KR20220074545A - 인공 구강점막모델을 위한 광경화성 GelMA 하이드로젤 - Google Patents

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황유식
안성영
강현정
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청주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 인간 구강 각질세포가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 위치하고, 인간 잇몸 섬유아세포가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크에 위치하여 공배양된, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명의 광경화성 GelMA 하이드로젤은 인공 점막조직 모델로 활용되어, 실험동물을 사용하지 않는 in vitro 피부 실험의 인공막으로 활용될 수 있고, 구강점막 질환 구강점막과 유사한 좋은 생체적합성을 지닌 생체재료(biomaterial)로 사용되여 구강점막과 관련된 질병의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인공 구강점막모델을 위한 광경화성 GelMA 하이드로젤 {Photocured gelatin methacryloyl hydrogel for an artificial mucosal tissue model}
본 발명은 인간 구강 각질세포 (human oral keratinocyte, HOK)가 광경화성 메타크릴레이트화된 (gelatin methacryloyl, GelMA) 하이드로젤의 표면에 위치하고, 인간 잇몸 섬유아세포 (human gingival fibroblast, HGF)가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크(bulk)에 위치하여 공배양된(co-cultured), 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) 메타크릴레이트화된 젤라틴 (GelMA) 용액을 제조하는 단계;
b) 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)를 GelMA 용액에 부가하여 배양하는 단계;
c) HGF가 배양된 GelMA 용액을 광경화시키는 단계;
d) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 표면에, 인간 구강 각질세포 (HOK)를 시딩(seeding)하는 단계; 및
e) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 각각 표면 및 벌크(bulk)에 위치하게 된 HOK 및 HGF를 공배양하는 단계를 포함하는,
광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법에 관한 것이다.
구강 점막 질병은 보통 건강 이상, 트라우마 및 수술 때문에 구강 점막의 비가역적인 또는 가역적인 손상으로 인해 발생한다. 그러한 질병의 치료를 위해 이상적으로는 구강점막과 유사한 좋은 생체적합성을 지닌 생체재료(biomaterial)가 필요하다. 기존의 연구들의 경우 여러 세포들의 분화를 위한 고분자 물질에 대한 성과는 있었으나 구강 점막 질병의 치료를 위한 특이적인 조건을 만족시키는 물질에 대한 연구는 아직 발견되지 않았다.
구강 점막조직의 각질화는 피부 조직의 각질화와 상이하므로 구강 질병 치료는 점막 이식 같은 방법으로 이루어진다. 조직 스캐폴드로서 천연 고분자 기반의 하이드로젤 시스템은 점막의 재생에 있어 이상적인 환경을 제공한다고 알려져 있다. 그러나 물리화학적 방법으로 제조된 하이드로젤은 우수한 특성을 잘 보여주지 못한다. 이런 한계를 극복하기 위해 자외선 가교된 하이드로젤 시스템이 제시되어왔다. 생체적합성이 있는 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 (GelMa)은 여러 조직의 스캐폴드로서 제시되어왔으나 기존에 보고된 하이드로젤은 인공 구강점막 조직 모델로서 사용할 수 없었다. 따라서, 구강점막 조직에 특화된 하이드로젤의 개발이 강력하게 요구되고 있다.
이에, 본 발명자는 상기 종래기술의 한계를 극복하기 위해 예의 연구노력한 결과, 인간 구강 각질세포 (human oral keratinocyte, HOK) 및 인간 잇몸 섬유아세포 (human gingival fibroblast, HGF)를 각각 GelMA 하이드로젤의 표면 및 벌크(bulk)에 배양시켜, 인공 구강 점막조직 모델로서의 2중층을 가지는 광경화성 GelMA 하이드로젤을 제조할 수 있었다.
국내 공개특허공보 10-2017-0125180호
본 발명자들은 인간 구강 각질세포 (HOK) 및 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)를 메타크릴레이트화된 젤라틴 (GelMA) 하이드로젤의 각각 표면 및 벌크(bulk)에 위치시켜 공배양(co-cultured)할 경우 최종산물의 2중층은 표피층 및 진피층으로 구성되어 피부나 점막의 표피-진피를 모방함으로써 인공 구강 점막조직 모델로서의 가치를 지니는지 살펴보았다.
