CN117357560A - 外周血抗原特异性cx3cr1+t细胞的应用及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫细胞以及免疫治疗技术领域，具体涉及一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞亚群的应用及其培养方法。本发明通过对肺癌患者中配对的外周血及肿瘤组织标本进行单细胞转录组及TCR测序，发现CX3CR1+T细胞与TIL TCR相似性较高且具有抗肿瘤效应性特征；进一步本发明收集临床肺癌患者样本，对其外周血中CX3CR1表达水平及功能进行全方面试验探究，首次证实CX3CR1+T细胞亚群具有抗肿瘤效应，属于外周血中存在的具有抗原特异性且功能较强的免疫细胞，说明CX3CR1+T细胞是外周血中具有肿瘤杀伤能力的新型细胞亚群，因此本发明能够为实体肿瘤的免疫细胞治疗提供新的策略。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞以及免疫治疗技术领域，具体涉及一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的应用及其培养方法。
背景技术
恶性肿瘤对人们的生命健康造成了严重威胁，且恶性肿瘤的发病率和死亡率在逐年上升。其中，我国肺癌的发病率和死亡率在所有肿瘤中均居首位。传统的治疗方法在一定程度上缓解了肿瘤进展，然而患者长期生存欠佳。近年来，免疫治疗彻底改变了肿瘤治疗的模式，为肿瘤患者带来了疾病缓解乃至治愈的新希望。
T细胞介导了抗肿瘤免疫反应，如肿瘤浸润性T细胞(TIL)、嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)等在临床应用中取得了突破性进展。尽管上述免疫细胞在临床试验应用中已经展示了较好的临床疗效，被用于多种实体瘤的治疗，但是在临床应用中仍存在一定局限性。例如TIL细胞能够识别多种肿瘤抗原及杀伤肿瘤细胞，然而一部分肿瘤患者无法通过手术获取肿瘤组织，且TIL细胞体外扩增周期长，难以满足患者需求。CAR-T细胞在血液肿瘤治疗中疗效显著，然而对实体瘤治疗疗效欠佳。究其原因，CAR-T细胞靶点单一、肿瘤微环境的免疫抑制等因素使其在实体瘤治疗应用中受限制。同时，CAR-T细胞治疗成本昂贵，为社会经济带了一定的负担。
综上可知，由于取材受限、抗原丢失及肿瘤微环境的抑制性因素等使TIL及CAR-T细胞在实体瘤治疗中存在一定的局限性。而外周血来源的肿瘤特异性T细胞相较于TIL和CAR-T细胞具有取材方便、易于获取、成本低的特点，逐渐引起了研究人员的关注。Rosenberg等团队研究发现在恶性黑素瘤患者外周血中表达PD-1+的T细胞与TIL细胞T细胞受体(TCR)具有一定的相似性，提示PD-1+T细胞具有肿瘤特异性杀伤能力。随着单细胞转录组及TCR测序技术的广泛应用，能够深入探究实体瘤患者外周血中具有肿瘤杀伤能力T细胞亚群。在小鼠结直肠癌模型中，通过单细胞测序发现外周血中PD-1+T细胞与TIL细胞TCR相似性仍然较低，提示其不是外周血肿瘤杀伤细胞较好的标志物。
因此，探究外周血中具有的新型T细胞亚群及功能以及匹配的培养方法，能够为实体肿瘤免疫治疗尤其是肺癌患者的治疗提供一种新策略。
发明内容
为解决上述现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的应用，该CX3CR1+T细胞为本发明首次鉴定的外周血中具有的新型T细胞亚群，能够为实体肿瘤治疗提供新策略。
本发明的第二目的是提供一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其培养时间短、经济高效，且能够扩增得到增殖能力、细胞杀伤能力得到显著提高的外周血CX3CR1+T细胞，从而支撑该细胞在实体瘤中的应用。
本发明的第三目的是提供一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞，该CX3CR1+T细胞来源于肿瘤患者外周血，取材方便；抗肿瘤效应强且不受限于单一靶点。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的应用，具体是外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用；所述外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞来源于肿瘤患者外周血。
