CN115369078A - 软骨类器官诱导培养基及诱导方法 - Google Patents

软骨类器官诱导培养基及诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及软骨类器官诱导培养基及诱导方法，软骨类器官诱导培养基至少包括诱导培养基一和诱导培养基二，诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；诱导培养基一由重组人激活素A(Activin A)、chir99021、FGF2、FBS、ITS等成分溶解在DMEM/F12培养液中组成；诱导培养基二由抗坏血酸、BMP2、TGF‑β1、GDF5、FBS、ITS、Glutamax、NEAA等成分溶解在DMEM培养液中组成。该诱导培养基及诱导方法能够获取稳定的人软骨类器官，在1‑2个月内形成体外软骨类器官模型，对于骨关节炎、软骨发育不全等其它相关疾病的机制研究和临床治疗具有重大的应用价值。

Description

软骨类器官诱导培养基及诱导方法
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，尤其涉及软骨类器官诱导培养基及诱导方法。
背景技术
软骨组织由软骨细胞和细胞间质组成，根据细胞间质的不同，可以把软骨分为：透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。其中透明软骨主要包括关节软骨和肋软骨等，关节软骨是一种高度特化的组织，其细胞外基质主要由II、IX和XI型胶原和蛋白多糖组成，覆盖在骨骼末端，提供减震和润滑的作用。创伤/坏死后出现大面积的关节软骨缺损，软骨自愈能力的退化导致关节功能受损，最终诱发骨关节炎。据世界卫生组织统计，全世界约有3.55亿人患骨关节炎，我国约有1.2亿患者，发病率为13％左右，其中在50-55岁以上的人群中，骨关节炎的发病率分别为50％和80％。临床上又可将骨关节炎分为原发性和继发性关节炎两类，原发性骨关节炎主要和年龄老化相关，而继发性骨关节炎主要与损伤、炎症、遗传和代谢等疾病相关，该疾病已严重威胁人类的健康和生活，给社会带来了沉重的经济负担。一般的物理疗法和药物治疗只能起到镇痛、抗炎和暂时症状缓解的作用，不能改善骨关节炎发病机制或逆转骨关节炎进程从而无法达到根本上的疾病治愈效果。自体软骨细胞移植是目前最为成功的修复关节软骨局部缺损的细胞治疗方法。然而，这种方法仅限于小于2cm2的关节软骨缺损，且需要牺牲健康的软骨来进行活检。此外，这种原代培养的软骨细胞在体外的增殖能力有限，难以适用于大规模的细胞治疗。
干细胞作为一种具有无限增殖和多潜能诱导分化的种子细胞，干细胞治疗已成为一种修复软骨缺陷的新选择，通过应用具有自我更新和多能分化潜力的人诱导多能干细胞(hiPSCs)进行细胞治疗，既可以克服组织细胞来源困难、体外扩增效率低等问题，还能够避免伦理和道德风险。人类胚胎干细胞(hESCs)和hiPSCs由于超强的分化能力可以分化为人体各个器官和组织所需的不同类型细胞，而软骨细胞的诱导方法也早在2015年就被报道，但目前还未见进一步发展。
近年来，类器官(Organoids)技术作为一颗“新星”在模型构建和细胞治疗等方面展现出了无限魅力，而类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官和组织特异性细胞的集合体。相比于体外培养的2D-细胞，类器官在组织结构和细胞间连接等多方面保留了与原始组织更高的还原度，在细胞成分和组织架构上具备更高的丰富度，因此，类器官在不同疾病的疾病模拟、病理研究、药物开发和再生医学等方面，能够弥补现有细胞模型体系的多种不足，具有重大的研究和应用价值。基于此出发点，软骨类器官的建立无疑对骨关节炎和其它软骨相关疾病的研究和治疗具有非凡的意义，而目前相关的研究及报道较少。本发明的研究正是要从hiPSCs中成功诱导出软骨类器官。
发明内容
有鉴于此，针对背景技术中指出的问题，本发明提供软骨类器官诱导培养基及诱导方法，该诱导培养基及诱导方法能够获取稳定的人软骨类器官，在1-2个月内形成体外软骨类器官模型，对于骨关节炎、软骨发育不全等其它相关疾病的机制研究和临床治疗具有重大的应用价值。
为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种软骨类器官诱导培养基，至少包括诱导培养基一和诱导培养基二，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；
所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：重组人激活素A(Activin A)，10-50ng/ml；chir99021，3-5μM；FGF2，10-50ng/ml；FBS，1％-10％；ITS，1％-5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；
所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：抗坏血酸(ascorbicacid)，10-100ng/ml；BMP2，10-20ng/ml；TGF-β1，10-20ng/ml；GDF5，10-20ng/ml；FBS，1％-5％；ITS，1％-5％；Glutamax，1％-5％；NEAA，1％-5％；丙酮酸钠(Na pyruvate)，1％-5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
优选地，所述诱导培养基二还包括：FGF2，10-20ng/ml。