본 발명의 일 측면에 따라, a) 메타크릴레이트화된 젤라틴 (GelMA) 용액을 제조하는 단계; b) 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)를 GelMA 용액에 부가하여 배양하는 단계; c) HGF가 배양된 GelMA 용액을 광경화시키는 단계; d) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 표면에, 인간 구강 각질세포 (HOK)를 시딩(seeding)하는 단계; 및 e) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 각각 표면 및 벌크(bulk)에 위치하게 된 HOK 및 HGF를 공배양하는 단계를 포함하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계의 GelMA 용액의 부피 대 중량비가 5 ~ 20 w/v%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 5 ~ 10 w/v%일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계에서 인간 잇몸 섬유아세포는 GelMA 용액에 부가되기 전 5 ~ 20%의 소 태아 혈청, 5 ~ 20 μg/mL 페니실린/5 ~ 20 μg/mL 스트렙토마이신을 보충한 배지에서 배양되어 세포를 분리할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 d) 단계에서 인간 구강 각질세포는 상기 광경화된 GelMA 하이드로젤의 표면에 시딩되기 전, 구강 각질세포 배지 및 0.5 ~ 2%의 페니실린/0.5 ~ 2%의 스트렙토마이신을 사용해 배양되어 세포를 분리할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 e) 단계의 최종산물의 2중층은 표피층 및 진피층으로 구성될 수 있다. 이는 피부나 점막의 표피-진피를 모방하는 것으로 인공 구강 점막조직 모델로서의 훌륭한 가치를 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에 따라, HOK가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 위치하고, HGF가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크에 위치하여 공배양된, 광경화성 GelMA 하이드로젤을 제공한다.
일 구현예에서, HGF를 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크에 위치시키기 위해, HGF를 GelMA 용액에 부가하여 배양하고 광경화 할 수 있다. 상기 GelMA 용액의 부피 대 중량비는 5 ~ 20 w/v%일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 5 ~ 10 w/v%일 수 있다
일 구현예에서, HOK를 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 위치시키기 위해, HGF가 벌크에 배양된 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 HOK를 시딩할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤은 인공 구강 점막조직 모델로서 표피층 및 진피층으로 구성되는 2중층을 가질 수 있다. 이는 피부나 점막의 표피-진피를 모방하는 것으로 인공 구강 점막조직 모델로서의 훌륭한 가치를 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 인간 구강 각질세포가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에, 인간 잇몸 섬유아세포가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크에 위치하여 공배양된(co-cultured), 광경화성 GelMA 하이드로젤을 제조할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 광경화성 GelMA 하이드로젤은 실험동물을 사용하지 않는 in vitro 피부 실험의 인공막으로 활용될 수 있고, 구강점막 질환 시 GelMA 하이드로젤을 구강점막과 유사한 좋은 생체적합성을 지닌 생체재료(biomaterial)로 사용하여 구강점막과 관련된 질병의 치료에도 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 인공 구강점막 모델로서, HOK 및 HGF로 공배양된 광경화성 GelMA 하이드로젤의 제조를 그림으로 도식화한 것이다.
도 2는 D2O를 사용해 분석한 GelMA의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 1일, 3일 및 5일 동안 관찰된, HGF를 내포하는 GelMA 하이드로젤의 명시야 (bright-field) 이미지를 나타낸다. 다양한 GelMA 용액의 농도 (5, 10, 15 및 20 w/v%)가 사용되었다. 백색의 축척바는 50 μm를 나타낸다.
도 4는 7일 및 14일 동안 관찰된, HGF를 내포하는 5 w/v% GelMA 하이드로젤의 생사 (live&dead) 형광 이미지를 나타낸다.
도 5는 7일 및 14일 동안 인큐베이션된 HGF를 내포하는 5 w/v% GelMA 하이드로젤의 표면에 공배양된 HOK의 명시야(bright-field) 이미지를 나타낸다. 백색의 축척바는 200 μm를 나타낸다.
도 6은 2-D 배양 플레이트상에 배양된 HOK의 이미지와 비교된 5 w/v% GelMA 하이드로젤 표면에 5일 동안 배양된 HOK의 면역형광 염색된 이미지를 나타낸다. E-카테린, 팔로이딘 및 DAPI는 각각 녹색, 적색, 청색으로 표시되어 있다. 백색의 축척바는 200 μm를 나타낸다.
