CN113876810A - 一种促进创伤愈合贴片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进创伤愈合贴片的制备方法。本发明采用超低温细胞裂解技术，结合连续流离心分离出MSCs中对创面愈合有促进作用的活性成分，通过优化创伤愈合的活性成分的工艺参数，最终得到促进创伤愈合活性成分，将该成分结合在载体贴片上冻干，即可提供一种现货的促进创伤愈合的含干细胞活性成分的贴片，制备方法简单，对仪器要求不高，适合量产，使用便捷，本发明贴片采用脐带间充质干细胞作为活性成份，使用过敏率低，适用范围。
Description
技术领域
本发明主要涉及外用医药的技术领域，具体地说，本发明涉及一种促进创伤愈合贴片及其制备方法。
技术背景
创伤修复一直是医学领域的热点问题。在我国，每年因糖尿病、血管硬化等导致的创面患者有数千万之多，皮肤作为人体最大的器官，是机体抵御外界侵害的第一道防线，同时也最易产生破溃缺损或功能缺失。皮肤的创面修复是一个复杂而有序，需要多种细胞和活性分子协同参与的过程。虽然目前全层皮肤移植和组织工程皮肤技术日趋完善，但仍存在一系列亟待解决的问题，如：异体皮肤移植后的免疫排斥反应；自体皮肤供皮区的二次损伤；愈合后瘢痕大量增生以及皮肤附属器无法完全再生导致的皮肤畸形或功能障碍。因此，促进创面无瘢痕愈合，实现皮肤形态及功能兼备的修复成为临床和科研亟待解决的紧迫任务。
间充质干细胞作为一类具备多向分化潜能的成体干细胞，目前已成为细胞治疗，免疫调节和组织工程等多个领域的研究热点。MSCs最初被定义为成纤维细胞集落形成单位(fibroblast colony-forming units,CFU-Fs)，于1976年由Friedenstein等人率先通过贴壁培养法从骨髓单个核细胞中分离得到。作为一种中胚层来源的细胞MSCs，不仅能在适宜条件下分化为大多数中胚层细胞，如成骨细胞、成脂肪细胞以及成软骨细胞，还能够跨胚层分化为神经细胞，肝细胞和表皮细胞等内胚层和外胚层细胞。MSCs来源广泛，目前已证实能够从骨髓、脂肪、脐带等多种组织中分离得到，并且不易引发机体的排斥反应，目前将MSCs应用于多种难治性疾病的相关成果不断涌现，如心肌梗死，急性肾损伤，以及创面愈合中。
脐带间充质干细胞(MSCs)存在新生儿脐带中，具有自我更新能力及多向分化潜能，其遗传背景较为稳定，置入人体后免疫排斥风险较低。MSCs在创面愈合中主要体现在其能够在部分生长因子的支持下，对其自身周围细胞进行刺激，且将其分成特化细胞，特化细胞包括肌肉细胞、神经元、软骨细胞和角质形成的细胞。在诸多细胞因子中皮肤中表皮干细胞是极为重要的，比如干细胞生长因子、角质形成细胞生长因子等。同时，MSCs能够在促炎细胞因子抑制的作用下，刺激和调节T细胞因子，实现对抗炎物质IL-10的增强，最终促进内皮细胞的分化，生成新的血管。
目前应用的MSCs多以活细胞形式注射或涂抹，由于细胞或因子存储条件苛刻，常温下无法实现现货供应，如何实现常温下现货供应成为MSCs应用中亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术中促进创伤愈合的活性成分多以活细胞形式注射或涂抹，由于细胞或因子存储条件苛刻，常温下无法实现现货供应的技术问题，且未见有文献和专利报道促进创伤愈合的活性成分在贴片中的应用。本发明旨在于可提供一种现货的促进创伤愈合的含干细胞活性成分的贴片及其制备方法。本发明采用超低温细胞裂解技术，结合连续流离心分离出MSCs中对创面愈合有促进作用的活性成分，通过优化创伤愈合的活性成分的工艺参数，最终得到促进创伤愈合活性成分，将该成分结合在载体贴片上冻干，即可提供一种现货的促进创伤愈合的含干细胞活性成分的贴片，制备方法简单，对仪器要求不高，适合量产，使用便捷，本发明贴片采用脐带间充质干细胞作为活性成份，使用过敏率低，适用范围。
本发明具体提供一种促进创伤愈合贴片，其制备方法包括以下步骤：
(1)采用无异种动物源成分的mTeSR1人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养脐带间充质干细胞，培养条件为37℃，5％-10％O2及10％-15％CO2，每天换液，培养15天。
(2)培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育1-10min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有mTeSR1人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿中进行悬浮培养，形成拟胚体。
(3)拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度1-20μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为1-20％。
(4)收集步骤(3)经培养基组合诱导后的拟胚体，4℃离心，5000g离心10分钟，取上清液，出去沉淀物，并用PBS洗，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁拟胚体中爬出后，消化后即可获得有促进创伤愈合的活性成分种子细胞。
(5)向有促进创伤愈合的活性成分种子细胞中加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解。
(6)将步骤(5)得到的促进创伤愈合的活性成分种子细胞在载体贴片上-80℃冻干，即可得到一种促进创伤愈合的含干细胞活性成分的贴片。
