CN110628712A - 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 - Google Patents

基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110628712A
CN110628712A CN201910931105.1A CN201910931105A CN110628712A CN 110628712 A CN110628712 A CN 110628712A CN 201910931105 A CN201910931105 A CN 201910931105A CN 110628712 A CN110628712 A CN 110628712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ipscs
culture
mscs
same
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910931105.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110628712B (zh
Inventor
季晨博
尤梁惠
曹彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Original Assignee
Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital filed Critical Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority to CN201910931105.1A priority Critical patent/CN110628712B/zh
Publication of CN110628712A publication Critical patent/CN110628712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110628712B publication Critical patent/CN110628712B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开iPSCs来源的MSCs的制备方法，包括以下步骤：iPSCs的培养；消化iPSCs，将消化的iPSCs细胞进行悬浮培养，形成拟胚体；拟胚体悬浮培养过程中添加诱导培养基组合A诱导分化；拟胚体分化后直接贴壁培养或消化后贴壁培养或消化后分选培养获取MSCs。本发明还公开iPSCs来源的MSCs的应用。本发明的新型快速制备iPSCs来源的MSCs的方法，具有无异种外源物质、悬浮培养、培养周期更短、操作简单、无限扩增等特点，高效率更适合大规模的生产。本发明获得的iPSCs来源的MSCs经鉴定符合MSCs的基本特征，并且具有与骨髓来源的MSCs类似的功能，可以用于组织修复以及免疫相关疾病的治疗。

Description

基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学和生物技术领域，具体涉及基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用。
背景技术
基于间充质干细胞(MSCs)的免疫调节作用以及多向分化的潜能，MSCs在免疫相关疾病与再生医学领域的应用研究受到广泛关注。然而，MSCs的稀有性、在不同组织器官中异质性、并且需要通过侵入性的手段(脐带来源除外)获得等特点使MSCs用于临床转化的潜力受到局限。此外，MSCs在培养过程中的扩增能力有限，通常8-10代之后就开始衰老，所以无法产生足够量的细胞用于临床治疗。因此，寻找简单、可靠、充足的细胞来源对于MSCs的临床转化至关重要。
诱导多能干细胞(iPSCs)是由成体细胞通过重编程技术诱导获得的、具有类似胚胎干细胞特性的多能干细胞。iPSCs能够不受限制的在体外培养扩增，持续产生大量的成体干细胞用于临床治疗。因此，iPSCs逐渐成为获得MSCs的最佳细胞来源。
目前已建立的从iPSCs分化获得包括MSCs在内的多种细胞类型的方法大多基于拟胚体(EB)的自发分化，通常需要30-40天。目前已知使用iPSCs制备MSCs的方法，大多需要贴壁培养、消化、反复传代，并涉及鼠源细胞共培养、异种动物源物质包被、流式分选或者病毒转染等，操作十分复杂繁琐，并不适用于大规模生产，产量小质量不稳定，且引入了外源异种物质，临床应用价值受到局限。
因此，建立一种简单、高效的制备治疗级人iPSCs来源MSCs的方法将具有广阔的应用前景和市场价值。
发明内容
发明目的：为克服现有技术中存在的不足，本发明采用悬浮培养方式结合新的诱导培养基组合建立了一种新的、简单、快速、高效且可以完全无异种外源物质的制备人iPSCs来源MSCs的方法。基于此方法，获得了多株人iPSCs来源MSCs细胞，并对其进行功能研究。本发明获得的MSCs属于临床治疗级的iPSCs来源MSCs，未来在符合国家相关法规要求的条件下制备的MSCs可使用于临床。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种iPSCs来源的MSCs的制备方法，该制备方法同样适用于胚胎干细胞(ESCs)来源的MSCs的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的iPSCs来源的MSCs在制备脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗急性肺损伤药物方面的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗免疫相关疾病中的应用，所述免疫相关疾病包括但不仅限于急性肺损伤、1型糖尿病、风湿性关节炎、移植物抗宿主反应等疾病，该iPSCs来源的MSCs在抗衰老方面有显著的效果，可以用于制备各种抗衰老的产品。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种iPSCs来源的MSCs的制备方法，包括以下步骤：
1)iPSCs的培养；
2)消化iPSCs，将消化下来的iPSCs细胞进行悬浮培养，形成拟胚体(EB)；
3)拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合A诱导分化；
4)拟胚体分化后采用直接贴壁培养或消化后贴壁培养或消化后分选培养获取MSCs。
其中，所述步骤1)iPSCs的培养步骤为：采用无异种动物源成分的TeSRTM-E8TM或者mTeSR1人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养iPSCs，培养条件为37℃，5％-10％O2及10％-15％CO2，95％湿度，每天换液。
其中，所述步骤2)消化iPSCs步骤为：iPSCs消化时，培养皿中加入EDTA或VerseneSolution，37℃孵育1-10min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有TeSRTM-E8TM或者mTeSR1人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿、细胞培养瓶或细胞培养袋中进行悬浮培养，形成拟胚体。