도 7은 HGF 및 HOK 공배양된 GelMA 하이드로젤을 이용한 인공 구강점막 모델의 제조를 위한 기체-액체 인터페이스 시스템의 사진이다. 하이드로젤은 21일 동안 인큐베이션 되었다.
도 8은 HOK 및 HGF로 공배양된 5 w/v% GelMA 하이드로젤의 H&E 염색된 이미지이다. 40배율 (축척바: 20 μm) 및 200배율 (축척바: 50 μm)로 관찰되었으며 흑색과 황색의 삼각형은 각각 표피층 및 섬유아세포를 의미한다.
본 발명은 광경화성 GelMA 하이드로젤로서, 인간 구강 각질세포 및 인간 잇몸 섬유아세포가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 각각 표면 및 벌크에 위치하여 공배양되어 인공 구강점막 모델로서의 광경화성 GelMA 하이드로젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 메타크릴레이트 젤라틴 (GelMA) 용액을 제조하는 단계; b) 미리 배양된 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)를 GelMA 용액에 부가하여 배양하는 단계; c) HGF가 배양된 GelMA 용액을 광경화시키는 단계; d) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 표면에 미리 배양된 인간 구강 각질세포 (HOK)를 시딩(seeding)하는 단계; 및 e) GelMA 하이드로젤의 각각 표면 및 벌크(bulk)에 위치하게 된 HOK 및 HGF를 공배양하는 단계를 포함하는, 인공 구강 점막조직 모델로서의 2중층을 가지는 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 b) 단계에서 GelMA 용액에 있어 부피 대 중량비는 5 ~ 20 w/v%일 수 있다. 또한 인간 잇몸 섬유아세포가 GelMA 용액에 부가되기 전 5 ~ 20%의 소 태아 혈청, 페니실린 10 ~ 20 μg/mL 및 스트렙토마이신 10 ~ 20 μg/mL을 보충한 배지를 사용해 배양된 세포를 분리시킬 수 있다. 이는 GelMA의 용액에 HGF를 배양시키기 위한 전처리이다.
상기 d) 단계에서 인간 구강 각질세포 (HOK)는 상기 광경화된 GelMA 하이드로젤의 표면에 시딩되기 전, 구강 각질세포 배지 및 1 ~ 2%의 페니실린 및 1 ~ 2% 스트렙토마이신을 사용해 배양된 세포를 분리시킬 수 있다. 이는 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 HOK를 배양시키기 위한 전처리이다.
상기 e) 단계의 최종산물 또는 인공 구강점막 모델로서의 광경화성 GelMA 하이드로젤은 표피층 및 진피층의 2중층 구성된다. 이는 인간 점막 또는 피부의 표피-진피를 모방하는 것으로 인공 구강 점막조직 모델로서의 적합한 GelMA 하이드로젤을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. GelMA의 제조
도면 1에 나타낸 것처럼, 젤라틴 (10 w/v%; 5 g)을 490 ml의 둘베코 포스페이트 버퍼 식염수 (DPBW)에 넣어 완전히 용해될 때까지 60oC의 조건에서 연속적으로 교반해주었다. 이후 메타크릴릭 무수화물 (MA)을 가하고 혼합물을 추가로 1시간 동안 50oC의 조건에서 교반했다. 미반응된 메타크릴릭 무수화물을 제거하기 위해, 최종 반응물은 정제수를 사용하여 7일 동안 투석하였다. 이후 -90oC로 7일 동안 동결건조하였다. in vitro 세포 배양에 앞서, 메타크릴레이트화된 젤라틴을 24시간 동안 70% 에탄올로 살균시켰다. 흰색 분말은 1H NMR 분석을 통해 특성을 관찰하고 D2O 내에서 측정하였다.