作为进一步的方案，所述实体瘤为肺癌实体瘤。
外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞在制备治疗实体瘤的药物时，外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞是作为活性成分以发挥作用。本发明对于所述药物的剂型不作特殊限定，其可以是临床上可接受的免疫治疗的常规药物剂型。
上述外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，包括以下步骤：
步骤(1)：从肿瘤患者外周血中分离得到外周血单个核细胞，然后进行磁分选，得到待培养的CX3CR1+T细胞；
步骤(2)：调整待培养的CX3CR1+T细胞的密度，分别加入CD3/CD28抗体偶联磁珠、800～1200IU/mL的细胞因子IL-2、2～4mmol/L的L-精氨酸混合，然后接种至培养基中进行扩增培养，扩增培养过程中，每隔2～3天补加含800～1200IU/mL细胞因子IL-2的培养基。
作为进一步的方案，步骤(1)中，外周血单个核细胞分离采用Ficoll密度梯度离心法。
作为进一步的方案，步骤(1)中，所述磁分选具体为：在外周血单个核细胞中加入磁分选缓冲液洗涤，然后离心弃去上清，将离心后所得细胞按照1×107个细胞的数量对应加入10μL的人anti-CX3CR1 PE抗体和70μL的磁分选缓冲液，孵育15min，再加入5mL的磁分选缓冲液洗涤，然后按照1×107个细胞的数量加入20μL PE-beads和70μL磁分选缓冲液，孵育15min，再在磁场中放入LS磁分选柱子，分选得到待培养的CX3CR1+T细胞。磁分选过程中，所述离心是在1500rpm、升速9降速9条件下离心5min。
优选地，步骤(2)中，采用培养基将待培养的CX3CR1+T细胞的密度调整至(1～3)×106个/mL。所述培养基为GT-T551培养基。
作为进一步的方案，步骤(2)中，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠的用量为待培养的CX3CR1+T细胞数量的2～4倍，更优选为3倍。
作为进一步的方案，步骤(2)中，所述培养基为GT-T551培养基。所述扩增培养的天数为6～8天，更优选为7天。
一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞，采用如上所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法培养得到。
作为进一步的方案，培养所得外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的增殖能力和细胞杀伤能力得到显著提高。
本发明的有益效果在于：
一、本发明通过对肺癌患者中配对的外周血及肿瘤组织标本进行单细胞转录组及TCR测序，发现CX3CR1+T细胞与TIL TCR相似性较高且具有抗肿瘤效应性特征。进一步地，本发明收集临床肺癌患者样本，对其外周血中CX3CR1表达水平及功能进行全方面试验探究，首次证实CX3CR1+T细胞具有抗肿瘤效应，属于外周血中存在的功能强的免疫细胞，说明外周血中具有肿瘤杀伤能力的新型细胞亚群，因此本发明的该项研究能够为实体肿瘤的免疫细胞治疗提供新的策略。
二、本发明中涉及的CX3CR1+T细胞来源于肿瘤患者外周血，具有取材方便、成本低的特点；并且试验发现，CX3CR1+T细胞的抗肿瘤效应强并且不受限于单一靶点，不受肿瘤微环境的免疫抑制。
三、本发明提供的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，经过改进培养过程后，不仅培养时间短，经济高效，而且本发明将L-精氨酸加入到患者外周血来源的CX3CR1+T细胞培养体系中，发现CX3CR1+T细胞的增殖能力及抗肿瘤效应能够得到显著增强，因此本发明提供了一种获取大量CX3CR1+T细胞的有效方式，能够为解决患者免疫细胞治疗标本取材受限、靶点治疗单一、培养时间长及成本高等临床治疗局限性提供一种新方案。
附图说明
图1为本发明试验例1中肺癌患者外周血CX3CR1+T细胞表达水平及TCR相似性分析
