JP2022551192A - 多能性幹細胞からの骨格筋細胞および骨格筋組織の製造法 - Google Patents

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本出願は、多能性幹細胞から人工的な骨格筋組織を製造するための方法を記載する。多能性幹細胞から骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞およびサテライト細胞を製造するための方法も開示される。記載される方法において、多能性幹細胞の分化および成熟は、骨格筋管細胞およびサテライト細胞へ方向付けられる。本出願はまた、サテライト細胞を有する多核骨格筋繊維を有する人工的な骨格筋組織を記載する。さらには、本発明は、開示される方法を手段として製造され得る、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、骨格筋芽細胞、サテライト細胞および骨格筋管細胞に関する。本出願はまた、薬物試験または医薬における骨格筋組織または開示される細胞の使用を記載する。最後に、本出願は、骨格筋組織または開示される細胞が使用されるインビトロ方法に関する。

Description

発明の背景
ヒトの身体は、呼吸、姿勢および運動を可能にする35～40％の骨格筋から構成される。健常な骨格筋は、小さな傷害、例えば裂傷または切り傷から完全に再生することができ、その理由は、サテライト細胞（SC）とも呼ばれる筋肉幹細胞が、傷害を受けた組織を完全に再生することができるからである。しかしながら、大きな傷害は治らず、永久的な損傷を残す。
「組織工学」の現行の理論は、要求される細胞種を生成し、操作された環境においてそれらを分化させてインビボ様組織を製造することから構成される。組織工学において、分化した細胞の解離の間に細胞外環境は喪失されるため、発生に関連する情報は喪失され得ることに留意することは重要である。例えば、解離は細胞間相互接続性、幾何学的な細胞配置、および細胞-細胞外マトリックス接続性を壊す。この環境は組織工学の間に再構築されなければならない（Zimmermann et al.2004,Tiburcy et al.2017）。さらに、分化した骨格筋組織は、骨格筋繊維だけからなるのではなく、環境および化学的刺激にしたがって形成される間質/結合組織細胞、特にサテライト細胞からもなる。
2D細胞培養物、小動物モデル、または小動物からの抽出された筋肉組織を使用する骨格筋細胞に関する異なる組織工学方法が当業者に公知である（Beldjilali-Labro et al.（2018）and Khodabukus et al.（2018））。例えば、Chal et al.（2016）は、2D方法における筋肉繊維の製造を記載する。
過去において、生物学的プロセスを研究するために小動物モデルが多くの場合に使用されてきた。しかしながら、動物モデルは概して何らかの制限を有する。動物モデルを用いる場合、特に疾患/治癒プロセスおよび薬物有効性に関して、結果をヒトに移行できるのかどうかは根本的に疑問である。
動物モデルの制限を克服するために、操作された骨格筋細胞および/または骨格筋組織の製造は極めて有益である見込みがある。
幹細胞の骨格筋細胞への分化を支持するために、幹細胞は過去には多くの場合に筋肉特異的転写因子をトランスフェクトされている。例えば、Rao et al.（2018）は、Pax7導入遺伝子が一過的に過剰発現される、操作された骨格筋組織の製造を記載する。しかしながら、トランスフェクション率は異なる細胞について異なり、また各実験と共に変動し得る。加えて、多くの研究者は分化プロトコールの間に血清を使用する。しかしながら、いずれの因子が哺乳動物由来の血清中に存在するのか、およびそれらが分化にどのように影響するのかは多くの場合に不明確である。したがって、これらの方法の再現性は深刻に制限されるため、導入遺伝子または血清を使用する分化プロトコールは弱点を有する。そのため、ヒト多能性幹細胞が、定義された因子により骨格筋細胞およびサテライト細胞または骨格筋組織に分化および成熟され、導入遺伝子または血清を必要としない方法を開発することが必須である。
さらには、化学的刺激だけでなく、物理的刺激もまた、骨格筋組織発生において役割を果たすことを示唆する証拠が増加しつつある。そのため、表面トポグラフィーおよび構造組成に加えて化学的および物理的刺激の組合せは、機能的な筋肉組織をインビトロで信頼性を伴って製造するために有望であるようである（Liao et al.（2008）、Pavesi et al.（2015））。しかしながら、細胞の分化および成熟の間のこれらの異なる刺激のクロノロジー、持続期間、および素性は不明確なままである。
堅牢な分化および成熟プロトコールの開発は、骨格筋細胞およびサテライト細胞、ならびに操作された骨格筋組織の製造を可能にするための非常に重要な工程である。
本発明者らは特許出願WO 2017/100498A1において、2D方法におけるヒト多能性幹細胞の骨格筋芽細胞への無血清分化プロトコールを開示している。しかしながら、この手順は、非分化細胞種を細胞プールから除去するための、フローサイトメトリーを介する骨格筋芽細胞の濃縮工程が必要である。フローサイトメトリーを介する精製は、スケール拡大を可能とせず、感染リスクおよび非常に高い細胞損失と関連付けられ、したがって細胞製造物の商用応用への重大な障壁となる。
特有の細胞種のためにさらなる濃縮工程を必要としない、トランスジェニックフリーかつ無血清の、多能性幹細胞の効率的な分化方法は未だ成功裏に記載されていない。特に、導入遺伝子および血清を回避しながら化学的および物理的刺激を記載する多能性幹細胞の骨格筋組織への効率的な分化方法は未だ成功裏に記載されていない。
Shahriyari et al.（2018）は、操作された骨格筋組織の予備的な製造を報告するに過ぎない。しかしながら、Shahriyari et al.は、本発明の操作された骨格筋組織の製造のために必要な必須の特徴に関する情報を欠いている。Kramer et al.（2014）は、多能性幹細胞からではなく、ラット筋芽細胞からの、操作された骨格筋の製造を記載する。
本発明は、操作された骨格筋組織、ならびに骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞およびサテライト細胞の調製方法であって、使用される培地が無血清であり、かつ異なる化学物質およびそれらの濃度、ならびに物理的刺激が定義されている、方法を記載する。追加的に、本明細書に記載の方法は、ヒト細胞への導入遺伝子のトランスフェクションなしに行われる。操作された骨格筋細胞は、筋芽細胞特異的な、筋管細胞特異的な、またはサテライト細胞特異的な遺伝子マーカーを呈し、これらの細胞種の効率的な分化を実証する。骨格筋組織は、その操作された製造にもかかわらず、非常に良好な刺激依存性収縮性を有し、かつ異なる刺激周波数に応答した収縮を示す。
本発明は、多能性幹細胞が、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞または骨格筋組織に分化および成熟される方法を含む。骨格筋組織は、細胞外マトリックス中に分散/包埋される。
本発明は、多能性幹細胞から、操作された骨格筋組織を製造するための方法であって、
（i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
（ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
有効量の（d）HGFを添加して培地中での培養を継続すること、続いて
有効量の（a）ガンマセクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
により、筋原性特化を誘導する工程;
（iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に拡大増殖および成熟させる工程;
（iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で機械的刺激下で、工程（iii）において取得され細胞外マトリックス中に分散されている細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
を含み、
それにより、操作された骨格筋組織を製造する、方法に関する。
追加的に、本発明は、多能性幹細胞から骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造するための方法であって、
（i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
（ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
有効量の（d）HGFを添加して培地中での培養を継続すること、続いて
有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
により、筋原性特化を誘導する工程;
（iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程、続いて
（iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（iii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
を含み、
それにより、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造する、方法に関する。
さらには、本発明は、サテライト細胞を伴う多核性成熟骨格筋繊維を有し、かつ血液供給および/または中枢神経系制御を有しない、操作された骨格筋組織に関する。これに関して、骨格筋繊維の存在は、アクチニンの染色によりおよびDAPIを用いて検出され得る。
追加的に、本発明は、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、工程（i）にしたがって調製および取得され、かつ遺伝子MSGN1および/またはTBX6の発現により特徴付けられ、MSGN1および/またはTBX6の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞に向けられている。これらの細胞はmRNA SP5を発現し、SP5の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る。
追加的に、本発明は、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、工程（i）～（ii）にしたがって製造および取得され、かつ遺伝子PAX3の発現により特徴付けられ、PAX3の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞に関する。これらの細胞はmRNA SIM1を発現し、SIM1の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る。
さらには、本発明は、骨格筋芽細胞であって、工程（i）～（iii）にしたがって製造および取得され、かつアクチニンの発現により特徴付けられ、アクチニンの発現が、フローサイトメトリーおよび/または骨格筋芽細胞における免疫染色により決定され得る、骨格筋芽細胞に関する。
本発明はさらに、サテライト細胞であって、工程（i）～（iii）にしたがって調製および取得され、遺伝子Pax7の発現により特徴付けられ、Pax7の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得、より好ましくはサテライト細胞がKi67をさらに発現する、サテライト細胞に関する。さらには、骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物は本発明によるものであり、フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合が、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、よりいっそう好ましくは少なくとも30％である;かつ/または、フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、全ての利用可能な細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％である。
さらには、本発明は、骨格筋管細胞であって、工程（i）～（iv）にしたがって調製および取得され、かつアクチニンタンパク質含有サルコメア構造の異方性配向により特徴付けられる、骨格筋管細胞に関する。
インビトロ薬物アッセイにおける、本発明による骨格筋組織、および/または本発明による細胞、および/または本発明による骨格筋管細胞の使用がさらに開示される。薬物試験は、薬理学的薬物候補および遺伝子治療薬候補の影響下での毒性アッセイまたは骨格筋組織機能のアッセイであってもよい。
追加的に、本発明は、医薬における使用のための本発明による骨格筋組織および/もしくは細胞、ならびに/または骨格筋管細胞に関する。
より特には、本発明は、損傷した骨格筋の療法ならびに/または骨格筋疾患、好ましくは遺伝子骨格筋欠陥、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび/もしくはベッカー-キーナー型筋ジストロフィー、および/もしくはリソソーム貯蔵疾患、特にポンペ病の治療における使用のための本発明によるサテライト細胞であって、好ましくは骨格筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、サテライト細胞に関する。
最後に、本発明は、以下のインビトロ方法に関する:
骨格筋組織に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本発明による骨格筋組織を提供する工程、
（b）任意で骨格筋組織に損傷を与える工程、および
（c）工程（a）または（b）の骨格筋組織を薬物候補と接触させる工程
を含み;
好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、骨格筋組織の収縮力および/もしくは構造ならびに/または代謝機能ならびに/または分子的パラメーターならびに/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法。
骨格筋組織に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本発明による骨格筋組織を提供する工程、
（b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される物質と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、骨格筋組織の収縮力および/もしくは構造ならびに/または代謝機能ならびに/または分子的パラメーターならびに/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法。
骨格筋組織性能に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本発明による骨格筋組織を提供する工程、
（b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、骨格筋組織の収縮力および/もしくは構造ならびに/または代謝機能ならびに/または分子的パラメーターならびに/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法。
中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本発明による中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）任意で工程（a）からの細胞に損傷を与える工程、および
（c）工程（a）または（b）の細胞を薬物候補と接触させる工程
を含み;
好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法。
中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本発明による中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）工程（a）の細胞を、試験される物質と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法。
中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本発明による中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）工程（a）の細胞を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法。
発明の詳細な説明
本開示は、多能性幹細胞から、操作された骨格筋組織を製造するための方法であって、
（i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
（ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
有効量の（d）HGFを添加して培地中での培養を継続すること、続いて
有効量の（a）ガンマセクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
により、筋原性特化を誘導する工程;
（iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に拡大増殖および成熟させる工程;
（iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で機械的刺激下で、工程（iii）において取得され細胞外マトリックス中に分散されている細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
を含み、
それにより、操作された骨格筋組織を製造する、方法に関する。
好ましい態様において、多能性幹細胞は霊長動物起源の細胞、特にヒト多能性幹細胞である。特に好ましい態様において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞、核移植を介して製造された多能性幹細胞、および化学的初期化を介して製造された多能性細胞より選択され、特に多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である。
「多能性幹細胞」は、身体の任意の細胞種に分化することができる。したがって、ヒト多能性幹細胞は、例えば、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞およびサテライト細胞を取得する相当な可能性を与える。現在、最も一般的に使用される多能性細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）または胚性幹細胞（ESC）である。ヒトESC系は、Thomson et al（Thomson et al,Science 282:1145-1147（1998））により最初に製造された。今日、ヒトESC研究は、体細胞をES様細胞に初期化するための新たな技術の開発を可能にする。この技術は、Yamanaka et al.により2006年に開発され、ヒト細胞にも応用可能である（Takahashi＆Yamanaka Cell 126:663-676（2006）およびTakahashi,Kazutoshi et al.Cell,131:（5）861-872（2007））。結果としてもたらされる人工多能性細胞（iPSC）は、ESCに非常に類似した挙動を示し、身体の任意の細胞に分化することもできる。さらには、別の態様において、単為生殖幹細胞を使用することができる。単為生殖幹細胞は、哺乳動物、好ましくはマウスの他にヒトにおいて、未受精卵母細胞のインビトロ活性化後に発生する胚盤胞から誘導され得る。これらの細胞は、多能性幹細胞の鍵となる特徴を呈し、その結果、インビトロで任意の細胞種に分化することができる（Espejel S et al.（2014））。よって、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、および単為生殖幹細胞より選択され得る。しかしながら、本発明の文脈において、多能性幹細胞は、ヒトの遺伝子同一性が生殖系列において変更されるか、またはヒト胚が産業もしくは商用目的のために使用される方法により製造されない。特に好ましい態様において、人工多能性幹細胞が選択される。
多能性幹細胞の骨格筋組織への方向付けられた細胞分化を達成するために、分化は、特有の因子または添加剤を用いて達成される。一般に、本発明による分化工程は、「基礎培地」の存在下で実行される。任意の好適な基礎培地が方法のために使用され得る。好ましくは、工程（i）～（iv）において使用される基礎培地は、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10およびHams F-12より選択される。好ましくは、工程（i）～（iv）において使用される基礎培地は、ピルビン酸塩を補充されたDMEMである。よりいっそう好ましくは、工程（i）～（iv）において使用される基礎培地は、1g/lのグルコースを含有するピルビン酸塩を補充されたDMEMである。基礎培地は、商業的に入手可能であるか、または例えばATCCのカタログからの、公開されている処方にしたがって調製することができる。非常に好ましい態様において、基礎培地は、1g/lのグルコース＋グルタミン調製物（例えば、L-アラニル-L-グルタミンまたはGlutaMAX（商標））を含むDMEMであり、表3に列記される物質からなる。適切とみなされる場合、基礎培地は、有効な濃度の非必須アミノ酸を補充されてもよい。好ましい態様において、基礎培地は、1有効濃度の、表2に列記される非必須アミノ酸を補充される。工程（ii）、（iii）および（iv）における基礎培地は、工程（i）において使用される基礎培地から独立して選択されてもよい。しかしながら、好ましい態様において、工程（i）～（iv）における基礎培地は同じである。
一般に、工程（i）～（iv）の異なる分化ステージは、特定のステージに特徴的な発現された遺伝子を使用して検出され得る。遺伝子発現を測定することができる1つの方法はRNAシークエンシング（RNA-Seq）である。RNAシークエンシングはトランスクリプトーム分析とも呼ばれる。RNAシークエンシングは、ハイスループット方法に基づくRNAのヌクレオチド配列の決定である。この目的のために、RNAはcDNAに変換（転写）され、その結果、DNAシークエンシング方法が適用され得る。そのため、RNAシークエンシングは、いずれのmRNAが発現されるのかについての情報を提供し、低いバックグラウンドノイズ、より高い分解能、および高い複製速度により特徴付けられる。当業者は、mRNAシークエンシングの方法に精通しており、それを行うことができる。本発明の実施例1は、RNAシークエンシングを使用して測定された例示的なデータを示す。特に、図4は、本発明の分化プロトコールの間の0～60日の時間枠中の異なる遺伝子のmRNA発現の時間経過を示す。
NANOG、POU5F1（OCT4）、およびZFP42のmRNA発現は多能性幹細胞に特徴的である。これらのマーカーを発現する細胞は多能性であることをこれは意味する。
本発明による多能性幹細胞の分化の間に、「中胚葉分化」が工程（i）において特有の因子/添加剤により誘導される。全ての左右相称動物（bilaterian animalsまたはbilateria）の他に、ヒトにおいて、中胚葉は、非常に初期の胚における3つの主要な胚葉のうちの1つである。左右相称動物において、中胚葉の3つの主な構成要素:沿軸中胚葉、中間中胚葉、および側板中胚葉がある。左右相称動物における沿軸中胚葉は、特には骨格筋を生じさせる。中胚葉分化の誘導は、特有の遺伝子の遺伝子発現、例えばMSGN1、TBX6、およびMEOX1のmRNAにより特徴付けられる。沿軸中胚葉発現に特異的なこれらのまたは他の遺伝子のmRNA発現は、本明細書に記載されるようなRNAシークエンシングにより測定され得る。
上記されるように、工程（i）の基礎培地は、有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む。受容体/酵素アゴニストまたは阻害剤の有効な濃度または量は、各々の物質の利用可能性および生物学的活性と共に変動することが当業者に公知である。
1つの態様において、FGF2の有効量は、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlである。
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK-3）は、リン酸残基を他のタンパク質のセリンおよびスレオニン残基に選択的に付加するセリン/スレオニンプロテインキナーゼである。グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3）の阻害は、多能性幹細胞の分化のためのWntシグナル伝達経路の活性化を助ける。例えば、基礎培地中のGSK3阻害剤は、CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、チデグルシブ、SB415286、6-ブロモインジルビン-3-オキシム、およびバルプロ酸塩からなる群より選択され、GSK3阻害剤CHIR99021が好ましい。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のGSK3阻害剤が使用され得る。GSK3阻害剤がCHIR99021である場合、有効量は、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMである。
SMAD阻害剤は、細胞発生および増殖を調節するために不可欠な重要性を持つタンパク質を阻害する。例えば、基礎培地中のSMAD阻害剤は、LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1からなる群より選択され、好ましくはSMAD阻害剤はLDN193189である。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のSMAD阻害剤が使用され得る。SMAD阻害剤がLDN193189である場合、有効量は、0.05～5μM、好ましくは0.1～2.5μM、より好ましくは0.2～1μM、よりいっそう好ましくは0.25～0.8μM、よりいっそう好ましくは0.3～0.75μM、よりいっそう好ましくは0.35～0.7μM、よりいっそう好ましくは0.4～0.6μM、よりいっそう好ましくは0.45～0.55μM、最も好ましくは約0.5μMである。阻害剤の有効な濃度または量は各々の物質の利用可能性および生物学的活性と共に変動し、これは全ての物質、例えばタンパク質/ペプチド、ヌクレオチドまたは化学的化合物に適用されることが当業者に公知である。
1つの態様において、無血清添加剤は、方法の工程（i）、（ii）、（iii）および（iv）において、50～500μg/mlのトランスフェリン（好ましくは70～300μg/mlのトランスフェリン、より好ましくは80～200μg/mlのトランスフェリン、よりいっそう好ましくは90～150μg/mlのトランスフェリン、最も好ましくは約100μg/mlのトランスフェリン）、
1～25μg/mlのインスリン（より好ましくは2～13μg/mlのインスリン、より好ましくは3～10μg/mlのインスリン、より好ましくは4～6μg/mlのインスリン、最も好ましくは約5μg/mlのインスリン）、
0.001～0.1μg/mlのプロゲステロン（好ましくは0.002～0.05μg/mlのプロゲステロン、より好ましくは0.004～0.01μg/mlのプロゲステロン、よりいっそう好ましくは0.005～0.008μg/mlのプロゲステロン、最も好ましくは約0.0063μg/mlのプロゲステロン）、
5～50μg/mlのプトレシン（好ましくは10～35μg/mlのプトレシン、より好ましくは12～25μg/mlのプトレシン、よりいっそう好ましくは14～18μg/mlのプトレシン、最も好ましくは約16μg/mlのプトレシン）;および
6～600nMのセレニウム（好ましくは12～300nMのセレニウム、より好ましくは20～150nMのセレニウム、よりいっそう好ましくは25～50nMのセレニウム、最も好ましくは約30nMのセレニウム）またはその生体利用可能な塩
の培地中の最終濃度で提供される。好ましい態様において、セレニウムは亜セレン酸塩として存在し、その有効濃度は、培地中の1～30μg/lの亜セレン酸塩（好ましくは2～20μg/lの亜セレン酸塩、より好ましくは3～10μg/lの亜セレン酸塩、よりいっそう好ましくは4～6μg/lの亜セレン酸塩、最も好ましくは約5μg/lの亜セレン酸塩）である。
上記の要求を満たす無血清添加剤は商業的に購入することができる。例えば、N2添加剤が使用され得る。好ましい態様において、無血清添加剤は、0.1～10％（v/v）のN2添加剤、好ましくは0.3～7.5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.5～5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.75％～2％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.9％～1.2％（v/v）のN2添加剤、最も好ましくは約1％（v/v）のN2添加剤の濃度のN2添加剤である。N2添加剤は100倍有効濃度において商業的に入手可能であり、組成は表1に列記される。これは、N2添加剤の1％（v/v）が1有効濃度に対応することを意味する。
好ましい態様において、方法の工程（i）は、24～132時間、好ましくは48～120時間、より好ましくは60～114時間、よりいっそう好ましくは72～108時間、より好ましくは84～102時間、最も好ましくは約96時間実行される。工程（i）の持続期間ならびに物質（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、および（d）無血清添加剤の濃度は、中胚葉分化の誘導の効率をモニターすることにより最適化されてもよい。上記のように、中胚葉分化の効率は、RNAシークエンシングにより追跡され得る。例えば、遺伝子マーカーMSGN1、TBX6およびMEOX1のうちの1つまたは複数が、RNAシークエンシングにより「リード/100万キロ塩基」により測定されたときに、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも10倍高い発現値、より好ましくは20倍高い発現値、よりいっそう好ましくは少なくとも30倍高い発現値、最も好ましくは少なくとも50倍高い発現値）を有する場合に、中胚葉分化の誘導が示される。
本発明による方法の工程（ii）において、「筋原性特化」が誘導される。この分化ステージは、特有の因子の発現により特徴付けられる。例えば、mRNA Pax3が筋原性特化において発現され、その発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る（図式的な概要について図1および図2を参照;PAX3の発現に関する実験データについて図4を参照）。例えば、遺伝子マーカーPax3が、RNAシークエンシングにより「リード/100万キロ塩基」により測定されたときに、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも10倍高い発現値、より好ましくは20倍高い発現値、よりいっそう好ましくは30倍高い発現値）を有する場合に、筋原性特化が示される。
上記のように、工程（ii）は3つの培養工程を含む。特には、工程（ii）は、有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤の基礎培地中で、工程（i）から取得された細胞を培養すること、続いて有効量の（d）HGFを添加して培地中での培養を継続すること、続いて有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養することを含む。
工程（i）と同様に、工程（ii）における基礎培地は、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10、およびHams F-12より選択されてもよい。追加的に、基礎培地は、非必須アミノ酸および/またはピルビン酸塩を補充されてもよい。工程（ii）における基礎培地についての例示的および好ましい態様は、工程（i）における例示的および好ましい態様に類似して選択されてもよい。工程（ii）における基礎培地は、工程（i）において使用される基礎培地から独立して選択されてもよい。しかしながら、好ましい態様において、工程（i）および（ii）における基礎培地は同じである。