2. HOK와 HGF의 배양
정상적인 HOK (1 계대)는 구강 각질세포 성장 보조제를 포함하는 구강 각질세포 배지 및 5% CO2 하에서 37℃로 설정한 인큐베이터 내의 1% 페니실린/ 스트렙토마이신을 사용하여 T25 세포 배양 플라스크에서 배양되었다. 세포 배양은 어둠 속에서 수행되었고 배양 배지는 격일 주기로 신선한 배지로 교체되었다. HGF는 10%의 소 태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 (10 μg/mL)를 보충한 섬유아세포 배지를 사용해 배양되었다. 배지는 3일 주기로 신선한 배지로 교체되었다. 두 세포가 70 ~ 80%의 융합에 도달했을 때, 0.05 %의 트립신 및 0.1%의 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 용액을 이용하여 배양 플라스크에서 세포들을 분리했다. 2회 세척 후 세포들을 두 배지에 재분산하였고, 이는 in vitro 세포 실험에 사용되었다.
3. 인공 구강의 점막조직 모델의 진피-표피 등가물 제조
진피 등가물은 인공 구강 점막조직 모델의 3-D 재구성을 위해 HGF를 포함한 광경화성 GelMA 하이드로젤을 사용하여 제조되었다. 특정 양의 HGF (5 X 105 세포/각각의 웰)를 일정 농도 (0.05 w/v %)의 광-개시제 Irgacure 2959와 함께 다양한 농도 (5, 10, 15 및 20 w/v %)의 GelMA 용액에 가했다. 4개의 GelMA 용액으로부터 특정한 양 (300 mL)을 분리하고 이를 직경 12 mm (밀리포어, 베드포드, 미국) Millicell 플레이트로 옮겼다.
1 ~ 20 mW/cm2에서 365 nm에서 광경화한 뒤, 하이드로젤이 로딩된 트랜스웰 인서트를 HGF 증식 배지 (2 mL)가 있는 6-웰 플레이트에 담갔으며 1, 3, 5, 7 및 14일간 배양되었다. 배양 배지는 격일 주기로 신선한 배지로 교체되었다.
1, 3, 5 일간 배양된 세포는 인버티드 (inverted) 형광 현미경 (IX71; 올림푸스 생명 과학; 도쿄, 일본)을 사용해 관찰하였다. 7 일 및 14 일간 배양된 세포의 생존도 (viability)를 칼세인-AM/에틸디움 호모다이머 생사 (live&dead) 분석을 통해 확인하였다. 표피 등가물은 진피 등가물을 제조하는 방법과 같은 방볍으로 제조했다.
HOK 세포 (1 X 106 세포/각 HGF 함유 하이드로젤)은 페니실린 100 μg/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL 소 뇌하수체 추출물 및 표피 성장인자 10 ng/mL를 포함한, 구강 각질세포-혈청이 없는 배지 (KGC Clonetics, 샌디에고, 캘리포니아, 미국)와 혼합되었다. 밀리셀 플레이트의 각각의 광감광 하이드로젤 표면에 세포를 시딩(seeding)한 후, 세포를 내포하는 하이드로젤은 6-웰 플레이트로 옮겨져 7 일 및 14 일 인큐베이션 했다. 배지는 격일 주기로 신선한 배지로 교체되었다. 배양된 세포는 인버티드 현미경 (IX71; 올림푸스 생명과학; 도쿄, 일본)을 사용하여 관찰하였다. 진피-표피 등가물은 상기에 언급된 진피 및 표피 등가물의 제조 방법에 따라 제조되었다. (도 1)
4. HOK가 시딩된 GelMA 하이드로젤 면역 형광염색
5 일 배양 후, 세포를 시딩한 하이드로젤은 실온에서 인산 나트륨 완충액에서 4%의 포름알데히드로 고정했고 10분간 0.1%의 Triton X-100로 투과되고, PBS (pH 7.4) 중 5%의 소 혈청 알부민으로 1시간 블로킹했다. 그 다음, 세포를 Alex Fluor 546와 콘쥬게이트된 항 F-액틴 (분자 프로브)을 이용해서 E-카데린 (E-cadherin) 항체 (Cell Signaling Tech) 및 염소 항-토끼 IgG로 면역염색을 수행했다. 핵은 4‘6-디아미디노-2-페놀인돌 (DAPI)을 사용해 염색되었다. 인버티드 형광현미경 (IX71; 올림푸스 생명과학; 도쿄, 일본)으로 공초점(confocal) 이미지를 얻었다.
