CN117230012A - 一种人结肠癌类器官培养方法及其应用 - Google Patents
一种人结肠癌类器官培养方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人结肠癌类器官培养方法及其应用。该方法包括以下步骤：将人结肠癌组织消化成单细胞悬液，裂红后与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官。采用本发明方法培养2天后可以观察到小的类器官形成，培养8‑9天后，类器官的直径达到300‑500μm。本发明还提供一种人结肠癌类器官与自体PBMC共培养进行药物筛选与评价的方法，该方法具有周期短、效率高、成本相对较低，更接近人体等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种人结肠癌类器官培养方法及其应用。
背景技术
肿瘤微环境对肿瘤的发生发展具有重要的影响，各种动物模型的构建使肿瘤微环境的研究得到飞跃发展，然而动物实验成本高、周期长，仅限于允许的饲养环境，且动物与人类仍然存在种属差异，转基因鼠也仅局限于某些蛋白人源化，经常不能够预测药物在人体中的疗效。人体类器官与真正的器官非常相似，为此，本发明采用人体结肠癌组织构建了一种模拟人体3D肿瘤微环境的人结肠癌类器官，提供了一种周期短、效率高、成本相对较低，且更接近人体的药物筛选和评价方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高效、稳定的人结肠癌类器官培养方法，其包括以下步骤：
将人结肠癌组织消化成单细胞悬液，裂红后与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官；所述的类器官培养基组成为：Advanced DMEM F12培养基、20％R-Spondin 1-conditioned medium、10％Noggin、10mM Nicotinamide、1mM N-acetyl cysteine、1×B-27supplement、50ng/mLRecombinant human EGF、500nM A83-01、10μM SB202190、10μM Y-27632、10nMprostaglandin E2；所述的Advanced DMEM F12培养基包含2mM Ultraglutamine I、10mMHEPES。
进一步的，所述的人结肠癌类器官培养方法，包括以下步骤：
(1)将人结肠癌组织用含1％双抗的PBS缓冲液洗净，移除多余的脂肪及坏死组织后剪碎，用消化液消化，加入PBS缓冲液终止消化后离心；用PBS缓冲液重悬细胞后，用细胞筛网过滤细胞悬浮液，PBS缓冲液清洗筛网，洗出液离心后，用PBS缓冲液清洗沉淀；往沉淀加入红细胞裂解液进行裂解后，加入PBS缓冲液中和反应并离心，用预冷的类器官培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液与与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官。
所述的细胞筛网的孔径为40μm。
所述消化的条件是37℃作用15min，3-4min震荡一下；所述裂解的条件是室温下反应1min。
所述细胞悬液的细胞量为＞3.9×105个/mL。
本发明的另一个目的在于提供一种人结肠癌类器官与自体外周血单个核细胞(PBMC)共培养进行药物筛选与评价的方法，包括以下步骤：
(1)按照上述的方法培养获得人结肠癌类器官；
(2)采用Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心方法，新鲜分离获得自体外周血单个核细胞；
(3)将外周血单个核细胞与人结肠癌类器官混合，加入待测药物，共同培养；采用流式细胞分析方法检测PBMC中免疫细胞亚群的变化，采用hoechst、caspase 3荧光共定位评价待测药物的抗肿瘤免疫活性。
步骤(3)中，所述外周血单个核细胞的用量为2×105个/孔；所述人结肠癌类器官的用量为50-100个/孔。
所述共同培养的条件是37℃，5％CO2条件下共培养12～48h。
所述共同培养的培养液为：Advanced DMEM F12培养基、20％R-Spondin 1-conditioned medium、10％Noggin、10mM Nicotinamide、1mM N-acetyl cysteine、1×B-27supplement、50ng/mL Recombinant human EGF、500nM A83-01、10μM SB202190、10μM Y-27632、10nM prostaglandin E2；所述的Advanced DMEM F12培养基包含2mMUltraglutamine I、10mM HEPES。
本发明提供了一种人结肠癌类器官培养方法，采用本发明方法培养2天后可以观察到小的类器官形成，培养8-9天后，类器官的直径达到300-500μm，此时可以进行传代，并与自体PBMC共培养进行药物筛选与评价。本发明还提供一种人结肠癌类器官与自体外周血单个核细胞(PBMC)共培养进行药物筛选与评价的方法，该方法将人结肠癌类器官与自体PBMC共培养后采用流式细胞仪，以及hoechst、caspase 3荧光共定位评价的手段来评价药物的抗肿瘤免疫活性。相较于现有技术，本发明建立了一种周期短、效率高、成本相对较低，更接近人体的药物筛选和评价方法。
附图说明