例えば、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤は、DAPT、RO4929097、セマガセスタット（LY450139）、アバガセスタット（BMS-708163）、ジベンザゼピン（YO-01027）、LY411575、IMR-1、L685458からなる群より選択され、好ましくはガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤はDAPTである。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が使用され得る。ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTである場合、その有効量は、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMである。
工程（ii）において、FGF2の有効量は、例えば、15～30ng/ml、好ましくは17.5～25ng/ml、より好ましくは18～22ng/ml、よりいっそう好ましくは19～21ng/ml、最も好ましくは約20ng/mlである。
例えば、HGFの有効量は、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlである。
受容体/酵素アゴニストまたは阻害剤の有効な濃度または量は、各々の物質の利用可能性および生物学的活性と共に変動することが当業者に公知である。
本明細書において使用される場合、「KnockOut Serum Replacement」（KSR）という用語は、有効濃度のアスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、およびアルブミンを意味する。好ましい態様において、KSRは、有効濃度のセレニウムまたはその生体利用可能な塩、グルタチオン、および微量元素を追加的に含む。より好ましい態様において、KSRは、有効濃度の表5に列記される物質を含む。最も好ましい態様において、KSRは、指し示される濃度の表5の物質を含む。「KnockOut Serum Replacement」（KSR）は先行技術において公知であり、特許出願WO 98/30679の第27～29頁の製剤にしたがって調製することができる。代替的に、KSRは、例えばGibcoから、商業的に入手可能である。
好ましい態様において、KSRは、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用される。非常に好ましい態様において、KSRは、還元剤の存在下で使用される。任意の好適な還元剤を使用することができ、還元剤の例はベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールである。ベータ-メルカプトエタノールは、典型的には、0.02～0.5mMの濃度、より好ましくは0.05～0.02mMの濃度、最も好ましくは約0.1mMの濃度で使用される。代替的に、アルファ-チオグリセロールが、例えば、0.02～0.5mMの濃度、より好ましくは0.05～0.02mMの濃度、最も好ましくは約0.1mMの濃度で使用されてもよい。
1つの態様において、工程（ii）における培養は、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）無血清添加剤の存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
培養は、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、（c）無血清添加剤、および（d）HGFの存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
培養は、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）の存在下で、72～120時間、好ましくは76～114時間、より好ましくは84～108時間、よりいっそう好ましくは90～102時間、最も好ましくは約96時間実行される。
本発明の方法の工程（iii）において、細胞は、有利には、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に成熟および拡大増殖される。骨格筋芽細胞は、融合コンピテントであること、およびしたがってさらなる工程において融合されて骨格筋管細胞になる能力により特徴付けられる。筋肉幹細胞とも呼ばれるサテライト細胞は、小さい複能性（multipotent）細胞である。サテライト細胞は、（i）サテライト細胞または（ii）分化した骨格筋芽細胞を生じさせることができる。より特には、活性化後に、サテライト細胞は、細胞周期に再び入って、増殖および筋芽細胞への分化が可能である。方法の分化ステージは、特有の因子の発現により特徴付けられる。例えば、Pax7の発現は、サテライト細胞の存在に特徴的である。同時に、MyoDの発現は骨格筋芽細胞に特徴的であり、その各々の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る（図式的な概要について図1および図2を参照;MyoD1およびPAX7の発現に関する実験データについて図4を参照）。例えば、遺伝子マーカーMyoDが、RNAシークエンシングを使用して「リード/100万キロ塩基」により測定された場合に、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも10倍高い発現値、より好ましくは15倍高い発現値、よりいっそう好ましくは20倍高い発現値）を有する場合に、骨格筋芽細胞は存在する。例えば、遺伝子マーカーPAX7が、RNAシークエンシングにより「リード/100万キロ塩基」により測定された場合に、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも10倍高い発現値、より好ましくは15倍高い発現値、よりいっそう好ましくは20倍高い発現値）を有する場合に、サテライト細胞は存在する。
上記のように、工程（iii）の基礎培地は、有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む。工程（i）および（ii）と同様に、工程（iii）における基礎培地は、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10、およびHams F-12より選択されてもよく、基礎培地は、非必須アミノ酸および/またはピルビン酸塩を補充されてもよい。工程（iii）における基礎培地についての例示的および好ましい態様は、工程（i）における例示的および好ましい態様に類似して選択されてもよい。工程（iii）における基礎培地は、工程（i）および（ii）において使用される基礎培地から独立して選択されてもよい。しかしながら、好ましい態様において、工程（i）、（ii）および（iii）における基礎培地は同じである。
工程（iii）におけるKSRおよび任意の還元剤は、工程（ii）におけるKSRおよび任意の還元剤と同じ好ましい態様を含む。このように、KSRは、当業者により調製され得るか、または商業的に購入され得る。
工程（iii）において、HGFの有効量は、例えば、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
KSRは、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRは、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される。
受容体/酵素アゴニストまたは阻害剤の有効量または有効濃度は、各々の物質の利用可能性および生物学的活性と共に変動することが当業者に公知である。
本発明による方法の工程（iv）において、細胞は、有利には、骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟される。骨格筋管細胞は、骨格筋芽細胞の融合により形成される。したがって、骨格筋管細胞は、成熟筋芽細胞の長い薄い筋管細胞への融合により形成される多核細胞構造である。骨格筋管細胞は筋細胞または筋肉繊維とも呼ばれる。図2は、操作された骨格筋組織により経験される発生ステージの図式的な概要を提供し、操作された骨格筋組織の形成は先行技術において筋発生として公知である。骨格筋管細胞（筋肉繊維）は、アクチニン含有サルコメア構造の異方性配向により特徴付けられる。再生コンピテントサテライト細胞ニッチが、融合した骨格筋管細胞に隣接して形成される。サテライト細胞ニッチは、骨格筋管細胞の外部にあるが、骨格筋管細胞と密接に接触している。サテライト細胞ニッチは、解剖学的に特徴的であり、天然の骨格筋組織においても形成される。結果として、生成されたサテライト細胞と共に、それは、操作された骨格筋組織の別の望ましい品質特徴となる。この分化ステージは、特有の因子の発現によっても特徴付けられる。例えば、Pax7の発現は、サテライト細胞の存在に特徴的である。同時に、ミオゲニンおよびアクチニンの発現は骨格筋管細胞に特徴的であり、その各々の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る（図式的な概要について図1および図2を参照;PAX7（paired box 7）、ACTN2（アクチニンアルファ2）、DMD（ジストロフィン）、およびMYH3（ミオシン重鎖3）の発現に関する実験データについて図4を参照。例えば、PAX7のmRNAが、RNAシークエンシングにより「リード/100万キロ塩基」により測定された場合に、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも10倍高い発現値、より好ましくは15倍高い発現値、よりいっそう好ましくは20倍高い発現値）を有する場合に、サテライト細胞は存在する。例えば、遺伝子マーカーACTN2が、RNAシークエンシングにより「リード/100万キロ塩基」により測定された場合に、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも50倍高い発現値、より好ましくは100倍高い発現値、よりいっそう好ましくは150倍高い発現値）を有する場合に、骨格筋管細胞は存在する。実際に、DMDおよびMYH3遺伝子マーカーは、典型的には、多能性幹細胞と比較して少なくとも200倍高い発現値（好ましくは少なくとも500倍高い発現値、より好ましくは1000倍高い発現値）を有する。
上記のように、工程（iii）において取得された細胞は、細胞外マトリックス中に分散され、機械的擬態の下で成熟される。機械的擬態は、当技術分野において一般に公知かつ使用されるように、例えば、ストレッチングデバイスの補助と共に、行われ得る。好ましくは、ストレッチングデバイスは、静的な、位相的なまたは動的な歪力を発揮する。そのため、機械的歪力は、（a）静的、（b）位相的、または（c）動的であってもよい。静的な歪力の例は等尺性筋収縮であり、この場合、筋肉は緊張における変化のみを経験し、長さにおける変化を経験しない。そのため、短縮は等尺性筋収縮の間に筋肉において起こらない。位相的な歪力は準等張性筋収縮であることができ、この場合、筋肉は収縮の間に短縮し、筋肉にかかる緊張は同じままである。動的な歪力は、例えば、筋肉が柔軟な支持体に懸架されて増負荷性収縮が促進される場合に、起こり得る。増負荷性収縮において、筋肉の長さおよび筋肉の緊張の両方が変化する。好ましくは、工程（iv）における機械的刺激は、静的な機械的刺激、すなわち、静的な緊張（静的な歪力）である。工程（iii）からの細胞および細胞外マトリックスは、力および対向する力（対向力）の下にあることをこれは意味する。
上記されるように、工程（iv）の基礎培地は、有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む。
工程（iv）における基礎培地についての例示的および好ましい態様は、工程（i）における例示的および好ましい態様に類似して選択されてもよい。
方法の工程（iv）における追加の無血清添加剤は、追加の無血清添加剤が以下の物質の最終濃度を提供するように調製される:0.5～50mg/mlのアルブミン（好ましくは1～40mg/ml、より好ましくは2～30mg/ml、よりいっそう好ましくは3～20mg/ml、よりいっそう好ましくは4～10mg/ml、最も好ましくは4.5～7.5mg/ml、例えば約5mg/ml）;
1～100μg/mlのトランスフェリン（好ましくは2～90μg/ml、より好ましくは3～80μg/ml、よりいっそう好ましくは4～70μg/ml、よりいっそう好ましくは5～60μg/ml、より好ましくは6～50μg/ml、より好ましくは7～40μg/ml、より好ましくは8～30μg/ml、より好ましくは9～20μg/ml、例えば約10μg/ml）;
0.1～10μg/mlのエタノールアミン（好ましくは0.2～9μg/ml、より好ましくは0.3～8μg/ml、よりいっそう好ましくは0.4～7μg/ml、よりいっそう好ましくは0.5～6μg/ml、より好ましくは0.6～5μg/ml、より好ましくは0.7～4μg/ml、より好ましくは0.8～3μg/ml、最も好ましくは1～2.5μg/ml、例えば約2μg/ml）;
17.4～1744nMのセレニウムまたはその生体利用可能な塩（好ましくは35～850nM、より好ましくは70～420nM、よりいっそう好ましくは120～220μg/ml、最も好ましくは約174nM）;
0.4～40μg/mlのL-カルニチンHCl（好ましくは0.5～30μg/ml、より好ましくは1～20μg/ml、よりいっそう好ましくは2～10μg/ml、より好ましくは3～5μg/ml、最も好ましくは約4μg/ml）;
0.05～5μl/mlの脂肪酸添加剤（好ましくは0.1～4μl/ml、より好ましくは0.2～3μl/ml、よりいっそう好ましくは0.3～3μl/ml、より好ましくは0.4～2μl/ml、最も好ましくは0.45～1μl/ml、例えば約0.5μl/ml）;および
0.0001～0.1μg/mlのトリヨード-L-チロニン（T3）（好ましくは0.001～0.01μg/ml、より好ましくは0.002～0.0075μg/ml、よりいっそう好ましくは0.003～0.005μg/ml、最も好ましくは約0.004μg/ml）。
脂肪酸添加剤は、例えば、リノール酸および/またはリノレン酸を含んでもよい。
好ましい態様において、追加の無血清添加剤は、0.1～10μg/mlのヒドロコルチゾン（好ましくは0.2～9μg/ml、より好ましくは0.3～8μg/ml、よりいっそう好ましくは0.4～7μg/ml、よりいっそう好ましくは0.5～6μg/ml、よりいっそう好ましくは0.6～5μg/ml、よりいっそう好ましくは0.7～4μg/ml、よりいっそう好ましくは0.8～3μg/ml、最も好ましくは0.9～2μg/ml、例えば約1μg/ml）をさらに含む。同様に好ましい態様において、追加の無血清添加剤は、0.3～30μg/mlのインスリン（好ましくは0.5～25μg/ml、より好ましくは1～20μg/ml、よりいっそう好ましくは1.5～15μg/ml、よりいっそう好ましくは2～10μg/ml、最も好ましくは2.5～5μg/ml、例えば約3μg/ml）をさらに含む。例えば、セレニウムの生体利用可能な塩は、0.003～0.3μg/ml（好ましくは0.005～0.2μg/ml、より好ましくは0.01～0.1μg/ml、よりいっそう好ましくは0.02～0.05μg/ml、最も好ましくは0.03μg/ml、例えば約0.032μg/ml）の最終濃度が基礎培地中に提供されるような亜セレン酸ナトリウムである。
さらには、追加の無血清添加剤は、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ビタミンA、D-ガラクトース、リノレン酸、プロゲステロン、およびプトレシンからなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含んでもよい。これらの成分は細胞生存のために有益である。各々の成分の好適な濃度は、当業者に公知であるか、または常法の手段により容易に決定され得る。
工程（iv）において言及される追加の無血清添加剤の例は、刊行されたプロトコールにしたがって調製され得るか（Brewer et al.1993も参照）、または商業的に購入可能である。例えば、B27（表4）が使用されてもよい。好ましい態様において、B27添加剤は、0.1～10％のB27、好ましくは0.5～8％、より好ましくは1～6％、より好ましくは1.5～4％、よりいっそう好ましくは1.5～4％、最も好ましくは約2％のB27の量で使用される。
本発明は、工程（i）の前に播種工程が行われてもよく、取得される操作された骨格筋組織は生物工学的に作られた骨格筋（bioengineered skeletal muscle;BSM）と呼ばれる。播種工程において、多能性幹細胞がROCK阻害剤の存在下で幹細胞培地に播種され、好ましくは、播種工程は工程（i）の18～30時間前に行われる。例えば、ROCK阻害剤は、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤は、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤は、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤はY27632である。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のROCK阻害剤が使用され得る。有効量のROCK阻害剤の濃度は、問題とする阻害剤の利用可能性および阻害定数と共に変動することが当業者により理解される。例えば、Y27632の場合、播種工程において使用される培地は、0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用されてもよい。幹細胞培地が播種工程において使用されてもよく、原理的に、方法のために好適な任意の幹細胞培地が使用され得る。好適な幹細胞培地は当業者に公知であり、iPS-Brew XF幹細胞培地が特に好ましい。
さらには、播種工程において、多能性幹細胞は、幹細胞培地が加えられる前にマスターミックス中の細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分の存在下で、操作された形態で最初に播種されてもよい。播種工程において、多能性幹細胞は工程（i）の前に細胞外マトリックスに分散され、その結果、細胞は細胞外マトリックスに包埋されて、三次元構造において、操作された骨格筋組織に分化および成熟される。
「細胞外マトリックス」はスキャフォールドとして作用し、細胞増殖および分化のための構造的および機能的な微環境を提供する。細胞外マトリックスの組成は各天然組織に独特であるが、細胞外マトリックスの主成分は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ならびに様々な種類のグリコアミノグリカンおよびプロテオグリカンである。プロテオグリカンは、生物の細胞の間で安定化を達成する特に強くグリコシル化された糖タンパク質のクラスを形成する。ここで、それらは、他のプロテオグリカンおよびヒアルロン酸の両方の他に、タンパク質、例えば細胞外マトリックスの主成分であるコラーゲンと大きい複合体を形成する。ラミニンは、コラーゲンに類似した糖タンパク質である。フィブロネクチンもまた、細胞外コラーゲンの重合のために重要な糖タンパク質であり、特に組織修復において重要な役割を果たし得る。マスターミックス中の細胞外マトリックスの成分は、好ましくはコラーゲン、好ましくはI型コラーゲン、より好ましくはウシ起源、ヒト起源、またはマウス起源のもの、特にはウシ起源のコラーゲンである。任意で、細胞外マトリックスは、ラミニンおよび/またはフィブロネクチンを追加的に含む。
多能性幹細胞は、典型的には、1～6×106細胞/mlおよび0.7～1.4mg/mlのコラーゲンの比で培地中に播種される。1つの態様において、マスターミックスは、5～15％（v/v）、好ましくは7.5％～12.5％（v/v）、より好ましくは9～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のエンゲルブレス-ホルム-スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm（EHS））マウス肉腫細胞の滲出物を細胞外マトリックス成分として含む。特に好ましい態様において、滲出物はMatrigelである。マスターミックスのpHは典型的にはpH 7.2～pH 7.8である。Matrigelは当業者に公知であり、さらに先行技術において記載されている（Hughes et al.2010）。
EHSマウス肉腫細胞の滲出物の代替として、マスターミックスは間質細胞を含んでもよく、間質細胞は、細胞外マトリックス成分コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および/またはプロテオグリカンを生成する。マスターミックスのpHは典型的にはpH 7.2～pH 7.8である。
好ましい態様において、幹細胞培地は、操作された形態中のマスターミックスに約1時間後に加えられ、幹細胞培地は好ましくは有効濃度のKSRおよびFGF2を含む。例えば、幹細胞培地は、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRを含んでもよい。
有効量のFGF2は、典型的には1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlのFGF2である。
BSMを製造する場合、工程（iii）は、7～11日間、好ましくは8～10日間、最も好ましくは約9日間実行される。
代替的に、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞は、工程（iii）の後かつ工程（iv）の前に追加の工程において播種されることができ、取得される操作された骨格筋組織は、操作された骨格筋（ESM）と呼ばれる。ここで、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞は、マスターミックス中の細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分の存在下で、操作された形態で播種される。好ましくは、マスターミックス中の細胞外マトリックスの成分は、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲン、より好ましくはウシ起源、ヒト起源またはマウス起源のもの、特にウシ起源のコラーゲンであり、任意で細胞外マトリックスはラミニンおよび/またはフィブロネクチンを追加的に含む。工程（iii）の後かつ工程（iv）の前の播種工程において、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞は、例えば、培地中に1～10×106細胞/mlおよび0.7～1.4mg/mlのコラーゲンの比で播種される。
1つの態様において、マスターミックスは、5～15％（v/v）、好ましくは7.5％～12.5％（v/v）、より好ましくは9～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のエンゲルブレス-ホルム-スワーム（EHS）マウス肉腫細胞の滲出物を細胞外マトリックス成分として含む。特に好ましい態様において、滲出物はMatrigelである。マスターミックスのpHは典型的にはpH 7.2～pH 7.8である。
EHSマウス肉腫細胞の滲出物の代替として、マスターミックスは間質細胞を含んでもよく、間質細胞は、細胞外マトリックス成分コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および/またはプロテオグリカンを生成する。マスターミックスのpHは典型的にはpH 7.2～pH 7.8である。
好ましい態様において、約1時間後に、工程（iii）において使用されたものと同様の基礎培地が、操作された形態中のマスターミックスに加えられ、培地は有効量のROCK阻害剤を追加的に含む。例えば、ROCK阻害剤は、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286A、およびRKI1447からなる群より選択される。好ましくは、ROCK阻害剤は、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択される。より好ましくは、ROCK阻害剤は、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤はY27632である。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のROCK阻害剤が使用され得る。有効量のROCK阻害剤の濃度は、問題とする阻害剤の利用可能性および阻害定数と共に変動することが当業者に公知である。例えば、Y27632の場合、播種工程において使用される培地は、0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用されてもよい。
ESMを調製する場合、工程（iii）および工程（iv）の間に行われる播種工程の約1日後に、培地は、工程（iii）において使用されたものと同様の培地に交換され、細胞は次にこの培地中でさらに5～9日間、好ましくは6～8日間、最も好ましくは約7日間さらに培養される。
BSMまたはESMの調製において、操作された形態は、例えば、リング、リボン、ストランド、パッチ、ポーチ、またはシリンダーの形態であってもよく、任意で個々の骨格筋組織が融合されてもよい。個々のおよび/または異なる幾何形状が融合されて骨格筋組織が形成され得ること、ならびにそのため異なる筋肉形状が達成され得ることをそれは意味する。特にリング、ストランドまたはリボンの形態は、例えば毒性試験のための、インビトロ方法における応用のために有用である。典型的には、操作された形態は、マスターミックスを流し込むことにより得られるため、一般に、任意の所望の流し込み可能な操作された形態が製造され得る。
工程（iv）は、少なくとも19日間、好ましくは少なくとも28日間、より好ましくは少なくとも56日間、よりいっそう好ましくは少なくとも120日間、特に少なくとも240日間実行することができ、より長い培養が可能である。本発明者らは、240日（8か月）の培養を既に実行できているが、より長い培養期間を否定するものではない。
先行技術において開示される多くの方法とは対照的に、本発明による方法は、分化または成熟関連導入遺伝子を用いるトランスフェクション工程を含まない。好ましくは、方法は筋原性導入遺伝子を含まず、より好ましくは、方法はPax7導入遺伝子もMyoD導入遺伝子も含まない。「導入遺伝子」は、細胞に導入される遺伝子を指す。そのような導入遺伝子は、DNA（例えば、プラスミドの形態）またはRNAの形態で細胞にトランスフェクトされてもよい。導入遺伝子は次に細胞中で発現され、それにより細胞の特徴が変更される。例えば、転写因子を導入遺伝子として細胞に導入することができ、これは次に他の遺伝子の発現に影響する。そのため、筋原性導入遺伝子は、細胞集団中の骨格筋芽細胞の割合を増加させることができる。しかしながら、導入遺伝子、例えばPax7またはMyoDを用いるトランスフェクション実験は、実験および細胞種に依存して異なるトランスフェクション効率を有する。これにより、トランスフェクション工程を要求する方法は、より低い制御可能性およびそのためより低い再現性となる。そのため、導入遺伝子フリーの方法は、導入遺伝子でのトランスフェクションを要求する方法よりも有利である。しかしながら、多能性幹細胞が、例えば、疾患パターンをシミュレートするために、別の形態において遺伝子改変されることは除外され得ない。さらには、細胞種および/もしくは細胞機能（例えばカルシウムもしくは電圧シグナル）の遺伝子工学的に作られた標識化または例えば光遺伝学的機構を介する細胞機能（例えば収縮頻度）の制御は除外されない。
本発明による方法の別の利点は、特有の細胞種、例えば骨格筋芽細胞などのさらなる選択工程は要求されないことである。好ましくは、方法は、細胞選択による濃縮工程を含まず、より好ましくは、抗体ベースの細胞選択による濃縮工程を含まない。細胞は追加の工程においてそれらの環境から抽出される必要がないので、これは有利である。抗体ベースの細胞選択の1つの可能な方法はフローサイトメトリーであり、これは当業者に公知である。フローサイトメトリーによるそのような細胞選択は、著しい細胞損失と関連付けられる。したがって、フローサイトメトリーを介する精製は、スケール拡大を可能とせず、感染リスクと関連付けられ、したがって細胞製造物の商用応用への鍵となる障壁となる。本発明の方法は細胞選択を要求しないので、本発明の操作された骨格筋組織および細胞の製造はスケール拡大可能であり、商用または医療応用のために好適である。
追加的に、方法は無血清であり、そのため異なる種類の血清バッチに関するばらつきがない。これは、全ての必要な化学的および物理的刺激が定義された、操作された骨格筋組織の製造のための堅牢な再現性のあるプロトコールを結果としてもたらす。
本発明は、多能性幹細胞から骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造するための方法であって、
（i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
（ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
有効量の（d）HGFを添加して培地中での培養を継続すること、続いて
有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
により、筋原性特化を誘導する工程;
（iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程、続いて
（iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（iii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
を含み、それにより、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を生成する、方法にさらに関する。
例えば、この方法において生成される細胞は、フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、全ての利用可能な細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％である。
好ましくは、方法は、フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、最も好ましくは少なくとも30％の、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合を達成する。
「フローサイトメトリー」の方法は当業者に公知である。フローサイトメトリーにおいて、細胞集団の物理的および/または化学的特性が検出される。本明細書に記載の発明のために、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、またはサテライト細胞への分化に特徴的な骨格筋特異的タンパク質の存在が、蛍光染色を使用して検出され得る。特に、タンパク質サルコメアα-アクチニン、ミオゲニン、Pax7、およびMyoDが一次抗体と共にインキュベートされ、それにより標識される。蛍光標識された二次抗体の補助と共に、骨格筋特異的な細胞が検出され得る。
先行技術を上回る本方法の主要な利点は、それは細胞、例えば骨格筋芽細胞を濃縮する工程を要求しないことである。好ましくは、方法は、細胞選択による濃縮工程を含まず、より好ましくは、抗体ベースの細胞選択、例えばフローサイトメトリーなどによる濃縮工程を含有しない。本発明による方法は、高純度の骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞および/またはサテライト細胞を達成するために細胞選択を要求しないことをこれは意味する。細胞選択の方法は、製造された高純度の骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞およびサテライト細胞を実証するための分析目的のためにのみ本明細書に開示される（図5を参照）。
上記のように、工程（i）の基礎培地は、有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む。
例えば、基礎培地中のGSK3阻害剤は、CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、チデグルシブ、SB415286、6-ブロモインジルビン-3-オキシム、およびバルプロ酸塩からなる群より選択され、GSK3阻害剤CHIR99021が好ましい。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のGSK3阻害剤が使用され得る。GSK3阻害剤がCHIR99021である場合、有効量は、4～18μM、好ましくは5～16μM、より好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは8～13μM、よりいっそう好ましくは9～12μM、よりいっそう好ましくは9.5～11μM、最も好ましくは約10μMである。
工程（i）～（iii）の好ましい例示的な態様は、操作された骨格筋組織を調製する方法において記載されており、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞およびサテライト細胞を調製する方法に類似的に応用され得る。