其中，所述步骤3)中的诱导培养基组合A包括：TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基、DMEM高糖培养基、mTeSR1人ESC/iPSC培养基、DMEM低糖培养基、DMEM/F12培养基或任何适合间充质干细胞增殖的培养基中的一种；和CHIR-99021(CT99021)、CHIR-99021(CT99021)HCl、AR-A014418、CHIR-98014、TWS119、1-Azakenpaullone、IWP-2中的任何一种或多种成分的组合，单种化合物终浓度1-50μM，若为两种及以上化合物，则各化合物的物质的量浓度的总和(视总体积相同，将各物质的物质的量浓度相加)不超过50μM；和人血清、胎牛血清、小牛血清、马血清、血清替代物中的任意一种或几种，单种血清终浓度范围1-20％，若为两种及以上血清，各种血清的总体的体积浓度为1-20％。
其中，所述步骤3)诱导培养基组合A还包括脂肪酸混合物、1×非必需氨基酸溶液、人成纤维细胞生长因子、维生素C中的一种或几种。
其中，本发明的诱导时间2-15天。其中，所述人血清为自体或异体来源均可，血清替代物包括但不仅限于ITS、N2、B27等，脂肪酸混合物(1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM)。
本发明在拟胚体(EB)悬浮培养过程进行诱导时，无需通过先获取中胚层祖细胞的过程、无需多次更换不同条件的培养基、无须反复消化传代，更适合大规模的生产。
其中，所述步骤4)的直接贴壁培养方法为：收集步骤3)经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁拟胚体中爬出后，消化后即可获得MSCs种子细胞；所述消化后贴壁培养方法为：收集步骤3)经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，培养2-8h，换液去除悬浮细胞，贴壁培养达到一定密度后，消化后即可获得MSCs种子细胞；所述消化后分选培养方法为：收集步骤3)经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，采用CD73、CD90或其他间充质干细胞表面marker的一种或几种磁珠或流式分选细胞，经悬浮培养或贴壁培养扩增1-3天即获得MSCs种子细胞。本发明的三种获取MSCs方法，均能保证MSCs比例在90％以上。
其中，所述步骤4)若需获得干性更强的MSCs样细胞，可过表达Nuclear receptorsubfamily 2，group F，member 2(NR2F2)、Methyl-CpG-binding protein(MBD6)中的一种或两种实现，可在步骤4)贴壁培养阶段，通过质粒、病毒、mRNA转染实现过表达上述基因。
本发明内容还包括所述的制备方法制备得到的iPSCs来源的MSCs。
本发明内容还包括所述的iPSCs来源的MSCs在制备脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞中的应用。
本发明内容还包括所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗急性肺损伤药物或抗衰老保健品或药物方面的应用。
本发明内容还包括所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗预防或治疗免疫相关疾病方面的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明建立的新型快速制备iPSCs来源的MSCs的方法，具有无异种外源物质、悬浮培养、培养周期更短(2-15天)、操作简单(无须反复传代)、无限扩增等特点，高效率更适合大规模的生产。而且本发明获得的iPSCs来源的MSCs经鉴定符合MSCs的基本特征，并且具有与骨髓来源的MSCs类似的功能，可以用于组织修复以及免疫相关疾病的治疗。
附图说明
图1 MSCs制备前iPSCs的典型形态；
图2拟胚体(EB)的典型形态；
图3最终获得的iPSCs来源MSCs形态；
图4 iPSCs来源MSCs转染干性基因后的细胞增殖能力；
图5 iPSCs来源MSCs表面标志物；
图6 iPSCs来源MSCs的成脂分化能力；
图7 iPSCs来源MSCs的成骨分化能力；
图8 iPSCs来源MSCs的成软骨分化能力；
图9 iPSCs来源MSCs治疗急性肺损伤小鼠模型；
图10、图11 iPSCs来源MSCs治疗1型糖尿病小鼠模型；
图12 iPSCs来源MSCs治疗快速衰老小鼠模型。
具体实施方式
以下通过实施例来具体说明本发明，这些实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1制备人iPSCs来源的MSCs方法的建立
1、人来源的iPSCs的培养
我们采用无异种动物源成分的TeSRTM-E8TM(STEMCELL Technologies，Catalog#5990)人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养人iPSCs(取正常人的皮肤成纤维细胞参见参考文献Warren L，Ni Y，Wang J，Guo X.Feeder-free derivation of humaninduced pluripotent stem cells with messenger RNA.Sci Rep.2012；2：657.doi：10.1038/srep00657.Epub 2012 Sep 14.的方法培养获得)，培养条件为37℃，5％-10％O2及10％-15％CO2，95％湿度。每天换液。
维持培养状态下iPSCs的典型形态见图1。iPSCs的典型形态，克隆细胞聚集呈圆形，形态均一，边缘整齐。显微镜100×镜下拍摄。
2、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
(1)将iPSCs消化，培养皿中加入适量Versene Solution(Gibco，15040066)，37℃孵育1-10min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿、细胞培养瓶或细胞培养袋中进行悬浮培养，形成拟胚体(EB)。EB的典型形态见图2。
(2)在悬浮培养过程中采用诱导培养基组合A诱导EB分化。诱导培养基组合A包括：①TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％(占培养基的体积百分比浓度，以下实施例均是)；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。分别于诱导的第2天、7天及15天进行下一步操作。
3、收取MSCs
