Linie: beginnender Tetanus mit einer Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) von ungefähr 1 Millinewton, einzelne Kontraktionen graphisch unterscheidbar), 100 Hz (Strichpunktlinie: voll ausgebildeter Tetanus mit einer Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) von ungefähr 2.2 Millinewton). (C) Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) in Millinewton (mN) des Skelettmuskelgewebes in Abhängigkeit der elektrischen Stimulationsfrequenz; n=3. Bei einem Stimulus von 1 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.5 Millinewton; bei einem Stimulus von 10 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.9 Millinewton; bei einem Stimulus von 20 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.1 Millinewton; bei einem Stimulus von 40 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.4 Millinewton; bei einem Stimulus von 60 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.55 Millinewton; bei einem Stimulus von 80 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.6 Millinewton; bei einem Stimulus von 100 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 2.1 Millinewton.
  • . Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe (engl.: Bioengineered Skeletal Muscle, BSM) aus hPSC. (A) Schema des BSM-Kultivierungsprotokolls. Humane induzierte pluripotente Stammzellen werden in ein Kollagen/Matrigel Hydrogel in ringförmige Formen gegossen und in 3D in Skelettmuskelgewebe differenziert. Die geformten Ringe werden an Tag 21 auf Dehnapparaturen überführt und unter Maturierungsbedingungen weiterkultiviert. Nach weiteren 4 Wochen wird typischerweise die Funktion der BSM in Organbädern gemessen. Im Einzelnen werden die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen dafür zunächst in einem Kollagen/Matrigel Hydrogel dispergiert und für 24 h in Brew XF mit Y-27632 und KSR konditioniert (Tag -1). Die Zellen werden dann von Tag 0 bis Tag 4 in Medium mit CHIR-99021, LDN193189 und FGF-2 kultiviert. Die Zellen werden von Tag 4 bis Tag 6 in Medium mit DAPT und FGF-2 kultiviert, gefolgt von einer Kultivierung von Tag 6 bis Tag 8 in Medium mit DAPT, FGF-2 und HGF, gefolgt von einer Kultivierung von Tag 8 bis Tag 12 in einem Medium mit DAPT, HGF und „Knockout-serum replacement“ (KSR). Die Zellen werden von Tag 12 bis Tag 21 in Medium mit HGF und KSR kultiviert. Von Tag 21 bis Tag 50 werden die Zellen in Maturierungsmedium auf statischen Dehnapparaturen kultiviert, d.h. unter mechanischer Dehnung. Zusätzlich umfasst das Medium von Tag 0 bis Tag 50 den serumfreien Zusatz N-2. (B) Repräsentative Kontraktionskraftkurven des künstlichen Skelettmuskelgewebes bei unterschiedlichen Stimulusfrequenzen: 1 Hz (Strichlinie: acht Einzelkontraktionen mit einer einzelnen Dauer von ungefähr 600 ms mit einer Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) von jeweils ungefähr 0.7 Millinewton) und 100 Hz (durchgezogene Linie: voll ausgebildeter Tetanus mit einer Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) von ungefähr 1.1 Millinewton). (C) Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) in Millinewton (mN) des Skelettmuskelgewebes in Abhängigkeit der elektrischen Stimulationsfrequenz; n=3. Bei einem Stimulus von 1 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.3 Millinewton; bei einem Stimulus von 10 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.5 Millinewton; bei einem Stimulus von 20 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.55 Millinewton; bei einem Stimulus von 40 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.6 Millinewton; bei einem Stimulus von 60 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.65 Millinewton; bei einem Stimulus von 80 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.72 Millinewton; bei einem Stimulus von 100 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.9 Millinewton.
  • . Fluoreszenzmikroskopie des Skelettmuskelgewebes hergestellt durch ESM und BSM-Verfahren. Immunfärbung von Aktin und DNA in repräsentativen Skelettmuskelgeweben hergestellt durch das ESM- (Beispiel 1 und 2) und BSM- (Beispiel 3) Verfahren. Die Fluoreszenzbilder zeigen multinukleäre, reife Skelettmuskelfasern, gekennzeichnet durch das charakteristische Streifenmuster (gefärbtes Aktin). Maßstab: 50 µm (ESM) und 10 µm (BSM).
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen, aber nicht darauf beschränken. Die Beispiele beschreiben technische Merkmale, und die Erfindung bezieht sich auch auf Kombinationen der in diesem Abschnitt vorgestellten technischen Merkmale. Methoden und Materialen, die in allen Beispielen verwendet wurden sind nach den Beispielen beschrieben.
  • Beispiel 1: Gerichtete Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in Skelettmuskelzellen und Satellitenzellen in 2D-Zellkultur.
  • Für die gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Skelettmuskelzellen und Satellitenzellen in 2D-Zellkultur wurde ein Verfahren entwickelt. Das hier beschriebene Verfahren ist transgen- und serumfrei. Durch dieses Verfahren können humane Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen in hoher Reinheit erzeugt werden. Bei diesem Verfahren wurde eine bestimmte zeitliche Abfolge von Wirkstoffen (kleine Moleküle sowie Inhibitoren und Stimulatoren) verwendet, die die Differenzierung der humanen pluripotenten Stammzellen induzieren. In unterschiedlichen Differenzierungsstadien von pluripotenten Stammzellen wurden unterschiedliche Gene exprimiert. Die typische Genexpression während einer Differenzierung werden auch Genexpressionsmuster genannt. Diese Genexpressionsmuster werden ebenfalls bei einer embryonalen Skelettmuskelentwicklung im menschlichen Körper durchlaufen. Das Schema des Differenzierungsprotokolls ist in abgebildet, und es zeigt die Abfolge der unterschiedlichen Wirkstoffe, die dem Medium beigemischt werden. Darüber hinaus zeigt die Differenzierungsstadien, die während der Differenzierung zu Skelettmyoblasten/Myotuben und Satellitenzellen durchlaufen werden, d.h. die Induzierung der Mesodermdifferenzierung, die Induzierung der myogenen Spezifikation, die (myogene) Expansion und die Maturierung zu Skelettmyoblasten und Satellitenzellen und die Maturierung zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen.
  • Um das Verfahren durchzuführen wurden die humane pluripotente Stammzellen am Vortag bei einer Dichte von 1.7 × 104 Zellen/cm2 auf Matrigel beschichteten Platten ausplattiert und in der Gegenwart von 12 ml StemMACS™ iPS-Brew XF Medium mit 5 µM Rock Inhibitor (Stemolecule Y27632) kultiviert (Verfahren zum Beschichten von Zellkulturplatten mit Matrigel am Ende von Beispiel 1), sodass die Zellkultur am darauffolgenden Tag (Tag 0) ungefähr 30% konfluent war. Die optimale Zellzahl für das Ausplattieren muss jedoch für jede Zelllinie individuell bestimmt werden.
  • Durch das Kultivieren in N2-FCL Medium wurde die Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen induziert. An den Tagen 0, 1, 2 und 3 wurde das Medium jeweils durch 15 ml N2-FCL Medium ersetzt und täglich gewechselt. N2-FCL Medium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (100x) (Thermo Scientific), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (100x) (MEM-NEAA, Invitrogen), 10 ng/ml rekombinates bFGF (Peprotech), 10 µM CHIR-99021 (Stemgent), 0.5 µM LDN193189 (Stemgent)).
  • Durch das Kultivieren in den Medien N2-FD, N2-FHD und N2-HKD wurde die myogene Spezifikation induziert. An den Tagen 4 und 5 wurde das Medium durch N2-FD Medium ersetzt und täglich gewechselt. N2-FD Medium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (100x) (Thermo Scientific), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (100x) (MEM-NEAA, Invitrogen), 20 ng/ml rekombinates bFGF (Peprotech), 10 uM DAPT (TOCRIS).
  • An den Tagen 6 und 7 wurde das Medium durch N2-FHD Medium ersetzt und täglich gewechselt. N2-FHD Medium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (100x) (Thermo Scientific), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (100x) (MEM-NEAA, Invitrogen), 20 ng/ml rekombinates bFGF (Peprotech), 10 µM DAPT (TOCRIS), 10 ng/ml rekombinates HGF (Peprotech).
  • An den Tagen 8, 9, 10 und 11 wurde das Medium durch N2-HKD Medium ersetzt und täglich gewechselt. N2-HKD Medium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (Gluta-MAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (100x) (Thermo Scientific), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (100x) (MEM-NEAA, Invitrogen), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Invitrogen), 10 µM DAPT (TOCRIS), 10 ng/ml rekombinates HGF (Peprotech), 10% Knockout serum replacement (Life Technologies).
  • Durch das Kultivieren in N2-HK Medium wurden die Zellen zu Skelettmyoblasten und Satellitenzellen myogen expandiert und maturiert. An den Tagen 12 bis 20 wurde das Medium durch N2-HK Medium (Expansionsmedium) ersetzt und jeden zweiten Tag gewechselt. N2-HK Medium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (100x) (Thermo Scientific), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (100x) (MEM-NEAA, Invitrogen), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Invitrogen), 10 ng/ml rekombinates HGF (Peprotech), 10% Knockout serum replacement (Life Technologies).
  • Ab Tag 21 wurden die Zellen entweder auf Zellkulturplatten weiterkultiviert, eingefroren oder in dem Verfahren von Beispiel 2 verwendet. Wenn die Zellen weiterkultiviert wurden, wurde das Medium durch Differenzierungsmedium (Maturierungsmedium) ausgetauscht. Maturierungsmedium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (Thermo Scientific), 1% B27-serumfreier Zusatz (Invitrogen). Durch Weiterkultieren auf Zellkulturplatten werden Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen erzeugt.
  • Um die gerichtete Differenzierung während den beschriebenen Kultivierungsschritten nachzuvollziehen, wurden die Genexpressionsmuster der Zellen über einen Zeitraum von 60 Tagen mit Hilfe von RNA-Sequenzierung bestimmt. Mit Hilfe von RNA-Sequenzierung wurden das Ansteigen und das Absinken der Expression von spezifischen Genen bestimmt, d.h. der Eintritt und Austritt in bestimmten Differenzierungs- oder Maturierungsphasen wurde analysiert.