分化の各々のステージは、当業者に公知の単純な実験的証拠により決定され得る。例えば、本発明者らは、蛍光顕微鏡法を使用して細胞を分析した。これは骨格筋特異的転写因子（Pax7、MyoD、およびミオゲニン）の免疫染色を伴う。方法の工程（iii）の後に、蛍光画像は、Pax7、MyoD、およびミオゲニンを発現する高いパーセンテージの細胞を示す（図3）。サテライト細胞（Pax7）の他に骨格筋芽細胞（MyoDおよびミオゲニン）が方法により生成されることをこの方法は示す。
本発明の方法の工程（iv）において、細胞は、骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟される。骨格筋管細胞は、骨格筋芽細胞の融合により生じる。したがって、骨格筋管細胞は、成熟筋芽細胞の長い筋管細胞への融合により形成される多核細胞構造である。骨格筋組織を製造するための方法の工程（iv）に記載されるように、この分化ステージはまた、特有の因子の発現により特徴付けられる。例えば、Pax7の発現は、サテライト細胞の存在に特徴的である。同時に、ミオゲニンおよびアクチニンの発現は骨格筋管細胞に特徴的であり、その各々の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る（図式的な概要について図1および図2を参照;PAX7、ACTN2、DMD、およびMYH3の発現に関する実験データについて図4を参照）。例えば、遺伝子マーカーPAX7が、RNAシークエンシングを使用して「リード/100万キロ塩基」により測定されたときに、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも10倍高い発現値、より好ましくは20倍高い発現値）を有する場合に、サテライト細胞が示される。例えば、遺伝子マーカーACTN2が、RNAシークエンシングにより「リード/100万キロ塩基」により測定されたときに、多能性幹細胞と比較して少なくとも5倍高い発現値（好ましくは少なくとも50倍高い発現値、より好ましくは100倍高い発現値、よりいっそう好ましくは150倍高い発現値）を有する場合に、骨格筋管細胞が示される。遺伝子マーカーDMDおよびMYH3は、多能性幹細胞と比較して少なくとも200倍高い発現値（好ましくは少なくとも500倍高い発現値、より好ましくは1000倍高い発現値）さえも呈する。
上記されるように、工程（iv）の基礎培地は、有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む。
方法の工程（iv）における追加の無血清添加剤は、追加の無血清添加剤が以下の物質の最終濃度を提供するように調製される:0.5～50mg/mlのアルブミン（好ましくは1～40mg/ml、より好ましくは2～30mg/ml、よりいっそう好ましくは3～20mg/ml、よりいっそう好ましくは4～10mg/ml、最も好ましくは4.5～7.5mg/ml、例えば約5mg/ml）;
1～100μg/mlのトランスフェリン（好ましくは2～90μg/ml、より好ましくは3～80μg/ml、よりいっそう好ましくは4～70μg/ml、よりいっそう好ましくは5～60μg/ml、より好ましくは6～50μg/ml、より好ましくは7～40μg/ml、より好ましくは8～30μg/ml、より好ましくは9～20μg/ml、例えば約10μg/ml）;
0.1～10μg/mlのエタノールアミン（好ましくは0.2～9μg/ml、より好ましくは0.3～8μg/ml、よりいっそう好ましくは0.4～7μg/ml、よりいっそう好ましくは0.5～6μg/ml、より好ましくは0.6～5μg/ml、より好ましくは0.7～4μg/ml、より好ましくは0.8～3μg/ml、最も好ましくは1～2.5μg/ml、例えば約2μg/ml）;
17.4～1744nMのセレニウムまたはその生体利用可能な塩（好ましくは35～850nM、より好ましくは70～420nM、よりいっそう好ましくは120～220μg/ml、最も好ましくは約174nM）;
0.4～40μg/mlのL-カルニチンHCl（好ましくは0.5～30μg/ml、より好ましくは1～20μg/ml、よりいっそう好ましくは2～10μg/ml、より好ましくは3～5μg/ml、最も好ましくは約4μg/ml）;
0.05～5μl/mlの脂肪酸添加剤（好ましくは0.1～4μl/ml、より好ましくは0.2～3μl/ml、よりいっそう好ましくは0.3～3μl/ml、より好ましくは0.4～2μl/ml、最も好ましくは0.45～1μl/ml、例えば約0.5μl/ml）;および
0.0001～0.1μg/mlのトリヨード-L-チロニン（T3）（好ましくは0.001～0.01μg/ml、より好ましくは0.002～0.0075μg/ml、よりいっそう好ましくは0.003～0.005μg/ml、最も好ましくは約0.004μg/ml）。
好ましい態様において、追加の無血清添加剤は、0.1～10μg/mlのヒドロコルチゾン（好ましくは0.2～9μg/ml、より好ましくは0.3～8μg/ml、よりいっそう好ましくは0.4～7μg/ml、よりいっそう好ましくは0.5～6μg/ml、よりいっそう好ましくは0.6～5μg/ml、よりいっそう好ましくは0.7～4μg/ml、よりいっそう好ましくは0.8～3μg/ml、最も好ましくは0.9～2μg/ml、例えば約1μg/ml）をさらに含む。同様に好ましい態様において、追加の無血清添加剤は、0.3～30μg/mlのインスリン（好ましくは0.5～25μg/ml、より好ましくは1～20μg/ml、よりいっそう好ましくは1.5～15μg/ml、よりいっそう好ましくは2～10μg/ml、最も好ましくは2.5～5μg/ml、例えば約3μg/ml）をさらに含む。例えば、セレニウムの生体利用可能な塩は、0.003～0.3μg/ml（好ましくは0.005～0.2μg/ml、より好ましくは0.01～0.1μg/ml、よりいっそう好ましくは0.02～0.05μg/ml、最も好ましくは0.03μg/ml、例えば約0.032μg/ml）の最終濃度が基礎培地中に提供されるような亜セレン酸ナトリウムである。
さらには、追加の無血清添加剤は、ビタミンA、ヒドロコルチゾン、D-ガラクトース、リノレン酸、プロゲステロン、およびプトレシンからなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含んでもよい。これらの成分は細胞生存のために有益である。各々の成分の好適な濃度は、当業者に公知であるか、または常法の手段により容易に決定され得る。
工程（iv）において言及される追加の無血清添加剤もまた商業的に入手可能である。例えば、B27が使用されてもよい。好ましい態様において、B27添加剤は、0.1～10％のB27、好ましくは0.5～8％、好ましくは1～6％、より好ましくは1.5～4％、よりいっそう好ましくは1.5～4％、最も好ましくは約2％のB27の量で使用される。
追加的に、この方法の工程（iv）は、少なくとも30日間、好ましくは少なくとも35日間、より好ましくは少なくとも40日間、よりいっそう好ましくは少なくとも50日間実行されてもよい。
この方法の工程（i）には播種工程が先行してもよく、播種工程では、多能性幹細胞がROCK阻害剤の存在下で幹細胞培地中に播種され、好ましくは播種工程は工程（i）の18～30時間前、好ましくは20～28時間前、より好ましくは22～26時間前、よりいっそう好ましくは23～25時間前、最も好ましくは約24時間前に行われる。例えば、ROCK阻害剤は、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤は、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤は、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤はY27632である。しかしながら、本発明の方法のために好適な任意のROCK阻害剤が使用され得る。有効量のROCK阻害剤の濃度は、問題とする阻害剤の利用可能性および阻害定数と共に変動することを当業者は理解する。例えば、Y27632の場合、播種工程において使用される培地は、0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用されてもよい。幹細胞培地が播種工程において使用されてもよく、原理的に、方法のために好適な任意の幹細胞培地が使用され得る。好適な幹細胞培地は当業者に公知であり、iPS-Brew XF幹細胞培地が特に好ましい。好ましくは、幹細胞培地は有効濃度のKSRおよびFGF2を含む。特に、幹細胞培地は、例えば、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSR;および/または
1～15ng/mlのFGF2、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlのFGF2を含む。
骨格筋組織を製造するための方法と同様に、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造するための方法の工程（i）～（iv）の分化ステージは、特定のステージに特徴的な発現された遺伝子を使用して検出され得る。RNAシークエンシングの方法は、骨格筋組織を製造するための方法と類似的にこの方法において使用される。よって、同じ発現された遺伝子（すなわちMSGN1、TBX6、MEOX1、PAX3、PAX7、MYOD1、ACTN2、DMD、MYH3）が分化ステージに依存して検出され得る。
骨格筋細胞を取得するための先行技術に開示される伝統的な方法は、多くの場合に、大規模な消化プロトコールおよび/またはフローサイトメトリーによる細胞選択工程を要求する。消化プロトコールは細胞を異なる環境に移し、それによりそれらは、細胞-細胞接続性の他に細胞-マトリックス接続性を喪失する。これは、細胞外環境および発生の間に形成される細胞種の空間分布を破壊し、制御が困難な骨格筋分化プロセスに対する阻害効果を有し得る。本発明は、消化工程の回数を最小化し、例えば骨格筋芽細胞を、濃縮するための細胞選択を要求せず、洗練されたプロトコールは、高純度の骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造する（少なくとも70％アクチニン陽性かつ少なくとも30％PAX7陽性の例示的な細胞集団が実施例に示される。図5も参照）。
本発明による方法により、有利な特性を有する操作された方式で製造される骨格筋組織が取得され得る。操作された方式で製造される骨格筋組織において、骨格筋管細胞の存在はアクチニンの染色により検出され得る（図8を参照）。特に、骨格筋組織は分化関連導入遺伝子も成熟関連導入遺伝子も含まず、好ましくは骨格筋組織は筋原性導入遺伝子を含まず、より好ましくは骨格筋組織は導入遺伝子Pax7もMyoDも含まない。天然の骨格筋組織と比較して、操作された骨格筋組織、例えばBSMまたはESMは、血液供給も中枢神経系制御も有しない。中枢神経系は当業者に公知であり、脊椎動物において脳および脊髄からなる。例えば、操作された骨格筋組織はまた、神経細胞による神経支配を有しない。血液供給は筋肉の血管新生を意味し、これは筋肉に血液を供給する。天然の骨格筋組織からの別の差異は、操作された骨格筋組織は、腱部分または骨を介する筋骨格付着を有さず、操作された骨格筋に完全にエクスビボで発生することである。そのため、操作された骨格筋組織は天然の骨格筋組織から明確に区別可能である。その操作された製造にもかかわらず、本発明による骨格筋組織はネイティブな骨格筋の多くの特徴を呈する。これらは、融合した筋細胞（筋肉繊維、多核骨格筋管細胞）の合胞体の形態学的特徴ならびに収縮性能（正の力-頻度比および強縮）を含む。先行技術の組織とは異なり、サテライト細胞ニッチは、骨格筋繊維との直接的な接触において形成される。追加的に、本発明にしたがって製造される骨格筋組織は横紋骨格筋の典型的な繊維を呈し、骨格筋組織は多くの筋肉繊維（合胞体）からなる。天然の骨格筋組織は多核骨格筋繊維を有し、各骨格筋繊維は一緒にストリング状となったサルコメアからなることが当業者に公知である。したがって、多核骨格筋繊維は、アクチン染色またはアクチニン染色におけるそれらの特徴的な横紋骨格筋パターンにより認識することができ、その理由はアクチン/アクチニンはサルコメア内で染色されるからである。サルコメアは、厳格な、規則的な構造を有し、それらは列に並べられ、一緒になって多核筋肉繊維を形成する。特徴的な横紋骨格筋パターンは多核骨格筋繊維が形成されたことを証明することをこれは意味する。特徴的な骨格筋組織構造（サテライト細胞ニッチを有する骨格筋繊維）は、アクチニンまたはアクチンおよびPax7の染色後に蛍光顕微鏡法により可視化されてもよい。本発明において本発明者らは、操作された骨格筋組織中の構造タンパク質アクチンを染色しており、図8の蛍光画像は特徴的な縞状パターンを例示する。
操作された骨格筋組織についての鍵となる機能的特徴は、組織は電気刺激に応答して収縮し、その結果、力を生成することである。この力生成特徴は、例えば、収縮出力を測定することにより、決定され得る。これらの収縮実験は、電気刺激に応答した、操作された骨格筋組織の収縮頻度および収縮力を測定する。リングの形態の骨格筋組織を、タイロード溶液（例えば、mmol/Lにおいて、120 NaCl、1 MgCl2、1.8 CaCl2、5.4 KCl、22.6 NaHCO3、4.2 NaH2PO4、5.6グルコース、および0.56アスコルビン酸塩）を含有する臓器浴（Fohr Medical Instruments）中、37℃で、5％のCO2および95％のO2での連続的なガス処理と共に試験した。操作された骨格筋組織が機械的に伸ばされ、最大力振幅（収縮力＝FOC）が、典型的には、1～100Hzの範囲内の電場刺激周波数（4ms矩形パルス;200mA）において測定される。本発明による組織のための例示的な測定方法は、図6B、図6C、図7B、および図7Cに示される。操作された骨格筋組織は、電気刺激に応答して力を生成する場合に特に有利な特性を呈することをこれらの収縮実験は示す。操作された骨格筋組織は、1Hz～100Hzの刺激周波数に応答して再現性のある収縮頻度および収縮力を示す。典型的には、1Hzの単一刺激において、収縮および完全な弛緩には約0.5秒を要する。収縮および緩和時間は約0.5秒を要するので、初発または完全強縮がより高い刺激周波数において形成される。強縮は、増加した刺激周波数で天然の骨格筋組織においても形成されるため、操作された骨格筋組織はこの点においてさえ天然の骨格筋組織と類似的に挙動する。さらには、筋肉組織の収縮力は収縮頻度の増加と共に増加すること（正の力-頻度関係性）を本発明者らは示すことができる。これらの特性はネイティブな骨格筋組織と合致し、ネイティブな骨格筋組織もまた、単収縮および強縮の他に、電気刺激に応答した正の力-頻度関係性を呈する。操作された骨格筋組織とは異なり、天然の筋肉組織における電気インパルスはニューロンの作用電位から生じる一方、操作された骨格筋組織は自発的に電気刺激に応答して収縮することができる。
図6B、図6C、図7B、図7C、および図8に例示されるように、本発明の方法により製造される、操作された骨格筋組織は、多核筋肉繊維（骨格筋管細胞）の特徴的な形成を有し、電気刺激に応答して力を生成する。典型的には、操作された骨格筋組織は、200mAにおける100Hzの刺激で少なくとも0.3ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.4mN、より好ましくは少なくとも0.5mN、より好ましくは少なくとも0.6mN、より好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、最も好ましくは少なくとも2mNの収縮力を生成することができる。
原理的に、操作された骨格筋組織は、任意の所望の形態を有することができる。例えば、それは、リング、リボン、ストランド、パッチ、ポーチ、またはシリンダー形態の、操作された形態を有してもよく、任意で個々の骨格筋組織が融合されている。例えば、本明細書の実施例において、骨格筋組織はリングの形態を有する。しかしながら、個々のおよび/または異なる幾何形状もまた所望により骨格筋組織に融合されてもよく、それにより、多くの他の異なる筋肉形態が達成され得る。特に、リング、ストランド、パッチまたはバンドの形態は、例えば毒性を試験するためまたはインビボでの筋肉修復のための治療応用のための、インビトロ方法における応用のために有用である。通常、操作された形態は、マスターミックスを流し込むことにより既に得られているため、一般に、任意の流し込み可能な操作された形態が製造され得る。
さらには、本発明は、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、本発明の工程（i）にしたがって取得され、MSGN1および/またはTBX6遺伝子の発現により特徴付けられ、MSGN1および/またはTBX6の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞を含む。これらの細胞はまた、SP5のmRNAを発現するということで特徴付けられ、SP5の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る。
追加的に、本発明は、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、本発明の工程（ii）にしたがって取得され、本発明の工程（i）および（ii）により製造され、遺伝子PAX3の発現により特徴付けられ、PAX3の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞に関する。これらの細胞は、SIM1のmRNAを発現するということで特徴付けられ、SIM1の発現は、RNAシークエンシングにより決定され得る。
さらには、本発明は、骨格筋芽細胞であって、本発明の工程（iii）にしたがって取得され、本発明の工程（i）～（iii）により製造され、アクチニンの発現により特徴付けられ、アクチニンの発現が、フローサイトメトリーおよび/または骨格筋芽細胞における免疫染色により決定され得る、骨格筋芽細胞に関する。
サテライト細胞であって、本明細書に開示される方法の工程（iii）にしたがって取得可能であり、かつ本明細書に開示される方法の工程（i）～（iii）により製造可能であり、遺伝子Pax7の発現により特徴付けられる、サテライト細胞が本開示によりさらに提供される。これに関して、Pax7の発現は、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る。サテライト細胞は、活性のまたは活性化可能な細胞周期により特徴付けられ、Pax7およびKi67を発現する。特に好ましい態様において、サテライト細胞はしたがってKi67をさらに発現する。操作された骨格筋組織における細胞周期活性化は、（例えば、圧力傷害、心臓毒処理、照射、または凍傷による）組織損傷後により頻繁に観察され、内因性の再生の意味で組織損傷の修復に繋がる。
骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物であって、フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、よりいっそう好ましくは少なくとも30％の、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合が達成され;かつ/または、フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％の、全ての利用可能な細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が達成される、混合物もまた開示される。
さらには、本発明は、骨格筋管細胞であって、本発明の工程（iv）にしたがって取得され、本発明の工程（i）～（iv）により製造され、アクチニンタンパク質含有サルコメア構造の異方性配向により特徴付けられる、骨格筋管細胞に関する。
有利には、操作された骨格筋組織、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、骨格筋芽細胞、サテライト細胞、および/または骨格筋管細胞は、インビトロ薬物アッセイにおいて使用されてもよい。薬物アッセイは、好ましくは、薬理学的薬物候補および遺伝子治療薬候補の影響下での毒性アッセイまたは骨格筋組織機能のアッセイである。薬理学的薬物候補は、典型的には、小分子化合物の他にタンパク質ベースの分子を含む薬物候補である。遺伝子治療薬候補は、典型的には、対応する核酸を導入することにより骨格筋組織のゲノムを変更する。
さらには、操作された骨格筋組織、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、骨格筋芽細胞、サテライト細胞、および/または骨格筋管細胞は、医薬において使用され得る。
ここで特に重要なのはサテライト細胞である。それらは、損傷した骨格筋の療法ならびに/または骨格筋疾患、好ましくは遺伝子骨格筋欠陥、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび/もしくはベッカー-キーナー型筋ジストロフィー、および/もしくはリソソーム貯蔵疾患、特にポンペ病の治療における使用のために想定され、好ましくは骨格筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。サテライト細胞は筋ジストロフィーの療法における臨床研究に既に応用されていることを当業者は先行技術から認識している（Tedesco FS et al.2010）。追加的に、サテライト細胞は、骨格筋疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、または筋硬直症の治療における使用のために考慮されている。筋硬直症は、弛緩の遅延および結果的に強直性筋収縮の病的な長期化を呈する様々な筋肉疾患を包含する。サテライト細胞は、骨格筋組織を連続的に再生させるため、損傷した骨格筋の療法のためおよび/または骨格筋疾患の治療のために特に好適である。「損傷した骨格筋組織」という用語は、外的な力により引き起こされる組織の傷害および負傷を指す。本発明の方法の工程（iii）または（iv）にしたがって取得されるヒトサテライト細胞は、特徴的なマーカーPax7を呈する。したがって、サテライト細胞は骨格筋組織の再生の増加に繋がるため、本発明によるサテライト細胞は、損傷した骨格筋組織における細胞ベースの療法のための有望な候補である（Yin et al.（2013））。同様に、本発明による操作された骨格筋組織は、損傷した骨格筋組織における細胞ベースの療法のため、特に大きい筋肉欠陥の治療のための有望な候補である。特に外傷または大きい筋肉破壊を伴う場合、置換組織、例えば操作された骨格筋組織の直接的な移植は、有望なアプローチである。骨格筋移植は、筋肉機能を回復させまたは治療的に支持するために、機能的に統合することができ、電気刺激または光遺伝学的活性化を介して制御可能であり得る。操作された骨格筋組織中のサテライト細胞の割合は、長期間の骨格筋の内因性の再生能力を確実にする。
操作された骨格筋組織の他に、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物はまた、分化および成熟のために重要な細胞機構を研究するための好適なモデルシステムである。そのため、それらは、基礎研究のための重要な科学ツールとなる。そのため、例えば、化学物質および、任意で、物理的刺激、例えばストレッチングまたは損傷が、ヒト身体の外側でヒト細胞においてまたは操作された骨格筋組織において試験され得る。本発明による細胞、骨格筋管細胞および操作された骨格筋組織は、薬理学的安全性および有効性実験を可能にし、それにより、細胞および組織に対する効果が試験され得る。これは動物実験（例えば、マウスまたはラット組織/細胞）を上回る明確な利点であり、薬理学的効果が例えばヒト組織、特定の態様において患者特異的な組織において試験され得る。天然の骨格組織に対する高い類似性に起因して、上記に開示される方法にしたがって製造される骨格組織は、有利には様々なインビトロ手順において使用され得る。
1つのそのような可能な応用は、骨格筋組織に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本明細書に記載の発明による骨格筋組織を提供する工程、
（b）任意で骨格筋組織に損傷を与える工程、および
（c）工程（a）または（b）の骨格筋組織を薬物候補と接触させる工程
を含み;
好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、骨格筋組織の収縮力および/もしくは構造ならびに/または代謝機能ならびに/または分子的および/もしくはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法である。
骨格筋組織の収縮力および/または構造は、本明細書に記載の収縮実験および本明細書に記載の蛍光顕微鏡法実験により測定されてもよい。例えば、代謝機能は、当業者に公知のSeahorse Metabolic Flux Analyzerを使用することにより測定され得る。例えば、Seahorse Metabolic Flux Analyzerは、生細胞の酸素消費および細胞外酸生成速度を測定し、重要な細胞機能、例えばミトコンドリア呼吸および解糖をさらに測定することができる。分子的パラメーター（マーカー）は、例えば、トランスクリプトーム分析（PCRまたはRNAシークエンシング）により測定され得る。タンパク質生化学的パラメーター（マーカー）は、例えば、質量分析または一般的な臨床化学測定方法（例えば、ELISAもしくは他の抗体および/もしくはクロマトグラフィーおよび/もしくは電気泳動および/もしくは親和性ベースの方法）を介して測定され得る。これらの分子的およびタンパク質生化学的パラメーターはマーカーまたはバイオマーカーとも呼ばれ、骨格筋に関する一般的なバイオマーカーは当業者に公知である。例えば、クレアチンキナーゼ（クレアチンキナーゼCK、CPK、またはクレアチンホスホキナーゼとしても公知）およびL-乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）はそのようなバイオマーカーである。
薬物候補は、薬理学的薬物候補、例えば小分子化合物およびタンパク質ベースまたは核酸ベースの分子を含む薬物候補を含む。さらには、薬物候補は遺伝子治療薬候補を含み、これは典型的には、対応する核酸を導入することにより本発明の細胞のゲノムを改変する。追加的に、薬物候補はまた、身体自身の物質であることができ、その結果、例えば、ホルモンまたはホルモン様シグナル物質の、効果が試験され得る。ホルモン様シグナル伝達物質の例は、マイオカイン、例えばミオスタチン、フォリスタチン、イリシン、ビスファチンおよびマイオネクチンである。
骨格筋組織に対する物質の毒性を試験するさらなるインビトロ方法であって、
（a）本明細書に記載の発明による骨格筋組織を提供する工程、
（b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される物質と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、骨格筋組織の収縮力および/もしくは構造ならびに/または代謝機能ならびに/または分子的および/もしくはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法が想定される。
収縮力および/または骨格筋組織構造は、本明細書に記載の収縮実験および本明細書に記載の蛍光顕微鏡法実験により測定されてもよい。代謝機能は、例えば、当業者に公知のSeahorse Metabolic Flux Analyzerを使用することにより、測定されてもよい。
毒性試験において使用される物質は、例えば薬物候補であり得るがこれに限定されない。むしろ、その毒性が評価されるべき任意の物質が試験され得る。
他の可能な応用は、骨格筋組織性能に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本明細書に記載の発明による骨格筋組織を提供する工程、
（b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される栄養分および栄養補助食品と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、骨格筋組織の収縮力および/もしくは構造ならびに/または代謝機能ならびに/または分子的および/もしくはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法に関する。
このインビトロ方法は、臨床的に関連する濃度での骨格筋組織に対する栄養分および栄養補助食品の効果を測定する機会を提供する。この方法は、筋肉成長、悪液質、または糖尿病におけるこれらの物質の効果を測定する場合に特に関心を持たれる。悪液質は、病的な、非常に重篤なやせ衰えであると理解される。慢性疾患、例えばがんまたは自己免疫疾患を有する多くの患者は、悪液質の追加の状態を患う。インビトロ方法は、身体の外側で骨格筋組織に対する物質の効果を測定する可能性を与える。
しかしながら、同様に、本明細書に開示される方法にしたがって調製される様々な細胞はまた、そのようなインビトロ方法において使用され得る。例えば、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本明細書に記載の発明による中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）任意で工程（a）からの細胞に損傷を与える工程、ならびに
（c）工程（a）または（b）の細胞を薬物候補と接触させる工程
を含み;
好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法が本明細書に記載される。
別の可能な応用は、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本明細書に記載の発明による中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）工程（a）の細胞を、試験される物質と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法に関する。
追加の可能な応用は、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）本明細書に記載の発明による中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物の混合物を提供する工程、
（b）工程（a）の細胞を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法に関する。
別の好ましい態様において、骨格筋組織は、100Hzの刺激で少なくとも0.6ミリニュートン（mN）の収縮力を生成することができ、好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、最も好ましくは少なくとも2mNが生成される。収縮力は、典型的には、刺激閾値より高くで測定される。刺激閾値を決定する好適な方法は当業者に公知である。例えば、収縮力は、200mAを用いる電場刺激において記録され得る（図6、図7、図9および図10を参照）。より好ましい態様において、骨格筋組織は、100Hzの刺激で少なくとも2ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも2.3mN、より好ましくは少なくとも2.6mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3mM、よりいっそう好ましくは少なくとも3.3mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3.6mN、最も好ましくは少なくとも4mNの収縮力を生成することができる。これは、典型的には、方法の工程（iv）が少なくとも50日間、例えば56日間実行される場合に起こる。本明細書に記載の操作された骨格筋組織の典型的な特徴は、収縮力が成熟の持続期間と共に増加することである。
別の好ましい態様において、骨格筋組織は、100Hzの刺激で少なくとも3mN/秒、好ましくは少なくとも4mN/秒、より好ましくは少なくとも5mN、より好ましくは少なくとも6mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも6.5mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも7mN/秒の収縮速度を有する。例えば、収縮速度は、200mAを用いる100Hzの刺激（5ms、単相または二相）で記録され得る。収縮速度は、力生成速度とも呼ばれ、それぞれ緊張の量、または緊張増加の速度を蓄積するために、操作された骨格筋組織のために要求される時間である。収縮速度は、等尺性収縮実験の文脈において収縮力における最大増加の時点（＋dFOC/dt）として決定される。
別の好ましい態様において、骨格筋組織は、100Hzの刺激の終了で少なくとも0.5mN/秒、好ましくは少なくとも0.7mN/秒、より好ましくは少なくとも0.9mN/秒、より好ましくは少なくとも1mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.2mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.5mN/秒の弛緩速度を有する。弛緩速度は、等尺性収縮実験の文脈において収縮力の最大減少の時点（-dFOC/dt）として骨格筋の弛緩期において決定される。