进一步地，所述诱导培养基还包括维持培养基，所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段，其按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％-20％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
第二方面，本发明提供一种软骨类器官诱导方法，是将hiPSCs采用上述培养基分阶段培养获得，所述分阶段至少包括：软骨中胚层类器官诱导阶段和软骨类器官诱导阶段，其中，软骨中胚层类器官诱导阶段采用上述诱导培养基一培养，软骨类器官诱导阶段采用上述诱导培养基二培养。
进一步地，所述诱导方法中，分阶段培养前还将hiPSCs进行增殖培养。
进一步地，所述诱导方法具体包括以下步骤：
步骤1，hiPSCs增殖培养：将hiPSCs细胞培养在培养皿中，培养基为增殖培养基，于37℃、5％CO2条件下培养至细胞密度为80％-90％；
步骤2，hiPSCs消化：采用适量Accutase消化增殖培养完成的细胞，并于37℃孵育6-8分钟，加入3-4倍的增殖培养基终止消化，离心取细胞沉淀；
步骤3，拟胚体(EBs)形成：采用增殖培养基将细胞悬浮，于37℃、5％CO2条件下培养24-48h，得到EBs；
步骤4，中胚层类器官诱导培养：将增殖培养基更换为诱导培养基一，继续培养3天，培养过程中每天进行换液；
步骤5，软骨类器官诱导培养：进一步将诱导培养基一更换为诱导培养基二，继续培养30-40天，培养过程中每2-3天进行换液。
进一步地，所述增殖培养基为E8或mTeSRTM1培养基，其中添加有1％的青霉素+链霉素双抗。
进一步地，所述hiPSCs增殖培养前，培养皿提前用100×-500×稀释的Matrigel于37℃包被1-2h，稀释Matrigel的液体为DMEM/F12培养基。
进一步地，所述步骤2中离心的控制条件为：1000-1200rpm转速下于室温离心3-5min。
进一步地，所述步骤3的培养体系中添加有终浓度为10μM的Y-27632。
优选地，所述步骤3中培养48h后，将培养板于45°倾斜在室温下放置3-5min，吸走75％的培养基上清，并加入新鲜增殖培养基继续培养1-2d。
进一步地，所述步骤5中培养过程的前14天，所述诱导培养基二中添加终浓度为10-20ng/ml的FGF2。
进一步地，所述诱导方法还包括步骤6，软骨类器官维持培养：进一步将诱导培养基二更换为维持培养基，继续培养10-30天，培养过程中每2-3天进行换液。
进一步地，所述维持培养基按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％-20％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
本发明的培养基和诱导方法具有如下特点：
1、本发明的诱导培养基一将Activin A、chir99021、FGF2、FBS、ITS进行复配，可以促进中胚层细胞的分化；
2、本发明的诱导培养基二包含ascorbic acid、BMP2、TGF-β1、GDF5、FBS、ITS、Glutamax等成分，有利于中胚层细胞特异性地分化为软骨细胞；
3、本发明的诱导方法采用分阶段培养方式，一方面模拟体内软骨的发育过程，分别历经中胚层细胞分化、软骨细胞分化和软骨细胞成熟阶段；另一方面，通过复配合适的培养基促进各个阶段细胞分化和成长，以确保类器官的形成及稳定。
4、本发明的诱导方法为全程悬浮培养，得到hiPSCs自发分化形成的3D-软骨类器官，具备丰富的细胞组成和细胞间连接，能够更好的模拟体内的软骨组织。
综上，本发明的诱导培养基和诱导方法能够获取稳定的人软骨类器官，在1-2个月内形成体外软骨类器官模型，对于骨关节炎、软骨发育不全等其它相关疾病的机制研究和临床治疗具有重大的应用价值。
附图说明
图1为实施例4获得的软骨类器官的形态图，其中，图(1)和图(2)为光学显微镜观察的形态图；图(3)和图(4)为肉眼观察的形态图；
图2为实施例4获得的软骨类器官的H&E染色结果；
图3为实施例4获得的软骨类器官的Safranin O染色结果；
图4为实施例4获得的软骨细胞标志物的RT-qPCR鉴定结果；
图5为实施例5获得的软骨类器官的形态图；
图6为实施例6获得的软骨类器官的形态图。
具体实施方式
本发明中的百分比均表示体积百分比。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供过一种软骨类诱导培养基，包括诱导培养基一、诱导培养基二和维持培养基，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段。
所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：Activin A，10ng/ml；chir99021，3μM；FGF2，20ng/ml；FBS，5％；ITS，1％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；
所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：ascorbic acid，50ng/ml；BMP2，10ng/ml；TGF-β1，10ng/ml；GDF5，10ng/ml；FBS，1％；ITS，1％；Glutamax，1％；NEAA，1％；Na pyruvate，1％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
所述诱导培养基二还包括：FGF2，10ng/ml，是在软骨类器官诱导培养的前14天加入。