  • Im Speziellen wurden die Expression spezifischer Gene für Pluripotenz, paraxiales Mesoderm, skelettmuskelspezifische Transkriptionsfaktoren und Sarkomere gemessen. Gene, die für die Pluripotenz typisch sind, wie NANOG, POU5F1 und ZFP42, zeigen an den Tagen 0 und 1 (am Tag nach dem Saatschritt und dem darauffolgenden Tag) eine hohe Expression ( . NANOG und POU5F1 zeigen die höchste Expression an Tag 0; ZFP42 zeigt die höchste Expression an Tag 1 ( . Gene, die für das paraxiale Mesoderm typisch sind, wie MSGN1, TBX6 und MEOX1, zeigen an den Tagen 1-8 eine hohe Expression ( . MSGN1 zeigt die höchste Expression an Tag 1; TBX6 zeigt die höchste Expression an Tag 4; und MEOX zeigt die höchste Expression an Tag 8 ( . Skelettmuskelspezifische Transkriptionsfaktoren, wie PAX3, PAX7 und MYOD1, zeigen an den Tagen 8, 29, bzw. 60 die höchste Expression ( ). Gene, die für Sarkomere typisch sind, wie ACTN2, DMD und MYH3, zeigen am Tag 60 die höchste Expression ( ). Darüber hinaus zeigen die Genexpressionsmuster vor allem während den ersten 21 Tagen einen steilen Anstieg oder Abfall der unterschiedlichen Marker. Beispielsweise wird TBX6 und MEOX1 wird nur an den Tagen 4 bzw. 8 stark exprimiert, wohingegen die Expression an den anderen Tagen mindestens 4-fach schwächer ist ( ). Dieser zeitliche Ablauf deutet auf einen homogenen Verlauf des Differenzierungsprozesses hin.
  • Um die Differenzierung mit Hilfe einer zweiten unabhängigen Methode festzustellen, haben die Erfinder die Zellen nach dem 21-tägigen Differenzierungsverfahren mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Dabei wurde DNA der Zellen mit Hoechst gefärbt und Aktin sowie Skelettmuskel-spezifischen Transkriptionsfaktoren (Pax7, MyoD und Myogenin) immunologisch eingefärbt. Nach 21 Tagen zeigen die Fluoreszenzbilder einen hohen Anteil von Zellen mit einer Expression von Pax7, MyoD und Myogenin ( ). Somit wurde mit Hilfe einer weiteren Methode gezeigt, dass durch das Differenzierungsprotokoll eine Zellpopulation von myogenen Zellen erzeugt wurde.
  • Um die Differenzierung mit Hilfe einer dritten unabhängigen Methode festzustellen, wurden die Zellen mit Hilfe von Durchflusszytometrie analysiert. Bei der Durchflusszytometrie, wie hier verwendet, wird die Expression von skelettmuskel-spezifischen Faktoren mit Hilfe von Immunfärbung gemessen. Im Speziellen wurde der Anteil von Skelettmyoblasten und Skelettmyotuben (Expression der Marker Aktinin, Myogenin, MyoD) sowie Satellitenzellen (Expression des Markers PAX7) in vier unabhängigen pluripotenten Stammzelllinien bestimmt (iPSC (WT 1), iPSC (WT 2), DMD iPSC, korrigierte DMD iPSC) ( ). Der Anteil der Aktinin-positiven Zellen betrug zwischen 71 und 77.6% in den vier Zellinien; der Anteil der Myogenin-positiven Zellen betrug zwischen 41.4% und 60.4% in den vier Zellinien; der Anteil der MyoD-positiven Zellen betrug zwischen 40% und 54.1% in den vier Zellinien; der Anteil der PAX7-positiven Zellen betrug zwischen 33.4% und 43.8% in den vier Zellinien ( ).
  • Auch die Durchflusszytometrie zeigt, dass die analysierten Zellen Skelettmyoblasten- und Skelettmyotuben-spezifische sowie Satellitenzellen-spezifische Marker in hoher Reinheit erzeugt wurden (>70% Aktinin-positive und >30% PAX7 positive Myozyten).
  • Somit wurde mit drei unterschiedlichen Methoden gemessen, dass die pluripotenten Stammzellen in einen skelettmyoblasthaltigen Zellpool differenziert wurden und somit die mesodermale Induktion, die myogene Spezifikation und die myogene Maturation durchlaufen haben.
  • Materialen und Methoden
  • Folgende pluripotente Stammzelllinien wurden verwendet: TC1133 (iPSC WT1; Baghbaderani et al. Stem Cell Reports 2015), iPSC WT2, DMD iPSC (DMD Del; Long et al. Sci Adv 2018), korrigierte DMD iPSC (Long et al. Sci Adv 2018). Bei der Stammzelllinie DMD iPSCs ist das X-chromosomale Dystrophin Gen (DMD) mutiert, das bei der Krankheit Muskeldystrophie Duchenne (DMD) ebenfalls mutiert ist und die Krankheit verursacht.
  • Für die Herstellung von Matrigel beschichteten Zellkulturplatten wurde BD Matrigel (Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced) in einem Verhältnis von 1:30 in eiskaltem PBS verdünnt und umgehend bei 4°C gelagert. Um Matrigel-beschichtete Platten vorzubereiten, wurde eine 1:120 Matrigel-Verdünnung mit eiskaltem PBS hergestellt. 0.1 ml/cm2 der Verdünnung wurde in die Zellkulturflaschen gegeben. Die Flaschen wurden mindestens über Nacht und maximal für 2 Wochen bei 4°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Platten mindestens für eine halbe Stunde in den 37°C Inkubator gestellt.
  • Für das Passagieren (z.B. zum Ablösen der Zellen für die Kryopräservation) wurden die Zellen einmal mit 3 ml TrypLE (Invitrogen) gewaschen, gefolgt von einer Inkubation in 5ml TrypLE für ungefähr 7 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wurde das TrypLE ausgewaschen und die Verdauung wurde mit 10 ml N2-HK Medium mit 5uM Rock Inhibitor gestoppt. Um Klumpen auszulösen, wurden die Zellsuspension mit Hilfe einer 10 ml-Pipette pipettiert. Die Abtrennung der Zellen muss behutsam genug sein, um die Zellviabilität nicht zu verringern. Die Zellen wurden mit Hilfe eine CASY Zählers gezählt (durch Zugabe von 20 µl der Zellsuspension in 10 ml CASY Puffer). Zellen wurden bei 100 × g für 10 min bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde entnommen und das Pellet wurde behutsam in N2-HK Medium mit 5uM Rock Inhibitor resuspendiert. Die Zellen wurden auf Matrigel-beschichteten Platten bei einer Dichte von 60-70 000 Zellen/cm2 in N2-HK Medium mit 5 µM Rock Inhibitor ausplattiert. Ab dem nächsten Tag wurde an jedem zweiten Tag das N2-HK Medium für 9 Tage ausgewechselt.
  • Für das Einfrieren von Zellen (z.B. an Tag 21, Kryopräservation) wurden die Zellen einmal mit 3 ml TrypLE (Invitrogen) gewaschen und dann in 5 ml TrypLE für ungefähr 7 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde das TrypLE ausgewaschen und die Verdauung wurde mit 10 ml N2-HK Medium mit 5 µM Rock Inhibitor gestoppt. Um Klumpen auszulösen, wurden die Zellsuspension mit Hilfe einer 10 ml-Pipette pipettiert. Die Abtrennung der Zellen muss behutsam genug sein, um die Zellviabilität nicht zu verringern. Die Zellen wurden mit Hilfe eine CASY Zählers gezählt (durch Zugabe von 20 µl der Zellsuspension in 10 ml CASY Puffer). Zellen wurden bei 100 x g für 10 min bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde entnommen und das Pellet wurde behutsam in N2-HK Medium mit 5 µM Rock Inhibitor und 10% DMSO (Sigma) bei 4°C resuspendiert. 10 × 106 Zellen wurden in 2 ml pro Kryovial mit Hilfe von Mr Frosty (Thermo) über Nacht bei -80 °C eingefroren. Danach wurden die Zellen auf -150 °C transferiert.
  • Für die RNA-Extraktion wurden in Trizol-Reagenz (Thermo Fisher) eingebettete Zelllysate durch Verwirbelung homogenisiert. Pro 1 ml Trizol-Reagenz wurden 200 µl Chloroform hinzugefügt (AppliChem). Reagenzgefäße wurden fest geschlossen und fünfmal umgedreht gefolgt von 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur. Die Proben wurden dann bei 10,000-12,000 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Phase, die RNA enthält, wurde in frische Reagenzgefäße überführt, gefolgt von dem Hinzufügen von 500 µl Isopropanol (Roth), um die RNA zu präzipitieren. Die Reagenzgefäße wurden verwirbelt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach für weitere 10 Minuten bei 12,000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und 1 ml 70% EtOH/Diethylpyrocarbonate (DEPC) H2O wurde hinzugegeben, um das Pellet zu waschen. Nach vorsichtigem Antippen des Reagenzgefäßes, um das Pellet zu lösen und zu waschen, wurden die Proben ein weiteres Mal für 5 Minuten bei 12,000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde abgenommen. Die Pellets wurden 5-10 Minuten offen stehen gelassen, bis die restliche Flüssigkeit verdunstet war, und die RNA wurde in DEPC H2O resuspendiert. Die RNA-Konzentration und Qualität wurde unter Verwendung eines Nanodrop ND-1000 bestimmt. Vor der Sequenzierung wurden die Qualität und RNA-Integrität mit dem Fragment Analyzer von Advanced Analytical weiter analysiert (Standard Sensitivität RNA-Analyse Kit (DNF-471)). Die Generierung von RNA-Seq-Bibliotheken erfolgte unter Verwendung eines modifizierten strangspezifischen, massivparallelen cDNA-Sequenzierungsprotokolls (RNA-Seq) (Illumina: TruSeq Stranded Total RNA (Cat. No. RS-122-2301)). Das Protokoll wurde optimiert, um den rRNA-Gehalt im Datensatz unter 5% zu halten (RiboMinus™ Technologie). Das restliche gesamte Transkriptom RiboMinus™ RNA ist für die direkte Sequenzierung geeignet. Der Ligationsschritt wurde optimiert, um die Ligationseffizienz zu erhöhen (>94%), und die PCR-Protokolle wurden für ein optimales Endprodukt der Bibliothek angepasst. Für die genaue Quantifizierung von cDNA-Bibliotheken, einem fluorometrisch basierten System, wurde das quantiFluor™dsDNA System von Promega verwendet. Die Größe der endgültigen cDNA-Bibliotheken wurde mit dem dsD-NA 905 Reagent Kit (Fragment Analyzer von Advanced Bioanalytical) bestimmt, wobei die Größe durchschnittlich 300 bp aufweist.