特に好ましい態様において、工程（iv）における基礎培地は、有効量のクレアチンおよび/またはトリヨード-L-チロニン（T3）を含んでもよい。例えば、クレアチンが成熟培地の基礎培地中に有効量で存在する場合、操作された骨格筋の収縮力は、有効量のクレアチンを用いない工程（iv）における成熟と比較して増加してもよい。収縮力におけるそのような増加は、実施例4および図9において実験データと共に示される。例えば、工程（iv）の基礎培地中の最終濃度としての有効量のクレアチンは0.1～10mMのクレアチンである。より好ましい濃度は、例えば、0.2～6mMのクレアチン、より好ましくは0.4～4mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.6～3mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.7～2.5mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.8～2mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.85～1.5mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.9～1.2mMのクレアチン、最も好ましくは約1mMのクレアチンである。
さらには、工程（iv）における成熟培地はまた、増加した量のT3を有してもよい。そのような増加した量のT3は、工程（iv）において増加した量のT3なしで調製される、操作された骨格筋組織と比較して、操作された骨格筋の収縮速度および/または弛緩速度を低減させてもよい。工程（iv）における基礎培地中の例示的な増加した量のT3は、0.001～1μMのトリヨード-L-チロニン（T3）、好ましくは0.005～0.7μMのT3、より好ましくは0.01～0.35μMのT3、よりいっそう好ましくは0.04～0.02μMのT3、よりいっそう好ましくは0.05～0.18μMのT3、よりいっそう好ましくは0.06～0.15μMのT3、よりいっそう好ましくは0.08～0.12μMのT3、よりいっそう好ましくは約0.1μMのT3である。さらには、実施例4の他に図10は、増加した濃度のT3の実験データと共に有利な効果を示す。
特に非常に好ましい態様において、工程（iv）における基礎培地は、有効量のクレアチンおよび/または増加した量のトリヨード-L-チロニン（T3）を所与の成熟期間にかけて含んでもよい。実施例4に示されるように、そのような期間は、4週、例えば、工程（iv）における1週目～5週目、または工程（iv）における5週目～9週目であってもよい。しかしながら、他の期間、例えば1～9週が、任意の成熟期間の間に選択されてもよい。例えば、この期間は、少なくとも1週、好ましくは少なくとも2週、より好ましくは少なくとも3週、より好ましくは少なくとも4週、よりいっそう好ましくは少なくとも5週、よりいっそう好ましくは少なくとも6週、よりいっそう好ましくは少なくとも7週、よりいっそう好ましくは少なくとも8週であってもよい。さらに、この期間は、例えば、最大9週、より好ましくは最大8週、より好ましくは最大7週、よりいっそう好ましくは最大6週、よりいっそう好ましくは最大5週、よりいっそう好ましくは最大4週であってもよい。本開示に照らして、当業者は、例示的な期間終点を自由に組み合わせることができる。
別の好ましい態様において、本明細書に記載の方法により製造される骨格筋組織は再生特性を有する。再生特性は、以前に存在した状態の天然の回復をもたらすことにより特徴付けられる。例えば、操作された骨格筋組織の収縮性は回復され得る。そのため、収縮性は回復され得、かつ/または筋肉は再建され得る。非常に好ましい態様において、再生特性は、回復された収縮性および/または筋肉再構築により特徴付けられ、好ましくは、収縮性および/または筋肉再構築を回復させる能力は、心臓毒への曝露および/または筋肉再構築の24時間後に測定され、より好ましくは、前記回復された収縮性および/または筋肉再構築は心臓毒曝露の10～30日後に測定される。心臓毒は、ポリペプチド毒素であり、永久的な脱分極を誘導することにより骨格筋細胞を破壊する。機能的に、心臓毒とのインキュベーションは、操作された骨格筋の収縮性の喪失を結果としてもたらす。構造的に、操作された骨格筋中の形成された筋管細胞の非可逆的な破壊が観察される。例えば2日後であっても、本明細書に記載の実施例5において収縮は記録され得なかった。図11に示されるように、再生特性を有する操作された骨格筋組織はこの収縮性を回復することができる。例えば、実施例5に記載されるように、筋肉は、心臓毒処理の21日後に再び収縮することができる。しかしながら、ガンマ放射線（X線）で処理された操作された骨格筋は再生特性を呈さず、例えば心臓毒インキュベーションの21日後であっても収縮することができない。操作された骨格筋組織において、骨格筋細胞が非可逆的に破壊される場合、再生能力を有する骨格筋細胞前駆細胞は保存され、細胞分裂および新たに形成される骨格筋細胞への分化により、操作された骨格筋組織中の収縮機能を有する骨格筋構造を再生しまたは再建できることをこの実施例は示す。図11に示されるように、再生特性を有する操作された骨格筋組織はこの筋肉再構築を達成することができる。図11Bは収縮力の再生を示し、図11C（上）は骨格筋の構造的再生を示す。ガンマ照射後の再生の失敗は、再生のための細胞分裂コンピテントな骨格筋前駆細胞（例えば、サテライト細胞）は心臓毒処理を生き延びたことを実証する。
実施例4に示されるように、手順の工程（iv）は数週にかけて行われ得る。非常に好ましい態様において、工程（iv）は、少なくとも50日間、より好ましくは少なくとも60日間、よりいっそう好ましくは少なくとも70日間、よりいっそう好ましくは少なくとも80日間行われる。本発明者らの現在の知識では、工程（iv）の持続期間の上限はない。例えば、工程（iv）の最大持続期間は、365日、好ましくは300日、より好ましくは250日であり得る。当業者は、本開示に照らして工程（iv）の例示的な期間限度を自由に組み合わせることができる。
さらには、本発明は、本明細書に記載されるような方法により製造される操作された骨格筋組織を含む。好ましい態様において、骨格筋組織は、100Hzの刺激で少なくとも0.6ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、より好ましくは少なくとも2mN、より好ましくは少なくとも2.3mN、より好ましくは少なくとも2.6mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3mM、よりいっそう好ましくは少なくとも3.3mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3.6mN、最も好ましくは少なくとも4mNの収縮力を生成する。収縮力は、例えば200mAの刺激において、記録され得る。
特に好ましい態様において、骨格筋組織は、100Hzの刺激で少なくとも3mN/秒、好ましくは少なくとも4mN/秒、より好ましくは少なくとも5mN/秒、より好ましくは少なくとも6mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも6.5mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも7mN/秒の収縮速度を有する。別の好ましい態様において、骨格筋組織は、100mN/秒の刺激を終了させた場合に少なくとも0.5mN/秒、好ましくは少なくとも0.7mN/秒、より好ましくは少なくとも0.9mN/秒、より好ましくは少なくとも1mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.2mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.5mN/秒の弛緩速度を有する。
本発明は、以下の態様によりさらに記載される。
1.多能性幹細胞から、操作された骨格筋組織を製造するための方法であって、
（i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
（ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
有効量の（d）HGFを添加して該培地中での培養を継続すること、続いて
有効量の（a）ガンマセクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
により、筋原性特化を誘導する工程;
（iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に拡大増殖および成熟させる工程;
（iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で機械的刺激下で、工程（iii）において取得され細胞外マトリックス中に分散されている細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
を含み、
それにより、操作された骨格筋組織を製造する、方法。
2.多能性幹細胞が霊長動物起源の細胞、特にヒト多能性幹細胞であり;かつ/または多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞、核移植を介して製造された多能性幹細胞、および化学的初期化を介して製造された多能性細胞より選択され、特に多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、態様1の方法。
3.工程（i）が、24～132時間、好ましくは48～120時間、より好ましくは60～114時間、よりいっそう好ましくは72～108時間、より好ましくは84～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、態様1または2の方法。
4.工程（i）において、GSK3阻害剤が、CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、チデグルシブ、SB415286、6-ブロモインジルビン-3-オキシムおよびバルプロ酸塩からなる群より選択され、好ましくはGSK3阻害剤がCHIR99021であり;かつ/または
工程（i）において、SMAD阻害剤が、LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1からなる群より選択され、好ましくはSMAD阻害剤がLDN193189である、
態様1～3のいずれかの方法。
5.工程（i）において、FGF2の有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
無血清添加剤が、培地中に、50～500μg/mlのトランスフェリン、1～20μg/mlのインスリン、0.001～0.1μg/mlのプロゲステロン、5～50μg/mlのプトレシンおよび6～600nMのセレニウムもしくはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウムの最終濃度を提供し、かつ/または
GSK3阻害剤がCHIR99021であり、かつ有効量が、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMであり;かつ/または
SMAD阻害剤がLDN193189であり、かつ有効量が、0.05～5μM、好ましくは0.1～2.5μM、より好ましくは0.2～1μM、よりいっそう好ましくは0.25～0.8μM、よりいっそう好ましくは0.3～0.75μM、よりいっそう好ましくは0.35～0.7μM、よりいっそう好ましくは0.4～0.6μM、よりいっそう好ましくは0.45～0.55μM、最も好ましくは約0.5μMである、
態様1～4のいずれかの方法。
6.工程（i）における無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.3～7.5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.5～5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.75％～2％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.9％～1.2％（v/v）のN2添加剤、最も好ましくは約1％（v/v）のN2添加剤である、態様1～5のいずれかの方法。
7.工程（i）、工程（ii）、工程（iii）、および/または工程（iv）における基礎培地が、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10、Hams F-12より選択され、基礎培地が好ましくはDMEMであり、特に基礎培地がピルビン酸塩および/もしくは非必須アミノ酸を補充されており、かつ/または1g/lのグルコースを含む、態様1～6のいずれかの方法。
8.工程（ii）において、培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）無血清添加剤の存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、（c）無血清添加剤、および（d）HGFの存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）の存在下で、72～120時間、好ましくは76～114時間、より好ましくは84～108時間、よりいっそう好ましくは90～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、
態様1～7のいずれかの方法。
9.工程（ii）において、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が、DAPT、RO4929097、セマガセスタット（LY450139）、アバガセスタット（BMS-708163）、ジベンザゼピン（YO-01027）、LY411575、IMR-1、L685458の群より選択され、好ましくはガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTである、態様1～8のいずれかの方法。
10.工程（ii）において、FGF2の有効量が、15～30ng/ml、好ましくは17.5～25ng/ml、より好ましくは18～22ng/ml、よりいっそう好ましくは19～21ng/ml、最も好ましくは約20ng/mlであり;かつ/または
HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTであり、かつ有効量が、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMであり;
KSRが、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
態様1～9のいずれかの方法。
11.工程（iii）において、
HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
KSRが、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
態様1～10のいずれかの方法。
12.工程（iv）において、追加の無血清添加剤が、培地中に、0.5～50mg/mlのアルブミン、1～100μg/mlのトランスフェリン、0.1～10μg/mlのエタノールアミン、17.4～1744nMのセレニウムまたはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウム、0.4～40μg/mlのL-カルニチン、0.05～5μl/mlの脂肪酸添加剤、0.0001～0.1μg/mlのトリヨード-L-チロニン（T3）の最終濃度を提供する、態様1～11のいずれかの方法。
13.工程（iv）における追加の無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のB27、好ましくは0.5～8％（v/v）、より好ましくは1～6％（v/v）、よりいっそう好ましくは1.5～4％（v/v）、最も好ましくは約2％（v/v）のB27である、態様1～12のいずれかの方法。
14.工程（iv）において、機械的刺激が、静的緊張、または動的刺激、または増負荷性刺激であり、好ましくは機械的刺激が静的緊張である、態様1～13のいずれかの方法。
15.工程（i）の前に播種工程を含み、該播種工程において、多能性幹細胞がROCK阻害剤の存在下で幹細胞培地に播種され、好ましくは、該播種工程が工程（i）の18～30時間前に実行される、態様1～14のいずれかの方法。
16.ROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤が、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤がY27632である、態様15の方法。
17.ROCK阻害剤がY27632であり、かつ0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用され;かつ/または
幹細胞培地がiPS-Brew XFである、
態様15または16の方法。
18.播種工程における多能性幹細胞が、幹細胞培地が加えられる前にマスターミックス中の細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分の存在下で、操作された形態で最初に播種される、態様15～17のいずれかの方法。
19.マスターミックス中の細胞外マトリックスの成分が、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲン、より好ましくはウシ起源、ヒト起源またはマウス起源のもの、特にウシ起源のコラーゲンであり、任意で細胞外マトリックスがラミニンおよび/またはフィブロネクチンを追加的に含む、態様18の方法。
20.多能性幹細胞が、1～6×106細胞/mlおよび0.7～1.4mg/mlのコラーゲンの比で培地中に播種される、態様19の方法。
21.マスターミックスが、5～15％（v/v）、好ましくは7.5％～12.5％（v/v）、より好ましくは9～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のエンゲルブレス-ホルム-スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm（EHS））マウス肉腫細胞の滲出物を細胞外マトリックス成分として含み、特に滲出物がMatrigelであり;かつ/または
マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
態様18～20のいずれかの方法。
22.マスターミックスが間質細胞を含み、間質細胞が、細胞外マトリックス成分コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および/もしくはプロテオグリカンを生成し;かつ/または
マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
態様18～20のいずれかの方法。
23.幹細胞培地が、約1時間後に、操作された形態中のマスターミックスに加えられ、幹細胞培地がKSRおよびFGF2を含む、態様18～22のいずれかの方法。
24.幹細胞培地が、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRを含み;かつ/または
幹細胞培地が、1～15ng/mlのFGF2、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlのFGF2を含む、態様23の方法。
25.工程（iii）が、7～11日間、好ましくは8～10日間、最も好ましくは約9日間実行される、態様18～24のいずれかの方法。
26.工程（iii）の後に、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞が、工程（iv）の前の追加の工程において、マスターミックス中の細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分の存在下で、操作された形態で播種される、態様1～17のいずれかの方法。
27.マスターミックス中の細胞外マトリックスの成分が、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲン、より好ましくはウシ起源、ヒト起源またはマウス起源のもの、特にウシ起源のコラーゲンであり、任意で細胞外マトリックスがラミニンおよび/またはフィブロネクチンを追加的に含む、態様26の方法。
28.骨格筋芽細胞およびサテライト細胞が、1～6×106細胞/mlおよび0.7～1.4mg/mlのコラーゲンの比で培地中に播種される、態様27の方法。
29.マスターミックスが、5～15％（v/v）、好ましくは7.5％～12.5％（v/v）、より好ましくは9～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のエンゲルブレス-ホルム-スワーム（EHS）マウス肉腫細胞の滲出物を細胞外マトリックス成分として含み、特に滲出物がMatrigelであり;かつ/または
マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
態様26～28のいずれかの方法。
30.マスターミックスが間質細胞を含み、間質細胞が、細胞外マトリックス成分コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および/もしくはプロテオグリカンを生成し;かつ/または
マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
態様26～28のいずれかの方法。
31.約1時間後に、工程（iii）において使用されたものと同様の培地が、操作された形態中のマスターミックスに加えられ、培地が有効量のROCK阻害剤を追加的に含み;
特にROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤が、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤がY27632である、
態様26～30のいずれかの方法。
32.ROCK阻害剤がY27632であり、かつ0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用される、態様31の方法。
33.約1日後に、培地が、工程（iii）において使用されたものと同様の培地で置き換えられ、かつ細胞がその後にこの培地中でさらなる5～9日間、好ましくは6～8日間、最も好ましくは約7日間さらに培養される、態様26～32のいずれか一つの方法。
34.操作された形態が、リング、リボン、ストランド、パッチ、ポーチ、またはシリンダーの形態を有し、任意で個々の骨格筋組織が融合されている、態様18～33のいずれかの方法。
35.工程（iv）が、少なくとも19日間、好ましくは少なくとも28日間、より好ましくは少なくとも56日間、よりいっそう好ましくは少なくとも120日間実行され、特に少なくとも240日間実行される、態様1～34のいずれかの方法。
36.分化関連導入遺伝子も成熟関連導入遺伝子も含まず、好ましくは筋原性導入遺伝子を含まず、より好ましくは導入遺伝子Pax7もMyoDも含まない、態様1～35のいずれかの方法。
37.骨格筋芽細胞濃縮工程を含まず、好ましくは、細胞選択による濃縮工程を含まず、より好ましくは、抗体ベースの細胞選択による濃縮工程を含まない、態様1～36のいずれかの方法。
38.多能性幹細胞から骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造するための方法であって、
（i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
（ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
有効量の（d）HGFを添加して該培地中での培養を継続すること、続いて
有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
により、筋原性特化を誘導する工程;
（iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程、続いて
（iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（iii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
を含み、
それにより、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造する、方法。
39.フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％の、全ての利用可能な細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が、前記方法により達成される、態様38の方法。
40.フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、最も好ましくは少なくとも30％の、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合が、前記方法により達成される、態様38または39の方法。
41.骨格筋芽細胞濃縮工程を含まず、好ましくは、細胞選択による濃縮工程を含まず、より好ましくは、抗体ベースの細胞選択による濃縮工程を含まない、態様38～40のいずれかの方法。
42.多能性幹細胞が霊長動物起源の細胞、特にヒト多能性幹細胞であり;かつ/または多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞、核移植を介して製造された多能性幹細胞、および化学的初期化を介して製造された多能性細胞より選択され、特に多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、態様38～41のいずれかの方法。
43.工程（i）が、48～132時間、好ましくは48～120時間、より好ましくは60～114時間、よりいっそう好ましくは72～108時間、より好ましくは84～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、態様38～42のいずれかの方法。
44.工程（i）において、GSK3阻害剤が、CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、チデグルシブ、SB415286、6-ブロモインジルビン-3-オキシムおよびバルプロ酸塩からなる群より選択され、好ましくはGSK3阻害剤がCHIR99021であり;かつ/または
工程（i）において、SMAD阻害剤が、LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1からなる群より選択され、好ましくはSMAD阻害剤がLDN193189である、
態様38～43のいずれかの方法。
45.工程（i）において、FGF2の有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
無血清添加剤が、培地中に、50～500mg/lのトランスフェリン、1～20mg/lのインスリン、1～30μg/lのプロゲステロン、5～50μg/mlのプトレシンおよび6～600nMのセレニウムもしくはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウムの最終濃度を提供し、かつ/または
GSK3阻害剤がCHIR99021であり、かつ有効量が、4～18μM、好ましくは5～16μM、より好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは8～13μM、よりいっそう好ましくは9～12μM、よりいっそう好ましくは9.5～11μM、最も好ましくは約10μMであり;かつ/または
SMAD阻害剤がLDN193189であり、かつ有効量が、0.05～5μM、好ましくは0.1～2.5μM、より好ましくは0.2～1μM、よりいっそう好ましくは0.25～0.8μM、よりいっそう好ましくは0.3～0.75μM、よりいっそう好ましくは0.35～0.7μM、よりいっそう好ましくは0.4～0.6μM、よりいっそう好ましくは0.45～0.55μM、最も好ましくは約0.5μMである、
態様38～44のいずれかの方法。
46.工程（i）における無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のN2添加剤、好ましくは0.3～7.5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.5～5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.75％～2％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.9％～1.2％（v/v）のN2添加剤、最も好ましくは約1％（v/v）のN2添加剤である、態様38～45のいずれかの方法。
47.工程（i）、工程（ii）、工程（iii）、および/または工程（iv）における基礎培地が、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10、Hams F-12より選択され、基礎培地が好ましくはDMEMであり、特に基礎培地がピルビン酸塩および/もしくは非必須アミノ酸を補充されており、かつ/または1g/lのグルコースを含む、態様38～46のいずれかの方法。
48.工程（ii）において、培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）無血清添加剤の存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、（c）無血清添加剤、および（d）HGFの存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）の存在下で、72～120時間、好ましくは76～114時間、より好ましくは84～108時間、よりいっそう好ましくは90～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、
態様38～47のいずれかの方法。
49.工程（ii）において、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が、DAPT、RO4929097、セマガセスタット（LY450139）、アバガセスタット（BMS-708163）、ジベンザゼピン（YO-01027）、LY411575、IMR-1、L685458の群より選択され、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が好ましくはDAPTである、態様38～48のいずれかの方法。
50.工程（ii）において、FGF2の有効量が、15～30ng/ml、好ましくは17.5～25ng/ml、より好ましくは18～22ng/ml、よりいっそう好ましくは19～21ng/ml、最も好ましくは約20ng/mlであり;かつ/または
HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTであり、かつ有効量が、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMであり;
KSRが、6～14％（v/v）、好ましくは7～13％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
態様38～49のいずれかの方法。
51.工程（iii）において、HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;
KSRが、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
態様38～50のいずれかの方法。
52.工程（iii）が、7～11日間、好ましくは8～10日間、最も好ましくは約9日間実行される、態様38～51のいずれかの方法。
53.工程（iv）において、追加の無血清添加剤が、培地中に、0.5～50mg/mlのアルブミン、1～100μg/mlのトランスフェリン、0.1～10μg/mlのエタノールアミン、17.4～1744nMのセレニウムまたはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウム、0.4～40μg/mlのL-カルニチン、0.05～5μl/mlの脂肪酸添加剤、0.0001～0.1μg/mlのトリヨード-L-チロニン（T3）の最終濃度を提供する、態様38～52のいずれかの方法。
54.工程（iv）における追加の無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のB27、好ましくは0.5～8％（v/v）、より好ましくは1～6％（v/v）、よりいっそう好ましくは1.5～4％（v/v）、最も好ましくは約2％（v/v）のB27である、態様38～53のいずれかの方法。