图2为本发明试验例2中CX3CR1+T细胞与CX3CR1-T细胞表型与功能的对比分析图；
图3为本发明试验例3中CX3CR1+T细胞与CX3CR1-T细胞杀伤自体肿瘤细胞的能力；
图4为本发明试验例4中CX3CR1+T细胞的体内抗肿瘤效应测试结果；
图5为本发明试验例5中L-精氨酸增强CX3CR1+T细胞的增殖能力与功能测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明。以下说明仅用于解释本发明，不应理解为对本发明保护范围的限制。下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为本领域常规方法。以下实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，可以从商业途径获得。
实施例1
本实施例提供一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的应用，具体是作为活性成分在制备治疗实体瘤的药物中的应用；所述外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞来源于肿瘤患者外周血。所述实体瘤为肺癌实体瘤。
本实施例还提供一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，包括以下步骤：
步骤(1)：采用Ficoll密度梯度离心法，从肺癌患者外周血中分离得到外周血单个核细胞(PBMCs)，然后进行磁分选，得到待培养的CX3CR1+T细胞；其中，Ficoll密度梯度离心法为本领域常规的PBMCs的分离方法，具体参见后续试验例1记载的方法。磁分选具体为：在外周血单个核细胞中加入磁分选缓冲液洗涤，然后在1500rpm、升速9降速9条件下离心5min，弃去上清，将离心后所得细胞按照1×107个细胞的数量对应加入10μL的人anti-CX3CR1 PE抗体和70μL的磁分选缓冲液，孵育15min，再加入5mL的磁分选缓冲液洗涤，然后按照1×107个细胞的数量加入20μL PE-beads和70μL磁分选缓冲液，孵育15min，进一步在磁场中放入LS磁分选柱子，分选得到待培养的CX3CR1+T细胞。
步骤(2)：将待培养的CX3CR1+T细胞计数后，采用GT-T551培养基调整细胞密度为1×106个/mL，分别加入刺激剂CD3/CD28抗体偶联磁珠(按照1个T细胞，3个磁珠的量刺激)、1000IU/mL的细胞因子IL-2、3mmol/L的L-精氨酸混合，然后接种至GT-T551培养基中在37℃，5％CO2培养箱中进行扩增培养，扩增培养过程中，每隔2～3天补加含1000IU/mL细胞因子IL-2的培养基。培养扩增至第7天离心收获细胞，进行后续指标测定。
本实施例还提供一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞，采用上述培养方法培养得到。
对比例1
本对比例提供一种外周血CX3CR1+T细胞的培养方法，其培养过程与实施例1基本相同，两者区别仅在于：该对比例在扩增培养时，不添加L-精氨酸，其余过程同实施例1。
试验例1单细胞TCR测序、生物信息学分析以及CX3CR+T细胞比例与表型检测
通过将肺癌患者配对的外周血与肿瘤组织浸润的T细胞(TIL)进行单细胞TCR测序及生物信息学分析，从而鉴定患者外周血中与肿瘤组织中具有相似TCR的T细胞亚群。具体步骤如下：
(1)样本收集与处理：2021年2-8月在郑州大学第一附属医院胸外科无菌条件下采集4例临床病理诊断为肺癌患者的外周血及配对肿瘤组织样本，患者样本采集经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准及患者知情同意。
肿瘤组织样本的处理：采用生理盐水洗涤肿瘤组织样本并剪成小块。在C-Tubs管(C管)中加入4.7mL的RPMI1640培养基、325μL人肿瘤组织解离试剂盒的三酶(200μL EnzymeH、100μL Enzyme R和25μL Enzyme A)，将组织块放入C管拧紧，倒置安装到gentleMACS组织处理器，运行处理器的h-tumor-01程序，程序结束后将C管放入37℃摇床，100rpm孵育30min。孵育后采用70μm过滤器过滤，50mL离心管收集肿瘤组织细胞悬液。