  • Die Bibliotheken wurden auf einem Illumina HiSeq 4000 (Illumina) gepoolt (zusammengeführt) und sequenziert und erzeugten 50 bp Single-End-Reads (30-40× 10^6 Reads/Sample). Sequenzbilder wurden mit der Illumina-Software BaseCaller in BCL-Dateien umgewandelt, die mit bcl2fastq v2.17.1.14 zu fastq-Dateien demultiplext wurden. Die Qualität wurde mit FastQC Version 0.11.5 (Andrews, 2014) evaluiert. Sequenzreads wurden der Humangenom-Referenzbibliothek zugeordnet (UCSC-Version hg19 mit Bowtie 2.0 (Langmead und Salzberg, 2012)). Dann wurde die Anzahl der abgebildeten Reads für jedes identifizierte Gen gezählt und die Software DESeq2 wurde zur Beurteilung der differentiellen Genexpression verwendet (Anders und Huber, 2010). Die Reads pro Kilobase Transkript pro Million (RPKM) wurden auf der Grundlage der Ensembl-Transkriptlänge berechnet, die von biomaRt (v2.24) extrahiert wurde.
  • Für die Durchflusszytometrie wurden Einzelzellensuspensionen durch Verdauung der Zellen mit TrypLE Select (Thermo Fisher) hergestellt. Die Zellen wurden in Kulturmedium resuspendiert, 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert und in 4% Formalin fixiert (Histofix, Roth). Nach der Fixierung wurden die Zellen erneut zentrifugiert und im Blockpuffer resuspendiert (PBS mit 1 mg/ml BSA (Sigma-Aldrich), 5% FCS (Thermo Fisher) und 0,1% Triton 100X (Sigma)). Nach 10 Minuten des Blockierens wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und im Blockpuffer mit primären Antikörpern (sarkomerisches α-Aktinin 1:4,000 (Sigma- Aldrich); Pax7 1:50 (DSHB); MyoD 1:100 (DAKO); Myogenin 1:50 (DSHB)) oder entsprechende IgG1-Isotypkontrolle für 45 min bei 4°C resuspendiert.
  • Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt in Blockpuffer und anschließender Inkubation in sekundärem Antikörper (1:1000 Anti-Maus 488 [A-11001] oder 633 [A-21052], Thermo Fisher) und Hoechst (10 ng/ml; Thermo Fisher) für 30 Minuten bei 4°C. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und schließlich in PBS zur Analyse resuspendiert. Pro Probe wurden 10 000 lebende Zellereignisse analysiert. Die Messungen wurden an einem LSRII SORP-Zytometer durchgeführt und mit der DIVA-Software (BD Biosciences) analysiert.
  • Beispiel 2: Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus Skelettmyoblasten und Satellitenzellen, die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet wurden (Zellen aus Beispiel 1) (engl.: Engineered Skeletal Muscle, ESM)
  • Für den Aufbau von künstlichem Skelettmuskelgewebe wurden die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen (Zellen von Tag 21) als Ausgangsmaterial verwendet und mit einer extrazellulären Matrix gemischt. Durch das Mischen mit einer extrazellulären Matrix werden die Zellen in eine Matrix dispergiert, um ein dreidimensionales Skelettmuskelgewebe zu erzeugen. Auch dieses Verfahren ist serumfrei und transgenfrei. Somit wird die Reproduzierbarkeit zum Herstellen von Skelettmuskelgewebe erhöht, da alle benötigten Substanzen und deren Konzentration definiert wurden. Durch dieses Verfahren kann ein krafterzeugendes Skelettmuskelgewebe erzeugt werden, das in Antwort auf einen elektrischen Stimulus kontrolliert kontrahiert. Es wird eine bestimmte zeitliche Abfolge von Wirkstoffen und physikalischen Reizen eingesetzt, die in der schematisch dargestellt und im Folgenden detailliert beschrieben sind.
  • Um das künstliche Skelettmuskelgewebe aufzubauen wurde die Zellen aus Beispiel 1 (Zellen von Tag 21) mit einer extrazelluläre Matrix gemischt und in Ringformen gegossen, um die Selbstorganisation der Zellen in einen kontraktilen Skelettmuskel zu unterstützen. Das bedeutet, dass die Zellen entweder (a) aus einer differenzierten Zellkultur nach Beispiel 1 dissoziiert wurde oder (b) eingefrorene Zellen aus Beispiel 1 verwendet wurden. (Detaillierte Beschreibung zum Auftauen von Zellen siehe unten).
  • Um die Zellen aus Beispiel 1 mit der extrazellulären Matrix zu mischen wurde ein Mastermix in einem 50 ml Reaktionsgefäß auf Eis gemischt. Eine 2 ml Pipette wurde zum Hinzufügen des Kollagens verwendet. Folgende exakte Pipettierfolge wurde eingehalten:
    ESM Anzahl (250 µl pro ESM) 4 8 16
    Alle Volumen sind in µl angegeben
    Bovines Kollaqen (6.5 mg/ml) 144 288 575
    2xDMEM Serumfrei 144 288 575
    NaOH 0.1 N 27 55 109
    Matrigel 100 200 400
    Zellsuspensionsvolumen 630 1260 2545
    Zellzahl (×106) 5 10 20
    Gesamtes Volumen 1050 2100 4200
  • Alternativ wurde der Mastermix nach folgenden Volumina pipettiert:
    ESM Anzahl (180 µl pro ESM) 1 8 48
    Alle Volumen sind in µl angegeben
    Bovines Kollagen (6.84 mg/ml) 35 280 1680
    2xDMEM Serumfrei 35 280 1680
    NaOH 0.1 N 5 40 240
    Matriqel 19 152 912
    Zellsuspensionsvolumen 100 800 4800
    Zellzahl (×106) 1 8 48
    Gesamtes Volumen 194 1552 9312
    Der Mastermix wurde in die Ringformen gegossen und die Ringformen wurden vorsichtig in einen Inkubator überführt, um das Gemisch für 1 Stunde bei 37°C ruhen zu lassen. Nach der Inkubationszeit wurden vorsichtig 8 ml Expansionsmedium mit 5 µM Rock Inhibitor pro Form hinzugefügt ( , Bild links). Expansionsmedium (N2-HK Medium): DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% serumfreier Zusatz N-2 (Thermo Scientific), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA, Invitrogen), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Invitrogen), 10 ng/ml rekombinates HGF (Peprotech), 10% Knockout serum replacement (Life Technologies).
  • Die Zellen wurden so für 7 Tage in Expansionsmedium kultiviert. An den Tagen 1, 3 und 5 wurde das Medium durch frisches Expansionsmedium (N2-HK Medium; ohne Rock Inhibitor) ersetzt. Nach dem Gießen komprimierte sich das Gemisch in der Ringform, sodass das Gemisch nach 24 Stunden vollständig komprimiert war.
  • Nach 7 Tagen wurden die geformten Ringe auf Dehnapparturen in 6-Well-Platten überführt ( , Bild in der Mitte). Somit wurden die Zellen unter einem physikalischen Stimulus, d.h. einer mechanischen Dehnung, weiterkultiviert. Außerdem wurde die Maturierung der Zellen durch Maturierungsmedium induziert, indem 5 ml Maturierungsmedium pro Well hinzugefügt wurden. Maturierungsmedium: DMEM mit 1 g/l Glukose und L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMAX™) ergänzt mit Pyruvat (Gibco), 1% Pen/Strep (Invitrogen), 1% N serumfreier Zusatz N-2 (Thermo Scientific), 2% B27 serumfreier Zusatz (Invitrogen).
  • Um die Zellen in Skelettmyotuben und Satellitenzellen zu maturieren, wurde das Maturierungsmedium an jedem zweiten Tag der darauffolgenden 6 Wochen der Maturierung gewechselt.
  • Um die Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe experimentell zu testen, wurde das erzeugte Skelettmuskelgewebe mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Das charakteristische Streifenmuster belegt, dass sich multinukleäre Skelettmuskelfasern ausgebildet haben, um einen krafterzeugenden Skelettmuskel zu erzeugen. Die Erfinder haben das Strukturprotein Aktin des eukaryotischen Zytoskeletts mithilfe einer Immunfärbung sichtbar gemacht und die DNA in den Zellkernen wurde mit dem Farbstoff DAPI eingefärbt. Die Fluoreszenzbilder zeigen das charakteristische Streifenmuster, was belegt, dass multinukleäre, reife Skelettmuskelfasern durch das Verfahren ausgebildet wurden ( . Durch die Immunfärbung wurde gezeigt, dass das künstliche Skelettmuskelgewebe die Architektur von reifen multinukleären Muskelfasern aufweist.
  • Um darüber hinaus das künstlich erzeugte Muskelgewebe auch funktionell zu testen, haben die Erfinder Kontraktionsexperimente durchgeführt ( , Bild rechts). Diese Kontraktionsexperimente in Organbädern messen die Kontraktionsfrequenz und die Kontraktionskraft des hergestellten Skelettmuskelgewebes in Antwort of elektrische Stimulation. Dazu wurde das Skelettmuskelgewebe in Form eines Ringes isometrisch in Organbädern (Föhr Medical Instruments) mit Tyrode-Lösung (in mmol/L: 120 NaCI, 1 MgCl2, 1,8 CaCI2, 5,4 KCI, 22,6 NaHCO3, 4,2 NaH2PO4, 5,6 Glucose und 0,56 Ascorbat) bei 37°C und kontinuierlicher Begasung mit 5% CO2 und 95% O2 überführt. Die ESMs wurden im Abstand von 125 µm mechanisch gedehnt, bis die maximale Kraftamplitude (Kontraktionskraft; engl.: force of contraction=FOC) beobachtet wurde. Die FOC-Messungen wurden bei elektrischen Feld-Stimulationsfrequenzen im Bereich von 1-100 Hz (4 ms Rechteckimpulse; 200 mA) durchgeführt.