图1是与人结直肠癌类器官共培养48h后PBMC中CD3+CD4+T细胞，CD3+CD8+T细胞，CD56+NK细胞流式细胞分析。
图2是Hoechst染色的PBMC与人结直肠癌类器官共培养后不同时间与greencaspase 3荧光共定位图，图中标尺为400μm。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、人结直肠癌类器官原代分离培养
(1)以含1％双抗(青霉素/链霉素)的PBS缓冲液(4℃)洗净人结直肠癌组织，并移除组织上多余的脂肪及坏死组织。
(2)使用剪刀将组织切碎至1mm3大小。
(3)加入10mL含1％双抗的PBS缓冲液并转移至50mL离心管，300×g 4℃离心5min。
(4)加入组织消化液1.5mL于37℃作用15min，3-4min震荡一下。
(5)加入4.5mL PBS缓冲液终止消化并离心，300×g 4℃离心5min。
(6)加入5mL PBS缓冲液重悬细胞，使用40μm细胞筛网过滤细胞悬浮液，用PBS缓冲液清洗筛网。
(7)洗出液300×g 4℃离心5min，PBS缓冲液清洗。
(8)加入红细胞裂解液1mL室温反应1min，加入3倍体积PBS缓冲液中和反应并离心。
(9)以500μL 4℃类器官培养基(Advanced DMEM F12培养基(包含2mMUltraglutamine I,10mM HEPES),20％R-Spondin 1-conditioned medium,10％Noggin,10mM Nicotinamide,1mM N-acetyl cysteine,1×B-27supplement,50ng/mL Recombinanthuman EGF,500nM A83-01,10μM SB202190,10μM Y-27632,10nM prostaglandin E2)重悬细胞，细胞悬液转移至1.5mL离心管，细胞计数，100μL细胞悬液(细胞量＞3.9×105个/mL)加入550μL基质胶混合至颜色均匀，25μL/孔细胞混合溶液加入预热的24孔板中心，细胞混合液置于冰上操作。
(10)将细胞板倒置放入培养箱待细胞凝固15min。
(11)每孔加入250μL类器官培养基(37℃)并放置于培养箱。
(12)每2-3天更换培养液，每天观察类器官生长情况，2天后可以观察到小的类器官形成，培养8-9天后，类器官的直径达到300-500μm，此时可以进行传代。
2、人结直肠癌类器官传代
(1)加入1mL PBS吹打基质胶(至少5次)，收集细胞至15mL离心管中。
(2)使用100μL枪头至1000μL枪反复吹打使细胞充分与基质胶分离。
(3)使用40μm滤膜过滤细胞。
(4)在10cm培养皿中以5mL PBS清洗滤膜。
(5)滤膜转移至新培养皿，加入7mL培养基冲洗滤膜并将细胞收集于15mL离心管，300×g 4℃离心5min。
(6)加入300μL消化液室温2-3min并不时吹打，在显微镜中确认细胞分离情况。(无需计数细胞，若类器官未达到300-500μm但密度高，按1-5步骤分离细胞并以低密度回种细胞)。
(7)当细胞分散成小团块即可停止消化，加入1mL培养基，300×g 4℃离心5min。
(8)类器官培养基(37℃)重悬细胞，并混合基质胶至75％，每孔加入25μL混合液至预热过的48孔板中，细胞以1:2稀释传代。
(9)倒置放入培养箱15min，加入250μL类器官培养基/孔。
3、人结直肠癌类器官与自体PBMC共培养评价不同TIGIT抗体药物活性
(1)采用Ficoll-Paque PLUS(Cytiva,Lot 10300123)密度梯度离心方法，新鲜分离患者外周血单个核细胞(PBMC)。收集到的PBMC分成两部分，其中一部分用hoechst染色并用PBS洗去多余染料。另外一部分用于流式细胞仪检测。
(2)将未染色的PBMC(2×105个/孔)加入人结直肠癌类器官(50-100个/孔)，分为PBS组，anti-TIGIT1(10μg/mL)，anti-TIGIT2(10μg/mL)，anti-TIGIT3(10μg/mL)组，每组3个重复孔，于37℃，5％CO2条件下共培养48h，培养液组成为：Advanced DMEM F12培养基、20％R-Spondin 1-conditioned medium、10％Noggin、10mM Nicotinamide、1mM N-acetylcysteine、1×B-27supplement、50ng/mLRecombinant human EGF、500nM A83-01、10μMSB202190、10μM Y-27632、10nM prostaglandin E2；所述的Advanced DMEM F12培养基包含2mM Ultraglutamine I、10mM HEPES。随后收集上清中的PBMC用于流式细胞仪检测。
(3)将用hoechst染色的PBMC(2×105个/孔)加入人结直肠癌类器官(50-100个/孔)，分为PBS组，anti-TIGIT1(10μg/mL)，anti-TIGIT2(10μg/mL)，anti-TIGIT3(10μg/mL)组，每组3个重复孔，于37℃，5％CO2条件下共培养，培养液组成同步骤(2)，在12h、24h分别加入green caspase 3染色后，用EVOS荧光显微镜拍照检测。(anti-TIGIT1，anti-TIGIT2，anti-TIGIT3由广东安普泽生物医药股份有限公司实验室自制)。
(4)实验结果