55.工程（iv）が、少なくとも30日間、好ましくは少なくとも35日間、より好ましくは少なくとも40日間、よりいっそう好ましくは少なくとも50日間実行される、態様38～54のいずれかの方法。
56.工程（i）の前に播種工程を含み、該播種工程において、多能性幹細胞がROCK阻害剤の存在下で幹細胞培地に播種され、好ましくは、該播種工程が工程（i）の18～30時間前に実行される、態様38～55のいずれかの方法。
57.ROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤が、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤がY27632である、態様56の方法。
58.ROCK阻害剤がY27632であり、かつ0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用され;かつ/または
幹細胞培地がiPS-Brew XFである、
態様56または57の方法。
59.幹細胞培地が、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRを含み;かつ/または
幹細胞培地が、1～15ng/mlのFGF2、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlのFGF2を含む、
態様58の方法。
60.サテライト細胞を伴う多核性成熟骨格筋繊維を有し、かつ血液供給および/または中枢神経系制御を有しない、操作された骨格筋組織であって;特に、骨格筋繊維の存在が、アクチニンの染色によりおよびDAPIを用いて決定される、操作された骨格筋組織。
61.骨格筋組織が無血清であり、かつ/または分化関連導入遺伝子も成熟関連導入遺伝子も含まず、好ましくは骨格筋組織が筋原性導入遺伝子を含まず、より好ましくは骨格筋組織が導入遺伝子Pax7もMyoDも含まない、態様60の操作された骨格筋組織。
62.骨格筋組織が、200mAにおける100Hzの刺激で少なくとも0.3ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.4mN、より好ましくは少なくとも0.5mN、より好ましくは少なくとも0.6mN、より好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、最も好ましくは少なくとも2mNの収縮力を生成する、態様60または態様61の操作された骨格筋組織。
63.骨格筋組織が操作により形成されており、好ましくはリング、リボン、ストランド、パッチ、ポーチ、またはシリンダー形態の、操作された形態を有し、任意で個々の骨格筋組織が融合されており、特には骨格筋組織がリングの形態を有する、態様60～62のいずれかの操作された骨格筋組織。
64.中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、態様1または態様38の工程（i）にしたがって取得され、態様1（i）または態様38（i）の方法により調製され、遺伝子MSGN1および/またはTBX6の発現により特徴付けられ、MSGN1および/またはTBX6の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得;かつ/またはmRNA SP5が発現されており、SP5の発現が、RNAシークエンシングにより決定され得る、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞。
65.筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、態様1または態様38の工程（ii）にしたがって取得され、態様1（i）～（ii）または態様38（i）～（ii）の方法により製造され、遺伝子PAX3の発現により特徴付けられ、PAX3の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得;かつ/またはmRNA SIM1が発現されており、SIM1の発現が、RNAシークエンシングにより決定され得る、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞。
66.骨格筋芽細胞であって、態様1または態様38の工程（iii）にしたがって取得され、態様1（i）～（iii）または態様38（i）～（iii）の方法により製造され、アクチニンの発現により特徴付けられ、好ましくはアクチニンの発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、骨格筋芽細胞。
67.サテライト細胞であって、態様1または態様38の工程（iii）にしたがって取得され、態様1（i）～（iii）または態様38（i）～（iii）の方法により製造され、遺伝子Pax7の発現により特徴付けられ、Pax7の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得、より好ましくはサテライト細胞がKi67をさらに発現する、サテライト細胞。
68.態様66の骨格筋芽細胞と態様67のサテライト細胞との混合物であって、フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、よりいっそう好ましくは少なくとも30％の、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合が取得され;かつ/または、フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％の、存在する全ての細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が取得される、混合物。
69.骨格筋管細胞であって、態様1または態様38の工程（iv）にしたがって取得され、態様1（i）～（iv）または態様38（i）～（iv）の方法により調製され、アクチニンタンパク質含有サルコメア構造の異方性配向により特徴付けられる、骨格筋管細胞。
70.インビトロ薬物アッセイにおける、態様60～63のいずれかの骨格筋組織、および/または態様64～68のいずれかの細胞、および/または態様69の骨格筋管細胞の使用であって;特に、薬物アッセイが、薬理学的薬物候補および遺伝子治療薬候補の影響下での毒性アッセイまたは骨格筋組織機能のアッセイである、使用。
71.医薬における使用のための、態様60～63のいずれかの骨格筋組織および/または態様64～68のいずれかの細胞、および/または態様69の骨格筋管細胞。
72.損傷した骨格筋の療法ならびに/または骨格筋疾患、好ましくは遺伝子骨格筋欠陥、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび/もしくはベッカー-キーナー型筋ジストロフィー、および/もしくはリソソーム貯蔵疾患、特にポンペ病の治療における使用のためのサテライト細胞であって、好ましくは骨格筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、態様67のサテライト細胞。
73.骨格筋組織に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）態様60～63のいずれかの骨格筋組織を提供する工程、
（b）任意で骨格筋組織に損傷を与える工程、および
（c）工程（a）または（b）からの骨格筋組織を薬物候補と接触させる工程
を含み;
好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、収縮力および/または骨格筋組織構造および/または代謝機能および/または分子的パラメーターおよび/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法。
74.骨格筋組織に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）態様60～63のいずれかの骨格筋組織を提供する工程、
（b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される物質と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、収縮力および/または骨格筋組織構造および/または代謝機能および/または分子的パラメーターおよび/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法。
75.骨格筋組織性能に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）態様60～63のいずれかの骨格筋組織を提供する工程、
（b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、収縮力および/または骨格筋組織構造および/または代謝機能および/または分子的パラメーターおよび/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
方法。
76.中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）態様64～69のいずれかの中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）任意で工程（a）からの細胞に損傷を与える工程、ならびに
（c）工程（a）または（b）の細胞を薬物候補と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、該発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法。
77.中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）態様64～69のいずれかの中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）工程（a）の細胞を、試験される物質と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、該発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法。
78.中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
（a）態様64～69のいずれかの中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
（b）工程（a）の細胞を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
を含み、
好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、該発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
方法。
79.骨格筋組織が、100Hzの刺激で少なくとも0.6ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、最も好ましくは少なくとも2mNの収縮力を生成する、態様1～59のいずれかの方法。
80.骨格筋組織が、100Hzの刺激で少なくとも2ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも2.3mN、より好ましくは少なくとも2.6mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3mM、よりいっそう好ましくは少なくとも3.3mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3.6mN、最も好ましくは少なくとも4mNの収縮力を生成する、態様1～59または79のいずれかの方法。
81.骨格筋組織が、100Hzの刺激で少なくとも3mN/秒、好ましくは少なくとも4mN/秒、より好ましくは少なくとも5mN/秒、より好ましくは少なくとも6mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも6.5mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも7mN/秒の収縮速度を有する、態様1～59、79、または80のいずれかの方法。
82.骨格筋組織が、100Hzの刺激の終了で少なくとも0.5mN/秒、好ましくは少なくとも0.7mN/秒、より好ましくは少なくとも0.9mN/秒、より好ましくは少なくとも1mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.2mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.5mN/秒の弛緩速度を有する、態様1～59または79～81のいずれかの方法。
83.工程（iv）における基礎培地が、有効量のクレアチンおよび/またはトリヨード-L-チロニン（T3）を含む、態様1～59または79～82のいずれかの方法。
84.基礎培地中の有効量のクレアチンが、有効量のクレアチンを用いない工程（iv）における成熟と比較して、操作された骨格筋の収縮力を増加させる、態様83の方法。
85.基礎培地中の有効量のT3が、有効量のT3を用いない工程（iv）における成熟と比較して、操作された骨格筋の収縮速度および/または弛緩速度を短縮させる、態様83または84の方法。
86.工程（iv）における基礎培地が、0.1～10mMのクレアチン、好ましくは0.2～6mMのクレアチン、より好ましくは0.4～4mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.6～3mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.7～2.5mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.8～2mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.85～1.5mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.9～1.2mMのクレアチン、最も好ましくは約1mMのクレアチンの最終濃度を提供する、態様1～59または79～85のいずれかの方法。
87.工程（iv）における基礎培地が、0.001～1μMのトリヨード-L-チロニン（T3）、好ましくは0.005～0.7μMのT3、より好ましくは0.01～0.35μMのT3、よりいっそう好ましくは0.04～0.02μMのT3、よりいっそう好ましくは0.05～0.18μMのT3、よりいっそう好ましくは0.06～0.15μMのT3、よりいっそう好ましくは0.08～0.12μMのT3、よりいっそう好ましくは約0.1μMのT3の最終濃度を提供する、態様1～59または79～86のいずれかの方法。
88.骨格筋組織が自己再生する特性を有する、態様1～59または79～87のいずれかの方法。
89.再生特性が、回復した収縮性および/または筋肉回復により特徴付けられ、好ましくは、前記回復した収縮性および/または筋肉回復が、心臓毒を用いた非可逆的な筋肉損傷後に測定され、より好ましくは、前記回復した収縮性および/または筋肉回復が、心臓毒とのインキュベーションの10～30日後に測定される、態様88の方法。
90.工程（iv）が、少なくとも50日間、より好ましくは少なくとも60日間、よりいっそう好ましくは少なくとも70日間、よりいっそう好ましくは少なくとも80日間実行される、態様1～59または79～89のいずれかの方法。
91.態様1～59または79～90のいずれかの方法により製造された、操作された骨格筋組織。
92.100Hzの刺激で少なくとも0.6ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、より好ましくは少なくとも2mN、より好ましくは少なくとも2.3mN、より好ましくは少なくとも2.6mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3mM、よりいっそう好ましくは少なくとも3.3mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3.6mN、最も好ましくは少なくとも4mNの収縮力を生成する、態様60～63または91のいずれかの操作された骨格筋組織。
93.100Hzの刺激で少なくとも3mN/秒、好ましくは少なくとも4mN/秒、より好ましくは少なくとも5mN/秒、より好ましくは少なくとも6mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも6.5mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも7mN/秒の収縮速度を有する、態様60～63または91～92のいずれかの操作された骨格筋組織。
94.100Hzの刺激の終了で少なくとも0.5mN/秒、好ましくは少なくとも0.7mN/秒、より好ましくは少なくとも0.9mN/秒、より好ましくは少なくとも1mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.2mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.5mN/秒の弛緩速度を有する、態様60～63または91～93のいずれかの操作された骨格筋組織。
95.インビトロ薬物アッセイにおける、態様60～63もしくは91～94のいずれかの骨格筋組織、および/または態様64～68のいずれかの細胞、および/または態様69の骨格筋管細胞の使用であって;特に、薬物アッセイが、薬理学的薬物候補および遺伝子治療薬候補の影響下での毒性アッセイまたは骨格筋組織機能のアッセイである、使用。
96.医薬における使用のための、態様60～63および91～94のいずれかの骨格筋組織、ならびに/または態様64～68のいずれかの細胞、ならびに/または態様69の骨格筋管細胞。
2D細胞培養における分化プロトコールの図式。2Dにおけるヒト多能性幹細胞（hPSC）の骨格筋芽細胞およびサテライト細胞への方向付けられた分化のための分化プロトコール。hPSCを前日に播種する。中胚葉誘導のために、細胞を、CHIR-99021、LDN193189、およびFGF-2を含む中胚葉誘導培地（ピルビン酸塩を補充した、1g/lのグルコースを含むDMEM）中で0日目から4日目まで培養する。筋原性特化のために、細胞を、DAPTおよびFGF-2を含有する培地中で4日目から6日目まで培養し、続いてDAPT、FGF-2、およびHGFを含有する培地中で6日目から8日目まで培養し、続いてDAPT、HGF、および「KnockOut Serum Replacement」（KSR）を含有する培地中で8日目から12日目まで培養する。筋原性拡大増殖および成熟のために、細胞を、HGFおよびKSRを含有する培地中で12日目から21日目まで培養する。筋原性成熟のために、細胞を、アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、カルニチン、脂肪酸、およびT3を含有する培地中で21日目から培養する。追加的に、培地は、0日目から21日目まで無血清添加剤N-2を含む。 多能性幹細胞から筋管細胞およびサテライト細胞への細胞分化の図式。以下のステージ:（i）多能性幹細胞、（ii）未分節中胚葉細胞、（iii）サテライト細胞を伴う筋芽細胞、（iv）サテライト細胞を伴う筋管細胞、および（v）サテライト細胞ニッチを伴う筋管細胞を含む、多能性幹細胞の筋管細胞への分化の図式的な表現。追加的に、分化の異なるステージの間のマーカー遺伝子の発現順序を示す。Oct4の発現は多能性幹細胞に特徴的である。MSGN1およびTbx6の発現は未分節中胚葉細胞に特徴的である。Pax3は、未分節中胚葉細胞から筋芽細胞への移行の間に主に発現される。Pax7発現は、サテライト細胞の存在に特徴的であり、未分節中胚葉ステージの終わりおよび筋芽細胞ステージの始めに最初に発現される。Pax7発現は筋芽細胞ステージにおいて最も高く、Pax7発現は筋管細胞ステージまでに平たくなるが、サテライト細胞ニッチ形成の徴候として残存する。MyoDの発現は筋芽細胞において最も強く存在し、筋管細胞においても検出可能である。ミオゲニンおよびアクチニンの発現は筋管細胞に特徴的であり、筋芽細胞にはほとんど発現されない。筋管細胞はサテライト細胞ニッチ、筋肉幹細胞ニッチを形成する。サテライト細胞ニッチはPax7陽性および静止性である。細胞周期は筋肉損傷で活性化され、その時点において細胞はまたKi67陽性である。 骨格筋細胞およびサテライト細胞の蛍光顕微鏡法。21日後の代表的な細胞培養における筋原性細胞の免疫染色（実施例1）。蛍光画像は、骨格筋特異的転写因子PAX7（上行左）、MyoD（中央行左）、およびミオゲニン（下行左）の発現を示す。PAX7はサテライト細胞を検出し、MyoDおよびミオゲニンは骨格筋芽細胞および/または骨格筋管細胞を検出する。さらには、蛍光画像は細胞核（核、右列）およびアクチンの発現（中央列）を示す。スケール:100μm。 RNAシークエンシングにより分析された骨格筋細胞へのヒト多能性幹細胞（hPSC）の分化の間の遺伝子発現パターン。方向付けられた分化は、胚骨格筋発生に類似した遺伝子発現パターンを示す。多能性および沿軸中胚葉に典型的な遺伝子の発現値（「リード/100万キロ塩基、RPKM」）を分化および成熟の時間にかけて図表的に示す（図4Aおよび図4B）。RNAシークエンシングにおいて、多能性に典型的な遺伝子、例えばNANOG、POU5F1、およびZFP42は、0および1日目に高い発現を示す。NANOGおよびPOU5F1は0日目に最も高い発現を示し、ZFP42は1日目に最も高い発現を示す。沿軸中胚葉に典型的な遺伝子、例えばMSGN1、TBX6、およびMEOX1は、1～8日目に高い発現を示す。MSGN1は1日目に最も高い発現を示し、TBX6は4日目に最も高い発現を示し、MEOXは8日目に最も高い発現を示す。分化および成熟の時間にかけての骨格筋特異的転写因子およびサルコメアの典型的な遺伝子の発現値（「リード/100万キロ塩基、RPKM」）を図表的に示す（図4Cおよび図4D）。骨格筋特異的転写因子、例えばPAX3、PAX7、およびMYOD1は、それぞれ8、29、および60日目に最も高い発現を示す。サルコメアに典型的な遺伝子、例えばACTN2、DMD、およびMYH3は、60日目に最も高い発現を示す。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 ヒト多能性幹細胞（hPSC）の骨格筋細胞への方向付けられた分化における効率の分析。4つの独立した多能性幹細胞系（iPSC（WT 1）、iPSC（WT 2）、DMD iPSC、補正DMD iPSC）からの筋肉細胞（アクチニンの他にミオゲニンまたはMyoD陽性）およびサテライト細胞（PAX7陽性）の割合のフローサイトメトリー決定。アクチニン陽性細胞の割合は4つの細胞系において71～77.6％であり、ミオゲニン陽性細胞の割合は4つの細胞系において41.4％～60.4％であり、MyoD陽性細胞の割合は4つの細胞系において40％～54.1％であり、PAX7陽性細胞の割合は4つの細胞系において33.4％～43.8％である。 hPSCに由来する骨格筋芽細胞からの、操作された骨格筋組織（ESM）の製造。（A）ESM培養プロトコールの図式。実施例1からの21日齢細胞プールを細胞外マトリックス（コラーゲン/Matrigel）に注ぎ、拡大増殖条件下で7日間リング形状鋳型（左パネル）中で培養する。形成されたリングをその後にストレッチング装置（中央画像）に移し、成熟条件下でさらに培養する。さらなる4週後に、ESM機能を臓器浴（右画像）中で測定する;スケール:5mm。（B）異なる刺激周波数における、操作された骨格筋組織の代表的な収縮力曲線:1Hz（破線:各約0.5ミリニュートンの収縮力（「FOC」）を伴う約500msの単一持続期間を有する8つの単収縮）、10Hz（実線:約1ミリニュートンの収縮力（「FOC」）を伴う初発強縮、個々の収縮は図表的に区別可能）、100Hz（一点鎖線:約2.2ミリニュートンの収縮力（「FOC」）を伴う十分に発生された強縮）。（C）電気刺激周波数に依存する骨格筋組織のミリニュートン（mN）での収縮力（「FOC」）;n＝3。1Hzの刺激について、収縮力の平均は0.5ミリニュートンであり;10Hzの刺激について、収縮力の平均は0.9ミリニュートンであり;20Hzの刺激について、収縮力の平均は1.1ミリニュートンであり;40Hzの刺激について、収縮力の平均は1.4ミリニュートンであり;60Hzの刺激について、収縮力の平均は1.55ミリニュートンであり;80Hzの刺激について、収縮力の平均は1.6ミリニュートンであり;100Hzの刺激について、収縮力の平均は2.1ミリニュートンである。 hPSCからの生物工学的に作られた骨格筋（BSM）の製造。（A）BSM培養プロトコールの図式。ヒト人工多能性幹細胞をコラーゲン/Matrigelハイドロゲル中でリング形状鋳型に流し込み、3Dにおいて骨格筋組織に分化させる。形成されたリングを21日目にストレッチング装置に移し、成熟条件下でさらに培養する。さらなる4週後に、BSM機能を典型的には臓器浴中で測定する。特に、この目的のために、ヒト人工多能性幹細胞を最初にコラーゲン/Matrigelハイドロゲルに分散させ、Y-27632およびKSRを含有するBrew XF中で24hコンディショニングする（-1日目）。細胞を次に、CHIR-99021、LDN193189およびFGF-2を含有する培地中で0日目から4日目まで培養する。細胞を、DAPTおよびFGF-2を含有する培地中で4日目から6日目まで培養し、続いてDAPT、FGF-2、およびHGFを含有する培地中で6日目から8日目まで培養し、続いてDAPT、HGF、および「KnockOut Serum Replacement」（KSR）を含有する培地中で8日目から12日目まで培養する。細胞を、HGFおよびKSRを含有する培地中で12日目から21日目まで培養する。21日目から50日目まで、細胞を、静的ストレッチング装置上、すなわち、機械的ストレッチング下で、成熟培地中で培養する。追加的に、0日目から50日目まで、培地は無血清添加剤N-2を含む。（B）異なる刺激周波数における、操作された骨格筋組織の代表的な収縮力曲線:1Hz（破線:それぞれ約0.7ミリニュートンの収縮力（「FOC」）を伴う、約600msの単一持続期間を有する8つの単収縮）および100Hz（実線:約1.1ミリニュートンの収縮力（「FOC」）を伴う十分に発生した強縮）。（C）電気刺激周波数に依存する骨格筋組織のミリニュートン（mN）での収縮力（「FOC」）;n＝3。1Hzの刺激について、収縮力の平均は0.3ミリニュートンであり;10Hzの刺激について、収縮力の平均は0.5ミリニュートンであり;20Hzの刺激について、収縮力の平均は0.55ミリニュートンであり;40Hzの刺激について、収縮力の平均は0.6ミリニュートンであり;60Hzの刺激について、収縮力の平均は0.65ミリニュートンであり;80Hzの刺激について、収縮力の平均は0.72ミリニュートンであり;100Hzの刺激について、収縮力の平均は0.9ミリニュートンである。 図７Ａの説明を参照。 図７Ａの説明を参照。 ESMおよびBSM方法により製造された骨格筋組織の蛍光顕微鏡法。ESM（実施例1および2）ならびにBSM（実施例3）方法により調製された代表的な骨格筋組織中のアクチンおよびDNAの免疫染色。蛍光画像は、特徴的な縞状パターン（アクチンの染色）により特徴付けられる多核性成熟骨格筋繊維を示す。スケール:50μm（ESM）および10μm（BSM）。 クレアチン処理によるESM機能の増強。A）4週にかけての1mMのクレアチンの追加投与を伴う5または9週にかけてのESM成熟の実験手順。B）5および9週の培養後のESMにおける100Hz電場刺激に応答した収縮力（FOC）;培養はAに示される通りであり、クレアチンの添加を伴ったか（右バー）または伴わなかった（左バー）;n＝3/群;＊p＜0.05スチューデントt検定。 甲状腺ホルモン処理によるESM機能の増強。A）4週にかけての0.1μmol/Lのトリヨード-L-チロニン（T3）の追加投与を伴う5または9週にかけてのESM成熟の実験スキーム。（B）代表的な曲線と共に100Hz電場刺激時およびその後の緊張（＋dFOC/dt）および弛緩（-dFOC/dt）の最大速度。5週目（56日目）および9週目（84日目）におけるT3あり（灰色）およびなし（黒）で処理されたESMの比較;n＝4～11/群;＊p＜0.05スチューデントt検定。C）T3あり（灰色バー）およびなし（黒バー）での9週のESM培養物におけるミオシン重鎖タンパク質2（MYH2;高速アイソフォーム）、ミオシン重鎖タンパク質7（MYH7;緩慢アイソフォーム）、およびミオシン重鎖タンパク質3（MYH3;胚性アイソフォーム）のタンパク質含有量;n＝3/群;＊p＜0.05スチューデントt検定。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 操作された骨格筋の再生能力。A）培養22および60日目の2D培養物の他に、培養60日目のESM（ESMは22日目の2D培養物から調製した）における骨格筋前駆細胞/幹細胞マーカーのRNAシークエンシングによるRNA検出（リード/100万キロ塩基、RPKM）。＊p＜0.05 一元配置ANOVAおよびチューキーの多重比較検定。B）培養60日目におけるESM（左）および2D（右）培養物中のESMにおける骨格筋細胞前駆細胞（Pax7）:Pax7（明るい核）、ラミニン、f-アクチン（細長い筋肉細胞体）、および核の免疫蛍光染色;バー:20μm。拡大図は、ESMおよび2D培養物中のサテライト細胞ニッチ（骨格筋細胞前駆体）を表す。C）心臓毒（CTX）傷害の実験スキーム。ESMを25μg/mlのCTXと共に24時間インキュベートした。照射群は、30Gy（ガンマ照射）で処理した24時間後にCTX傷害を行って細胞増殖およびそれと関連付けられる再生を阻害した。D）CTX傷害（25μg/ml）またはビヒクル処理（Veh.）後の指し示される時点におけるガンマ照射なし（左バー）またはあり（右バー）でのESMの100Hz強縮における収縮力（FOC）;n＝3～4、＊p＜0.05対対照＋2日目、＊p＜0.05一元配置ANOVAおよびチューキーの多重比較検定。E）Aのスキームによるガンマ照射ありおよびなしの群におけるCTX傷害の21日後のESMにおけるサルコメアアクチニンおよび核の免疫染色。非照射対照群における筋肉成長はESM中の筋肉細胞前駆体からの新たな筋肉細胞の増殖および分化に起因する。バー:50μm。 図１１Ａの説明を参照。 図１１Ａの説明を参照。 図１１Ａの説明を参照。 図１１Ａの説明を参照。
以下の実施例は、本発明の実例をさらに示すことを意図し、本発明を限定することは意図されない。実施例は技術的特徴を記載し、本発明はまたこのセクションに提示される技術的特徴の組合せに関する。全ての実施例において使用された方法および材料は、実施例の後に記載される。
実施例1:2D細胞培養におけるヒト多能性幹細胞（hPSC）の骨格筋細胞およびサテライト細胞への方向付けられた分化。
2D細胞培養における人工多能性幹細胞の骨格筋細胞およびサテライト細胞への方向付けられた分化のための方法を開発した。ここに記載される方法は導入遺伝子フリーかつ無血清である。ヒト骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞は、この方法により高純度で生成され得る。この方法において、剤（小分子および阻害剤および刺激因子）の特有の時間的配列を使用してヒト多能性幹細胞の分化を誘導した。多能性幹細胞の異なる分化ステージにおいて、異なる遺伝子が発現された。分化の間の典型的な遺伝子発現は遺伝子発現パターンとも呼ばれる。これらの遺伝子発現パターンはまた、ヒト身体において胚骨格筋発生の間に経験される。分化プロトコールの図式を図1に示し、それは培地への異なる剤の一連の添加を示す。追加的に、図1は、骨格筋芽細胞/筋管細胞およびサテライト細胞への分化の間に経験される分化ステージ、すなわち、中胚葉分化の誘導、筋原性特化の誘導、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞への（筋原性）拡大増殖および成熟、ならびに骨格筋管細胞およびサテライト細胞への成熟を示す。
方法を行うために、ヒト多能性幹細胞を1.7×104細胞/cm2の密度でMatrigelコーティングしたプレートに前日にプレーティングし、5μMのRock阻害剤（Stemolecule Y27632）を含む12mlのStemMACS（商標）iPS-Brew XF培地の存在下で培養して（細胞培養プレートにMatrigelをコーティングする方法は実施例1の終わりにある）、細胞培養物を翌日（0日目）に約30％コンフルエントとした。しかしながら、プレーティングのための最適な細胞数は、各細胞系について個々に決定されなければならない。
N2-FCL培地中での培養は多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導した。0、1、2、および3日目の各々に、培地を15mlのN2-FCL培地で置き換え、1日毎に交換した。N2-FCL培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（100x）（Thermo Scientific）、1％の非必須アミノ酸（100x）（MEM-NEAA、Invitrogen）、10ng/mlの組換えbFGF（Peprotech）、10μMのCHIR-99021（Stemgent）、0.5μMのLDN193189（Stemgent））を含有するDMEM。