收取方法包括：①直接贴壁培养收取：收集培养基组合A诱导分化2天、7天及15天后的EB，离心，并用PBS洗一遍，用间充质干细胞培养基重悬，接种到合适数量的普通塑料细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁EB中爬出后，消化后即可获得MSCs种子细胞。②消化后贴壁培养方法：收集培养基组合A诱导分化2天、7天及15天后的EB，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，培养2-8h，换液去除悬浮细胞，贴壁培养达到一定密度后，消化后即可获得MSCs种子细胞；③消化后分选培养方法：收集培养基组合A诱导分化2天、7天及15天后的EB，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，采用间充质干细胞表面标志物CD73和CD90磁珠分选细胞(或流式分选)，将分选后的细胞进行悬浮培养、贴壁培养，扩增1-3天即获得MSCs种子细胞。最终获得的MSCs种子细胞形态见图3，细胞呈梭形或者纺锤形。显微镜100×镜下拍摄。
实施例2
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％(体积百分比)；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例3
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例4
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例5
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例6
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例7
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基(Gibco，C11995500BT)；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例8
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例9
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例10
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例11
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例12
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例13
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例14
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例15
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例16
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例17
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例18
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例19
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1 μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例20
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例21
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例22
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例23
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例24
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例25
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例26
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例27
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例28
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例29
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例30
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例31
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例32
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例33
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例34
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例35
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例36
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②AR-A014418，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例37
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例38
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例39
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例40
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例41
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例42
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例43
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例44
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例45
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例46
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例47
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例48