通过本发明提供的上述技术方案实施本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明制备的一种有促进创伤愈合活性成分的贴片，制备方法简单，对仪器要求不高，适合量产。
(2)本发明制备的一种促进创伤愈合贴片使用便捷，撕开包装把贴片取出，敷在患处即可，可以促进伤口愈合。本产品使用的是脐带间充质干细胞，过敏率低，适用范围广，烫伤，烧伤，皮肤破损等都适用。
说明书附图
无
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料都为本领域熟知选用的。
实施例1：促进创伤愈合贴片的制备方法
本发明具体提供一种促进创伤愈合贴片的制备，包括以下步骤：
(1)采用无异种动物源成分的mTeSR1人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养脐带间充质干细胞，培养条件为37℃，5％-10％O2及10％-15％CO2，每天换液，培养15天。
(2)培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育1-10min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有mTeSR1人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿中进行悬浮培养，形成拟胚体。
(3)拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度1-20μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为1-20％。
(4)收集步骤3)经培养基组合诱导后的拟胚体，4℃离心，5000g离心10分钟，取上清液，出去沉淀物，并用PBS洗，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁拟胚体中爬出后，消化后即可获得有促进创伤愈合的活性成分种子细胞。
(5)向有促进创伤愈合的活性成分种子细胞中加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解。
(6)将步骤(5)得到的促进创伤愈合的活性成分种子细胞在载体贴片上-80℃冻干，即可得到一种促进创伤愈合的含干细胞活性成分的贴片。
实施例2：促进创伤愈合贴片的制备方法
在实施例1的制备方法的基础上，提供一种有促进创伤愈合活性成分的贴片的制备方法，mTeSR1人ESC/iPSC培养基中5％O2及10％CO2，培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育1min，拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度1μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为1％。
实施例3：促进创伤愈合贴片的制备方法
在实施例1的制备方法的基础上，提供一种有促进创伤愈合活性成分的贴片的制备方法，mTeSR1人ESC/iPSC培养基中7％O2及12％CO2，培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育4min，拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度5μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为5％。
实施例4：促进创伤愈合贴片的制备方法
在实施例1的制备方法的基础上，提供一种有促进创伤愈合活性成分的贴片的制备方法，mTeSR1人ESC/iPSC培养基中9％O2及13％CO2，培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育6min，拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度10μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为10％。
实施例5：促进创伤愈合贴片的制备方法
在实施例1的制备方法的基础上，提供一种有促进创伤愈合活性成分的贴片的制备方法，mTeSR1人ESC/iPSC培养基中10％O2及15％CO2，培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育10min，拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度20μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为20％。
实施例6：促进创伤愈合贴片的制备方法优化
本实施例在实施例1-5的基础上，对促进创伤愈合贴片的制备工艺参数进一步优化，以孵育时间/min(A)、AR-A014418浓度/μM(B)、最终化合物浓度/％(C)为试验因素，以促进创伤愈合的活性成分的种子细胞含量为考察指标，综合评分法，选用L9(33)正交试验优化促进创伤愈合活性成分贴片制备的方法，每个因素设置三个水平见表1。
表1：L9(33)正交试验因素水平设计表
表2：促进创伤愈合活性成分贴片制备方法L9(33)正交优化试验结果
由表1和2数据可知，制备工艺参数对促进创伤愈合贴片综合评分的影响顺序为A>B>C，即孵育时间＞AR-A014418浓度＞最终化合物浓度，得到最佳的组合为A2B2C2，即最佳的参数为10min孵育、20μMAR-A014418浓度、最终化合物浓度为20％，最佳效果为实施例5.