N2-FD、N2-FHDおよびN2-HKD培地中で培養することにより筋原性特化を誘導した。4および5日目に、培地をN2-FD培地で置き換え、1日毎に交換した。N2-FD培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（100x）（Thermo Scientific）、1％の非必須アミノ酸（100x）（MEM-NEAA、Invitrogen）、20ng/mlの組換えbFGF（Peprotech）、10uMのDAPT（TOCRIS）を含むDMEM。
6および7日目に、培地をN2-FHD培地で置き換え、1日毎に交換した。N2-FHD培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（100x）（Thermo Scientific）、1％の非必須アミノ酸（100x）（MEM-NEAA、Invitrogen）、20ng/mlの組換えbFGF（Peprotech）、10μMのDAPT（TOCRIS）、10ng/mlの組換えHGF（Peprotech）を含むDMEM。
8、9、10および11日目に、培地をN2-HKD培地で置き換え、1日毎に交換した。N2-HKD培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（100x）（Thermo Scientific）、1％の非必須アミノ酸（100x）（MEM-NEAA、Invitrogen）、0.1mMの2-メルカプトエタノール（Invitrogen）、10μMのDAPT（TOCRIS）、10ng/mlの組換えHGF（Peprotech）、10％のKnockOut Serum Replacement（Life Technologies）を含むDMEM。
N2-HK培地中で培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に筋原性拡大増殖および成熟させた。12～20日目に、培地をN2-HK培地（拡大増殖培地）で置き換え、1日おきに交換した。N2-HK培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（100x）（Thermo Scientific）、1％の非必須アミノ酸（100x）（MEM-NEAA、Invitrogen）、0.1mMの2-メルカプトエタノール（Invitrogen）、10ng/mlの組換えHGF（Peprotech）、10％のKnockOut Serum Replacement（Life Technologies）を含むDMEM。
21日目から、細胞を細胞培養プレート上でさらに培養したか、凍結したか、または実施例2の方法において使用した。細胞をさらに培養した場合、培地を分化培地（成熟培地）で置き換えた。成熟培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（Thermo Scientific）、1％のB27無血清添加剤（Invitrogen）を含むDMEM。骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞およびサテライト細胞は、細胞培養プレート上でさらに培養することにより生成される。
記載される培養工程の間の方向付けられた分化を追跡するために、細胞の遺伝子発現パターンを60日の期間にかけてRNAシークエンシングを使用して決定した。RNAシークエンシングを使用して、特有の遺伝子の発現における増加および減少を決定し、すなわち、特有の分化または成熟ステージの開始および終了を分析した。
特に、多能性、沿軸中胚葉、骨格筋特異的転写因子、およびサルコメアについての特有の遺伝子の発現を測定した。多能性に典型的な遺伝子、例えばNANOG、POU5F1、およびZFP42は、0および1日目（播種工程後の日および翌日）に高い発現を示した（図4a）。NANOGおよびPOU5F1は0日目に最も高い発現を示し、ZFP42は1日目に最も高い発現を示す（図4a）。沿軸中胚葉に典型的な遺伝子、例えばMSGN1、TBX6、およびMEOX1は、1～8日目に高い発現を示す（図4b）。MSGN1は1日目に最も高い発現を示し、TBX6は4日目に最も高い発現を示し、MEOXは8日目に最も高い発現を示す（図4b）。骨格筋特異的転写因子、例えばPAX3、PAX7、およびMYOD1は、それぞれ8、29、および60日目に最も高い発現を示す（図4c）。サルコメアに典型的な遺伝子、例えばACTN2、DMD、およびMYH3は、60日目に最も高い発現を示す（図4d）。さらに、遺伝子発現パターンは、特に最初の21日の間に、異なるマーカーの急な増加または減少を示す。例えば、TBX6およびMEOX1はそれぞれ4および8日目にのみ強く発現される一方、発現は他の日において少なくとも4倍弱い（図4d）。この時間経過は分化プロセスの均質な進行を指し示す。
第2の独立した方法を使用して分化を決定するために、本発明者らは、21日の分化方法の後に蛍光顕微鏡法を使用して細胞を分析した。これは、細胞のDNAをHoechstで染色すること、ならびにアクチンおよび骨格筋特異的転写因子（Pax7、MyoD、およびミオゲニン）を免疫染色することを伴った。21日後に、蛍光画像は、Pax7、MyoD、およびミオゲニンを発現する細胞の高いパーセンテージを示した（図3）。そのため、別の方法を使用して、筋原性細胞の細胞集団が分化プロトコールにより生成されることが示された。
第3の独立した方法により分化を決定するために、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ここで使用されるフローサイトメトリーは、免疫染色を使用して骨格筋特異的因子の発現を測定する。特に、骨格筋芽細胞および骨格筋管細胞（マーカーアクチニン、ミオゲニン、MyoDの発現）ならびにサテライト細胞（マーカーPAX7の発現）の割合を4つの独立した多能性幹細胞系（iPSC（WT 1）、iPSC（WT 2）、DMD iPSC、補正DMD iPSC）において決定した（図5）。アクチニン陽性細胞のパーセンテージは4つの細胞系において71～77.6％であり、ミオゲニン陽性細胞のパーセンテージは4つの細胞系において41.4％～60.4％であり、MyoD陽性細胞のパーセンテージは4つの細胞系において40％～54.1％であり、PAX7陽性細胞のパーセンテージは4つの細胞系において33.4％～43.8％であった（図5）。
分析された細胞は骨格筋芽細胞および骨格筋管細胞特異的なマーカーの他にサテライト細胞特異的なマーカーを高純度（＞70％のアクチニン陽性および＞30％のPAX7陽性筋細胞）で産生することもまたフローサイトメトリーは示した。
そのため、3つの異なる方法を使用して、多能性幹細胞は、骨格筋芽細胞含有細胞プールに分化し、そのため中胚葉誘導、筋原性特化、および筋原性成熟を経験することが測定された。
材料および方法
以下の多能性幹細胞系を使用した:TC1133（iPSC WT1;Baghbaderani et al.Stem Cell Reports 2015）、iPSC WT2、DMD iPSC（DMD Del;Long et al.Sci Adv 2018）、補正DMD iPSC（Long et al.Sci Adv 2018）。DMD iPSC幹細胞系において、X連鎖性ジストロフィン遺伝子（DMD）は突然変異しており、これはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）疾患においても突然変異しており、疾患を引き起こす。
Matrigelコーティングされた細胞培養プレートを調製するために、BD Matrigel（Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced）を、氷冷したPBS中に1:30の比で希釈し、直ちに4℃で貯蔵した。Matrigelコーティングされたプレートを調製するために、1:120のMatrigel希釈液を、氷冷したPBSを用いて作製した。0.1ml/cm2の希釈液を細胞培養フラスコに加えた。フラスコを4℃で少なくとも終夜、最大で2週間貯蔵した。使用前に、プレートを37℃のインキュベーターに少なくとも30分間置いた。
継代のために（例えば、凍結保存のために細胞を剥離するために）、細胞を3mlのTrypLE（Invitrogen）で1回洗浄し、続いて5mlのTrypLE中室温で約7分間インキュベートした。TrypLEを次に洗浄除去し、5uMのRock阻害剤を含有する10mlのN2-HK培地で消化を停止させた。凝集塊を誘導するために、10mlピペットを使用して細胞懸濁液をピペッティングした。細胞の分離は、細胞生存を低減させないように十分に穏やかでなければならない。（20μlの細胞懸濁液を10mlのCASY緩衝液に加えることにより）CASYカウンターを使用して細胞をカウントした。細胞を100×gで10分間、室温でペレット化させた。上清を除去し、5uMのRock阻害剤を含有するN2-HK培地中にペレットを穏やかに再懸濁した。細胞を、Matrigelコーティングされたプレートに60～70000細胞/cm2の密度で5μMのRock阻害剤を含有するN2-HK培地中にプレーティングした。翌日に開始して、N2-HK培地を9日間1日おきに置き換えた。
細胞凍結（例えば、21日目、凍結保存）のために、細胞を3mlのTrypLE（Invitrogen）で1回洗浄し、次に5mlのTrypLE中室温で約7分間インキュベートした。その後、TrypLEを洗浄除去し、5μMのRock阻害剤を含有する10mlのN2-HK培地で消化を停止させた。凝集塊を誘導するために、10mlピペットを使用して細胞懸濁液をピペッティングした。細胞の分離は、細胞生存を低減させないように十分に穏やかでなければならない。（20μlの細胞懸濁液を10mlのCASY緩衝液に加えることにより）CASYカウンターを使用して細胞をカウントした。細胞を100×gで10分間、室温でペレット化させた。上清を除去し、5μMのRock阻害剤および10％のDMSO（Sigma）を含有するN2-HK培地中に4℃でペレットを穏やかに再懸濁した。10×106個の細胞を、Mr Frosty（Thermo）を使用してクライオバイアル当たり2mlで終夜-80℃で凍結した。細胞を次に-150℃に移した。
RNA抽出のために、Trizol試薬（Thermo Fisher）中に包埋された細胞溶解液をボルテックスによりホモジナイズした。1ml毎のTrizol試薬に対して、200μlのクロロホルム（AppliChem）を加えた。試薬チューブをきつく閉じ、5回反転させ、続いて室温で5分インキュベートした。試料を次に10,000～12,000×gで15分間遠心分離した。RNAを含有する水相を新たな試薬チューブに移し、続いて500μlのイソプロパノール（Roth）を加えてRNAを沈殿させた。試薬チューブをボルテックスし、室温で10分間静置し、次に12,000×gでさらに10分間遠心分離した。上清を除去し、1mlの70％ EtOH/ピロカルボン酸ジエチル（DEPC）H2Oを加えてペレットを洗浄した。試薬チューブを穏やかにタップしてペレットを溶解および洗浄した後に、試料をさらにもう1回12,000×gで5分間遠心分離し、上清を除去した。残留液が蒸発するまでペレットを5～10分間開いたままとし、RNAをDEPC H2Oに再懸濁した。Nanodrop ND-1000を使用してRNA濃度および品質を決定した。シークエンシングの前に、品質およびRNA完全性を、Advanced AnalyticalのFragment Analyzer（Standard Sensitivity RNA Analysis Kit（DNF-471））を使用してさらに分析した。改変鎖特異的超並列cDNAシークエンシング（RNA-Seq）プロトコール（Illumina:TruSeq Stranded Total RNA（Cat.No.RS-122-2301））を使用してRNA-Seqライブラリーを生成した。データセット中のrRNA含有量を5％未満に保つようにプロトコールを最適化した（RiboMinus（商標）technology）。残存全トランスクリプトームRiboMinus（商標）RNAは直接的なシークエンシングのために好適である。ライゲーション工程は、ライゲーション効率を増加（＞94％）させるために最適化し、PCRプロトコールは、ライブラリーの最適な最終生成物のために調整した。cDNAライブラリーの正確な定量化のために、蛍光定量ベースのシステム、PromegaのquantiFluor（商標）dsDNAシステムを使用した。dsDNA 905 Reagent Kit（Advanced BioanalyticalのFragment Analyzer）を使用して最終cDNAライブラリーのサイズを決定し、300bpの平均サイズであった。
ライブラリーをプール（マージ）し、Illumina HiSeq 4000（Illumina）でシークエンシングし、50bpシングルエンドリード（30～40×10＾6リード/試料）を生成した。IlluminaソフトウェアBaseCallerを使用してシークエンス画像をBCLファイルに変換し、bcl2fastq v2.17.1.14を使用してそれをfastqファイルに多重分離した。FastQCバージョン0.11.5（Andrews,2014）を使用して品質を評価した。配列リードをヒトゲノム参照ライブラリー（Bowtie 2.0を伴うUCSCバージョンhg19（Langmead and Salzberg,2012））にマッピングした。次に、各同定された遺伝子についてマッピングされたリードの数をカウントし、DESeq2ソフトウェアを使用して差次的な遺伝子発現を評価した（Anders and Huber,2010）。biomaRt（v2.24）から抽出されたEnsembl転写物の長さに基づいてリード/キロ塩基転写物/100万（RPKM）を算出した。
フローサイトメトリーのために、細胞をTrypLE Select（Thermo Fisher）で消化することにより単一細胞懸濁液を調製した。細胞を培養培地に再懸濁し、300gで5分間遠心分離し、4％のホルマリン（Histofix、Roth）中に固定した。固定後に、細胞を再び遠心分離し、ブロック緩衝液（1mg/mlのBSA（Sigma-Aldrich）、5％のFCS（Thermo Fisher）、および0.1％のTriton 100X（Sigma）を含有するPBS）に再懸濁した。10分のブロッキング後に、遠心分離により細胞をペレット化し、一次抗体（サルコメアα-アクチニン1:4,000（Sigma-Aldrich）;Pax7 1:50（DSHB）;MyoD 1:100（DAKO）;ミオゲニン1:50（DSHB））または適切なIgG1アイソタイプ対照と共に4℃で45分間ブロッキング緩衝液に再懸濁した。
細胞をPBSで2回洗浄し、続いてブロッキング緩衝液中の洗浄工程を行い、その後に二次抗体（1:1000の抗マウス488［A-11001］または633［A-21052］、Thermo Fisher）およびHoechst（10ng/ml;Thermo Fisher）と4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、最後に分析のためにPBSに再懸濁した。試料当たりで10,000の生細胞事象を分析した。測定はLSRII SORPサイトメーターで実行し、DIVAソフトウェア（BD Biosciences）を使用して分析した。
実施例2:多能性幹細胞に由来する骨格筋芽細胞およびサテライト細胞（実施例1からの細胞）からの、操作された骨格筋（ESM）組織の製造
操作された骨格筋組織の構築のために、実施例1において取得された細胞（21日目からの細胞）を出発材料として使用し、細胞外マトリックスと混合した。細胞外マトリックスと混合することにより、細胞をマトリックスに分散させて三次元骨格筋組織を生成させた。この方法もまた無血清かつ導入遺伝子フリーである。そのため、骨格筋組織を製造する再現性が増加し、その理由は、全ての要求される物質およびそれらの濃度が定義されているからである。この方法により、電気刺激に応答して制御された方式で収縮する力生成性骨格筋組織が生成され得る。剤および物理的刺激の特有の時間的配列が使用され、それは図6Aに図式的に示され、以下において詳細に記載される。
操作された骨格筋組織を構築するために、実施例1からの細胞（21日目からの細胞）を細胞外マトリックスと混合し、リング鋳型に流し込んで、収縮性骨格筋への細胞の自己集合を支持した。（a）細胞を実施例1による分化した細胞培養物から解離したか、または（b）実施例1からの凍結した細胞を使用したかのいずれかをこれは意味する（細胞を解凍する方法の詳細な説明について以下を参照）。
実施例1からの細胞を細胞外マトリックスと混合するために、マスターミックスを氷上の50ml反応チューブ中で混合した。2mlピペットを使用してコラーゲンを加えた。以下の正確なピペット添加順序に従った:
Figure 2022551192000001
代替的に、マスターミックスを以下の体積にしたがってピペットで添加した:
Figure 2022551192000002
マスターミックスをリング鋳型に注ぎ、リング鋳型を慎重にインキュベーターに移して、混合物を37℃で1時間静置した。インキュベーション期間後に、5μMのRock阻害剤を含有する8mlの拡大増殖培地を鋳型毎に慎重に加えた（図6A、左パネル）。拡大増殖培地（N2-HK培地）:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％の無血清添加剤N-2（Thermo Scientific）、1％の非必須アミノ酸（MEM-NEAA、Invitrogen）、0.1mMの2-メルカプトエタノール（Invitrogen）、10ng/mlの組換えHGF（Peprotech）、10％のKnockOut Serum Replacement（Life Technologies）を含むDMEM。
細胞をそのように拡大増殖培地中で7日間培養した。1、3、および5日目に、培地を新鮮な拡大増殖培地（N2-HK培地;Rock阻害剤を含まない）で置き換えた。流し込み後に、混合物をリング鋳型中で圧縮し、その結果、混合物は24時間後に十分に圧縮された。
7日後に、鋳型リングを拡大増殖トレイの6ウェルプレートに移した（図6A、中央パネル）。そこで、細胞を物理的刺激、すなわち、機械的ストレッチング下でさらに培養した。追加的に、ウェル当たり5mlの成熟培地を加えることにより、成熟培地によって細胞の成熟を誘導した。成熟培地:ピルビン酸塩を補充した1g/lのグルコースおよびL-アラニル-L-グルタミン（GlutaMAX（商標））（Gibco）、1％のPen/Strep（Invitrogen）、1％のN無血清添加剤N-2（Thermo Scientific）、2％のB27無血清添加剤（Invitrogen）を含有するDMEM。
細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させるために、続く6週間の成熟において1日おきに成熟培地を交換した。
操作された骨格筋組織の製造を実験的に試験するために、生成された骨格筋組織を、蛍光顕微鏡法を使用して分析した。特徴的な縞状パターンは、多核骨格筋繊維が形成されて力生成性骨格筋が製造されたことを証明する。
本発明者らは、免疫染色を使用して真核細胞骨格の構造タンパク質アクチンを可視化し、核中のDNAを色素DAPIで染色した。蛍光画像は特徴的な縞状パターンを示し、多核の成熟骨格筋繊維が本方法により形成されたことを実証する（図8A）。免疫染色は、操作された骨格筋組織が、成熟した多核筋肉繊維の構造を呈することを実証した。
さらには、人工的に生成された筋肉組織を機能的にも試験するために、本発明者らは収縮実験を行った（図6A、右パネル）。臓器浴中でのこれらの収縮実験は、電気刺激に応答した製造された骨格筋組織の収縮頻度および収縮力を測定する。
この目的のためにリングの形態の骨格筋組織を、37℃、5％のCO2および95％のO2での連続的なガス処理を伴うタイロード溶液（mmol/Lにおいて:120 NaCl、1 MgCl2、1.8 CaCl2、5.4 KCl、22.6 NaHCO3、4.2 NaH2PO4、5.6グルコース、および0.56アスコルビン酸塩）を含有する臓器浴（Fohr Medical Instruments）に等尺的に移した。最大力振幅（収縮力＝FOC）が観察されるまでESMを125μmの間隔で機械的に伸ばした。FOC測定は、1～100Hzの範囲内の電場刺激周波数（4ms矩形パルス;200mA）で行った。
収縮実験の結果を図6Bおよび図6Cに示す。図6Bは、異なる刺激周波数での、操作された骨格筋組織の代表的な収縮力曲線を示す。1Hzの刺激（破線）において、約0.5秒の単一持続期間を有する8つの単収縮が記録され、10Hzの刺激（実線）において、初発強縮が測定され、100Hzの刺激（一点鎖線）において、十分に発生した強縮が検出された。図6Cは、刺激周波数の関数としての、操作された骨格筋組織の収縮力を示す。収縮力（「FOC」）は、電気刺激周波数に依存する骨格筋組織のミリニュートン（mN）で測定した（n＝3）。1Hzの刺激において、収縮力の平均は0.5ミリニュートンであり;10Hzの刺激において、収縮力の平均は0.9ミリニュートンであり;20Hzの刺激において、収縮力の平均は1.1ミリニュートンであり;40Hzの刺激において、収縮力の平均は1.4ミリニュートンであり;60Hzの刺激において、収縮力の平均は1.55ミリニュートンであり;80Hzの刺激において、収縮力の平均は1.6ミリニュートンであり;100Hzの刺激において、収縮力の平均は2.1ミリニュートンである。
試験された骨格筋組織は、1Hz～100Hzの刺激周波数に応答して再現性のある収縮頻度および収縮力を示した。1Hzの単一刺激において、収縮および完全な弛緩には約0.5秒を要した。収縮および緩和時間は約0.5秒であるので、開始または完全強縮がより高い刺激周波数において記録された。強縮は、増加した刺激周波数で天然の骨格筋組織においても形成されるため、操作された骨格筋組織はこの点において天然の骨格筋組織と類似的に挙動する。さらには、筋肉組織の収縮力は収縮頻度の増加と共に増加することを本発明者らは示すことができた。これらの特性はネイティブな骨格筋組織と合致し、ネイティブな骨格筋組織もまた、単収縮および強縮の他に、電気刺激に応答した正の力-頻度関係性を呈する。操作された骨格筋組織とは対照的に、天然の筋肉組織において電気インパルスは運動終板からの神経伝達物質刺激（アセチルコリン）によりトリガーされる。
このように、記載される方法は、多核筋肉繊維（筋管細胞）の特徴的な形成を示し、かつ電気刺激に応答して力を生成する、操作された筋肉組織を生成した。
材料および方法
細胞培養物（T75細胞培養フラスコについて記載される体積）からの細胞の解離のために、細胞を3mlのTrypLE（Invitrogen）で1回洗浄し、次に5mlのTrypLE中、室温で約7分間インキュベートした。TrypLEを洗浄除去し、5μMのRock阻害剤を含有する10mlの拡大増殖培地で消化を停止させた。凝集塊を誘導するために、10mlピペットを使用して細胞懸濁液をトリチュレーションした。細胞の分離は、細胞生存を低減させないように十分に穏やかでなければならない。（20μlの細胞懸濁液を10mlのCASY緩衝液に加えることにより）CASYカウンターを使用して細胞をカウントした。細胞を100×gで10分間、室温でペレット化させた。上清を除去し、ESMの数に依存して、5μMのRock阻害剤を含有する適切な体積の拡大増殖培地（マスターミックスを参照）にペレットを穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液を氷上に置いた。
細胞を解凍するために、バイアルを-152℃の冷凍器から取り出した。細胞を37℃の水浴中で2分間、急速に解凍した。バイアルにアルコールをスプレーし、細胞培養フード下に移した。クライオバイアルの内容物を、2ml血清学的ピペットを使用して15ml反応チューブに移した。5μMのRock阻害剤を含む室温の1mlの拡大増殖培地でクライオバイアルを洗浄し、拡大増殖培地を滴下で細胞に加えて浸透圧ショックを回避した。5μMのRock阻害剤を含有する別の8mlの拡大増殖培地を緩徐に加えた。細胞損傷を回避するために懸濁液を細胞カウントの前に2回以下、上下にピペッティングした。（20μlの細胞懸濁液を10mlのCASY緩衝液に加えることにより）CASYカウンターを使用して細胞をカウントした。細胞を100×gで10分間、室温でペレット化させた。上清を除去し、5μMのRock阻害剤を含有する適切な体積の拡大増殖培地にペレットを穏やかに再懸濁し、ESMの数に依存して、定義された体積の細胞懸濁液を調製した（マスターミックスを参照）。細胞懸濁液を氷上に置いた。
実施例3:多能性幹細胞からの、操作された骨格筋組織（生物工学的に作られた骨格筋、BSM）の製造
この実施例において、多能性幹細胞および細胞外マトリックスを使用して、操作された骨格筋組織（BSM）が構築される。実施例1および2とは対照的に、Matrigelコーティングされた細胞培養プレートから細胞外マトリックスへの移動はBSMの製造において行わなかった。代わりに、ヒト人工多能性幹細胞を、定義された細胞外マトリックスに直接的に分散/包埋した。多能性幹細胞の骨格筋組織への自己集合を、化学的および物理的刺激の存在下で細胞外マトリックスにおいて支持した。この方法もまた無血清かつ導入遺伝子フリーであるため、全ての要求される物質およびそれらの濃度が定義された。そのため、ヒト多能性幹細胞の骨格筋管細胞およびサテライト細胞（骨格筋繊維）への分化および成熟は制御された。
分化プロトコールの図式を図7Aに示し、これは、培地に加えられる一連の異なる剤およびストレッチング装置での物理的刺激を示す。図7Aに描写される方法の間に、中胚葉分化を誘導し（0～4日目）、筋原性特化を誘導し（4～12日目）、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に成熟させ（12～21日目）、最後に骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させた（21～50日目）。
方法を行うために、人工多能性幹細胞を前日に細胞培養物から解離し、カウントし、ペレットを適切な体積の培地（5uMのRock阻害剤、10ng/mlのbFGF（Peptrotech）を含む10％のKO serum replacement（Life Technologies）を含むiPS-Brew XF）に穏やかに再懸濁した。幹細胞を細胞懸濁液として氷上に置いた。
ヒト多能性幹細胞をコラーゲン/Matrigelと混合し、リング鋳型に注ぐために、マスターミックスを氷上の50ml反応チューブ中で混合した。2mlピペットを使用してコラーゲンを加え、以下の正確なピペット添加順序に従った。
Figure 2022551192000003
マスターミックスをリング鋳型に注いだ。リング鋳型を慎重にインキュベーターに移して、混合物を37℃で1時間静置した。インキュベーション期間後に、鋳型当たり8mlの培地（5μMのRock阻害剤、10ng/mlのbFGF（Peptrotech）を含有する10％のKO serum replacement（Life Technologies）を含有するiPS-Brew XF）を慎重に加えた。
N2-FCL培地中での培養は多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導した。流し込みの24時間後に培地をN2-FCL培地で置き換えた。1、2、および3日目に、培地を新鮮なN2-FCL培地で1日毎に置き換えた（組成について実施例1を参照）。
N2-FD、N2-FHDおよびN2-HKD培地中で培養することにより筋原性特化を誘導した。4および5日目に、培地をN2-FD培地で置き換え、1日毎に交換した（組成について実施例1を参照）。6および7日目に、培地をN2-FHD培地で置き換え、1日毎に交換した（組成について実施例1を参照）。8、9、10、および11日目に、培地をN2-HKD培地で置き換え、1日毎に交換した（組成について実施例1を参照）。
12～20日目に、培地をN2-HK培地（拡大増殖培地）で置き換え、1日おきに交換した（組成について実施例1を参照）。拡大増殖培地中で培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞に成熟させた。
21日目に、形成されたリングをストレッチング装置の6ウェルプレートに移し、成熟条件下でさらに培養した。そこで、細胞を物理的刺激、すなわち、機械的ストレッチング下でさらに培養した。追加的に、ウェル当たり5mlの成熟培地を加えることにより、成熟培地によって細胞の成熟を誘導した（成熟培地の組成について実施例2を参照）。細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させるために、続く4週間の成熟において1日おきに成熟培地を交換した。
人工多能性幹細胞からの、操作された骨格筋組織の製造を実験的に試験するために、実施例2におけるように、生成された骨格筋組織を、蛍光顕微鏡法を使用して分析した。実施例2におけるように、免疫染色を使用して真核細胞骨格の構造タンパク質アクチンを可視化し、核中のDNAを色素DAPIで染色した。実施例2におけるように、蛍光画像は特徴的な縞状パターンを示し、多核性成熟骨格筋繊維の形成を実証した（図8b）。このように、BSMもまた、本方法により形成される多核性成熟骨格筋繊維を呈する。
さらには、人工的に生成された筋肉組織を機能的に試験するために、実施例2におけるように、本発明者らは収縮実験を行った。臓器浴中でのこれらの収縮実験は、電気刺激に応答した製造された骨格筋組織の収縮頻度および収縮力を測定する。
収縮実験の結果を図7Bおよび図7Cに示す。
図7Bは、異なる刺激周波数での、操作された骨格筋組織の代表的な収縮力曲線を示す。1Hzの刺激（破線）において、約0.5秒の単一持続期間を有する8つの単収縮が記録され、100Hzの刺激（実線）において、十分に発生した強縮が検出された。図7Cは、刺激周波数に依存する、操作された骨格筋組織の収縮力を示す。収縮力（「FOC」）は、骨格筋組織のミリニュートン（mN）で測定した（n＝3）。1Hzの刺激において、収縮力の平均は0.3ミリニュートンであり;10Hzの刺激において、収縮力の平均は0.5ミリニュートンであり;20Hzの刺激において、収縮力の平均は0.55ミリニュートンであり;40Hzの刺激において、収縮力の平均は0.6ミリニュートンであり;60Hzの刺激において、収縮力の平均は0.65ミリニュートンであり;80Hzの刺激において、収縮力の平均は0.72ミリニュートンであり;100Hzの刺激において、収縮力の平均は0.9ミリニュートンであった。
BSMもまた電気刺激に応答して力を生成することを、これらの収縮実験は実証する。試験された骨格筋組織は、1Hz～100Hzの刺激周波数に応答して再現性のある収縮頻度および収縮力を示し、単一刺激後の収縮および緩和時間は約0.6秒であった。追加的に、ESMおよびBSMは、強縮形成および収縮力の増加の観点において同じ特徴を示す。実施例2に記載のESMと同様に、BSMは、増加した刺激周波数、例えば100Hzにおいて強縮を発生する。これも実施例2と同様に、BSMの収縮力は刺激周波数の増加と共に増加する。
これらの特性の両方は、天然の筋肉組織における収縮挙動に類似しており、その理由は、天然の骨格筋においても、強縮が形成され、収縮力が刺激の周波数の増加と共に増加するからである。天然の骨格筋に類似して、操作された骨格筋組織は、単収縮および強縮の他に、電気刺激に応答した正の力-頻度関係性を示した。
そのため、実施例2および3の操作された骨格筋組織（ESMおよびBSM）は、電気刺激に応答して天然の骨格筋組織に類似して挙動する。
実施例4-操作された骨格筋組織の機能の増加
操作された骨格筋の機能をさらに増加させるために、例えば、特有の分子を加えることにより収縮力を増加させることができる。この実施例において、我々は、クレアチンの添加および甲状腺ホルモンT3の濃度の増加（トリヨード-L-チロニン（T3）;工程ivの成熟培地において3nmol/Lから100nmol/Lへ）に応答した、収縮力の他に収縮および緩和時間の増強を特に試験した。ここで、実施例1および2による手順を最初に行った。実施例2とは対照的に、方法の28～56日目または56～84日目のいずれかにおいて成熟培地にクレアチンまたは増加濃度のT3を補充した。
クレアチン補充:手順の28日目から56日目まで成熟培地に1mMのクレアチンを補充した場合、収縮力（FOC）は100Hz刺激での強縮の間に1.8mNから2.5mNへと増加した（図9B、上）。このように、この培地添加は収縮力を39％増加させた。さらには、長期の本方法における収縮力の可能な増加を試験した。この目的のために、方法を実施例2に記載されるようにさらに4週間延長し、この時間の間に培地に1mMのクレアチンを補充した。手順の56日目から84日目まで成熟培地に1mMのクレアチンを補充することで、収縮力（単収縮張力）は100Hz刺激での強縮の間に4.0mNから5.2mNに増加した（図9B、下）。この培地添加はこのように収縮力を30％増加させた。
このことから、成熟培地へのクレアチンの添加は、両方の実験において収縮力を著しく増加させる。
T3の補充:方法の28日目から56日目まで成熟培地に0.1μMのT3を補充することで、スチューデントT検定による決定で収縮および弛緩速度は有意に減少した（図10B）。さらには、実施例2に記載されるように方法を長期とし、56～84日目に培地に0.1μMのT3を補充した場合に、収縮および弛緩速度は減少した（図10B）。このように、操作された骨格筋は、強縮刺激により迅速に応答し、かつ刺激の終了後により迅速に弛緩する。