  • Die Ergebnisse der Kontraktionsexperimente sind in und dargestellt. zeigt repräsentative Kontraktionskraftkurven des künstlichen Skelettmuskelgewebes bei unterschiedlichen Stimulationsfrequenzen. Bei einer Stimulation von 1 Hz (Strichlinie) wurden acht Einzelkontraktionen mit einer einzelnen Dauer von ungefähr 0.5 Sekunden aufgezeichnet; bei einer Stimulation von 10 Hz (durgezogene Linie) wurde ein beginnender Tetanus gemessen und bei einer Stimulation von 100 Hz (Strichpunktlinie) wurde ein voll ausgebildeter Tetanus festgestellt. zeigt die Kontraktionskraft des künstlichen Skelettmuskelgewebes in Abhängigkeit der Stimulusfrequenz. Die Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) wurde in Millinewton (mN) des Skelettmuskelgewebes in Abhängigkeit der elektrischen Stimulationsfrequenz (n=3) gemessen. Bei einem Stimulus von 1 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.5 Millinewton; bei einem Stimulus von 10 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.9 Millinewton; bei einem Stimulus von 20 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.1 Millinewton; bei einem Stimulus von 40 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.4 Millinewton; bei einem Stimulus von 60 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.55 Millinewton; bei einem Stimulus von 80 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 1.6 Millinewton; bei einem Stimulus von 100 Hz beträgt die Kontraktionskraft im Durchschnitt 2.1 Millinewton.
  • Die getesteten Skelettmuskelgewebe zeigten eine reproduzierbare Kontraktionsfrequenz und Kontraktionskraft in Antwort auf Stimulationsfrequenzen zwischen 1 Hz und 100 Hz. Bei einer Einzelstimulation von 1 Hz dauerte eine Kontraktion und vollständige Relaxation ungefähr 0.5 Sekunden. Da die Kontraktions- und Relaxationszeit ungefähr 0.5 Sekunden dauert, wurde bei höheren Stimulationsfrequenzen ein beginnender oder vollständiger Tetanus aufgezeichnet. Auch in natürlichen Skelettmuskelgebeweben wird bei einer erhöhten Stimulationsfrequenz ein Tetanus ausgebildet, sodass sich das künstliche Skelettmuskelgewebe in dieser Hinsicht analog zu natürlichem Skelettmuskelgewebe verhält. Des Weiteren konnten die Erfinder zeigen, dass die Kontraktionskraft des Muskelgewebes mit zunehmender Kontraktionsfrequenz steigt. Diese Eigenschaften sind im Einklang mit nativem Skelettmuskelgewebe, das auch Einzelkontraktionen und tetanische Kontraktionen sowie eine positive Kraft-Frequenz-Verhältnis als Reaktion auf elektrische Stimulation zeigt. Im Unterschied zu dem künstlichen Skelettmuskelgewebe werden bei natürlichen Muskelgeweben die elektrischen Impulse durch einen Neurotransmitterstimulus (Acetylcholin) der motorischen Endplatte ausgelöst.
  • Somit wurde durch das beschriebene Verfahren ein künstliches Muskelgewebe erzeugt, das eine charakteristische Ausbildung von multinukeären Muskelfasern (Myotuben) zeigt und das in Antwort auf elektrische Stimulation Kraft erzeugt.
  • Materialen und Methoden
  • Für das Dissoziieren der Zellen aus einer Zellkultur (Volumenangaben für eine T75 Zellkulturflasche) wurden die Zellen einmal mit 3 ml TrypLE (Invitrogen) gewaschen und dann in 5 ml TrypLE für ungefähr 7 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das TrypLE wurde ausgewaschen und der Verdau mit 10 ml Expansionsmedium mit 5 µM Rock Inhibitor gestoppt. Um Klumpen auszulösen, wurden die Zellsuspension mit Hilfe einer 10 ml-Pipette trituriert. Die Abtrennung der Zellen muss behutsam genug sein, um die Zellviabilität nicht zu verringern. Die Zellen wurden mit Hilfe eine CASY Zählers gezählt (durch Zugabe von 20 µl der Zellsuspension in 10 ml CASY Puffer). Die Zellen wurden bei 100 × g für 10 min bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde entnommen und das Pellet wurde behutsam im entsprechenden Volumen von Expansionsmedium mit 5 µM Rock Inhibitor resuspendiert, anhängig von der Anzahl der ESMs (siehe Mastermix). Die Zellsuspension wurde auf Eis gestellt.
  • Für das Auftauen von Zellen wurde ein Vial aus dem -152 °C Gefrierschrank entnommen. Die Zellen wurden schnell in einem Wasserbad bei 37°C für 2 Minuten aufgetaut. Das Vial wurde mit Alkohol eingesprüht und unter die Zellkulturhaube transferiert. Der Inhalt des Cryovials wurde mit Hilfe einer 2 ml serologischen Pipette in ein 15 ml-Reaktionsgefäß überführt. Das Cryovial wurde mit 1 ml Expansionsmedium bei Raumtemperatur mit 5 µM Rock Inhibitor gewaschen und das Expansionsmedium wurde tröpfchenweise zu den Zellen hinzugegeben, um einen osmotischen Schock zu vermeiden. Weitere 8 ml Expansionsmedium mit 5 µM Rock Inhibitor wurden langsam hinzugegeben. Die Suspension wurde nicht mehr als zweimal vor der Zellzählung auf- und abpipettiert, um eine Zellschädigung zu vermeiden. Die Zellen wurden mit Hilfe eine CASY Zählers gezählt (durch Zugabe von 20 µl der Zellsuspension in 10 ml CASY Puffer). Die Zellen wurden bei 100 × g für 10 min bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde entnommen, und das Pellet wurde behutsam im entsprechenden Volumen von Expansionsmedium mit 5 µM Rock Inhibitor resuspendiert, abhängig von der Anzahl der ESMs wurde ein definiertes Volumen der Zellsuspension vorbereitet (siehe Mastermix). Die Zellsuspension wurde auf Eis gestellt.
  • Beispiel 3: Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen (engl.: Bioengineered Skeletal Muscle, BSM)
  • Für den Aufbau von künstlichem Skelettmuskelgewebe (BSM) werden in diesem Beispiel pluripotenten Stammzellen und eine extrazelluläre Matrix verwendet. Im Unterschied zu Beispiel 1 und 2 fand beim Herstellen von BSM kein Übergang von Matrigel beschichteten Zellkulturplatten zu einer extrazellulären Matrix statt. Anstatt dessen wurden humane induzierte pluripotente Stammzellen direkt in eine definierte extrazelluläre Matrix dispergiert/eingebettet. Die Selbstorganisation von pluripotenten Stammzellen zu einem Skelettmuskelgewebe wurde in der extrazellulären Matrix in Gegenwart von chemischen und physikalischen Stimuli unterstützt. Auch dieses Verfahren ist serumfrei und transgenfrei, sodass alle benötigten Substanzen und deren Konzentration definiert waren. Somit wurde die Differenzierung und Maturierung der humanen pluripotenten Stammzellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen (Skelettmuskelfasern) gesteuert.
  • Das Schema des Differenzierungsprotokolls ist in abgebildet und zeigt die Abfolge der unterschiedlichen Wirkstoffe, die dem Medium beigemischt werden, sowie die physikalische Stimulierung auf Dehnapparturen. Während des in dargestellten Verfahrens wurde die Mesodermdifferenzierung induziert (Tag 0-4), die myogenen Spezifikation induziert (Tag 4-12), die Zellen zu Skelettmyoblasten und Satellitenzellen maturiert (Tag 12-21) und schließlich in Skelettmyotuben und Satellitenzellen maturiert (Tag 21-50).
  • Um das Verfahren durchzuführen wurden die induzierten pluripotenten Stammzellen am Vortag aus einer Zellkultur dissoziiert, gezählt und das Pellet behutsam in einem angemessenen Volumen von Medium (iPS-Brew XF mit 5 uM Rock Inhibitor, 10% KO serum replacement (Life Technologies) mit 10 ng/ml bFGF (Peptrotech)) resuspendiert. Die Stammzellen wurden als Zellsuspension auf Eis gestellt.
  • Um die humanen pluripotenten Stammzellen mit Kollagen/Matrigel zu mischen und in Ringformen zu gießen, wurden der Mastermix in einem 50 ml Reaktionsgefäß auf Eis gemischt. Eine 2 ml Pipette wurde zum Hinzufügen des Kollagens verwendet und folgende exakte Pipettierfolge wurde eingehalten.
    BSM Anzahl (180 µl pro BSM) 4
    Alle Volumen sind in µl angegeben
    Bovines Kollaqen (6.5 mg/ml) 125
    2xDMEM Serum-frei 125
    NaOH 0.1 N 24
    Matriqel 96
    Zellsuspensionsvolumen 448
    Zellzahl (×106) 3.2
    Gesamtes Volumen 818
  • Der Mastermix wurde in die Ringformen gegossen. Die Ringformen wurden vorsichtig in einen Inkubator überführt, um das Gemisch für 1 Stunde bei 37°C ruhen zu lassen. Nach der Inkubationszeit wurden vorsichtig 8 ml Medium pro Form (iPS-Brew XF mit 5 µM Rock Inhibitor, 10% KO serum replacement (Life Technologies) mit 10 ng/ml bFGF (Peptrotech)) hinzugefügt.
  • Durch das Kultivieren in N2-FCL Medium wurde die Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen induziert. 24 Stunden nach dem Gießen wurde das Medium durch N2-FCL-Medium ersetzt. An den Tagen 1, 2 und 3 wurde das Medium täglich durch frisches N2-FCL-Medium ersetzt. (Zusammensetzung siehe Beispiel 1).
  • Durch das Kultivieren in den Medien N2-FD, N2-FHD und N2-HKD wurde die myogene Spezifikation induziert. An den Tagen 4 und 5 wurde das Medium durch N2-FD Medium ersetzt und täglich gewechselt (Zusammensetzung siehe Beispiel 1). An den Tagen 6 und 7 wurde das Medium durch N2-FHD Medium ersetzt und täglich gewechselt. (Zusammensetzung siehe Beispiel 1). An den Tagen 8, 9, 10 und 11 wurde das Medium durch N2-HKD Medium ersetzt und täglich gewechselt (Zusammensetzung siehe Beispiel 1).
  • An den Tagen 12 bis 20 wurde das Medium durch N2-HK Medium (Expansionsmedium) ersetzt und jeden zweiten Tag gewechselt (Zusammensetzung siehe Beispiel 1). Durch das Kultivieren in Expansionsmedium wurden die Zellen zu Skelettmyoblasten maturiert.
  • An Tag 21 wurden die geformten Ringe auf Dehnapparaturen in 6-Well-Platten überführt und unter Maturierungsbedingungen weiterkultiviert. Somit wurden die Zellen unter einem physikalischen Stimulus, d.h. einer mechanischen Dehnung, weiterkultiviert. Außerdem wurde die Maturierung der Zellen durch Maturierungsmedium induziert, indem 5 ml Maturierungsmedium pro Well hinzugefügt wurden (Zusammensetzung des Maturierungsmedium siehe Beispiel 2). Um die Zellen in Skelettmyotuben und Satellitenzellen zu maturieren, wurde das Maturierungsmedium an jedem zweiten Tag der darauffolgenden 4 Wochen der Maturierung gewechselt.