实施例7：一种促进创伤愈合贴片的应用实验
在实施例1-5的基础上，对本发明提供的促进创伤愈合贴片(实施例2-5组)、与市售创伤贴片(对照1)对小鼠创伤愈合情况的影响试验。
(1)实验设计
实验动物：50只25g-35g昆明小鼠。
试验方法：对小鼠进行背部脱毛处理后常规喂养，备用。
对小鼠进行乙醚吸入麻醉法使其麻醉后，在小鼠背部脊柱旁约0.5cm处做两条平行的纵向线型切口，切口长约1cm。一侧切口使用本发明产品(实施例2-5)，另一侧使用市售创伤贴片，还有一组10只小鼠做空白对照，使用样品的小鼠以医用胶布固定。操作完成小鼠自然清醒后单笼喂养查看状态。5d后处死，沿切口起止点取下局部皮肤约0.8cm×0.8cm,做创伤拉力试验。实验结果如下表3：
表3：本发明与市售创伤贴片(对照1)实验结果对比
由表3数据可知，本发明提供的促进创伤愈合贴片(实施例2-5组)与市售创伤贴片(对照1)对小鼠创伤愈合的影响相比，使用本发明制备的促进创伤愈合贴片，小鼠皮肤愈合后拉力强度明显高于对照组，尤其是实施例5，线型切口愈合的也平整光滑，无任何的不良反应，对于烧伤、烫伤等皮肤损伤也有显著愈合效果。
实施例8：促进创伤愈合贴片的应用对比试验
邀请80名皮肤破损面积2％左右的人员对本发明提供的一种有促进创伤愈合活性成分贴片与与市售创伤贴片(对照1)进行使用效果评价，其中，少年、青年、中年和老年各20名，男女各半，连续使用2个月后，对使用效果进行统计，愈合明显A，伤口处依旧疤痕明显B，化脓、感染C具体见表3。
表4：本发明与与市售创伤贴片(对照1)打分对比
本发明一种促进创伤愈合贴片与与市售创伤贴片(对照1)应用效果验证试验，结果表明，使用本发明提供的一种促进创伤愈合贴片2个月后，创口的愈合效果明显，疤痕减少，也无过敏反应，使用中无刺痛感，而对照组伴有轻微的刺痛感，使用的打分明显低于本发。且本发明贴片的使用方法简单，撕开包装，直接敷在患处即可。
需要说明的是：本发明实施例2-5制备的一种有促进创伤愈合活性成分贴片同样具有上述试验效果，各实施例之间与上述试验效果差异不大。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种促进创伤愈合贴片的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
(1)采用无异种动物源成分的mTeSR1人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养脐带间充质干细胞，培养条件为37℃，5％-10％O2及10％-15％CO2，每天换液，培养15天；
(2)培养过程中在培养皿中加入EDTA，37℃孵育1-10min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有mTeSR1人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿中进行悬浮培养，形成拟胚体；
(3)拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合TeSRTM-E8TM人ESC/iPSC培养基和AR-A014418诱导分化，浓度1-20μM，加入的胎牛血清，最终化合物浓度为1-20％；
(4)收集步骤(3)经培养基组合诱导后的拟胚体，4℃离心，5000g离心10分钟，取上清液，出去沉淀物，并用PBS洗，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁拟胚体中爬出后，消化后即可获得有促进创伤愈合的活性成分种子细胞；
(5)向有促进创伤愈合的活性成分种子细胞中加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解；
(6)将步骤(5)得到的促进创伤愈合的活性成分种子细胞在载体贴片上-80℃冻干，即可得到一种促进创伤愈合的含干细胞活性成分的贴片。
2.如权利要求1所述的一种促进创伤愈合贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养条件为10％O2及15％CO2。
3.如权利要求1所述的一种促进创伤愈合贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)最终化合物浓度为20％。
4.如权利要求1至3任意一项制备方法获得的促进创伤愈合贴片。
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