一般に、T3濃度を増加させた成熟培地は、収縮および緩和時間の加速という点で、骨格筋収縮性の向上に繋がることが想定され得る。
この向上した筋肉機能の分子的原因を調べるために、異なるタンパク質の発現をウエスタンブロットにより分析した。MYH2は高速ミオシンの重鎖（MYH2;高速ミオシン重鎖）であり;MYH7は緩慢ミオシンの重鎖（MYH7;緩慢ミオシン重鎖）であり;MYH3は胚性ミオシンの重鎖（MYH3;胚性ミオシン重鎖）である。タンパク質発現を84日目に分析した。図10Cに示されるように、MYH2のタンパク質発現は、0.1μMのT3の4週の添加で有意に増加される。3つの独立した実験に基づいて、発現は少なくとも5倍増加される。MYH7の発現は0.1μMのT3の添加により不変のままであった。MYH3の発現は平均で約半分低減された。これらのタンパク質発現データは図10Bからの機能的なデータを支持し、操作された骨格筋の応答時間の低減は、T3による高速ミオシン（MYH2）アイソフォームの発現の増加により説明され得る。
結論として、成熟の間のクレアチンおよび/またはT3の添加は、操作された骨格筋の機能を増加させることが示された。特に、クレアチンの添加は収縮力を大きく増加させることが示された。追加的に、T3の添加は、操作された骨格筋の反応速度を増加させることが示された。機能におけるこの増加は、MYH2の発現の増加により支持される。
操作された骨格筋の機能における増加は、操作された骨格筋組織を実施例3にしたがって調製し（BSM）、次にクレアチンおよび/またはT3を成熟培地に加えた場合に同じ方式で起こることもまた想定され得る。
実施例5-操作された骨格筋組織の再生能力
操作された骨格筋組織を、例えば、インプラントとしてまたは再生もしくは筋肉成長誘導性薬物を試験するためのモデルとして使用できるように、操作された骨格筋組織は理想的には再生特性を有する。この再生特性は、操作された骨格筋組織に対する傷害が修復され得るという事実により特徴付けられる。この修復プロセスのために、操作された骨格筋組織は、再生特性を有する細胞、例えば、サテライト細胞（骨格筋前駆細胞）を必要とする。図11Aにおいて、骨格筋細胞前駆体において発現されるマーカーのタンパク質発現が分析された（PAX7、PAX3、MYF5、およびBARX2）。2D培養物とは対照的に、4つ全てのマーカーが方法の培養60日目のESMにおいて明確に発現された。さらには、PAX3、MYF5、およびBARX2は、2Dプレート中で培養された骨格筋細胞中よりも、操作された骨格筋中でより高く発現された。これは、操作された骨格筋組織において、骨格筋細胞前駆体が、並列2D培養物とは対照的に、維持され、かつ追加的に増殖させることを指し示す。図11Bはまた、ESM中の良好に分化したサテライト細胞ニッチを示し、散在性かつより低い分化のサテライト細胞ニッチもまた、本明細書に記載の方法に類似した2D培養物中に見られた。
再生特性を試験するために、操作された骨格筋組織（60日齢）を筋肉毒素心臓毒（25μg/ml）と共に24時間インキュベートした。収縮力をインキュベーションの2日および21日後に測定した（図11C）。図11Dに示されるように、操作された骨格筋組織は、CTXとのインキュベーションの2日後に収縮を示さず、インキュベーションの21日後に、操作された骨格筋は1mMの収縮力で再び収縮した。このように、操作された骨格筋は再生が可能である。比較として、ガンマ放射線（30Gy）で追加的に処理された骨格筋は、CTXとのインキュベーションから回復しなかった。このことは、操作された骨格筋の再生が、含有される骨格筋細胞前駆細胞の活性化に依存することを指し示す。照射は、細胞分裂活性を有するこれらおよび全ての他の細胞を阻害する。この実験は、分子的におよび顕微鏡的に検出可能な骨格筋細胞前駆細胞（図11A～B）が機能的であることをさらに実証する。比較として、図11Eはまた、蛍光顕微鏡法による照射ESMと比較した非照射ESMにおける筋肉再構築を示す。CTX誘導性筋肉細胞破壊後21日目の、サルコメアアクチニンを有する細胞の検出は、骨格筋細胞前駆細胞の細胞分裂および分化を伴う活性化を介するESMにおける筋肉再構築を実証する。照射ESMにおいて再生活性は検出できなかった。これらの形態学的観察は図11Dにおける機能的観察と合致する。このことは、操作された骨格筋が、CTX媒介性筋肉細胞破壊の21日後に、約1mNで再び収縮することを示す。
実施例4および5の方法
成熟条件
成熟培地を1日おきに交換し、9週まで機械的ストレッチング下で培養した。成熟培地は、低グルコース、GlutaMAX（商標）Supplement、ピルビン酸塩（Thermo Fisher Scientific）、1％のN-2 Supplement（Thermo Fisher Scientific）、2％のB-27 Supplement（Thermo Fisher Scientific）、および任意の抗生物質（例えば、1％のPen/Strep-Thermo Fisher Scientific）を含むDMEMから構成された。指し示される時点で（例えば、28～56日目または56～84日目）、0.1μMのT3（Sigma-Aldrich）または1mMのクレアチン一水和物（Sigma-Aldrich）を4週の期間にわたり成熟培地に加えた。
等尺性力測定
操作された骨格筋組織の収縮機能を、ガス処理（5％のCO2/95％のO2）したタイロード溶液（mmol/Lで、120 NaCl、1 MgCl2、0.2 CaCl2、5.4 KCl、22.6 NaHCO3、4.2 NaH2PO4、5.6グルコース、および0.56アスコルビン酸塩を含有する）で満たした臓器浴中37℃の等尺性条件下で測定した。力-長さの関係性を検証するために、200mAの5ms矩形パルスと共に1HzでESMを電気的に刺激しながら、最大収縮力が観察されるまで、125μmの間隔での機械的ストレッチングにより筋肉長さを増加させた。最大力生成の長さにおいて、定義された刺激周波数（10、20、40、60、80、および100Hzでの4秒の刺激）下で強縮力を評価した。
心臓毒傷害モデル
対照の、操作された骨格筋を、照射ESMと並列で心臓毒傷害（CTX）に供した。傷害を誘導するために、組織を、25μg/mlのCTXを含有する成熟培地（Latoxan）中に24時間維持した（Tiburcy et al.,2019）。傷害を受けた組織を次にすすぎ、DMEM、低グルコース、GlutaMAX（商標）Supplement、ピルビン酸塩（Thermo Fisher Scientific）、1％のN-2 Supplement（Thermo Fisher Scientific）、1％のMEM非必須アミノ酸溶液（Thermo Fisher Scientific）、10ng/mlのHGF（Peprotech）、および10％のKnockOut Serum Replacement（Thermo Fisher Scientific）からなる拡大増殖培地に1週間入れ、次にDMEM、低グルコース、GlutaMAX（商標）Supplement、ピルビン酸塩（Thermo Fisher Scientific）、1％のN-2 Supplement（Thermo Fisher Scientific）、2％のB-27 Supplement（Thermo Fisher Scientific）、および1mMのクレアチン一水和物（Sigma-Aldrich）からなる成熟培地中でさらなる2週間の再生期間、培養した。培地を1日おきに交換した。任意で、抗生物質（例えば、1％のPen/Strep-Thermo Fisher Scientific）を加えることができる。
ESMの照射
CTX処理の24時間前にSTS Biobeam 8000ガンマ照射装置中の培養皿にESMを入れ、単回ドーズの30Gy照射に10分間曝露した（Tiburcy et al.,2019）。
免疫染色および共焦点イメージング
2D細胞培養物を、リン酸緩衝化食塩水（PBS）中のホルムアルデヒド4％（Carl Roth）中、室温で15分間固定した。操作された骨格筋をPBS中の4％のパラホルムアルデヒド中に4℃で終夜固定した。固定後に、操作された骨格筋を70％のエタノール（Carl Roth）に1分間浸漬し、次に1Xトリス酢酸塩-EDTA（TAE）緩衝液中の2％のアガロース（peqGOLD）に包埋した。Leica Vibrotome（LEICAVT1000S）を使用して切片を400μmに切断し、冷1X PBS中に貯蔵した。染色の前に、2D細胞培養物およびESM切片の両方を1X PBSで洗浄した。ブロッキングおよび透過処理を誘導するために、試料をブロッキング緩衝液（5％のウシ胎仔血清、1％のウシ血清アルブミン（BSA）、および0.5％のTriton-Xを含有する1X PBS）中でインキュベートした。全ての一次および二次抗体染色を同じブロッキング溶液中で行った。以下の抗体を、RTで4h、または4℃で24～72hの一次染色のために使用した:Pax3（1:100、DSHB）、Pax7（1:100、DSHB）、MyoD（1:100、Dako）、およびミオゲニン（1:10、DSHB）。サルコメアα-アクチニン（1:500、Sigma-Aldrich）、ラミニン（1:50、Sigma-Aldrich）。3回のPBSでの洗浄後に、適切なAlexa蛍光色素標識二次抗体（1:1000、Thermo Fisher Scientific）を室温で2h適用した。二次抗体と並行して、Alexa 633共役ファロイジン（1:100、Thermo Fisher Scientific）およびHoechst 33342（1:1000、Molecular Probes）をそれぞれf-アクチンおよび核染色のために使用した。PBSでの3回の洗浄後に、試料をFluoromount-G（Southern Biotech）で染色した。全ての画像は、Zeiss LSM 710/NLO共焦点顕微鏡を使用して取得した。標識された細胞を定量化するために、3つの異なる実験からの試料当たり3つのランダムな焦点面を、ImageJ Cell Counter Toolを使用する分析のために選択した。
ウエスタンブロット分析
タンパク質単離のために、操作された骨格筋をエッペンドルフチューブに入れ、液体窒素中でスナップ凍結させた。操作された骨格筋に、1/10のホスファターゼ阻害剤（Roche）および1/7のプロテアーゼ阻害剤（Roche）を含有する150μlの氷冷したタンパク質溶解緩衝液（500mlのddH2Oの総体積中の2.38gのHEPES、10.20gのNaCl、100mlのグリセロール、102mgのMgCl2、93mgのEDTA、19mgのEGTA、5mlのNP-40）を加えた。7mmステンレス鋼ボール（Qiagen）をエッペンドルフチューブに加え、TissueLyser II（Qiagen）を使用して30Hzおよび4℃で30秒間試料をホモジナイズし、続いて氷上で2時間インキュベートし、次に12,000rpmおよび4℃で30分間遠心分離した。上清をタンパク質試料として収集し、タンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質アッセイにより測定した。30μgのタンパク質試料を4～15％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）にロードし、100Vで約2.5時間電気泳動分離し、次に冷貯蔵庫に終夜置いた氷で満たしたボックス中30Vでポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。全タンパク質を可視化するために、PVDF膜をPonceau Redで染色した。一次抗体（室温で4時間）および二次抗体（室温で1時間）での染色を、1xトリス緩衝食塩水（TBS）中の5％ミルクおよび0.1％のTween 20を含有するブロッキング溶液中で行った。以下の一次抗体:モノクローナル胚性ミオシン重鎖3（1:500、F1.652、DSHB）、緩慢ミオシン型重鎖7（1:500、A4.951、DSHB）、および高速ミオシン型重鎖2（1:100、A4.74、DSHB）を使用してウエスタンブロットによりESM中のタンパク質発現を分析した。タンパク質ローディングをビンキュリン（VCL）抗体（1:5000、V3131、Sigma-Aldrich）により制御した。膜を1xトリス緩衝食塩水（TBS）および0.1％のTween 20で5分間洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgG抗体（1:10,000、P0260、Dako）を二次染色のために使用した。膜を1xトリス緩衝食塩水（TBS）および0.1％のTween 20で5分間洗浄した後、ブロットをFemto LUCENT（商標）Luminol試薬（Gbiosciences）で覆い、BIO-RAD ChemiDoc（商標）MPシステムを使用してタンパク質バンドをイメージングした。ImageJを使用してウエスタンブロットからのタンパク質定量化を行った。
定量リアルタイムPCR
Trizol試薬（Thermo Fisher Scientific）を使用してトータルRNAを2D細胞培養物および操作された骨格筋から単離した。Trizolを培養プレート中の2D細胞に加え、細胞を剥がし取り、細胞溶解液をボルテックスによりホモジナイズした。操作された骨格筋をポリプロピレンチューブ（Eppendorf）に入れ、液体窒素中でスナップ凍結させた。7mmステンレス鋼ボール（Qiagen）の存在下で1mlのTrizolを、操作された骨格筋に加え、TissueLyser II（Qiagen）を使用して30Hzおよび4℃で2分間試料を溶解した。RNA単離は製造者のプロトコールにしたがって行った。Nanodrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を使用してRNA濃度を定量化した。製造者の指示にしたがって、1μgのRNA試料をDNase I（Roche）で処理し、次にHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）を使用して試料を相補的DNA（cDNA）に逆転写した。Fast SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）およびAB7900 HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を使用して定量PCRを行った。代替的に、Illuminaプラットフォームを使用してRNAシークエンシングによりトランスクリプトーム分析を行った。
全ての実施例において使用された材料
本明細書において使用された材料は、他に記載されなければ商業的に入手可能である。例えば、ペニシリン/ストレプトマイシン、B27無血清添加剤、必須アミノ酸（MEM-NEAA）、および2-メルカプトエタノールはInvitrogenから入手可能である。会社名は、使用された材料の各々と共に指し示される。
N2およびB27無血清添加剤溶液のストック溶液は-20℃で貯蔵した。解凍したら、それらを培地に加え、4℃で最大1週間貯蔵した。KnockOut Serum Replacementストック溶液もまた-20℃で貯蔵した。解凍したら、それらを4℃で最大2週間貯蔵した。LDN193189ストック溶液はDMSO中で10mMの濃度を有し、-20℃で貯蔵した。DAPTストック溶液はDMSO中で20mMの濃度を有し、-20℃で貯蔵した。bFGFストック溶液は、0.1％のヒト組換えアルブミンを含有するPBS中で10μg/mlの濃度を有し、-20℃で貯蔵した。HGFストック溶液は、0.1％のヒト組換えアルブミンを含有するPBS中で10μg/mlの濃度を有し、-20℃で貯蔵した。Rock阻害剤はDMSO中で10mMの濃度を有し、-20℃で貯蔵した。
増殖因子および小分子のストック溶液を解凍したら、それらを4℃で最大1週間貯蔵した。
（表１）100x有効濃度における無血清添加剤N-2の組成（液体形態）、すなわち、1％（v/v）は1（1x）有効濃度に対応する
Figure 2022551192000004
（表２）100x有効濃度（100x）における非必須アミノ酸の組成
Figure 2022551192000005
（表３）DMEM、1g/lの低グルコース、ピルビン酸塩を補充したGlutaMAX（商標）（Gibco、カタログ番号:10567014）
Figure 2022551192000006
（表４）50X有効濃度での追加の無血清B27添加剤の組成（液体形態）
500mlの培地当たりの10mlの50X B27添加剤は2％（v/v）に対応する
Figure 2022551192000007
（表５）Knockout Serum Replacement（KSR）の組成
Figure 2022551192000008
参考文献
Figure 2022551192000009
Figure 2022551192000010

Claims (96)

  1. 多能性幹細胞から、操作された骨格筋組織を製造するための方法であって、
    （i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
    （ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
    有効量の（d）HGFを添加して該培地中での培養を継続すること、続いて
    有効量の（a）ガンマセクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
    により、筋原性特化を誘導する工程;
    （iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に拡大増殖および成熟させる工程;
    （iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で機械的刺激下で、工程（iii）において取得され細胞外マトリックス中に分散されている細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
    を含み、
    それにより、操作された骨格筋組織を製造する、方法。
  2. 骨格筋組織が、100Hzの刺激で少なくとも0.6ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、最も好ましくは少なくとも2mNの収縮力を生成する、請求項1記載の方法。
  3. 多能性幹細胞が霊長動物起源の細胞、特にヒト多能性幹細胞であり;かつ/または多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞、核移植を介して製造された多能性幹細胞、および化学的初期化を介して製造された多能性細胞より選択され、特に多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1または2記載の方法。
  4. 工程（i）が、24～132時間、好ましくは48～120時間、より好ましくは60～114時間、よりいっそう好ましくは72～108時間、より好ましくは84～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 工程（i）において、GSK3阻害剤が、CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、チデグルシブ、SB415286、6-ブロモインジルビン-3-オキシムおよびバルプロ酸塩からなる群より選択され、好ましくはGSK3阻害剤がCHIR99021であり;かつ/または
    工程（i）において、SMAD阻害剤が、LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1からなる群より選択され、好ましくはSMAD阻害剤がLDN193189である、
    請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 工程（i）において、FGF2の有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
    無血清添加剤が、培地中に、50～500μg/mlのトランスフェリン、1～20μg/mlのインスリン、0.001～0.1μg/mlのプロゲステロン、5～50μg/mlのプトレシンおよび6～600nMのセレニウムもしくはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウムの最終濃度を提供し、かつ/または
    GSK3阻害剤がCHIR99021であり、かつ有効量が、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMであり;かつ/または
    SMAD阻害剤がLDN193189であり、かつ有効量が、0.05～5μM、好ましくは0.1～2.5μM、より好ましくは0.2～1μM、よりいっそう好ましくは0.25～0.8μM、よりいっそう好ましくは0.3～0.75μM、よりいっそう好ましくは0.35～0.7μM、よりいっそう好ましくは0.4～0.6μM、よりいっそう好ましくは0.45～0.55μM、最も好ましくは約0.5μMである、
    請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 工程（i）における無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のN2添加剤、好ましくは0.3～7.5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.5～5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.75％～2％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.9％～1.2％（v/v）のN2添加剤、最も好ましくは約1％（v/v）のN2添加剤である、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  8. 工程（i）、工程（ii）、工程（iii）、および/または工程（iv）における基礎培地が、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10、Hams F-12より選択され、基礎培地が好ましくはDMEMであり、特に基礎培地がピルビン酸塩および/もしくは非必須アミノ酸を補充されており、かつ/または1g/lのグルコースを含む、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 工程（ii）において、培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）無血清添加剤の存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
    培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、（c）無血清添加剤、および（d）HGFの存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
    培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）の存在下で、72～120時間、好ましくは76～114時間、より好ましくは84～108時間、よりいっそう好ましくは90～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、
    請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 工程（ii）において、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が、DAPT、RO4929097、セマガセスタット（LY450139）、アバガセスタット（BMS-708163）、ジベンザゼピン（YO-01027）、LY411575、IMR-1、L685458の群より選択され、好ましくはガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTである、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
  11. 工程（ii）において、FGF2の有効量が、15～30ng/ml、好ましくは17.5～25ng/ml、より好ましくは18～22ng/ml、よりいっそう好ましくは19～21ng/ml、最も好ましくは約20ng/mlであり;かつ/または
    HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
    ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTであり、かつ有効量が、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMであり;
    KSRが、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
    請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. 工程（iii）において、
    HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
    KSRが、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
    請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 工程（iv）において、追加の無血清添加剤が、培地中に、0.5～50mg/mlのアルブミン、1～100μg/mlのトランスフェリン、0.1～10μg/mlのエタノールアミン、17.4～1744nMのセレニウムまたはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウム、0.4～40μg/mlのL-カルニチン、0.05～5μl/mlの脂肪酸添加剤、0.0001～0.1μg/mlのトリヨード-L-チロニン（T3）の最終濃度を提供する、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 工程（iv）における追加の無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のB27、好ましくは0.5～8％（v/v）、より好ましくは1～6％（v/v）、よりいっそう好ましくは1.5～4％（v/v）、最も好ましくは約2％（v/v）のB27である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
  15. 工程（iv）において、機械的刺激が、静的緊張、動的刺激、または増負荷性刺激であり、好ましくは機械的刺激が静的緊張である、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 工程（i）の前に播種工程を含み、該播種工程において、多能性幹細胞がROCK阻害剤の存在下で幹細胞培地に播種され、好ましくは、該播種工程が工程（i）の18～30時間前に実行される、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  17. ROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤が、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤がY27632である、請求項15記載の方法。
  18. ROCK阻害剤がY27632であり、かつ0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用され;かつ/または
    幹細胞培地がiPS-Brew XFである、
    請求項16または17記載の方法。
  19. 播種工程における多能性幹細胞が、幹細胞培地が加えられる前にマスターミックス中の細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分の存在下で、操作された形態で最初に播種される、請求項15～18のいずれか一項記載の方法。
  20. マスターミックス中の細胞外マトリックスの成分が、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲン、より好ましくはウシ起源、ヒト起源またはマウス起源のもの、特にウシ起源のコラーゲンであり、任意で細胞外マトリックスがラミニンおよび/またはフィブロネクチンを追加的に含む、請求項19記載の方法。
  21. 多能性幹細胞が、1～6×106細胞/mlおよび0.7～1.4mg/mlのコラーゲンの比で培地中に播種される、請求項20記載の方法。
  22. マスターミックスが、5～15％（v/v）、好ましくは7.5％～12.5％（v/v）、より好ましくは9～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のエンゲルブレス-ホルム-スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm（EHS））マウス肉腫細胞の滲出物を細胞外マトリックス成分として含み、特に滲出物がMatrigelであり;かつ/または
    マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
    請求項19～21のいずれか一項記載の方法。
  23. マスターミックスが間質細胞を含み、間質細胞が、細胞外マトリックス成分コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および/もしくはプロテオグリカンを生成し;かつ/または
    マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
    請求項19～21のいずれか一項記載の方法。
  24. 幹細胞培地が、約1時間後に、操作された形態中のマスターミックスに加えられ、幹細胞培地がKSRおよびFGF2を含む、請求項19～23のいずれか一項記載の方法。
  25. 幹細胞培地が、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRを含み;かつ/または
    幹細胞培地が、1～15ng/mlのFGF2、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlのFGF2を含む、請求項24記載の方法。
  26. 工程（iii）が、7～11日間、好ましくは8～10日間、最も好ましくは約9日間実行される、請求項19～25のいずれか一項記載の方法。
  27. 工程（iii）の後に、骨格筋芽細胞およびサテライト細胞が、工程（iv）の前の追加の工程において、マスターミックス中の細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分の存在下で、操作された形態で播種される、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
  28. マスターミックス中の細胞外マトリックスの成分が、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲン、より好ましくはウシ起源、ヒト起源またはマウス起源のもの、特にウシ起源のコラーゲンであり、任意で細胞外マトリックスがラミニンおよび/またはフィブロネクチンを追加的に含む、請求項27記載の方法。
  29. 骨格筋芽細胞およびサテライト細胞が、1～6×106細胞/mlおよび0.7～1.4mg/mlのコラーゲンの比で培地中に播種される、請求項28記載の方法。
  30. マスターミックスが、5～15％（v/v）、好ましくは7.5％～12.5％（v/v）、より好ましくは9～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のエンゲルブレス-ホルム-スワーム（EHS）マウス肉腫細胞の滲出物を細胞外マトリックス成分として含み、特に滲出物がMatrigelであり;かつ/または
    マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
    請求項27～29のいずれか一項記載の方法。
  31. マスターミックスが間質細胞を含み、間質細胞が、細胞外マトリックス成分コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および/もしくはプロテオグリカンを生成し;かつ/または
    マスターミックスのpHがpH 7.2～pH 7.8である、
    請求項27～29のいずれか一項記載の方法。
  32. 約1時間後に、工程（iii）において使用されたものと同様の培地が、操作された形態中のマスターミックスに加えられ、培地が有効量のROCK阻害剤を追加的に含み;
    特にROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤が、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤がY27632である、
    請求項27～31のいずれか一項記載の方法。
  33. ROCK阻害剤がY27632であり、かつ0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用される、請求項32記載の方法。