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②CHIR-98014，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例49
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例50
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例51
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例52
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例53
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例54
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例55
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例56
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例57
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例58
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例59
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例60
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②TWS119，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例61
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例62
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例63
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例64
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例65
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例66
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例67
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例68
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例69
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例70
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例71
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例72
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例73
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例74
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例75
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例76
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例77
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例78
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①TeSRTM-E8TM；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例79
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(自体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例80
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③人血清(异体来源)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例81
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③胎牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例82
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③小牛血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例83
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③马血清，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例84
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
诱导培养基组合A为：①DMEM高糖培养基；②IWP-2，终浓度分别为1μM、25μM及50μM；③血清替代物(ITS、N2、B27等)，终浓度分别设置为1％、10％及20％；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)。其余同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
实施例85
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
2.3、转染Nuclear receptor subfamily 2，group F，member 2(NR2F2)mRNA(100ng/106细胞)实现过表达干性基因，转染48h后iPSCs来源MSCs的细胞增殖能力显著强于未转染组，结果见图4。可收取用于后续实验。
实施例86
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
2.3、转染Methyl-CpG-binding protein(MBD6)mRNA(100ng/106细胞)实现过表达干性基因，转染48h后iPSCs来源MSCs的细胞增殖能力显著强于未转染组，结果见图4。可收取用于后续实验。
实施例87
1、人来源的iPSCs的培养
同实施例1。