所述维持培养基按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
实施例2
本实施例提供过一种软骨类诱导培养基，包括诱导培养基一、诱导培养基二和维持培养基，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段。
所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：Activin A，10ng/ml；chir99021，5μM；FGF2，15ng/ml；FBS，10％；ITS，1％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；
所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：ascorbic acid，10ng/ml；BMP2，10ng/ml；TGF-β1，20ng/ml；GDF5，12ng/ml；FBS，1％；ITS，1％；Glutamax，1％；NEAA，1％；Na pyruvate，2％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
所述诱导培养基二还包括：FGF2，15ng/ml，是在软骨类器官诱导培养的前14天加入。
所述维持培养基按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中
实施例3
本实施例提供过一种软骨类诱导培养基，包括诱导培养基一、诱导培养基二和维持培养基，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段。
所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：Activin A，50ng/ml；chir99021，3μM；FGF2，20ng/ml；FBS，2％；ITS，1％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；
所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：ascorbic acid，20ng/ml；BMP2，20ng/ml；TGF-β1，20ng/ml；GDF5，20ng/ml；FBS，5％；ITS，2％；Glutamax，1％；NEAA，1％；Na pyruvate，1％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
所述诱导培养基二还包括：FGF2，15ng/ml，是在软骨类器官诱导培养的前14天加入。
所述维持培养基按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中
实施例4
本实施例提供一种软骨类器官诱导方法，是采用实施例1的诱导培养基，该方法包括以下步骤：
1).hiPSCs培养：将iPSCs细胞培养在培养皿中，培养基为增殖培养基(添加1％的青霉素+链霉素双抗的E8或mTeSRTM1培养基)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。每天换液，并观察细胞状态。备注：培养皿需要提前用100×-500×稀释的Matrigel在37℃培养箱中包被1-2h，稀释Matrigel的液体为DMEM/F12培养基。
2)hiPSCs消化：待细胞密度为80％-90％时，用适量的Accutase消化细胞，在37℃培养箱中孵育6-8分钟，观察至细胞边缘翘起，细胞明显变亮状态时，加入3-4倍的增殖培养基终止消化。备注：Accutase用量按照1个6孔板的1个孔使用Accutase量为500-1000μl。
3)EBs形成：将步骤2中的细胞收集至15ml离心管中，1000-1200rpm室温离心3-5分钟，离心结束后吸走上清，用增殖培养基将细胞悬浮，转移至低吸附6孔板中，培养48h。备注：细胞转移密度为0.5-3×105/ml，1个6孔加入2ml细胞；培养基中添加浓度为10μM的Y-27632以促进细胞存活。48h后，将培养板45度倾斜在室温放置3-5分钟，吸走75％的培养基上清，加入新鲜的iPSCs增殖培养基，继续培养1-2天。
4)中胚层类器官诱导：观察至均匀大小，边缘光滑的EBs形成后，将培养基更换为培养基一，继续培养3天。备注：培养的EBs大小约为1-3mm；换液方法同步骤3；在此培养过程中，每天进行换液。
5)软骨类器官的诱导：将步骤4中的培养基更换为培养基二，继续培养30天。备注：换液方法同步骤2和步骤3；在此阶段培养的前14天在培养基中添加浓度为10-20ng/ml的FGF2；在此培养过程中，每2-3天进行换液。
6)软骨类器官的维持培养：将步骤5中的培养基二更换为维持培养基，继续培养30天。备注：换液方法同上述步骤。
将实施例4获得的人软骨类器官形态鉴定验证和标志物鉴定：
1)采用光学显微镜对培养板进行观察，获得软骨类器官的形态图，如图1中的图(1)和图(2)，以及肉眼观察的软骨类器官形态图如图1中的图(3)和图(4)：肉眼观察的软骨类器官呈白色，表面光滑，形态与软骨组织相似。
2)H&E染色：将培养获得的软骨类器官经过4％PFA固定后，进行石蜡包埋，切片，并用HE染色剂对软骨切片进行染色，结果如图2所示，表明软骨类器官中的细胞排列呈现为透明软骨细胞形态：幼稚软骨细胞位于软骨类器官表层，体积较小；成熟软骨细胞位于类器官内部，细胞体积增大。
3)Safranin O染色：将培养获得的软骨类器官经过4％PFA固定后，进行石蜡包埋，切片，并用HE染色剂对软骨切片进行染色，结果如图3所示，软骨类器官中的软骨细胞表现出明显的Safranin O阳性(橙红色)，细胞质中存在明显脂滴。