  • Um die Herstellung von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen experimentell zu testen, wurde das erzeugte Skelettmuskelgewebe, wie in Beispiel 2, mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wie in Beispiel 2 wurde das Strukturprotein Aktin des eukaryotischen Zytoskeletts mithilfe einer Immunfärbung sichtbar gemacht und die DNA in den Zellkernen wurde mit dem Farbstoff DAPI eingefärbt. Die Fluoreszenzbilder zeigten, wie in Beispiel 2, das charakteristische Streifenmuster, was die Ausbildung von multinukleäre, reife Skelettmuskelfasern zeigt ( . Somit weist auch das BSM multinukleäre reife Skelettmuskelfasern auf, die durch das Verfahren ausgebildet wurden.
  • Um darüber hinaus das künstlich erzeugte Muskelgewebe auch funktionell zu testen, haben die Erfinder Kontraktionsexperimente, wie in Beispiel 2, durchgeführt. Diese Kontraktionsexperimente in Organbädern messen die Kontraktionsfrequenz und die Kontraktionskraft des hergestellten Skelettmuskelgewebes in Antwort of elektrische Stimulation.
  • Die Ergebnisse der Kontraktionsexperimente sind in und dargestellt. zeigt repräsentative Kontraktionskraftkurven des künstlichen Skelettmuskelgewebes bei unterschiedlichen Stimulusfrequenzen. Bei einer Stimulation von 1 Hz (Strichlinie) wurden acht Einzelkontraktionen mit einer einzelnen Dauer von ungefähr 0,5 Sekunden aufgezeichnet; bei einer Stimulation von 100 Hz (durgezogene Linie) wurde ein voll ausgebildeter Tetanus festgestellt. zeigt die Kontraktionskraft des künstlichen Skelettmuskelgewebes in Abhängigkeit der Stimulusfrequenz. Die Kontraktionskraft („Force of contraction, FOC“) wurde in Millinewton (mN) des Skelettmuskelgewebes (n=3) gemessen. Bei einem Stimulus von 1 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.3 Millinewton; bei einem Stimulus von 10 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.5 Millinewton; bei einem Stimulus von 20 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.55 Millinewton; bei einem Stimulus von 40 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.6 Millinewton; bei einem Stimulus von 60 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.65 Millinewton; bei einem Stimulus von 80 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.72 Millinewton; bei einem Stimulus von 100 Hz betrug die Kontraktionskraft im Durchschnitt 0.9 Millinewton.
  • Diese Kontraktionsexperimente zeigen, dass auch das BSM in Antwort auf elektrische Stimulation Kraft erzeugt. Die getesteten Skelettmuskelgewebe zeigten eine reproduzierbare Kontraktionsfrequenz und Kontraktionskraft in Antwort auf Stimulationsfrequenzen zwischen 1 Hz und 100 Hz und die Kontraktions- und Relaxationszeit nach einem Einzelstimulus betrug ungefähr 0.6 Sekunden. Darüber hinaus zeigen das ESM und das BSM gleiche Eigenschaften in Bezug auf Tetanusausbildung und Steigerung der Kontraktionskraft. Wie auch das in Beispiel 2 beschriebene ESM, bildet das BSM bei einer erhöhten Stimulationsfrequenz, wie z.B. 100 Hz, einen Tetanus aus. Ebenfalls wie in Beispiel 2, steigt die Kontraktionskraft des BSM bei steigender Stimulusfrequenz.
  • Beide Eigenschaften sind analog zu einem Kontraktionsverhalten zu natürlichem Muskelgewebe, da in natürlichen Skelettmuskeln ebenfalls bei einer erhöhten Häufigkeit der Stimulation ein Tetanus ausgebildet wird und die Kontraktionskraft steigt. Ähnlich wie natürliche Skelettmuskeln zeigten die künstlichen Skelettmuskelgewebe Einzelkontraktionen und tetanische Kontraktionen sowie eine positive Kraft-Frequenz-Beziehung als Reaktion auf elektrische Stimulation.
  • Somit verhalten sich künstlichen Skelettmuskelgewebe aus Beispiel 2 und 3 (ESM und BSM) in Antwort auf elektrische Stimulation analog zu natürlichem Skelettmuskelgewebe.
  • Verwendete Materialen in allen Beispielen
  • Die hierin verwendeten Materialen sind im Handel erhältlich, soweit nicht anders angegeben. So sind beispielsweise Penicillin/Streptomycin, B27-serumfreier Zusatz, essentielle Aminosäuren (MEM-NEAA) und 2-Mercaptoethanol von Invitrogen erhältlich. Der Name der Firma ist bei den verwendeten Materialen jeweils angegeben.
  • Die Stammlösungen der N2- und B27- serumfreien Zusatzlösungen wurden bei -20 °C gelagert. Wenn sie einmal aufgetaut wurden, wurden sie zum Medium hinzugegeben und maximal eine Woche bei 4°C gelagert. Die Knockout Serum Replacement-Stammlösungen wurden auch bei -20 °C gelagert. Wenn sie einmal aufgetaut wurden, wurden sie maximal zwei Wochen bei 4°C gelagert. Die LDN193189-Stammlösung hatte eine Konzentration von 10 mM in DMSO und wurde bei -20 °C gelagert. Die DAPT-Stammlösung hatte eine Konzentration von 20 mM in DMSO und wurde bei -20 °C gelagert. Die bFGF-Stammlösung hatte eine Konzentration von 10 µg/ml in PBS mit 0.1 % humanes rekombinantes Albumin und wurde bei -20 °C gelagert. Die HGF-Stammlösung hatte eine Konzentration von 10 µg/ml in PBS mit 0.1 % humanes rekombinantes Albumin und wurde bei -20 °C gelagert. Der Rock-Inhibitor hatte eine Konzentration von 10 mM in DMSO und wurde bei -20 °C gelagert.
  • Wenn die Stammlösungen der Wachstumsfaktoren und kleinen Moleküle einmal aufgetaut wurden, wurden sie maximal eine Wochen bei 4°C gelagert. Tabelle 1: Zusammensetzung des serumfreien Zusatzes N-2 in 100x wirksamer Konzentration (flüssige Form), d.h. 1% (v/v) entspricht einer einfachen (1x) wirksamen Konzentration
    Bestandteile Molekulargewicht Konzentration (µg/ml) Konzentration (mM)
    Humanes Transferrin (Holo) 10000.0 10000.0 1.0
    Insulin, rekombinante Vollkette 5807.7 500.0 0.0860926
    Progesteron 314.47 0.63 0.0020033708
    Putrescin 161.0 1611.0 10.006211
    Selenit 173.0 0.52 0.0030057803
    Tabelle 2: Zusammensetzung der Nicht-essentielle Aminosäuren in 100x wirksamer Konzentration 1x
    Bestandteile Molekulargewicht Konzentration (mg/L) Konzentration (mM)
    Glycin 75.0 750.0 10.0
    L-Alanin 89.0 890.0 10.0
    L-Asparagin 132.0 1320.0 10.0
    L-Asparaginsäure 133.0 1330.0 10.0
    L-Glutaminsäure 147.0 1470.0 10.0
    L-Prolin 115.0 1150.0 10.0
    L-Serin 105.0 1050.0 10.0
    Tabelle 3: DMEM, niedriger Glukosegehalt mit 1 g/l, GlutaMAX™, ergänzt mit Pyruvat (Gibco, Katalognummer: 10567014)
    Bestandteile Molekulargewicht Konzentration (mg/L) Konzentration (mM)
    Aminosäuren
    Glycin 75.0 30.0 0.4
    L-Alanyl-Glutamin 217.0 862.0 3.9723501
    L-Arginin-Hydrochlorid 211.0 84.0 0.39810428
    L-Cystin 313.0 48.0 0.15335463
    L-Histidin-Hydrochloride-H2O 210.0 42.0 0.2
    L-Isoleucin 131.0 105.0 0.8015267
    L-Leucin 131.0 105.0 0.8015267
    L-Lysin-Hydrochloride 183.0 146.0 0.7978142
    L-Methionin 149.0 30.0 0.20134228
    L-Phenylalanin 165.0 66.0 0.4
    L-Serin 105.0 42.0 0.4
    L-Threonin 119.0 95.0 0.79831934
    L-Tryptophan 204.0 16.0 0.078431375
    L-Tyrosin 181.0 72.0 0.39779004
    L-Valin 117.0 94.0 0.8034188
    Vitamine
    Cholinchlorid 140.0 4.0 0.028571429
    D-Kalziumpantothenat 477.0 4.0 0.008385744
    Folsäure 441.0 4.0 0.009070295
    Niacinamid 122.0 4.0 0.032786883
    Pyridoxinhydrochlorid 206.0 4.0 0.019417476
    Riboflavin 376.0 0.4 0.0010638298
    Thiaminhydrochlorid 337.0 4.0 0.011869436
    i-Inositol 180.0 7.2 0.04
    Anorqanische Salze
    Kalziumchlorid (CaCl2·2H2O) 147.0 264.0 1.7959183
    Eisen-III-Nitrat (Fe(NO3)3·9H2O) 404.0 0.1 2.4752476 E-4
    Magnesiumsulfat (MgSO4-7H2O) 246.0 200.0 0.8130081
    Kaliumchlorid (KCl) 75.0 400.0 5.3333335
    Natrium-Bicarbonat (NaHCO3) 84.0 3700.0 44.04762
    Natriumchlorid (NaCl) 58.0 6400.0 110.344826
    Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4-2H2O) 156.0 141.0 0.90384614
    Andere Bestandteile
    D-Glukose (Dextrose) 180.0 1000.0 5.5555553
    Phenol rot 376.4 15.0 0.039851222
    Natriumpyruvat 110.0 110.0 1.0
    Tabelle 4: Zusammensetzung des zusätzlichen serumfreien Zusatzes B27 in 50x wirksamer Konzentration (flüssige Form)Medium entseucht 2% (v/v)
    Bestandteile Konzentration in 50x B27
    µg/ml
    BSA fraction V IgG free Fatty Acid Poor 125000
    Catalase 125
    Glutathion reduziert 50
    Humanes Insulin 156,25
    Superoxid Dismutase 125
    Humanes Holo-Transferin 250
    T3 0,1
    L-carnitin 100
    Ethanolamin 50
    D+-galactose 750
    Putrescin 805
    Natrium-Selenit 0,625
    Corticosterone 1
    Linolsäure 50
    Linolensäure 50
    Progesteron 0,315
    Retinylacetat 5
    DL -alpha tocopherol (Vit E) 50
    DL-alpha tocopherol Acetat 50
    Biotin 125
    Tabelle 5: Zusammensetzung des Knockout Serum Replacement (KSR)
    Substanz Konzentration im Zusatz (µq/ml) Substanz Konzentration im Zusatz (µg/ml)
    Glycin 150 Aq+ 0.0006
    L-Histidin 940 Al3+ 0.0007
    L-Isoleucin 3400 Ba2+ 0.008
    L-Methionin 90 Cd2+ 0.03
    L-Phenylalanin 1800 Cr3+ 0.003
    L-Prolin 4000 Ge4+ 0.003
    L-Hydroxyprolin 100 Se4+ 0.02
    L-Serin 800 Br- 0.004
    L-Threonin 2200 I- 0.0007
    L-Tryptophan 440 Mn2+ 0.0004
    L-Tyrosin 77 F- 0.010
    L-Valin 2400 Si4+ 0.01
    Thiamin 33 V5+ 0.003
    Reduziertes Glutathion 10 Mp6+ 0.006
    Ascorbinsäure -2-PO4 (Mp-Salz) 330 Ni2+ 0.0002
    Transferrin 55 Rb+ 0.005
    Insulin 100 Sn2+ 0.0002
    Natrium-Selenit 0.07 Zr4+ 0.01
    AlbuMAX 83 000
    AqNO3 0.0009 KBr 0.0006
    AlCl3 6H2O 0.006 KI 0.0009
    Ba(C2H3O2)2 0.01 MnCl24H2O 0.002
    CdSO4 8H2O 0.08 NaF 0.02
    CoCl2 6H2O 0.01 Na2SiO3 9H2O 1
    Cr2(SO4)3 1H2O 0.003 NaVO3 0.006
    GeO2 0.003 (NH4)6Mo7O24 4H2O 0.06
    Na2SeP3 0.007 RbCI 0.007
    H2SeO3 0.02 SnCl2 0.0003
    ZrOCl2 8H2O 0.02
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  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
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    • WO 9830679 [0186]
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Claims (78)