2.1、诱导培养基组合A悬浮培养诱导iPSCs-EB分化
同实施例1。
2.2、收取MSCs
同实施例1。
2.3、转染Nuclear receptor subfamily 2，group F，member 2(NR2F2)mRNA(100ng/106细胞)和Methyl-CpG-binding protein(MBD6)mRNA(100ng/106细胞)实现过表达干性基因组合，转染48h后iPSCs来源MSCs的细胞增殖能力显著强于未转染组，结果见图4。可收取用于后续实验。
实施例88 iPSCs来源的MSCs的鉴定
1、iPSCs来源的MSCs表面标志物
采用流式细胞术检测实施例1制备获得的iPSCs来源MSCs细胞表面标志物。实施例1中消化后收集MSCs种子细胞(P15代)，300g离心3min后弃上清，用1×PBS洗一遍后采用100μL 1×PBS重悬，按1∶100比例加入抗人的荧光标记的流式抗体CD73-PE(Miltenyi，130-097-943)、CD105-FITC(BioLegend，323203)、HLA-DR-APC(Miltenyi，130-098-178)、以及CD45-PerCP-Cy5.5(BioLegend，304028)，室温孵育15min，加入1×PBS 300g离心5min洗一遍后用300μL 1×PBS重悬，上机检测iPSCs来源MSCs的表面标志物CD73、CD105、CD45、HLA-DR的表达。如图5所示，我们获得的iPSCs来源MSCs符合MSCs的基本标志物特征，即CD73阳性(99.70％)、CD105阳性(29.71％)、CD45阴性(0.07％)、HLA-DR阴性(0.24％)。实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs的表面标志物的表达与实施例1相似。
2、iPSCs来源的MSCs的成脂分化能力
采用油红染色评估实施例1制备获得的iPSCs来源MSCs的成脂分化能力。将实施例1制备iPSCs来源的MSCs接种于培养板中培养，待细胞长满后，将间充质干细胞培养基换为成脂分化培养基PADM完全培养基(Sciencell，#7221)诱导脂肪分化，每隔两天换一次液，共诱导20天。吸弃培养基，1×PBS洗3遍后，用4％多聚甲醛室温固定20-30min，1×PBS洗3遍，加入油红染色液37度染色20-30min，双蒸水洗1min后，倒置显微镜观察、拍照。
结果见图6。iPSCs来源MSCs更换成脂分化培养基20天后，油红染色检测细胞成脂分化情况，显微镜200×镜下观察可见细胞内聚集可被油红染色的红色脂滴，表明成脂分化成功。
实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs的成脂分化能力与实施例1相似。
3、iPSCs来源的MSCs的成骨分化能力
采用茜素红染色评估实施例1制备获得的iPSCs来源MSCs的成骨分化能力。将iPSCs来源MSCs接种于多聚赖氨酸(2μg/cm2)包被的培养板中培养，待细胞长满后，将间充质干细胞培养基换为成骨分化培养基MODM培养基(Sciencell，#7531)诱导成骨分化，每隔3-5天换一次液，共诱导33天。吸弃培养基，1×PBS洗3遍后，用4％多聚甲醛室温固定30min，1×PBS洗3遍，加入茜素红染色液染色10-20min，双蒸水洗去多余液体，倒置显微镜观察、拍照。
结果见图7。显微镜200×镜下观察可见细胞内茜素红染色阳性的钙结节，表明成骨分化成功。
实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs的成骨分化能力与实施例1相似。
4、iPSCs来源的MSCs的成软骨分化能力
采用阿利新蓝染色检测实施例1制备获得的iPSCs来源MSCs的成软骨分化能力。采用3D球状分化的方式，将5×105个iPSCs来源MSCs细胞重悬于含有500μL MesenCultTM ACF成软骨分化培养基(STEMCELL，#05455)的15mL离心管中，300g室温离心10min，将15mL离心管放置于试管架上，拧松盖子，37度，5％CO2条件下培养3天后，加入500μL新鲜的MesenCultTM ACF成软骨分化培养基(STEMCELL，#05455)继续培养3天，之后每隔3天换一次液，共诱导26天。吸弃培养基，1×PBS洗3遍后，用10％福尔马林室温固定30min，并进行石蜡包埋、切片、阿利新蓝染色，正置显微镜观察、拍照。
结果见图8。显微镜100×镜下观察可见细胞团内细胞外基质中的硫酸软骨素等物质呈阿利新蓝蓝色阳性，表明成软骨分化成功。
实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs的成软骨分化能力与实施例1相似。
实施例89 iPSCs来源的MSCs的应用
1、iPSCs来源MSCs在治疗急性肺损伤模型中的应用
SPF级6-8周龄C57BL/6雄性小鼠购买于南京大学-南京生物医药研究院，腹腔注射1-10mg/kg的脂多糖(LPS，Sigma，L2630)，建立急性肺损伤小鼠模型。1-2h后，分别尾静脉注射1×106个实施例1制备的iPSCs来源MSCs和商品化的骨髓来源MSCs细胞(Cyagen，HUXMF-01001)，并设置对照组。24h后，处死小鼠，取右肺组织置于4％多聚甲醛室温固定后进行石蜡包埋、切片、H&E染色，正置显微镜观察、拍照。结果见图9。肺组织切片H&E染色结果表明，脂多糖(LPS)处理组显微镜200×镜下肺间质弥漫性水肿，并有大量炎性细胞浸润，而iPSCs来源MSCs处理组肺组织水肿、炎性细胞浸润情况明显减轻，表明iPSCs来源MSCs有很好的抗炎作用。骨髓来源MSCs具有相似效果。同时，采用5级评分法对各组小鼠组织切片的肺损伤程度进行评分，评分越高，则代表组织损伤越严重。如图9柱状图所示，LPS组肺损伤评分为(2.182±0.438)、LPS+骨髓来源MSCs组肺损伤评分为(0.818±0.264)、LPS+iPSCs来源MSCs组肺损伤评分为(0.454±0.158)，表明iPSCs来源MSCs处理组能够显著缓解LPS引起的肺损伤。实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs效果与实施例1相似。
2、iPSCs来源的MSCs在治疗I型糖尿病模型中的应用
SPF级6-8周龄C57BL/6雄性小鼠购买于南京大学-南京生物医药研究院，腹腔注射40-80mg/kg链脲佐菌素(STZ，Sigma，S0130)，连续注射3-7天。于最后一次注射STZ两天后取尾尖血测禁食血糖，血糖浓度>200mg/dL(11mM)视为糖尿病表型，表明1型糖尿病模型建立成功。分别尾静脉注射1×106个实施例1制备的iPSCs来源MSCs和商品化的骨髓来源MSCs细胞(Cyagen，HUXMF-01001)，并设置对照组。在注射细胞后的第0天、第4天及第8天检测并记录小鼠空腹血糖，15天后处死小鼠，取胰腺组织置于4％多聚甲醛室温固定后进行石蜡包埋、切片、H&E染色，正置显微镜观察、拍照。血糖检测结果如图10，注射后第8天STZ组空腹血糖为(353.3±46.97mg/dL)、STZ+骨髓来源MSCs组空腹血糖为(184.5±19.90mg/dL)、STZ+iPSCs来源MSCs组空腹血糖为(188.0±14.41mg/dL)，可见骨髓来源MSCs和iPSCs来源MSCs能够显著降低1型糖尿病小鼠空腹血糖。胰腺组织切片H&E染色结果见图11，结果显示，显微镜200×镜下STZ诱导的1型糖尿病模型组胰腺组织中胰岛数量减少、变小，而iPSCs来源MSCs处理组胰岛数量较模型组增多，增大，表明iPSCs来源MSCs具有修复胰腺组织的功能。骨髓来源MSCs具有类似效果。实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs效果与实施例1相似。