共培养48h后收集PBMC，采用BD BV510 Mouse Anti-Human CD3+,BD PCy7 MouseAnti-Human CD8+,BD OptiBuildTMBV421-Mouse Anti-Human TIGIT,BD PE Mouse Anti-Human CD56流式抗体染色后进行流式细胞分析。结果显示，给药组CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的总和，CD56+NK细胞相对百分比均比PBS对照组升高，CD4+/CD8+细胞百分比比值也有所增加，表明给药组PBMC抗肿瘤免疫活性增强，如图1所示。
采用hoechst染色的PBMC与人结直肠癌类器官共培养，0h,12h,36h用Greencaspase3染色后采用荧光显微镜拍照，结果显示，PBMC可侵润类器官，3种anti-TIGIT治疗组caspase3荧光强度均比PBS组强，其中anti-TIGIT2治疗组凋亡相关蛋白caspase3荧光强度最强，其次是anti-TIGIT3治疗组和anti-TIGIT1治疗组，并且随着孵育时间的延长而荧光强度显著增强，如图2所示。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将人结肠癌组织消化成单细胞悬液，裂红后与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官；所述的类器官培养基组成为：AdvancedDMEMF12培养基、20％R-Spondin 1-conditioned medium、10％Noggin、10mMNicotinamide、1mMN-acetyl cysteine、1×B-27supplement、50ng/mL Recombinant humanEGF、500nM A83-01、10μM SB202190、10μM Y-27632、10nM prostaglandin E2；所述的Advanced DMEM F12培养基包含2mM Ultraglutamine I、10mM HEPES。
2.根据权利要求1所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将人结肠癌组织用含1％双抗的PBS缓冲液洗净，移除多余的脂肪及坏死组织后剪碎，用消化液消化，加入PBS缓冲液终止消化后离心；用PBS缓冲液重悬细胞后，用细胞筛网过滤细胞悬浮液，PBS缓冲液清洗筛网，洗出液离心后，用PBS缓冲液清洗沉淀；往沉淀加入红细胞裂解液进行裂解后，加入PBS缓冲液中和反应并离心，用预冷的类器官培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液与与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官。
3.根据权利要求2所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，所述的细胞筛网的孔径为40μm。
4.根据权利要求2所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，所述消化的条件是37℃作用15min，3-4min震荡一下；所述裂解的条件是室温下反应1min。
5.根据权利要求2所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞量为＞3.9×105个/mL。
6.一种人结肠癌类器官与自体外周血单个核细胞共培养进行药物筛选与评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照权利要求1所述的方法培养获得人结肠癌类器官；
(2)采用Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心方法，新鲜分离获得自体外周血单个核细胞；
(3)将外周血单个核细胞与人结肠癌类器官混合，加入待测药物，共同培养；采用流式细胞分析方法检测PBMC中免疫细胞亚群的变化，采用hoechst、caspase 3荧光共定位评价待测药物的抗肿瘤免疫活性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述外周血单个核细胞的用量为2×105个/孔；所述人结肠癌类器官的用量为50-100个/孔。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共同培养的条件是37℃，5％CO2条件下共培养12～48h。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共同培养的培养液为：AdvancedDMEMF12培养基、20％R-Spondin 1-conditioned medium、10％Noggin、10mMNicotinamide、1mM N-acetyl cysteine、1×B-27supplement、50ng/mL Recombinanthuman EGF、500nMA83-01、10μM SB202190、10μM Y-27632、10nM prostaglandin E2；所述的AdvancedDMEM F12培养基包含2mM Ultraglutamine I、10mM HEPES。
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