  1. Verfahren zum Herstellen von künstlichem Skelettmuskelgewebe aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst; (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR); (iii) Expansion und Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR); (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen, die in einer extrazellulären Matrix dispergiert sind, unter mechanischer Stimulation in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst; dadurch Erzeugen von künstlichem Skelettmuskelgewebe.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pluripotenten Stammzellen Stammzellen aus Primatenursprung, insbesondere humane pluripotente Stammzellen sind; und/oder wobei die pluripotenten Stammzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen, parthenogenetischen Stammzellen, über Kerntransfer hergestellten pluripotenten Stammzellen und über chemische Reprogrammierung hergestellten pluripotente Zellen ausgewählt sind, insbesondere wobei die pluripotenten Stammzellen induzierte pluripotente Stammzellen sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Schritt (i) für 24 bis 132 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 48 bis 120 Stunden, stärker bevorzugt für 60 bis 114 Stunden, noch stärker bevorzugt für 72 bis 108 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 102 Stunden und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-3, wobei in Schritt (i) der GSK3-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, Tideglusib, SB415286, 6-bromoindirubin-3-oxime und einem Valproatsalz, bevorzugt wobei der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist; und /oder wobei in Schritt (i) der SMAD-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus LDN193189, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, ausgewählt ist, bevorzugt wobei der SMAD Inhibitor LDN193189 ist.
  5. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-4, wobei in Schritt (i) die wirksame Menge von FGF2 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder der serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 50-500 µg/ml Transferrin, 1-20 µg/ml Insulin, 0,001-0,1 µg/ml Progesteron, 5-50 µg/ml Putrescin und 6-600 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, in dem Medium bereitstellt, und/oder der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist, und die wirksame Menge 1-20 µM beträgt, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt; und/oder der SMAD-Inhibitor LDN193189 ist, und die wirksame Menge 0,05-5 µM beträgt, bevorzugt 0,1-2,5 µM, stärker bevorzugt 0,2-1 µM, noch stärker bevorzugt 0,25-0,8 µM, noch stärker bevorzugt 0,3-0,75 µM, noch stärker bevorzugt 0,35-0,7 µM, noch stärker bevorzugt 0,4-0,6 µM, noch stärker bevorzugt 0,45-0,55 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 µM beträgt.
  6. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-5, wobei der serumfreie Zusatz in Schritt (i) 0,1-10% (v/v) N2-Zusatz, bevorzugt 0,3-7,5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,5-5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,75%-2% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,9%-1,2% (v/v) N2-Zusatz, und am stärksten bevorzugt etwa 1% (v/v) N2-Zusatz ist.
  7. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-6, wobei das Basalmedium in Schritt (i), Schritt (ii), Schritt (iii) und/oder in Schritt (iv) ausgewählt ist aus DMEM , DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10, Hams F-12, wobei das Basalmedium bevorzugt DMEM ist, insbesondere wobei das Basalmedium mit Pyruvat und/oder nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt ist, und/oder 1 g/l Glukose umfasst.
  8. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-7, wobei in Schritt (ii) die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) dem serumfreien Zusatz für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, (c) dem serumfreien Zusatz und (d) HGF für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) dem serumfreien Zusatz, und (d) Knockout serum replacement (KSR) für 72 bis 120 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 76 bis 114 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 108 Stunden, noch stärker bevorzugt für 90 bis 102 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-8, wobei in Schritt (ii) der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe DAPT, RO4929097, Semagacestat (LY450139), Avagacestat (BMS-708163), Dibenzazepine (YO-01027), LY411575, IMR-1, L685458 , bevorzugt wobei der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist.
  10. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-9, wobei in Schritt (ii) die wirksame Menge von FGF2 15-30 ng/ml beträgt, bevorzugt 17,5-25 ng/ml, stärker bevorzugt 18-22 ng/ml, noch stärker bevorzugt 19-21 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 20 ng/ml beträgt; und/oder die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist, und die wirksame Menge 1-20 µM beträgt, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt; das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
  11. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-10, wobei in Schritt (iii) die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
  12. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-11, wobei in Schritt (iv) der zusätzliche serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 0,5-50 mg/ml Albumin, 1-100 µg/ml Transferrin, 0,1-10 µg/ml Ethanolamin, 17.4-1744 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, 0,4-40 µg/ml L-Carnitin, 0,05-5 µl/ml Fettsäure- Zusatz, 0,0001-0,1 µg/ml Triod-L-Thyronin (T3) in dem Medium bereitstellt.
  13. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-12, wobei der zusätzliche serumfreie Zusatz in Schritt (iv) 0,1-10 % (v/v) B27, bevorzugt 0,5-8 % (v/v), stärker bevorzugt 1-6 % (v/v), sogar stärker bevorzugt 1,5-4% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 2% (v/v) B27 ist.
  14. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-13, wobei in Schritt (iv) die mechanische Stimulation ein statischer Zug, eine dynamische Stimulation oder eine auxotone Stimulation ist, bevorzugt wobei die mechanische Stimulation ein statischer Zug ist.
  15. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-14, das vor Schritt (i) einen Saatschritt umfasst, in dem die pluripotenten Stammzellen in einem Stammzellmedium in der Gegenwart eines ROCK-Inhibitors ausgesät werden, bevorzugt wobei der Saatschritt 18-30 Stunden vor Schritt (i) ausgeführt wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der ROCK-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der ROCK-Inhibitor Y27632 ist und in einer Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet wird; und/oder wobei das Stammzellmedium iPS-Brew XF ist.
  18. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 15-17, wobei die pluripotenten Stammzellen in dem Saatschritt zunächst in der Gegenwart von einem oder mehreren Bestandteilen einer extrazellulären Matrix in einem Mastermix in eine künstliche Form ausgesät werden, bevor das Stammzellmedium hinzugefügt wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Bestandteil einer extrazellulären Matrix in dem Mastermix Kollagen ist, bevorzugt Typ I Kollagen, stärker bevorzugt aus Rinderursprung, humanem Ursprung oder marinem Ursprung, insbesondere Kollagen aus Rinderursprung, gegebenenfalls wobei die extrazelluläre Matrix zusätzlich Laminin und /oder Fibronektin umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die pluripotenten Stammzellen in einem Verhältnis von 1-6 × 106 Zellen/ml und 0,7-1,4 mg/ml Kollagen in Medium ausgesät werden.
  21. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 18-20, wobei der Mastermix 5-15% (v/v) eines Exsudats von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkomzellen als extrazellulären Matrixbestandteil umfasst, bevorzugt 7.5%-12.5% (v/v), stärker bevorzugt 9-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10 % (v/v) umfasst, insbesondere wobei das Exsudat Matrigel ist; und/oder wobei der pH-Wert des Mastermix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
  22. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 18-20, wobei der Mastermix Stromazellen umfasst, wobei die Stromazellen die extrazellulären Matrixbestandteile Kollagene, Laminin, Fibronektin und/oder Proteoglykane erzeugen; und/oder wobei der pH-Wert des Master mix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
  23. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 18-22, wobei das Stammzellmedium nach etwa 1 Stunde zu dem Mastermix in der künstlichen Form hinzugefügt wird, wobei das Stammzellmedium KSR und FGF2 umfasst.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Stammzellmedium 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR umfasst; und/oder wobei das Stammzellmedium 1-15 ng/ml FGF2 umfasst, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml FGF2 umfasst.
  25. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 18-24, wobei Schritt (iii) für 7-11 Tage, bevorzugt für 8-10 Tage, und am stärksten bevorzugt für etwa 9 Tage durchgeführt wird.
  26. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-17, wobei nach Schritt (iii) die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in einem zusätzlichen Schritt vor Schritt (iv) in der Gegenwart von einem oder mehreren Bestandteilen einer extrazellulären Matrix in einem Mastermix in eine künstliche Form ausgesät werden.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Bestandteil einer extrazellulären Matrix in dem Mastermix Kollagen ist, bevorzugt Typ I Kollagen, stärker bevorzugt aus Rinderursprung, humane Ursprung oder marinem Ursprung, insbesondere Kollagen aus Rinderursprung, gegebenenfalls wobei die extrazelluläre Matrix zusätzlich Laminin und/oder Fibronektin umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Skelettmyoblasten und Satellitenzellen in einem Verhältnis von 1-6 × 106 Zellen/ml und 0,7-1,4 mg/ml Kollagen in Medium ausgesät werden.