3、iPSCs来源MSCs在快速衰老模型中的应用
SPF级12周龄雄性SAMP8快速老化小鼠购买于北京中科泽晟科技有限公司。分别尾静脉注射1×106个实施例1制备的iPSCs来源MSCs和商品化的骨髓来源MSCs细胞(Cyagen，HUXMF-01001)，并设置对照组。共注射3次细胞，每次间隔一个月，于第三次注射后一个月处死小鼠，取皮肤组织置于4％多聚甲醛室温固定后进行石蜡包埋、切片、MASSON染色，正置显微镜观察、拍照。皮肤组织切片结果如图12，SAMP8快速衰老小鼠皮肤变形褶皱，真皮区域可见受损的胶原蛋白和弹性蛋白纤维，染色浅；而iPSC-MSCs处理组SAMP8小鼠的皮肤变形褶皱明显减少，胶原纤维染色深。皮肤真皮层厚度的定量分析结果表明，与SAMP8组小鼠相比，iPSC-MSCs处理组的小鼠的皮肤真皮层厚度显著增加(见图12)，SAMP8组真皮层厚度为(525.8±29.47μm)，SAMP8+骨髓来源MSCs组真皮层厚度为(691.9±44.87μm)，SAMP8+iPSCs来源MSCs组真皮层厚度为(771.6±36.25μm)。可见iPSCs来源MSCs具有显著的抗衰老作用，骨髓来源MSCs具有类似效果。实施例2～87制备获得的iPSCs来源MSCs效果与实施例1相似。

Claims (10)

1.一种iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）iPSCs的培养；
2）消化iPSCs，将消化下来的iPSCs细胞进行悬浮培养，形成拟胚体；
3）拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合A诱导分化；
4）拟胚体分化后采用直接贴壁培养或消化后贴壁培养或消化后分选培养获取MSCs。
2.根据权利要求1 所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤1）iPSCs的培养步骤为：采用无异种动物源成分的TeSR™-E8™或者mTeSR1人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养iPSCs，培养条件为37℃，5%-10%O2及10%-15%CO2，每天换液。
3.根据权利要求2所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤2）消化iPSCs步骤为：iPSCs消化时，培养皿中加入EDTA或Versene Solution，37℃孵育1-10 min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有TeSR™-E8™或者mTeSR1人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿、细胞培养瓶或细胞培养袋中进行悬浮培养，形成拟胚体。
4.根据权利要求1 所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中的诱导培养基组合A包括：TeSR™-E8™人ESC/iPSC培养基、DMEM高糖培养基、mTeSR1人ESC/iPSC培养基、DMEM低糖培养基、DMEM/F12培养基或任何适合间充质干细胞增殖的培养基中的一种；和CHIR-99021 (CT99021)、CHIR-99021 (CT99021) HCl、AR-A014418、CHIR-98014、TWS119、1-Azakenpaullone、IWP-2中的任何一种或多种成分的组合，单种或多种化合物终浓度1-50 μM；和人血清、胎牛血清、小牛血清、马血清、血清替代物中的任意一种或几种，单种或多种血清终浓度范围1-20%。
5.根据权利要求4所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤3）诱导培养基组合A还包括脂肪酸混合物、1×非必需氨基酸溶液、人成纤维细胞生长因子、维生素C中的一种或几种。
6.根据权利要求1 所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤4）的直接贴壁培养方法为：收集步骤3）经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁拟胚体中爬出后，消化后即可获得MSCs种子细胞；所述消化后贴壁培养方法为：收集步骤3）经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，培养2-8h，换液去除悬浮细胞，贴壁培养达到一定密度后，消化后即可获得MSCs种子细胞；所述消化后分选培养方法为：收集步骤3）经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，采用CD73、CD90或其他间充质干细胞表面marker的一种或几种磁珠或流式分选细胞，经悬浮培养或贴壁培养扩增1-3天即获得MSCs种子细胞。
7.权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得到的iPSCs来源的MSCs。
8.权利要求7所述的iPSCs来源的MSCs在制备脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞中的应用。
9.权利要求7所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗急性肺损伤药物或抗衰老保健品或药物方面的应用。
10.权利要求7所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗预防或治疗免疫相关疾病方面的应用。
CN201910931105.1A 2019-09-27 2019-09-27 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 Active CN110628712B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910931105.1A CN110628712B (zh) 2019-09-27 2019-09-27 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910931105.1A CN110628712B (zh) 2019-09-27 2019-09-27 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110628712A true CN110628712A (zh) 2019-12-31
CN110628712B CN110628712B (zh) 2023-11-24

Family