外周血样本的处理：将外周血样本放入离心机中，1500rpm、升速9降速9离心10min，弃去上层血清，按照1:2体积加入PBS。另取一50mL离心管加入15mL淋巴细胞分离液，将血细胞混合液缓慢加入淋巴细胞分离液上层，升降速均为5、2500rpm下离心25min。离心后收集白膜层，用等体积的PBS洗涤，1500rpm离心10min，弃上清沉淀得到外周血单个核细胞(PBMCs)。
(2)CD3+T细胞磁分选：使用磁分选缓冲液洗涤步骤(1)所得PBMCs与肿瘤组织细胞悬液，1500rpm、升速9降速9离心5min，弃去上清。按照1×107个细胞加入20μL人CD3磁珠(beads)和70μL磁分选缓冲液，混匀后4℃避光孵育15min。加入1mL磁分选缓冲液润湿磁分选柱子，将孵育的细胞加入1mL磁分选缓冲液，在磁场中过柱分选，得到CD3+T细胞。
(3)单细胞转录组测序：将步骤(2)磁分选后所得肺癌患者外周血及肿瘤组织来源的CD3+T细胞，送至北京斑马鱼科技有限公司进行建库、利用10×技术进行单细胞转录水平及T细胞受体(TCR)测序并进行数据分析，鉴定患者外周血中与肿瘤组织中具有相似TCR的T细胞亚群。
(4)CX3CR+T细胞比例与表型检测：取健康供者与肺癌患者外周血PBMCs(1×105个)，采用PBS洗涤一遍后弃上清，避光分别加入1μL抗CD3、CX3CR1、PD-1、TIM3及TIGIT等流式抗体，4℃孵育15min，流式细胞仪上机检测。
上述测定结果如图1所示。图1中，A图为肺癌患者外周血与TIL具有相似TCR的T细胞基因表达水平，其中CX3CR1表达水平较高；B图为外周血中CX3CR1+与CX3CR1-T细胞与TCR相似性分析；C图为肺癌患者外周血与健康对照中CX3CR1的表达水平。
由图1综合分析可知，通过将肺癌患者配对的外周血与肿瘤组织浸润的T细胞(TIL)进行单细胞TCR测序及生物信息学分析，结果发现外周血中与TIL具有相似TCR的T细胞高表达CX3CR1。同时，与CX3CR1﹣T细胞相比较，外周血中CX3CR1+T细胞与TIL相似性显著增高，表明外周血CX3CR1+T细胞具有肿瘤杀伤功能。进一步采用流式细胞术比较健康供者与肺癌患者外周血CX3CR1表达，发现肺癌患者(Patient)外周血中CX3CR1表达显著高于健康供者(HD)外周血，因此能够为体外扩增培养CX3CR1+T细胞提供保障。
试验例2CX3CR1+T细胞比例与表型检测
CX3CR1+T细胞磁分选：收集肺癌患者外周血并按照上述方法分离PBMCs，加入5mL磁分选缓冲液(MACS buffer)洗涤，1500rpm、升速9降速9离心5min，弃去上清。按照1×107个细胞加入10μL人anti-CX3CR1 PE抗体和70μL的磁分选缓冲液，孵育15min，加入5mL MACSbuffer洗涤，在按照1×107个细胞加入20μL入PE-beads和70μL磁分选缓冲液，孵育15min。在磁场中放入磁分选柱子分选CX3CR1+T细胞。
然后采用流式细胞术检测肺癌患者外周血中CX3CR1+与CX3CR1-T细胞表型分泌杀伤性细胞因子的能力。结果如图2所示。图2中，A图为肺癌患者外周血中CX3CR1+与CX3CR1-T细胞抑制性分子表达水平；B图为CX3CR1+与CX3CR1-T细胞分析促炎性细胞因子的能力。
由图2综合分析可知，CX3CR1+T细胞低表达抑制性分子PD-1、TIM3和TIGIT，且CX3CR1+T细胞分泌Granzyme B和Perforin的能力显著优于CX3CR1-T细胞，表明CX3CR1+T细胞具有更强的抗肿瘤效应，且抗肿瘤效应强不受限于单一靶点。
试验例3CX3CR1+T细胞杀伤自体肿瘤细胞能力检测
将肺癌患者外周血中分离的CX3CR1+T细胞、CX3CR1-T细胞及TIL细胞与自体的肿瘤细胞按照效靶比5:1铺于96孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h后收集细胞，一部分标记CD107A和Granzyme B检测T细胞功能。另取一部分细胞标记Annexin-V，上机前加入PI检测肿瘤细胞的凋亡。结果如图3所示。图3中，A图为患者标本采集及分选T细胞与肿瘤细胞共孵育示意图；B图为外周血CX3CR1+T细胞杀伤自体肿瘤细胞的能力。