  29. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 26-28, wobei der Mastermix 5-15% (v/v) eines Exsudats von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkomzellen als extrazellulären Matrixbestandteil umfasst, bevorzugt 7.5%-12.5% (v/v), stärker bevorzugt 9-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10 % (v/v) umfasst, insbesondere wobei das Exsudat Matrigel ist; und/oder wobei der pH-Wert des Mastermix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
  30. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 26-28, wobei der Mastermix Stromazellen umfasst, wobei die Stromazellen die extrazellulären Matrixbestandteile Kollagene, Laminin, Fibronektin und/oder Proteoglykane erzeugen; und/oder wobei der pH-Wert des Master mix pH 7,2 bis pH 7,8 beträgt.
  31. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 26-30, wobei nach etwa einer Stunde ein wie in Schritt (iii) verwendetes Medium zu einem Mastermix in einer künstlichen Form hinzugefügt wird, wobei das Medium zusätzlich eine wirksame Menge eines ROCK-Inhibitors umfasst; insbesondere wobei der ROCK-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der ROCK-Inhibitor Y27632 ist und in einer Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet wird.
  33. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 26-32, wobei nach etwa einem Tag das Medium gegen ein wie in Schritt (iii) verwendetes Medium ausgetauscht wird, und die Zellen anschließend in diesem Medium für weitere 5-9 Tage, bevorzugt 6-8 Tage, am stärksten bevorzugt etwa 7 Tage weiterkultiviert werden.
  34. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 18-33, wobei die künstliche Form die Form eines Ringes, eines Bandes, eines Stranges, eines Flickens, eines Beutels, oder eines Zylinders hat, wobei optional einzelne Skelettmuskelgewebe fusioniert werden.
  35. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-34, wobei Schritt (iv) für mindestens 19 Tage, bevorzugt mindestens 28 Tage, stärker bevorzugt für mindestens 56 Tage durchgeführt wird, noch stärker bevorzugt für mindestens 120 Tage durchgeführt wird und insbesondere für mindestens 240 Tage durchgeführt wird.
  36. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-35, wobei das Verfahren kein differenzierungs- oder maturierungsbezogenes Transgen umfasst, bevorzugt wobei das Verfahren kein myogenes Transgen umfasst, stärker bevorzugt wobei das Verfahren nicht das Transgen Pax7 oder MyoD umfasst.
  37. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1-36, wobei das Verfahren keinen Schritt zur Anreicherung von Skelettmyoblasten enthält, bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Zellselektion, stärker bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Antikörper-basierte Zellselektion.
  38. Verfahren zum Herstellen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen aus pluripotenten Stammzellen, umfassend die Schritte (i) Induzieren von Mesodermdifferenzierung der pluripotenten Stammzellen durch Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) FGF2, (b) einem GSK3-Inhibitor, (c) einem SMAD-Inhibitor, und (d) einem serumfreien Zusatz, welcher Transferrin, Insulin, Progesteron, Putrescin und Selen oder ein bioverfügbares Salz davon umfasst; (ii) Induzieren der myogenen Spezifikation durch Kultivieren der in Schritt (i) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), gefolgt von Fortsetzen der Kultivierung in dem Medium unter Zugabe einer wirksamen Menge von (d) HGF, gefolgt von Kultivieren der Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (d) Knockout serum replacement (KSR); (iii) Maturieren der Zellen in Skelettmyoblasten und Satellitenzellendurch Kultivieren der in Schritt (ii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) HGF, (b) einem serumfreien Zusatz wie in (i), und (c) Knockout serum replacement (KSR), gefolgt von (iv) Maturieren der Zellen zu Skelettmyotuben und Satellitenzellen durch Kultivieren der in Schritt (iii) erhaltenen Zellen in einem Basalmedium, umfassend eine wirksame Menge von (a) einem serumfreien Zusatz wie in Schritt (i) und (b) einem zusätzlichen serumfreien Zusatz, welcher Albumin, Transferrin, Ethanolamin, Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, L-Carnitin, Fettsäurezusatz, und Triod-L-Thyronin (T3) umfasst; dadurch Erzeugen von Skelettmyoblasten, Skelettmyotuben und Satellitenzellen.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei durch das Verfahren ein Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% erzielt wird, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
  40. Verfahren nach Anspruch 38 oder 39, wobei durch das Verfahren ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, am stärksten bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie.
  41. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-40, wobei das Verfahren keinen Schritt zur Anreicherung von Skelettmyoblasten enthält, bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Zellselektion, stärker bevorzugt keinen Anreicherungsschritt durch Antikörper-basierte Zellselektion.
  42. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-41, wobei die pluripotenten Stammzellen Stammzellen aus Primatenursprung, insbesondere humane pluripotente Stammzellen sind; und/oder wobei die pluripotenten Stammzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen, parthenogenetischen Stammzellen, über Kerntransfer hergestellten pluripotenten Stammzellen und über chemische Reprogrammierung hergestellten pluripotente Zellen ausgewählt sind, insbesondere wobei die pluripotenten Stammzellen induzierte pluripotente Stammzellen sind.
  43. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-42, wobei Schritt (i) für 48 bis 132 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 48 bis 120 Stunden, stärker bevorzugt für 60 bis 114 Stunden, noch stärker bevorzugt für 72 bis 108 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 102 Stunden und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
  44. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-43, wobei in Schritt (i) der GSK3-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHIR99021, CHIR98014, SB216763, TWS119, Tideglusib, SB415286, 6-bromoindirubin-3-oxime und einem Valproatsalz, bevorzugt wobei der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist; und /oder wobei in Schritt (i) der SMAD-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus LDN193189, K02288, LDN214117, ML347, LDN212854, DMH1, ausgewählt ist, bevorzugt wobei der SMAD Inhibitor LDN193189 ist.
  45. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-44, wobei in Schritt (i) die wirksame Menge von FGF2 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder der serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 50-500 mg/l Transferrin, 1-20 mg/l Insulin, 1-30 µg/l Progesteron, 5-50 µg/ml Putrescin und 6-600 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, in dem Medium bereitstellt, und/oder der GSK3-Inhibitor CHIR99021 ist, und die wirksame Menge 4-18 µM beträgt, bevorzugt 5-16 µM, stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 8-13 µM, noch stärker bevorzugt 9-12 µM, noch stärker bevorzugt 9,5-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt; und/oder der SMAD-Inhibitor LDN193189 ist, und die wirksame Menge 0,05-5 µM beträgt, bevorzugt 0,1-2,5 µM, stärker bevorzugt 0,2-1 µM, noch stärker bevorzugt 0,25-0,8 µM, noch stärker bevorzugt 0,3-0,75 µM, noch stärker bevorzugt 0,35-0,7 µM, noch stärker bevorzugt 0,4-0,6 µM, noch stärker bevorzugt 0,45-0,55 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 0,5 µM beträgt.
  46. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-45, wobei der serumfreie Zusatz in Schritt (i) 0,1-10% (v/v) N2-Zusatz, bevorzugt 0,3-7,5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,5-5% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,75%-2% (v/v) N2-Zusatz, stärker bevorzugt 0,9%-1,2% (v/v) N2-Zusatz, und am stärksten bevorzugt etwa 1% (v/v) N2-Zusatz ist.
  47. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-46, wobei das Basalmedium in Schritt (i), Schritt (ii), Schritt (iii) und/oder Schritt (iv) ausgewählt ist aus DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM, alphaMEM, Medium 199, Hams F-10, Hams F-12, wobei das Basalmedium bevorzugt DMEM ist, insbesondere wobei das Basalmedium mit Pyruvat und/oder nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt ist, und/oder 1 g/l Glukose umfasst.
  48. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-47, wobei in Schritt (ii) die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, und (c) dem serumfreien Zusatz für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) FGF2, (c) dem serumfreien Zusatz und (d) HGF für 36 bis 60 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 42 bis 54 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 48 Stunden durchgeführt wird; und/oder die Kultivierung in Gegenwart von (a) einem Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor, (b) HGF, (c) dem serumfreien Zusatz, und (d) Knockout serum replacement (KSR) für 72 bis 120 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt für 76 bis 114 Stunden, stärker bevorzugt für 84 bis 108 Stunden, noch stärker bevorzugt für 90 bis 102 Stunden, und am stärksten bevorzugt für etwa 96 Stunden durchgeführt wird.
  49. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-48, wobei in Schritt (ii) der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe DAPT, RO4929097, Semagacestat (LY450139), Avagacestat (BMS-708163), Dibenzazepine (YO-01027), LY411575, IMR-1, L685458 , wobei der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor bevorzugt DAPT ist.
  50. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-49, wobei in Schritt (ii) die wirksame Menge von FGF2 15-30 ng/ml beträgt, bevorzugt 17,5-25 ng/ml, stärker bevorzugt 18-22 ng/ml, noch stärker bevorzugt 19-21 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 20 ng/ml beträgt; und/oder die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; und/oder der Gamma-Sekretase/NOTCH Inhibitor DAPT ist, und die wirksame Menge 1-20 µM beträgt, bevorzugt 2-19 µM, stärker bevorzugt 3-18 µM, noch stärker bevorzugt 4-17 µM, noch stärker bevorzugt 5-16 µM, noch stärker bevorzugt 6-15 µM, noch stärker bevorzugt 7-14 µM, noch stärker bevorzugt 7.5-13 µM, noch stärker bevorzugt 8-12 µM, noch stärker bevorzugt 9-11 µM, und am stärksten bevorzugt etwa 10 µM beträgt; das KSR in einer Menge von 6-14% (v/v), bevorzugt 7-13% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmitteis wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
  51. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-50, wobei in Schritt (iii) die wirksame Menge von HGF 1-15 ng/ml beträgt, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml beträgt; das KSR in einer Menge von 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR verwendet wird; insbesondere wobei das KSR in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie beta-Mercaptoethanol und/oder alpha-Thioglycerol verwendet wird.
  52. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-51, wobei Schritt (iii) für 7-11 Tage, bevorzugt 8-10 Tage, und am stärksten bevorzugt für etwa 9 Tage durchgeführt wird.