5. HOK 및 HGF 공배양된 GelMA 하이드로젤의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색
HOK 및 HGF로 공배양된 GelMA 하이드로젤을 21분 동안 인큐베이션하고 4%의 포름알데히드를 포함한 PBS에서 12시간 고정하였다. 파라핀에 엠베딩(embedding)시키고, 블로킹된 샘플은 3 μm 두께의 슬라이스 (Leica Biosystems : 버팔로 그로브, 일리노이, 미국)로 섹션화했다. 슬라이드는 H&E로 염색되고 인버티드 형광 현미경 (IX71; 올림푸스 생명 과학; 도쿄, 일본)으로 관찰되었다.
6. 결과
(1) GelMA의 H NMR 스펙트럼
젤라틴과 MA의 화학적 반응은 D2O를 사용하여 1H NMR 분석을 통해 확인하였다. 도 2에 보이는 것처럼 GelMA의 스펙트럼 중 메타크릴릴 무수화물(MA)의 비닐 그룹에 해당하는 5.31 및 5.55 ppm에서 2개의 피크가 관찰되었다. a 및 b 피크의 합계로 계산된 MA의 치환 정도는 28%로 계산되었다. 이는 GelMA가 성공적으로 형성됨을 입증한다.
(2) GelMA 하이드로젤의 HGF의 부착과 분화
도 3은 5 w/v% 내지 20 w/v%의 범위를 가지는 GelMA를 이용해 제조된 하이드로젤에 셀을 봉입한 후 1, 3 및 5일 동안의 HGF의 세포 추이를 나타낸 것이다. 1일째에는 변화가 미미했으나 3일째에는 5 ~ 10 w/v%의 GelMA 하이드로젤이 세포-세포 상호작용을 나타냈고, 뒤이어 15 ~ 20 w/v%의 GelMA 하이드로젤과 비교하여 세포수의 증가가 있었다. 5일째에는 GelMA의 농도가 증가할수록 세포 수가 감소하였다. 결과적으로 세포가 5 w/v%의 GelMA 하이드로젤에서 양성 세포와 결합되는 추이를 나타냄을 입증한다.
(3) HGF의 생존도
도 4는 7 및 14일 동안 5 w/v% GelMA 하이드로젤의 HGFs의 HGFs의 생존도를 평가하기 귀해 ive&dead 분석 세포분석을 한 결과를 나타낸다. 5 w/v%에서 최적화된 결과를 보였으므로 GelMA의 농도를 5 w/v%로 고정시켰다. 7 및 14일에 하이드로젤에서 살아있는 세포가 주로 관찰되었다. 또한, 14일 배양 후에 세포들은 잘 분화되었다.
(4) 5 w/v%의 GelMA 하이드로젤 표면에서의 HOK 세포의 부착과 분화
도 5는 7일 및 14일 동안 하이드로젤 표면에 배양된 HOK 세포의 추이에 대한 이미지를 나타낸다. 2-D 플라스크에서 배양된 HOK와 비교하여 7일 동안 하이드로젤 표면에 배양된 세포는 잘 분화되었다. 14일 동안의 배양 후, HOK 세포의 개수는 증가하였고 연속직인 세포 분화를 나타냈다. 이는 광경화된 GelMA가 HOK의 부착과 분화에 생체적합성을 가진다는 것을 의미한다.
각질세포의 특성이 유지되는지 조사하기 위해 면역염색을 하였고 이는 E-카테린의 발현을 통해 확실하게 입증되었다. 팔로이딘 염색을 통해 하이드로젤 표면 상에 배양된 HOK 세포가 골고루 펴졌다는 것을 알 수 있었다. E-카테린 염색을 통해 5일 동안 배양된 HOK 세포가 E-카테린의 발현을 유지한다는 것을 확인하였다. 특히, 3-D 하이드로젤의 HOK 세포 배양은 입페적인 세포 분화를 보였는데 이는 GelMA 하이드로젤이 구강 점막조직의 공학적 스캐폴드로 사용될 수 있음을 시사한다.
(5) 인공 구강점막의 확립
기체-액체 인터페이스 시스템을 활용한 광경화된 GelMA 하이드로젤에 기반한 인공 구강점막, HOK 세포 및 HGF 세포를 도 7에 나타냈다. HOK 및 HGF 세포를 GelMA 하이드로젤에 시딩하고 21일 동안 인큐베이션한 결과, 세포가 공배양된 하이드로젤은 붕괴 없이 온전한 구조를 유지했음을 알 수 있다.