图3中，为了验证CX3CR1+T细胞的抗肿瘤效应，将肺癌患者外周血CX3CR1+/CX3CR1-T细胞、TIL细胞与自体肿瘤细胞进行共孵育，结果发现CX3CR1+T细胞与TIL组肿瘤细胞裂解率显著高于CX3CR1-T细胞组。同时，CX3CR1+T细胞与肿瘤共孵育后杀伤性标志物CD107A和Granzyme B的表达显著高于CX3CR1-T细胞。这些结果表明肺癌患者外周血CX3CR1+T细胞具有良好的抗肿瘤效应。
试验例4CX3CR1+T细胞的体内抗肿瘤效应
体内抗肿瘤效应的测试过程为：
(1)肺癌荷瘤小鼠模型构建：取对数生长期的小鼠肺癌细胞系LLC-OVA，加入10mLPBS洗涤细胞，弃去PBS后加入1mL 0.25％胰酶，37℃培养箱中消化5min，加入10mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化并将细胞吹打成肿瘤细胞单细胞悬液。采用PBS洗涤细胞，计数，每只C57小鼠编号从1-20，背部接种1×106个肿瘤细胞，观察肿瘤生长情况，构建得到肺癌荷瘤小鼠。
(2)CX3CR1+T细胞体内抗肿瘤效应检测：从8周龄OT-1CD45.1转基因小鼠中取出脾脏，在无菌超级工作台内磨碎，加入20mL PBS洗涤并过滤到另一50mL离心管中，1500rpm、升速9降速9离心5min，弃去上清，加入小鼠CD3、CX3CR1抗体进行流式细胞分选，分选所得CX3CR1+T细胞与CX3CR1-T细胞进行计数，按照1×106个/mL密度重悬于1640培养基中，加入CD3(10μg/mL)、CD28(5μg/mL)小鼠活化单抗、IL-2(1000IU/mL)，37℃培养箱活化培养48h。将1×106个活化的细胞通过尾静脉过继输注至每只肺癌荷瘤小鼠，每隔2d测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并观察小鼠生存时间。
(3)分离小鼠肿瘤组织浸润的T细胞，加入1μL小鼠流式抗体PD-1、TIM3抗体，避光孵育15min，加入200μL多聚甲醛固定20min，离心弃去上清后加入1×破膜剂避光孵育30min，采用PBS洗涤一遍后加入小鼠流式抗体Granzyme B和Perforin，上机检测。
测试结果如图4所示。图4中，A图为小鼠肺癌模型构建及输注OT1 T细胞的示意图；B图为流式细胞术检测肿瘤浸润CD3+、CX3CR1+与CX3CR1-细胞耗竭性标志物PD-1+TIM3+表达水平；C图为流式细胞术检测小鼠脾脏中三种T细胞亚群Granzyme B和Perforin的分泌；D图为流式细胞术检测小鼠肿瘤浸润的三种T细胞亚群Granzyme B和Perforin的分泌；E图为不同处理组小鼠生存期。
图4中，通过构建肺癌荷瘤小鼠模型，分别过继回输OT1小鼠CD3+、CX3CR1+与CX3CR1-T细胞，结果发现肿瘤组织浸润的CX3CR1+T细胞耗竭性标志物PD-1+TIM3+比例显著低于CD3+、CX3CR1-T细胞组，且CX3CR1+T细胞分泌Granzyme B和Perforin的能力显著增强。同时，输注CX3CR1+T细胞组小鼠生存组显著延长，提示过继回输CX3CR1+T细胞能够为肺癌的免疫细胞治疗提供一种新策略。
试验例5CX3CR1+T细胞增殖能力及胞内因子检测
本试验例对实施例1和对比例1的培养方法培养所得CX3CR1+T细胞的增殖能力及胞内因子水平进行检测。测试时分别取实施例1和对比例1培养所得CX3CR1+T细胞1×105个，采用PMA(50ng/mL)、离子霉素(750ng/mL)和阻断剂BFA(5μg/mL)在37℃，5％CO2培养箱中刺激细胞6h，收集细胞采用PBS洗涤一遍，加入表面抗体CD3后4℃孵育15min，加入200μL的多聚甲醛固定20min，离心弃去上清后加入1×破膜剂避光孵育30min，采用PBS洗涤一遍后加入Ki67、Granzyme B和Perforin等胞内抗体，上机检测。结果如图5所示。其中，图5A为流式细胞术检测L-精氨酸处理的CX3CR1+T细胞ki67的表达水平；图5B为流式检测L-精氨酸处理的CX3CR1+T细胞促炎性细胞因子分泌水平。
由图5可知，采用实施例1的含有3mM的L-精氨酸的培养体系培养CX3CR1+T细胞7天，与对比例1相比，本发明的L-精氨酸处理组的增殖指标Ki67表达显著升高(实施例1均值为35.8％；对比例1均值为17.6％)，且细胞杀伤相关标志物Granzyme B(实施例1均值为39.3％；对比例1均值为18.5％)和Perforin(实施例1均值为29.6％；对比例1均值为15.1％)的能力也显著增强。由此说明本发明将L-精氨酸加入到患者外周血来源的CX3CR1+T细胞培养体系中，能够显著增强CX3CR1+T细胞的增殖能力及抗肿瘤效应。