  53. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-52, wobei in Schritt (iv) der zusätzliche serumfreie Zusatz eine Endkonzentration von 0,5-50 mg/ml Albumin, 1-100 µg/ml Transferrin, 0,1-10 µg/ml Ethanolamin, 17.4-1744 nM Selen oder ein bioverfügbares Salz davon, insbesondere Natriumselenit, 0,4-40 µg/ml L-Carnitin, 0,05-5 µl/ml Fettsäure- Zusatz, 0,0001-0,1 µg/ml Triod-L-Thyronin (T3) in dem Medium bereitstellt.
  54. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-53, wobei der zusätzliche serumfreie Zusatz in Schritt (iv) 0,1-10 % (v/v) B27, bevorzugt 0,5-8 % (v/v), stärker bevorzugt 1-6 % (v/v), sogar stärker bevorzugt 1,5-4% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 2% (v/v) B27 ist.
  55. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-54, wobei Schritt (iv) für mindestens 30 Tage, bevorzugt mindestens 35 Tage, stärker bevorzugt für mindestens 40 Tage, und noch stärker bevorzugt für mindestens zu 50 Tage durchgeführt wird.
  56. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 38-55, das vor Schritt (i) einen Saatschritt umfasst, in dem die pluripotenten Stammzellen in einem Stammzellmedium in der Gegenwart eines ROCK-Inhibitors ausgesät werden, bevorzugt wobei der Saatschritt 18-30 Stunden vor Schritt (i) ausgeführt wird.
  57. Verfahren nach Anspruch 56, wobei der ROCK-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiazovivin, Fasudil, Hydroxyfasudil, GSK429286A und RKI1447, bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632, H-1152P, Thiozovivin, Fasudil und Hydroxyfasudil, stärker bevorzugt ist der ROCK-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Y27632 und H-1152P, wobei besonders bevorzugt der ROCK-Inhibitor Y27632 ist.
  58. Verfahren nach Anspruch 56 oder 57, wobei der ROCK-Inhibitor Y27632 ist und in einer Konzentration von 0,5-10 µM, bevorzugt 1-9 µM, stärker bevorzugt 2-8 µM, stärker bevorzugt 3-7 µM, stärker bevorzugt 4-6 µM, und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 5 µM verwendet wird; und/oder wobei das Stammzellmedium iPS-Brew XF ist.
  59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Stammzellmedium 5-20% (v/v), bevorzugt 6-17,5% (v/v), stärker bevorzugt 7-15% (v/v), stärker bevorzugt 8%-12% (v/v), stärker bevorzugt 9%-11% (v/v), und am stärksten bevorzugt etwa 10% (v/v) KSR umfasst; und/oder wobei das Stammzellmedium 1-15 ng/ml FGF2 umfasst, bevorzugt 2,5-14 ng/ml, stärker bevorzugt 5-13 ng/ml, noch stärker bevorzugt 7,5-12,5 ng/ml, noch stärker bevorzugt 8-12 ng/ml, noch stärker bevorzugt 9-11 ng/ml, und am stärksten bevorzugt etwa 10 ng/ml FGF2 umfasst.
  60. Künstliches Skelettmuskelgewebe, das multinukleäre reife Skelettmuskelfasern mit Satellitenzellen aufweist, und keine Durchblutung und/oder keine Steuerung über das zentrale Nervensystem aufweist; insbesondere wobei die Gegenwart von Skelettmuskelfasern durch Färbung von Actinin und mit DAPI festgestellt wird.
  61. Künstliches Skelettmuskelgewebe nach Anspruch 60, wobei das Skelettmuskelgewebe serumfrei ist und/oder kein differenzierungs- oder maturierungsbezogenes Transgen umfasst, bevorzugt wobei das Skelettmuskelgewebe kein myogenes Transgen umfasst, stärker bevorzugt wobei das Skelettmuskelgewebe nicht das Transgen Pax7 oder MyoD umfasst.
  62. Künstliches Skelettmuskelgewebe nach Anspruch 60 oder Anspruch 61, wobei das Skelettmuskelgewebe bei einem Stimulus von 100 Hz bei 200 mA mindestens eine Kontraktionskraft von 0,3 Millinewton (mN) erzeugt, bevorzugt mindestens 0,4 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,5 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,6 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,7 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,8 mN, stärker bevorzugt mindestens 0,9 mN, stärker bevorzugt mindestens 1 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,2 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,3 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,4 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,5 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,6 mN, stärker bevorzugt mindestens 1,7 mN; stärker bevorzugt mindestens 1,8 mN; stärker bevorzugt mindestens 1,9 mN; und am stärksten bevorzugt mindestens 2 mN erzeugt.
  63. Künstliches Skelettmuskelgewebe nach einem beliebigen der Ansprüche 60-62, wobei das Skelettmuskelgewebe künstlich geformt ist, bevorzugt wobei es die künstliche Form eines Ringes, eines Bandes, eines Stranges, eines Flickens, eines Beutels, oder eines Zylinders hat, wobei optional einzelne Skelettmuskelgewebe fusioniert werden, insbesondere wobei das Skelettmuskelgewebe die Form eines Ringes aufweist.
  64. Mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen erhalten nach Schritt (i) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1(i) oder gemäß Anspruch 38(i), die durch die Expression von den Genen MSGN1 und/oder TBX6 gekennzeichnet sind, wobei die Expression von MSGN1 und/oder TBX6 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann; und/oder die mRNA SP5 exprimiert wird, wobei die Expression von SP5mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
  65. Myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen erhalten nach Schritt (ii) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1(i) bis (ii) oder gemäß Anspruch 38(i) bis (ii), die durch die Expression des Gens PAX3 gekennzeichnet ist, wobei die Expression von PAX3 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann; und/oder die mRNA SIM1 exprimiert wird, wobei die Expression von SIM1 mittels RNA Sequenzierung bestimmt werden kann.
  66. Skelettmyoblastenzellen erhalten nach Schritt (iii) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1(i) bis (iii) oder gemäß Anspruch 38(i) bis (iii), die durch die Expression von Aktinin gekennzeichnet sind, bevorzugt wobei die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  67. Satellitenzelle erhalten nach Schritt (iii) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1(i) bis (iii) oder gemäß Anspruch 38(i) bis (iii), die durch die Expression des Gens Pax7 gekennzeichnet ist, wobei die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann, stärker bevorzugt wobei Satellitenzellen ferner Ki67 exprimieren.
  68. Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen gemäß Anspruch 66 und Satellitenzellen gemäß Anspruch 67, wobei ein Anteil an Satellitenzellen von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 10% erzielt wird, bevorzugt mindestens 15%, stärker bevorzugt mindestens 20%, noch stärker bevorzugt mindestens 30% erzielt wird, bestimmt durch die Expression von Pax7 mittels Durchflusszytometrie; und/oder wobei ein Anteil an Skelettmyoblasten von der Menge aller vorliegenden Zellen von mindestens 40% erzielt wird, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, am meisten bevorzugt mindestens 70%, bestimmt durch die Expression von Aktinin mittels Durchflusszytometrie.
  69. Skelettmyotuben erhalten nach Schritt (iv) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 38, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1(i) bis (iv) oder gemäß Anspruch 38(i) bis (iv), die durch eine anisotrope Ausrichtung der Aktinin Protein enthaltenen Sarkomerstruktur charakterisiert sind.
  70. Verwendung eines Skelettmuskelgewebes gemäß den Ansprüchen 60-63, und/oder von Zellen gemäß einem beliebigen der Ansprüche 64-68, und/oder von Skelettmyotuben gemäß Anspruch 69 in einem in vitro Arzneimitteltest; insbesondere wobei der Arzneimitteltest ein Toxizitätstest ist, oder ein Test auf die Funktion des Skelettmuskelgewebes unter dem Einfluss von pharmakologischen und gentherapeutischen Wirkstoffkandidaten.
  71. Skelettmuskelgewebe gemäß den Ansprüchen 60-63 und/oder Zellen gemäß einem beliebigen der Ansprüche 64-68, und/oder von Skelettmyotuben gemäß Anspruch 69 zur Verwendung in der Medizin.
  72. Satellitenzellen gemäß dem Anspruch 67 zur Verwendung in der Therapie von geschädigtem Skelettmuskel und/oder in der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen, bevorzugt genetischen Skelettmuskeldefekten, insbesondere von Muskeldystrophie Duchenne und/oder Muskeldystrophie Becker-Kiener, und/oder von lysosomalen Speicherkrankheiten, insbesondere von Morbus Pompe, bevorzugt wobei die Skelettmuskelerkrankung Muskeldystrophie Duchenne ist.
  73. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß einem beliebigen der Ansprüche 60-63, (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu dem Skelettmuskelgewebe, und (c) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten; bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (c) umfasst.
  74. In vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf ein Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß einem beliebigen der Ansprüche 60-63, (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz. bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
  75. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf die Leistungsfähigkeit von Skelettmuskelgewebe, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen eines Skelettmuskelgewebes gemäß einem beliebigen der Ansprüche 60-63, (b) In-Kontakt-Bringen des Skelettmuskelgewebes aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Kontraktionskraft und/oder der Struktur des Skelettmuskelgewebes und/oder der metabolischen Funktion und/oder molekularer Parameter und/oder proteinbiochemischer Parameter vor und/oder nach Schritt (b) umfasst.
  76. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Wirkstoffkandidaten auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß einem beliebigen der Ansprüche 64-69, (b) gegebenenfalls Zufügen einer Schädigung zu den Zellen aus Schritt (a), und (c) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) oder (b) mit einem Wirkstoffkandidaten, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (c) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  77. In vitro-Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß einem beliebigen der Ansprüche 64-69, (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einer zu testenden Substanz, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
  78. In vitro-Verfahren zum Testen der Wirkung von Nährstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln auf mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder ein Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von mesodermal differenzierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, myogen spezifizierte Skelettmyoblastenvorläuferzellen, Satellitenzellen, Skelettmyoblastenzellen, Skelettmyotuben oder einem Gemisch aus Skelettmyoblastenzellen und Satellitenzellen gemäß einem beliebigen der Ansprüche 64-69, (b) In-Kontakt-Bringen der Zellen aus Schritt (a) mit einem zu testenden Nährstoff oder Nahrungsergänzungsmittel, bevorzugt wobei das Verfahren des Weiteren das Bestimmen der Expression von Aktinin und/oder Pax7 vor und/oder nach Schritt (b) umfasst, wobei die Expression mittels Durchflusszytometrie und/oder Immunfärbungen bestimmt werden kann.
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