  34. 約1日後に、培地が、工程（iii）において使用されたものと同様の培地で置き換えられ、かつ細胞がその後にこの培地中でさらなる5～9日間、好ましくは6～8日間、最も好ましくは約7日間さらに培養される、請求項27～33のいずれか一項記載の方法。
  35. 操作された形態が、リング、リボン、ストランド、パッチ、ポーチ、またはシリンダーの形態を有し、任意で個々の骨格筋組織が融合されている、請求項19～34のいずれか一項記載の方法。
  36. 工程（iv）が、少なくとも19日間、好ましくは少なくとも28日間、より好ましくは少なくとも56日間、よりいっそう好ましくは少なくとも120日間実行され、特に少なくとも240日間実行される、請求項1～35のいずれか一項記載の方法。
  37. 分化関連導入遺伝子も成熟関連導入遺伝子も含まず、好ましくは筋原性導入遺伝子を含まず、より好ましくは導入遺伝子Pax7もMyoDも含まない、請求項1～36のいずれか一項記載の方法。
  38. 骨格筋芽細胞濃縮工程を含まず、好ましくは、細胞選択による濃縮工程を含まず、より好ましくは、抗体ベースの細胞選択による濃縮工程を含まない、請求項1～37のいずれか一項記載の方法。
  39. 多能性幹細胞から骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を製造するための方法であって、
    （i）有効量の（a）FGF2、（b）GSK3阻害剤、（c）SMAD阻害剤、ならびに（d）トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、およびセレニウムまたはその生体利用可能な塩を含む無血清添加剤を含む基礎培地中で、多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
    （ii）有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（i）において取得された細胞を培養すること、続いて
    有効量の（d）HGFを添加して該培地中での培養を継続すること、続いて
    有効量の（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で細胞を培養すること
    により、筋原性特化を誘導する工程;
    （iii）有効量の（a）HGF、（b）（i）におけるものと同様の無血清添加剤、および（c）KnockOut Serum Replacement（KSR）を含む基礎培地中で、工程（ii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋芽細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程、続いて
    （iv）有効量の（a）工程（i）におけるものと同様の無血清添加剤、ならびに（b）アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウムまたはその生体利用可能な塩、L-カルニチン、脂肪酸添加剤、およびトリヨード-L-チロニン（T3）を含む追加の無血清添加剤を含む基礎培地中で、工程（iii）において取得された細胞を培養することにより、細胞を骨格筋管細胞およびサテライト細胞に成熟させる工程
    を含み、
    それにより、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、およびサテライト細胞を生成する、方法。
  40. フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％の、全ての利用可能な細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が、前記方法により達成される、請求項39記載の方法。
  41. フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、最も好ましくは少なくとも30％の、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合が、前記方法により達成される、請求項39または40記載の方法。
  42. 骨格筋芽細胞濃縮工程を含まず、好ましくは、細胞選択による濃縮工程を含まず、より好ましくは、抗体ベースの細胞選択による濃縮工程を含まない、請求項39～41のいずれか一項記載の方法。
  43. 多能性幹細胞が霊長動物起源の細胞、特にヒト多能性幹細胞であり;かつ/または多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、単為生殖幹細胞、核移植を介して製造された多能性幹細胞、および化学的初期化を介して製造された多能性細胞より選択され、特に多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項39～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 工程（i）が、48～132時間、好ましくは48～120時間、より好ましくは60～114時間、よりいっそう好ましくは72～108時間、より好ましくは84～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、請求項39～43のいずれか一項記載の方法。
  45. 工程（i）において、GSK3阻害剤が、CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、チデグルシブ、SB415286、6-ブロモインジルビン-3-オキシムおよびバルプロ酸塩からなる群より選択され、好ましくはGSK3阻害剤がCHIR99021であり;かつ/または
    工程（i）において、SMAD阻害剤が、LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1からなる群より選択され、好ましくはSMAD阻害剤がLDN193189である、
    請求項39～44のいずれか一項記載の方法。
  46. 工程（i）において、FGF2の有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
    無血清添加剤が、培地中に、50～500mg/lのトランスフェリン、1～20mg/lのインスリン、1～30μg/lのプロゲステロン、5～50μg/mlのプトレシンおよび6～600nMのセレニウムもしくはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウムの最終濃度を提供し、かつ/または
    GSK3阻害剤がCHIR99021であり、かつ有効量が、4～18μM、好ましくは5～16μM、より好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは8～13μM、よりいっそう好ましくは9～12μM、よりいっそう好ましくは9.5～11μM、最も好ましくは約10μMであり;かつ/または
    SMAD阻害剤がLDN193189であり、かつ有効量が、0.05～5μM、好ましくは0.1～2.5μM、より好ましくは0.2～1μM、よりいっそう好ましくは0.25～0.8μM、よりいっそう好ましくは0.3～0.75μM、よりいっそう好ましくは0.35～0.7μM、よりいっそう好ましくは0.4～0.6μM、よりいっそう好ましくは0.45～0.55μM、最も好ましくは約0.5μMである、
    請求項39～45のいずれか一項記載の方法。
  47. 工程（i）における無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のN2添加剤、好ましくは0.3～7.5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.5～5％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.75％～2％（v/v）のN2添加剤、より好ましくは0.9％～1.2％（v/v）のN2添加剤、最も好ましくは約1％（v/v）のN2添加剤である、請求項39～46のいずれか一項記載の方法。
  48. 工程（i）、工程（ii）、工程（iii）、および/または工程（iv）における基礎培地が、DMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM、alphaMEM、Medium 199、Hams F-10、Hams F-12より選択され、基礎培地が好ましくはDMEMであり、特に基礎培地がピルビン酸塩および/もしくは非必須アミノ酸を補充されており、かつ/または1g/lのグルコースを含む、請求項39～47のいずれか一項記載の方法。
  49. 工程（ii）において、培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、および（c）無血清添加剤の存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
    培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）FGF2、（c）無血清添加剤、および（d）HGFの存在下で、36～60時間、好ましくは42～54時間、最も好ましくは約48時間実行され;かつ/または
    培養が、（a）ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤、（b）HGF、（c）無血清添加剤、および（d）KnockOut Serum Replacement（KSR）の存在下で、72～120時間、好ましくは76～114時間、より好ましくは84～108時間、よりいっそう好ましくは90～102時間、最も好ましくは約96時間実行される、
    請求項39～48のいずれか一項記載の方法。
  50. 工程（ii）において、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が、DAPT、RO4929097、セマガセスタット（LY450139）、アバガセスタット（BMS-708163）、ジベンザゼピン（YO-01027）、LY411575、IMR-1、L685458の群より選択され、ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤が好ましくはDAPTである、請求項39～49のいずれか一項記載の方法。
  51. 工程（ii）において、FGF2の有効量が、15～30ng/ml、好ましくは17.5～25ng/ml、より好ましくは18～22ng/ml、よりいっそう好ましくは19～21ng/ml、最も好ましくは約20ng/mlであり;かつ/または
    HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;かつ/または
    ガンマ-セクレターゼ/NOTCH阻害剤がDAPTであり、かつ有効量が、1～20μM、好ましくは2～19μM、より好ましくは3～18μM、よりいっそう好ましくは4～17μM、よりいっそう好ましくは5～16μM、よりいっそう好ましくは6～15μM、よりいっそう好ましくは7～14μM、よりいっそう好ましくは7.5～13μM、よりいっそう好ましくは8～12μM、よりいっそう好ましくは9～11μM、最も好ましくは約10μMであり;
    KSRが、6～14％（v/v）、好ましくは7～13％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
    請求項39～50のいずれか一項記載の方法。
  52. 工程（iii）において、HGFの有効量が、1～15ng/ml、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlであり;
    KSRが、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRの量で使用され;特に、KSRが、還元剤、例えばベータ-メルカプトエタノールおよび/またはアルファ-チオグリセロールの存在下で使用される、
    請求項39～49のいずれか一項記載の方法。
  53. 工程（iii）が、7～11日間、好ましくは8～10日間、最も好ましくは約9日間実行される、請求項39～52のいずれか一項記載の方法。
  54. 工程（iv）において、追加の無血清添加剤が、培地中に、0.5～50mg/mlのアルブミン、1～100μg/mlのトランスフェリン、0.1～10μg/mlのエタノールアミン、17.4～1744nMのセレニウムまたはその生体利用可能な塩、特に亜セレン酸ナトリウム、0.4～40μg/mlのL-カルニチン、0.05～5μl/mlの脂肪酸添加剤、0.0001～0.1μg/mlのトリヨード-L-チロニン（T3）の最終濃度を提供する、請求項39～53のいずれか一項記載の方法。
  55. 工程（iv）における追加の無血清添加剤が、0.1～10％（v/v）のB27、好ましくは0.5～8％（v/v）、より好ましくは1～6％（v/v）、よりいっそう好ましくは1.5～4％（v/v）、最も好ましくは約2％（v/v）のB27である、請求項39～54のいずれか一項記載の方法。
  56. 工程（iv）が、少なくとも30日間、好ましくは少なくとも35日間、より好ましくは少なくとも40日間、よりいっそう好ましくは少なくとも50日間実行される、請求項39～55のいずれか一項記載の方法。
  57. 工程（i）の前に播種工程を含み、該播種工程において、多能性幹細胞がROCK阻害剤の存在下で幹細胞培地に播種され、好ましくは、該播種工程が工程（i）の18～30時間前に実行される、請求項39～56のいずれか一項記載の方法。
  58. ROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、ヒドロキシファスジル、GSK429286AおよびRKI1447からなる群より選択され、好ましくはROCK阻害剤が、Y27632、H-1152P、チアゾビビン、ファスジル、およびヒドロキシファスジルからなる群より選択され、より好ましくはROCK阻害剤が、Y27632およびH-1152Pからなる群より選択され、特に好ましくはROCK阻害剤がY27632である、請求項57記載の方法。
  59. ROCK阻害剤がY27632であり、かつ0.5～10μM、好ましくは1～9μM、より好ましくは2～8μM、より好ましくは3～7μM、より好ましくは4～6μM、最も好ましくは約5μMの濃度で使用され;かつ/または
    幹細胞培地がiPS-Brew XFである、
    請求項57または58記載の方法。
  60. 幹細胞培地が、5～20％（v/v）、好ましくは6～17.5％（v/v）、より好ましくは7～15％（v/v）、より好ましくは8％～12％（v/v）、より好ましくは9％～11％（v/v）、最も好ましくは約10％（v/v）のKSRを含み;かつ/または
    幹細胞培地が、1～15ng/mlのFGF2、好ましくは2.5～14ng/ml、より好ましくは5～13ng/ml、よりいっそう好ましくは7.5～12.5ng/ml、よりいっそう好ましくは8～12ng/ml、よりいっそう好ましくは9～11ng/ml、最も好ましくは約10ng/mlのFGF2を含む、
    請求項59記載の方法。
  61. サテライト細胞を伴う多核性成熟骨格筋繊維を有し、かつ血液供給および/または中枢神経系制御を有しない、操作された骨格筋組織であって;特に、骨格筋繊維の存在が、アクチニンの染色によりおよびDAPIを用いて検出される、操作された骨格筋組織。
  62. 骨格筋組織が無血清であり、かつ/または分化関連導入遺伝子も成熟関連導入遺伝子も含まず、好ましくは骨格筋組織が筋原性導入遺伝子を含まず、より好ましくは骨格筋組織がPax7導入遺伝子もMyoD導入遺伝子も含まない、請求項61記載の操作された骨格筋組織。
  63. 骨格筋組織が、200mAにおける100Hzの刺激で少なくとも0.3ミリニュートン（mN）の収縮力を生成し、好ましくは少なくとも0.4mN、より好ましくは少なくとも0.5mN、より好ましくは少なくとも0.6mN、より好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、最も好ましくは少なくとも2mNの収縮力を生成する、請求項61または請求項62記載の操作された骨格筋組織。
  64. 骨格筋組織が操作により形成されており、好ましくはリング、リボン、ストランド、パッチ、ポーチ、またはシリンダー形態の、操作された形態を有し、任意で個々の骨格筋組織が融合されており、特には骨格筋組織がリングの形態を有する、請求項61～63のいずれか一項記載の操作された骨格筋組織。
  65. 中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、請求項1または請求項39記載の工程（i）にしたがって取得され、請求項1（i）または請求項39（i）記載の方法により調製され、遺伝子MSGN1および/またはTBX6の発現により特徴付けられ、MSGN1および/またはTBX6の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得;かつ/またはmRNA SP5が発現されており、SP5の発現が、RNAシークエンシングにより決定され得る、中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞。
  66. 筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞であって、請求項1または請求項39記載の工程（ii）にしたがって取得され、請求項1（i）～（ii）または請求項39（i）～（ii）記載の方法により製造され、遺伝子PAX3の発現により特徴付けられ、PAX3の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得;かつ/またはmRNA SIM1が発現されており、SIM1の発現が、RNAシークエンシングにより決定され得る、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞。
  67. 骨格筋芽細胞であって、請求項1または請求項39記載の工程（iii）にしたがって取得され、請求項1（i）～（iii）または請求項39（i）～（iii）記載の方法により製造され、アクチニンの発現により特徴付けられ、好ましくはアクチニンの発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、骨格筋芽細胞。
  68. サテライト細胞であって、請求項1または請求項39記載の工程（iii）にしたがって取得され、請求項1（i）～（iii）または請求項39（i）～（iii）記載の方法により製造され、遺伝子Pax7の発現により特徴付けられ、Pax7の発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得、より好ましくはサテライト細胞がKi67をさらに発現する、サテライト細胞。
  69. 請求項67記載の骨格筋芽細胞と請求項68記載のサテライト細胞との混合物であって、フローサイトメトリーによってPax7の発現により決定される、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、よりいっそう好ましくは少なくとも30％の、全ての利用可能な細胞の量のうちのサテライト細胞の割合が取得され;かつ/または、フローサイトメトリーによってアクチニンの発現により決定される、少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最も好ましくは少なくとも70％の、全ての利用可能な細胞の量のうちの骨格筋芽細胞の割合が取得される、混合物。
  70. 骨格筋管細胞であって、請求項1または請求項39記載の工程（iv）にしたがって取得され、請求項1（i）～（iv）または請求項39（i）～（iv）記載の方法により調製され、アクチニンタンパク質含有サルコメア構造の異方性配向により特徴付けられる、骨格筋管細胞。
  71. インビトロ薬物アッセイにおける、請求項61～64のいずれか一項記載の骨格筋組織、および/または請求項64～68のいずれか一項記載の細胞、および/または請求項70記載の骨格筋管細胞の使用であって;特に、薬物アッセイが、薬理学的薬物候補および遺伝子治療薬候補の影響下での毒性アッセイまたは骨格筋組織機能のアッセイである、使用。
  72. 医薬における使用のための、請求項61～64記載のいずれか一項記載の骨格筋組織および/または請求項65～69のいずれか一項記載の細胞、および/または請求項70記載の骨格筋管細胞。
  73. 損傷した骨格筋の療法ならびに/または骨格筋疾患、好ましくは遺伝子骨格筋欠陥、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび/もしくはベッカー-キーナー型筋ジストロフィー、および/もしくはリソソーム貯蔵疾患、特にポンペ病の治療における使用のためのサテライト細胞であって、好ましくは骨格筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項68記載のサテライト細胞。
  74. 骨格筋組織に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
    （a）請求項60～63のいずれか一項記載の骨格筋組織を提供する工程、
    （b）任意で骨格筋組織に損傷を与える工程、および
    （c）工程（a）または（b）の骨格筋組織を薬物候補と接触させる工程
    を含み;
    好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、収縮力および/または骨格筋組織構造および/または代謝機能および/または分子的パラメーターおよび/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
    方法。
  75. 骨格筋組織に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
    （a）請求項61～64のいずれか一項記載の骨格筋組織を提供する工程、
    （b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される物質と接触させる工程
    を含み、
    好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、収縮力および/または骨格筋組織構造および/または代謝機能および/または分子的パラメーターおよび/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
    方法。
  76. 骨格筋組織性能に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
    （a）請求項61～64のいずれか一項記載の骨格筋組織を提供する工程、
    （b）工程（a）からの骨格筋組織を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
    を含み、
    好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、収縮力および/または骨格筋組織構造および/または代謝機能および/または分子的パラメーターおよび/またはタンパク質生化学的パラメーターを決定する工程をさらに含む、
    方法。
  77. 中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する薬物候補の有効性を試験するためのインビトロ方法であって、
    （a）請求項65～70のいずれか一項記載の中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
    （b）任意で工程（a）からの細胞に損傷を与える工程、ならびに
    （c）工程（a）または（b）の細胞を薬物候補と接触させる工程
    を含み、
    好ましくは、方法が、工程（c）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、該発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
    方法。
  78. 中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する物質の毒性を試験するためのインビトロ方法であって、
    （a）請求項65～70のいずれか一項記載の中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
    （b）工程（a）の細胞を、試験される物質と接触させる工程
    を含み、
    好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、該発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
    方法。
  79. 中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物に対する栄養分および栄養補助食品の効果を試験するためのインビトロ方法であって、
    （a）請求項65～70のいずれか一項記載の中胚葉分化した骨格筋芽細胞前駆細胞、筋原性特化した骨格筋芽細胞前駆細胞、サテライト細胞、骨格筋芽細胞、骨格筋管細胞、または骨格筋芽細胞とサテライト細胞との混合物を提供する工程、
    （b）工程（a）の細胞を、試験される栄養分または栄養補助食品と接触させる工程
    を含み、
    好ましくは、方法が、工程（b）の前および/または後に、アクチニンおよび/またはPax7の発現を決定する工程をさらに含み、該発現が、フローサイトメトリーおよび/または免疫染色により決定され得る、
    方法。
  80. 骨格筋組織が、100Hzの刺激で少なくとも2ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも2.3mN、より好ましくは少なくとも2.6mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3mM、よりいっそう好ましくは少なくとも3.3mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3.6mN、最も好ましくは少なくとも4mNの収縮力を生成する、請求項1～60のいずれか一項記載の方法。
  81. 骨格筋組織が、100Hzの刺激で少なくとも3mN/秒、好ましくは少なくとも4mN/秒、より好ましくは少なくとも5mN/秒、より好ましくは少なくとも6mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも6.5mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも7mN/秒の収縮速度を有する、請求項1～60または80のいずれか一項記載の方法。
  82. 骨格筋組織が、100Hzの刺激の終了で少なくとも0.5mN/秒、好ましくは少なくとも0.7mN/秒、より好ましくは少なくとも0.9mN/秒、より好ましくは少なくとも1mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.2mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.5mN/秒の弛緩速度を有する、請求項1～60、80、または81のいずれか一項記載の方法。
  83. 工程（iv）における基礎培地が、有効量のクレアチンおよび/またはトリヨード-L-チロニン（T3）を含む、請求項1～60または80～82のいずれか一項記載の方法。
  84. 基礎培地中の有効量のクレアチンが、有効量のクレアチンを用いない工程（iv）における成熟と比較して、操作された骨格筋の収縮力を増加させる、請求項83記載の方法。
  85. 基礎培地中の有効量のT3が、有効量のT3を用いない工程（iv）における成熟と比較して、操作された骨格筋の収縮速度および/または弛緩速度を短縮させる、請求項83または84記載の方法。
  86. 工程（iv）における基礎培地が、0.1～10mMのクレアチン、好ましくは0.2～6mMのクレアチン、より好ましくは0.4～4mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.6～3mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.7～2.5mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.8～2mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.85～1.5mMのクレアチン、よりいっそう好ましくは0.9～1.2mMのクレアチン、最も好ましくは約1mMのクレアチンの最終濃度を提供する、請求項1～60または80～85のいずれか一項記載の方法。
  87. 工程（iv）における基礎培地が、0.001～1μMのトリヨード-L-チロニン（T3）、好ましくは0.005～0.7μMのT3、より好ましくは0.01～0.35μMのT3、よりいっそう好ましくは0.04～0.02μMのT3、よりいっそう好ましくは0.05～0.18μMのT3、よりいっそう好ましくは0.06～0.15μMのT3、よりいっそう好ましくは0.08～0.12μMのT3、よりいっそう好ましくは約0.1μMのT3の最終濃度を提供する、請求項1～60または80～86のいずれか一項記載の方法。
  88. 骨格筋組織が自己再生する特性を有する、請求項1～60または80～87のいずれか一項記載の方法。
  89. 再生特性が、回復した収縮性および/または筋肉回復により特徴付けられ、好ましくは、前記回復した収縮性および/または筋肉回復が、心臓毒を用いた非可逆的な筋肉損傷後に測定され、より好ましくは、前記回復した収縮性および/または筋肉回復が、心臓毒とのインキュベーションの10～30日後に測定される、請求項88記載の方法。
  90. 工程（iv）が、少なくとも50日間、より好ましくは少なくとも60日間、よりいっそう好ましくは少なくとも70日間、よりいっそう好ましくは少なくとも80日間実行される、請求項1～60または80～89のいずれか一項記載の方法。
  91. 請求項1～60または80～90のいずれか一項記載の方法により製造された、操作された骨格筋組織。
  92. 100Hzの刺激で少なくとも0.6ミリニュートン（mN）、好ましくは少なくとも0.7mN、より好ましくは少なくとも0.8mN、より好ましくは少なくとも0.9mN、より好ましくは少なくとも1mN、より好ましくは少なくとも1.2mN、より好ましくは少なくとも1.3mN、より好ましくは少なくとも1.4mN、より好ましくは少なくとも1.5mN、より好ましくは少なくとも1.6mN、より好ましくは少なくとも1.7mN、より好ましくは少なくとも1.8mN、より好ましくは少なくとも1.9mN、より好ましくは少なくとも2mN、より好ましくは少なくとも2.3mN、より好ましくは少なくとも2.6mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3mM、よりいっそう好ましくは少なくとも3.3mN、よりいっそう好ましくは少なくとも3.6mN、最も好ましくは少なくとも4mNの収縮力を生成する、請求項61～64または91のいずれか一項記載の操作された骨格筋組織。
  93. 100Hzの刺激で少なくとも3mN/秒、好ましくは少なくとも4mN/秒、より好ましくは少なくとも5mN/秒、より好ましくは少なくとも6mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも6.5mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも7mN/秒の収縮速度を有する、請求項61～64または91～92のいずれか一項記載の操作された骨格筋組織。
  94. 100Hzの刺激の終了で少なくとも0.5mN/秒、好ましくは少なくとも0.7mN/秒、より好ましくは少なくとも0.9mN/秒、より好ましくは少なくとも1mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.2mN/秒、よりいっそう好ましくは少なくとも1.5mN/秒の弛緩速度を有する、請求項61～64または91～93のいずれか一項記載の操作された骨格筋組織。
  95. インビトロ薬物アッセイにおける、請求項61～64もしくは91～94のいずれか一項記載の骨格筋組織、および/または請求項65～69のいずれか一項記載の細胞、および/または請求項70記載の骨格筋管細胞の使用であって;特に、薬物アッセイが、薬理学的薬物候補および遺伝子治療薬候補の影響下での毒性アッセイまたは骨格筋組織機能のアッセイである、使用。
  96. 医薬における使用のための、請求項61～64および91～94のいずれか一項記載の骨格筋組織、ならびに/または請求項65～69のいずれか一項記載の細胞、ならびに/または請求項70記載の骨格筋管細胞。
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