4)RT-qPCR鉴定：收集软骨类器官，提取RNA并进行反转录和RT-qPCR实验，检测软骨细胞标志物SOX9,Col2A1和ACAN的表达，GAPDH作为内参，结果如图4所示，与未分化iPSCs(d0)相比，软骨类器官中上述标志物表达显著升高。
实施例5
本实施例提供一种软骨类器官诱导方法，是采用实施例2的诱导培养基，具体过程同实施例4。软骨类器官形态如图5所示。
实施例6
本实施例提供一种软骨类器官诱导方法，是采用实施例3的诱导培养基，具体过程同实施例4。软骨类器官形态如图6所示。
综上，本发明利用Activin A、chir99021、FGF2、FBS、ITS复配形成的诱导培养基一促进中胚层细胞的分化，ascorbic acid、BMP2、TGF-β1、GDF5、FBS、ITS、Glutamax等成分复配形成的诱导培养基二使中胚层细胞特异性地分化为软骨细胞，通过阶段式悬浮培养，获得hiPSCs自发分化形成的3D-软骨类器官，该3D-软骨类器官稳定且具备丰富的细胞组成和细胞间连接，能够更好的模拟体内的软骨组织，对于骨关节炎、软骨发育不全等其它相关疾病的机制研究和临床治疗具有重大的应用价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种软骨类器官诱导培养基，其特征在于：至少包括诱导培养基一和诱导培养基二，所述诱导培养基一用于软骨中胚层类器官诱导阶段；所述诱导培养基二用于软骨类器官诱导阶段；
所述诱导培养基一按照各组分在其中的终浓度组成包括：重组人激活素A，10-50ng/ml；chir99021，3-5μM；FGF2，10-50ng/ml；FBS，1％-10％；ITS，1％-5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中；
所述诱导培养基二按照各组分在其中的终浓度组成包括：抗坏血酸，10-100ng/ml；BMP2，10-20ng/ml；TGF-β1，10-20ng/ml；GDF5，10-20ng/ml；FBS，1％-5％；ITS，1％-5％；Glutamax，1％-5％；NEAA，1％-5％；丙酮酸钠(Na pyruvate)，1％-5％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
2.根据权利要求1所述的一种软骨类器官诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基二还包括：FGF2，10-20ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种软骨类器官诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基还包括维持培养基，所述维持培养基用于软骨类器官维持培养阶段，其按照各组分在其中的终浓度组成包括：FBS，10％-20％；青霉素+链霉素双抗，1％；以上成分均溶于DMEM培养液中。
4.一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：是将hiPSCs采用权利要求1～3任意一项所述的培养基分阶段培养获得，所述分阶段至少包括：软骨中胚层类器官诱导阶段和软骨类器官诱导阶段，其中，软骨中胚层类器官诱导阶段采用上述诱导培养基一培养，软骨类器官诱导阶段采用上述诱导培养基二培养。
5.根据权利要求4所述的一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：所述诱导方法中，分阶段培养前还将hiPSCs进行增殖培养。
6.根据权利要求5所述的一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：所述诱导方法包括以下步骤：
步骤1，hiPSCs增殖培养：将hiPSCs细胞培养在培养皿中，培养基为增殖培养基，于37℃、5％CO2条件下培养至细胞密度为80％-90％；
步骤2，hiPSCs消化：采用适量Accutase消化增殖培养完成的细胞，并于37℃孵育6-8分钟，加入3-4倍的增殖培养基终止消化，离心取细胞沉淀；
步骤3，拟胚体(EBs)形成：采用增殖培养基将细胞悬浮，于37℃、5％CO2条件下培养24-48h，得到EBs；
步骤4，中胚层类器官诱导培养：将增殖培养基更换为诱导培养基一，继续培养3天，培养过程中每天进行换液；
步骤5，软骨类器官诱导培养：进一步将诱导培养基一更换为诱导培养基二，继续培养30-40天，培养过程中每2-3天进行换液。
7.根据权利要求6所述的一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：所述增殖培养基为E8或mTeSRTM1培养基，其中添加有1％的青霉素+链霉素双抗。
8.根据权利要求6所述的一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：所述步骤3的培养体系中添加有终浓度为10μM的Y-27632。
9.根据权利要求6所述的一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：所述步骤5中培养过程的前14天，所述诱导培养基二中添加终浓度为10-20ng/ml的FGF2。
10.根据权利要求6所述的一种软骨类器官诱导方法，其特征在于：所述诱导方法还包括步骤6，软骨类器官维持培养：进一步将诱导培养基二更换为维持培养基，继续培养10-30天，培养过程中每2-3天进行换液。
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