(6) 조직학적 평가
도 8은 H&E로 염색되고 인버티드 형광현미경으로 관착된, 21일 동안 5 w/v%의 하이드로젤에서 HGF 및 HOK 세포를 보여준다. H&E 염색된 이미지를 보건대 대부분의 핵과 세포질은 헤마톡실린 및 에오신으로 각각 경미하게 염색되었다는 것을 알 수 있었다.
세포-공배양된 하이드로젤은 HOK-배양된 표피층 및 하이드로젤 벌크 내 과립화 조직을 형성했다. HOK로 배양된 표면에서 다중 표피증이 관찰되었는데 이는 인간 구강 점막의 표피 조직과 유사했다. 또한, 과립화 조직은 HGF-공배양된 벌크에서 정상적으로 형성되었다. 이는 HOK 및 HGF가 상호 간섭 없이 각자의 위치에서 표피층와 진피층을 정상적으로 형성함을 보여준다. 또한, 3-D 광경화 GelMA 하이드로젤은 인간 구강 점막조직 모델의 온전한 제조를 위한 생체재료로 쓰일 수 있음을 시사한다.
7. 결론
HOK 및 HGF로 공배양된 광경화성 GelMA 하이드로젤은 2중층을 가지는 구강 점막조직을 형성했다. HOK 세포는 하이드로젤의 표면에 효과적으로 부착되었고, HGF 세포는 하이드로젤의 벌크에서 성공적으로 분화되었다. 본 발명에서 제조된 인공 점막조직은 실험동물을 사용하지 않는 in vitro 피부 실험의 인공막으로 활용될 수 있고, 구강점막 질환 시 GelMA 하이드로젤을 구강점막과 유사한 좋은 생체적합성을 지닌 생체재료(biomaterial)로 사용되여 구강점막과 관련된 질병의 치료에도 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 인간 구강 각질세포 (human oral keratinocyte, HOK)가 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 (gelatin methacryloyl, GelMA) 하이드로젤의 표면에 위치하고, 인간 잇몸 섬유아세포 (human gingival fibroblast, HGF)가 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크(bulk)에 위치하여 공배양된(co-cultured), 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤.
  2. 제1항에 있어서, 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)를 광경화성 GelMA 하이드로젤의 벌크에 위치시키기 위해, HGF를 GelMA 용액에 부가하여 배양하고 광경화하는 것을 특징으로 하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤.
  3. 제2항에 있어서, 상기 GelMA 용액의 부피 대 중량비가 5 ~ 20 w/v%인 것을 특징으로 하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤.
  4. 제1항에 있어서, 인간 구강 각질세포 (HOK)를 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 위치시키기 위해, 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)가 벌크에 위치한 광경화성 GelMA 하이드로젤의 표면에 HOK를 시딩(seeding)하는 것을 특징으로 하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤.
  5. 제1항에 있어서, 상기 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤은 인공 구강 점막조직 모델로서 표피층 및 진피층으로 구성되는 2중층을 가지는 것을 특징으로 하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤.
  6. 제1항의 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법으로서,
    a) 메타크릴레이트화된 젤라틴 (GelMA) 용액을 제조하는 단계;
    b) 인간 잇몸 섬유아세포 (HGF)를 GelMA 용액에 부가하여 배양하는 단계;
    c) HGF가 배양된 GelMA 용액을 광경화시키는 단계;
    d) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 표면에, 인간 구강 각질세포 (HOK)를 시딩(seeding)하는 단계; 및
    e) 광경화된 GelMA 하이드로젤의 각각 표면 및 벌크(bulk)에 위치하게 된 HOK 및 HGF를 공배양하는 단계를 포함하는,
    광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 b) 단계의 GelMA 용액의 부피 대 중량비가 5 ~ 20 w/v%인 것을 특징으로 하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 e) 단계의 최종산물인 HOK 및 HGF가 공배양된 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤은 인공 구강 점막조직 모델로서 표피층 및 진피층으로 구성되는 2중층을 가지는 것을 특징으로 하는, 광경화성 메타크릴레이트화된 젤라틴 하이드로젤의 제조방법.
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