ID=68973311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910931105.1A Active CN110628712B (zh) 2019-09-27 2019-09-27 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110628712B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113876810A (zh) * 2021-03-15 2022-01-04 陕西医赛尔生物科技有限公司 一种促进创伤愈合贴片及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520687A (zh) * 2016-10-12 2017-03-22 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的方法
CN107937338A (zh) * 2017-11-30 2018-04-20 中山大学 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法
KR20180078160A (ko) * 2016-12-29 2018-07-09 의료법인 성광의료재단 중간엽 줄기세포의 제조방법
US20190071637A1 (en) * 2016-03-16 2019-03-07 Cynata Therapeutics Limited Colony forming medium and use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190071637A1 (en) * 2016-03-16 2019-03-07 Cynata Therapeutics Limited Colony forming medium and use thereof
CN106520687A (zh) * 2016-10-12 2017-03-22 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的方法
KR20180078160A (ko) * 2016-12-29 2018-07-09 의료법인 성광의료재단 중간엽 줄기세포의 제조방법
CN107937338A (zh) * 2017-11-30 2018-04-20 中山大学 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
付小兵: "《付小兵再生医学》", 31 March 2019, pages: 938 *
余元勋: "《中国疾病信号通路与靶向治疗学》", 31 May 2013, pages: 374 *
宋后燕: "分子医学导论", 复旦大学出版社 *
萧树东: "《胃肠病学和肝病学：基础理论与临床进展》", 31 October 2004, pages: 877 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113876810A (zh) * 2021-03-15 2022-01-04 陕西医赛尔生物科技有限公司 一种促进创伤愈合贴片及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110628712B (zh) 2023-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11339372B2 (en) Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof
US9133438B2 (en) Brown fat cell compositions and methods
US20060110825A1 (en) Process for the preparation of stem cells from human muscle tissue and adipose tissue, and stem cell obtainable by this process
US20110217385A1 (en) Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof
JP5155855B2 (ja) 多分化性幹細胞の単離
CN112048470B (zh) 一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法
CN110468101A (zh) 一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法
CN101948803B (zh) 人表皮源性间充质干细胞样多能细胞及其制备方法
CN111826348A (zh) 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用
CN105039248B (zh) 树鼩骨髓间充质干细胞培养系统
CN107557331A (zh) 一种分离和培养人脂肪干细胞的方法
CN113151149A (zh) 一种经济简便诱导肺类器官的方法及实验模型的建立
CN111621475A (zh) 脐带间充质干细胞膜片及其制备方法
CN114540298A (zh) 一种干细胞无血清培养基及其制备方法
CN104774808A (zh) 将脐带间充质干细胞诱导分化成γ-氨基丁酸能神经元的方法
CN109897815B (zh) 一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法
CN110628712B (zh) 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用
CN108753710A (zh) 一种无血清完全培养基及其应用
CN104789531A (zh) 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法
CN105886462A (zh) 用于ADSCs培养的组合物及ADSCs培养方法
CN115125192B (zh) 一种骨髓上清液及其在细胞培养中的应用
CN104726407A (zh) 一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法
WO2022056991A1 (zh) 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用
CN110484491B (zh) 羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法
Mahboudi et al. Comparison between high cell-density culture systems for chondrogenic differentiation and articular cartilage reconstruction of human mesenchymal stem cells: a literature review

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant