CN112608947B - 一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用 - Google Patents

一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用，切取人的面部皮肤，去除表皮层和皮下组织，分离得到皮脂腺，加入增殖培养液进行原代培养，制备H‑tert慢病毒感染细胞连续传代至50代得到稳定细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功。针对人皮脂腺组织细胞的特征，采用中性蛋白酶、EDTA对组织块进行消化，将消化后的组织块移植到培养瓶中，加入增殖培养液进行原代培养，病毒液感染细胞株筛选后连续传代继而成功构建人皮脂腺细胞系。通过本发明的方法构建的人皮脂腺细胞系，具有连续传代的能力；稳定传代后，细胞呈长梭状，并经相关细胞株鉴定证明该细胞系是一种特性稳定、成分均一的中国人皮脂腺细胞系，是作为研究皮脂腺相关疾病的良好材料。

Description

一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用。
背景技术
人类皮肤具有重要的生理、防护等功能。作为皮肤附属器的皮脂腺在保障皮肤正常的功能中发挥着重要的作用。皮脂腺位于毛囊侧面，由多个分叶构成，腺体外围由基膜包覆，基膜上有未分化的扁平细胞，该细胞不断向腺体中央移动并成熟，细胞内部合成皮脂，通过全浆分泌释放，皮脂经皮脂腺导管流入毛囊，可能被毛囊内的微生物分解，再经毛囊开口流出，以尚未阐明的机制铺展于皮肤表面，形成一层酸性的“皮脂膜”，发挥滋润皮肤和毛发、天然抗紫外线B、抑制皮肤表面的微生物过度增殖等作用。皮脂腺的生理活动受多种因素的调控或影响，例如性别和年龄、内分泌、饮食和营养、季节和日光等。与皮脂腺相关的多种疾病的机理至今尚未完全清楚，病理生理过程中也存在诸多有待阐明之处，特别是寻常痤疮迄今尚未有突破性进展。导致痤疮研究困难的重要原因之一是痤疮是人类特有的疾病，缺乏有效的动物模型，所以体外培养皮脂腺细胞成为一种重要的研究手段。
从人体分离的原代皮脂腺细胞受分裂代数的影响，难以大规模扩增用于相关研究，若要持续使用，则须不断重新从活体皮肤中分离，标本获取困难、成本和工作量巨大，不利于研究开展。对细胞进行永生化则可以获得理论上可以无限增殖、功能和原代细胞接近、遗传背景和特性稳定一致的细胞，便于大规模研究应用，并使不同研究结果间具有可比性。
端粒是位于真核染色体末端的含有非编码重复DNA序列的结构。这些区域在连续多轮的细胞分裂中渐进地缩短，从而导致基本遗传信息的损失并最终导致细胞死亡。因此端粒区域的存在阻止了来自染色体末端的DNA的损失，使得免于发生细胞衰老和老化的现象。端粒酶逆转录酶(h-tert)是分化细胞中端粒酶活性的限制因子，由于其不涉及肿瘤抑制因子的失活，h-tert的引入优于使用蛋白病毒进行永生化。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法。
本发明的第二个目的是，提供如上所述方法构建得到的人皮脂腺细胞系的用途。
本发明的第三个目的是，提供一种3D皮脂腺类器官结构的构建方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，包括如下步骤：
1)组织块的处理：切取人面部皮肤，在青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡，酒精消毒处理，用含两性霉素B的HBSS冲洗，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成组织小块，将组织小块浸泡在中性蛋白酶和EDTA中消化过夜；剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2)原代培养：将组织块移植到培养瓶中，用增殖培养液进行培养；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶静置消化，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，进行传代培养，并进行细胞的生物学标记鉴定；
4)H-tert病毒培养液制备：pMXs-H-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
5)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养，加入步骤4)的病毒培养液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
6)步骤5)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功；
所述增殖培养液为含有5-10％胎牛血清、10-40ng/ml表皮生长因子、1-5ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、100-400IU/ml青霉素、100-400ug/ml链霉素、0.25-2ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
在上述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法中，作为优选的，所述构建方法包括如下步骤：
1)组织块的处理：切取人面部皮肤，于浓度为200-2000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30分钟，以50-75％酒精消毒处理，用浓度为1-4.5ug/ml的两性霉素B的HBSS冲洗3次，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成1mm3的组织小块，将组织小块浸泡在0.01-0.1％中性蛋白酶和0.005-0.03％EDTA中，4度消化过夜；使用显微手术操作，在体视显微镜下剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2)原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为35-37℃，放入5-10％CO2细胞培养箱培养72h，隔天半量更换增殖培养液一次；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶静置消化，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，于37℃，5-10％CO2进行传代培养，并进行细胞的生物学标记鉴定；
4)H-tert病毒培养液制备：pMXs-H-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
5)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养生长至30％-40％时，加入步骤4)的病毒培养液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
6)步骤5)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功；
所述增殖培养液为含有5-10％胎牛血清、10-40ng/ml表皮生长因子、1-5ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、100-400IU/ml青霉素、100-400ug/ml链霉素、0.25-2ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
在上述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法中，作为优选的，所述构建方法包括如下步骤：
1)组织块的处理：切取人面部皮肤，于浓度为2000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30分钟，以75％酒精消毒处理，用浓度为2ug/ml的两性霉素B的HBSS冲洗3次，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成1mm3的组织小块，将组织小块浸泡在0.0251％中性蛋白酶和0.01％EDTA中，4度消化过夜；使用显微手术操作，在体视显微镜下剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2)原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为37℃，放入5％CO2细胞培养箱培养72h，隔天半量更换增殖培养液一次；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶静置消化，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，于37℃，5％CO2进行传代培养，并进行细胞的生物学标记鉴定；
4)H-tert病毒培养液制备：pMXs-H-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
5)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养生长至30％-40％时，加入步骤4)的病毒培养液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
6)步骤5)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功；
所述增殖培养液为含有5-10％胎牛血清、10-40ng/ml表皮生长因子、1-5ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、100-400IU/ml青霉素、100-400ug/ml链霉素、0.25-2ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
在上述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法中，作为优选的，步骤3)中加入的胰蛋白酶浓度为0.05-0.2％，消化时间为3-5min。
在上述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法中，作为优选的，步骤4)使用pMXs-H-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒对细胞进行感染。
在上述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法中，作为优选的，所述增殖培养液为含有8％胎牛血清、30ng/ml表皮生长因子、2ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、300IU/ml青霉素、300ug/ml链霉素、0.5ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的方法所构建的人皮脂腺细胞系在制备人3D皮脂腺中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种3D皮脂腺类器官结构的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
1)在24孔培养皿底表面制作均匀平铺的基质胶原支撑层；
2)取如上任一所述的方法所构建的人皮脂腺细胞系，用基质胶原溶液重悬皮脂腺细胞，并在混匀后共同加入基质支撑层上，然后放入37℃，5-10％CO2细胞培养箱使其凝固，培养周期为14d，隔天换液。
本发明所构建的人皮脂腺细胞系具有以下生物学特性：
a.原代分离自正常人面部皮肤组织，呈上皮样细胞，传代稳定后呈长梭样细胞的形态特点；
b.细胞增殖能力强，每一个组织块在处理后3d左右均能分离出大量细胞，均具有连续传代的能力；
c.该细胞系培养条件为37℃，5-10％CO2细胞培养箱。
本发明优点在于：
1、本发明针对人皮脂腺细胞的特征，采用适合该细胞生长增殖的培养基，及适宜的培养条件；继而用pMXs-H-tert逆转录病毒载体成功构建了人皮脂腺细胞系，其雄激素和视黄酸受体不丢失、细胞的代谢活动与特征与原代细胞更为接近，且生命活力和传代能力强，分瓶传代后培养3天即可完全汇合。该细胞系已连续传代至50代以上，可提供大量的人皮脂腺细胞。
2、本发明所构建的人皮脂腺细胞系为分子细胞水平上展开人皮脂腺相关疾病的病理生理以及治疗研发等提供了基础。
3、建立人皮脂腺细胞系3D类器官结构，进一步拓展了本发明的研究应用价值。
附图说明
附图1为透射电镜下稳定传代后的中国人皮脂腺细胞系。
附图2为相差显微镜下稳定传代后的中国人皮脂腺细胞系。
附图3为3D培养皮脂腺类器官结构。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1细胞系的构建方法
一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，包括如下步骤：
1)组织块的处理：切取人面部皮肤，于浓度为2000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30分钟，以75％酒精消毒处理，用浓度为2ug/ml的两性霉素B的HBSS冲洗3次，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成1mm3的组织块，将组织小块浸泡在0.025％中性蛋白酶和0.01％EDTA中，于4度下保存过夜；利用显微手术，在体视显微镜下剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2)原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为37℃，放入5％CO2细胞培养箱培养72h，隔天半量更换增殖培养液一次；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入浓度为0.05％的胰蛋白酶静置消化5min，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，于37℃，5％CO2进行传代培养，部分进行生物学标记鉴定，以确定细胞种类正确。特别地，使用油红或尼罗红染色，可在细胞质中发现大量油脂滴，结合CK4、MUC-1阳性，确定本细胞的身份；
4)pMXs-h-TERT逆转录病毒载体构建：根据人ips细胞h-TERT上下游克隆位点设引物，上游引物5’GCTGCTCAGGTCTTTCTTT 3’，含Bgl II酶切位点；下游引物5’TTCAAGTGCTGTCTGATTCC 3’，含Not I酶切位点。PCR法扩增出hTERT的cDNA片段，将pMXs载体和hTERT酶切产物连接得到pMXs-hTERT载体；
5)h-TERT病毒培养液制备：步骤4)中的病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
6)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养，生长至汇合度为30％-40％时，加入步骤5)的病毒液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
7)步骤6)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功。
所述增殖培养液为含有8％胎牛血清、30ng/ml表皮生长因子、2ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、300IU/ml青霉素、300ug/ml链霉素、0.5ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
分瓶传代后，于5％CO2培养箱中培养3天即可长满，该细胞系具有较强的繁殖能力。显微镜下观察(图2)，细胞呈长梭状形态，该细胞系是一种特性稳定、成分均一的中国人皮脂腺细胞系，是研究皮脂腺相关疾病病理生理的良好材料。该人皮脂腺细胞系可传代至少50代，细胞能稳定增殖，具有连续传代的能力。
实施例2细胞系的构建方法
一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，包括如下步骤：
1)组织块的处理：切取人面部皮肤，于浓度为200IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30分钟，以50％酒精消毒处理，用浓度为1ug/ml的两性霉素B的HBSS冲洗3次，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成1mm3的组织块，将组织小块浸泡在0.1％中性蛋白酶和0.03％EDTA中，于4度下保存过夜；利用显微手术，在体视显微镜下剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2)原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为35℃，放入10％CO2细胞培养箱培养72h，隔天半量更换增殖培养液一次；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入浓度为0.2％的胰蛋白酶静置消化3min，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，于37℃，10％CO2进行传代培养，部分进行生物学标记鉴定，以确定细胞种类正确。特别地，使用油红或尼罗红染色，可在细胞质中发现大量油脂滴，结合CK4、MUC-1阳性，确定本细胞的身份；
4)pMXs-h-TERT逆转录病毒载体构建：根据人ips细胞h-TERT上下游克隆位点设引物，上游引物5’GCTGCTCAGGTCTTTCTTT 3’，含Bgl II酶切位点；下游引物5’TTCAAGTGCTGTCTGATTCC 3’，含Not I酶切位点。PCR法扩增出hTERT的cDNA片段，将pMXs载体和hTERT酶切产物连接得到pMXs-hTERT载体；
5)h-tert病毒培养液制备：步骤4)中的pMXs-h-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
6)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养，生长至汇合度为30％-40％时，加入步骤5)的病毒液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
7)步骤6)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功。
所述增殖培养液为含有10％胎牛血清、40ng/ml表皮生长因子、1ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、400IU/ml青霉素、400ug/ml链霉素、2ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
实施例3细胞系的构建方法
一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，包括如下步骤：
1)组织块的处理：切取人面部皮肤，于浓度为1000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30分钟，以60％酒精消毒处理，用浓度为4.5ug/ml的两性霉素B的HBSS冲洗3次，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成1mm3的组织块，将组织小块浸泡在0.01％中性蛋白酶和0.005％EDTA中，于4度下保存过夜；利用显微手术，在体视显微镜下剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2)原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为36℃，放入8％CO2细胞培养箱培养72h，隔天半量更换增殖培养液一次；
3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入浓度为0.1％的胰蛋白酶静置消化4min，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，于37℃，8％CO2进行传代培养，部分进行生物学标记鉴定，以确定细胞种类正确。特别地，使用油红或尼罗红染色，可在细胞质中发现大量油脂滴，结合CK4、MUC-1阳性，确定本细胞的身份；
4)pMXs-h-TERT逆转录病毒载体构建：根据人ips细胞h-TERT上下游克隆位点设引物，上游引物5’GCTGCTCAGGTCTTTCTTT 3’，含Bgl II酶切位点；下游引物5’TTCAAGTGCTGTCTGATTCC 3’，含Not I酶切位点。PCR法扩增出hTERT的cDNA片段，将pMXs载体和hTERT酶切产物连接得到pMXs-hTERT载体；
5)h-tert病毒培养液制备：步骤4)中的pMXs-h-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
6)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养，生长至汇合度为30％-40％时，加入步骤5)的病毒液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
7)步骤6)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功。
所述增殖培养液为含有5％胎牛血清、10ng/ml表皮生长因子、5ng/ml I型胰岛素样细胞生长因子、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、1ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
实施例4构建3D皮脂腺
一、实验方法
1)在24孔培养皿底表面制作均匀平铺的基质胶原支撑层；
2)用基质胶原溶液重悬上述实施例制备的皮脂腺细胞，并在混匀后一起加到基质支撑层上，然后放入37℃，5-10％CO2细胞培养箱使其凝固，培养周期为14d，隔天换液；
3)细胞在基质胶原中形成球状，其结构类似于人皮脂腺(图3)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）组织块的处理：将人面部皮肤于浓度为2000IU/ml青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30分钟，以75%酒精消毒处理，用浓度为2ug/ml的两性霉素B的HBSS冲洗3次，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成1mm3的组织小块，将组织小块浸泡在0.0251%中性蛋白酶和0.01%EDTA中，4℃消化过夜；使用显微手术操作，在体视显微镜下剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
2）原代培养：将组织块移植到底面积为25cm2的培养瓶中，保持温度为37℃，放入5% CO2细胞培养箱培养72 h，隔天半量更换增殖培养液一次；
3）传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶静置消化，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，于37℃，5% CO2进行传代培养，并进行细胞的生物学标记鉴定；
4）H-tert病毒培养液制备：pMXs-H-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；
5）病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养生长至30%-40%时，加入步骤4）的病毒培养液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
6）步骤5）中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功；
所述增殖培养液为含有5-10%胎牛血清、10-40ng/ml表皮生长因子、1-5ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、100-400IU/ml青霉素、100-400ug/ml链霉素、0.25-2ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液；所述步骤3）中加入的胰蛋白酶浓度为0.05-0.2%，消化时间为3-5min。
2.根据权利要求1所述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，其特征在于，步骤4）使用pMXs-H-tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒对细胞进行感染。
3. 根据权利要求1所述永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，其特征在于，所述增殖培养液为含有8%胎牛血清、30ng/ml表皮生长因子、2ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、300IU/ml青霉素、300ug/ml链霉素、0.5ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养液。
4.由权利要求1-3任一所述的方法所构建的人皮脂腺细胞系在制备人3D皮脂腺中的应用。
5.一种3D皮脂腺类器官结构的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）在24孔培养皿底表面制作均匀平铺的基质胶原支撑层；
2）取权利要求1-3任一所述的方法所构建的人皮脂腺细胞系，用基质胶原溶液重悬皮脂腺细胞，并在混匀后共同加入基质支撑层上，然后放入37℃，5-10% CO2细胞培养箱使其凝固，培养周期为14 d，隔天换液。
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