综上可知，本发明提供的CX3CR1+T细胞的培养方法，不仅培养时间短、经济高效，而且通过将L-精氨酸加入到患者外周血来源的CX3CR1+T细胞培养体系中，能够显著增强CX3CR1+T细胞的增殖能力及抗肿瘤效应。并且，本发明试验证实，CX3CR1+T细胞为外周血中具有的新型T细胞亚群，该CX3CR1+T细胞来源于肿瘤患者外周血，取材方便，抗肿瘤效应强且不受限于单一靶点，能够为解决实体肿瘤患者免疫细胞治疗标本取材受限及靶点治疗单一等临床治疗局限性提供一种新策略。
Claims (10)
1.外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的应用，其特征在于，外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用；所述外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞来源于肿瘤患者外周血。
2.根据权利要求1所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的应用，其特征在于，所述实体瘤为肺癌实体瘤。
3.如上所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：从肿瘤患者外周血中分离得到外周血单个核细胞，然后进行磁分选，得到待培养的CX3CR1+T细胞；
步骤(2)：调整待培养的CX3CR1+T细胞的密度，分别加入CD3/CD28抗体偶联磁珠、800～1200IU/mL的细胞因子IL-2、2～4mmol/L的L-精氨酸混合，然后接种至培养基中进行扩增培养，扩增培养过程中，每隔2～3天补加含800～1200IU/mL细胞因子IL-2的培养基。
4.根据权利要求3所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，外周血单个核细胞分离采用Ficoll密度梯度离心法。
5.根据权利要求3所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磁分选具体为：在外周血单个核细胞中加入磁分选缓冲液洗涤，然后离心弃去上清，将离心后所得细胞按照1×107个细胞的数量对应加入10μL的人anti-CX3CR1 PE抗体和70μL的磁分选缓冲液，孵育15min，再加入5mL的磁分选缓冲液洗涤，然后按照1×107个细胞的数量加入20μL PE-beads和70μL磁分选缓冲液，孵育15min，再在磁场中放入LS磁分选柱子，分选得到待培养的CX3CR1+T细胞。
6.根据权利要求3～5任一项所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，采用培养基将待培养的CX3CR1+T细胞的密度调整至(1～3)×106个/mL。
7.根据权利要求3～5任一项所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠的用量为待培养的CX3CR1+T细胞数量的2～4倍。
8.根据权利要求3～5任一项所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基为GT-T551培养基；所述扩增培养的天数为6～8天。
9.一种外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞，其特征在于，采用如权利要求3～8任一项所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的培养方法培养得到。
10.根据权利要求9所述的外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞，其特征在于，培养所得外周血抗原特异性CX3CR1+T细胞的增殖能力和细胞杀伤能力得到显著提高。
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