CN110938594A - 一种功能增强型til细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能增强型TIL细胞的培养方法,包括:从肿瘤组织分离淋巴细胞,加入启动培养基,种于12孔培养板,4ml/孔,进行启动淋巴细胞培养,培养10天或14天获得启动TIL细胞,收获启动的TIL细胞冻存备用;用诱导培养基悬浮淋巴细胞于25cm2培养瓶中,20ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱进行TIL细胞诱导培养1天;用扩增培养基进行半量换液,进行扩瓶培养和扩袋培养,共培养13天或14天;在培养第14天或第15天,收集TIL细胞,生理盐水洗涤,用功能增强培养基重悬TIL细胞后,孵育30分钟;收集TIL细胞,进行功能检测,获得所述的功能增强型TIL细胞。本发明所述的培养方法能获得具有更强的杀伤肿瘤细胞的活性、更高水平的抗肿瘤细胞因子分泌能力的功能增强型TIL细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及细胞的培养方法,具体涉及一种功能增强型肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TIL)细胞的培养方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗有望成为治愈肿瘤的一种新武器,尤其是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体在临床肿瘤免疫治疗中的应用得到广泛的关注,它们显著延长了晚期恶性黑色素瘤、肺癌和结肠癌等患者的生存期,让许多难以治疗的癌症患者见到了曙光。免疫检查点阻断剂主要是通过阻断肿瘤组织内T细胞抑制性信号通路,从而使T细胞持续性活化,突破肿瘤微环境的免疫抑制,达到杀伤肿瘤细胞的目的。2018年也被称为是中国免疫治疗的元年,多个抗PD-1抗体已在国内上市。然而,随着免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的临床应用,也暴露出非常突出的局限性,对于很多肿瘤患者的疗效有限,部分患者出现较强的副作用;另外,肿瘤患者一个疗程的用量按2-3mg/公斤,通常要用4-6个疗程,用量大,疗程数多,许多肿瘤患者难以承受高额的治疗费用(一支进口的100mg的PD-1抗体需18600多元,一个患者在治疗过程中至少要用6-8支PD-1抗体)。
细胞免疫治疗是肿瘤免疫治疗另一重要手段,其中嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体T细胞(TCR-T)在临床已取得较好的疗效,CD19 CAR-T细胞在美国也已获批用于临床白血病和淋巴瘤的治疗。但这类细胞由于存在脱靶效应、细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrome,CRS),以及肿瘤微环境的屏障和肿瘤免疫逃逸的复杂机制,限制了这类细胞在恶性实体瘤的临床应用。肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltratinglymphocytes,TIL)也是一种肿瘤抗原特异性的淋巴细胞,它与CAR-T细胞和TCR-T细胞不同,具有高效、特异、副作用小等优点。TIL细胞是浸润于肿瘤组织中的一群异质性细胞,以肿瘤抗原特异性CD4+T和CD8+T淋巴细胞为主,同时包括B细胞和NK细胞,大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。TIL细胞可特异性识别自体肿瘤抗原,具有特异的MHC限制性的抗肿瘤活性,相对于外周血淋巴细胞来说,TIL细胞除了具有抗肿瘤的免疫功能外,还表达粘附分子和选择素,从而增强肿瘤间质的浸润。研究发现TIL细胞与患者的临床预后和机体的抗肿瘤免疫密切相关。
TIL细胞一般来源于恶性胸腹水、恶性实体瘤原发灶以及转移的淋巴结组织,这些浸润的淋巴细胞从瘤体中分离,在体外经IL-2刺激后大量扩增,体外及小鼠体内的实验研究表明具有明显的抗肿瘤活性;临床试验研究表明回输自体的TIL细胞给肿瘤患者能有效发挥抗肿瘤作用,该疗法具有高效、特异、副作用小等优点。自从1986年Rosenberg研究组首先从黑色素瘤肿瘤组织中分离、扩增TIL细胞,将它在体外用白细胞介素II(IL-2)扩增到一定数量后用于治疗恶性黑色素瘤取得良好的疗效以来,TIL细胞在肿瘤治疗中的应用越来越广泛。最近,部分临床试验研究表明TIL细胞在恶性肿瘤治疗中具有良好的治疗作用,治愈率约为20-40%。
由于TIL细胞的来源受限,常规的TIL细胞培养方法受肿瘤大小、瘤内TIL细胞浸润数量、取肿瘤组织过程中易污染等多种因素的影响,限制了TIL细胞疗法在临床肿瘤治疗中的广泛应用。相比较于细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)和NK细胞,TIL细胞培养过程中细胞增殖速度和增殖倍率都不如前者;且培养过程中需使用大量IL-2,可促使CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的扩增,从而影响TIL细胞的抗肿瘤活性,导致肿瘤免疫逃逸的发生。因此,如何研发出一种适用于大量扩增、具有高效杀瘤活性的功能增强型TIL细胞,是目前TIL细胞临床应用需要亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种“功能增强型TIL细胞”的培养方法,该培养方法简单,操作性强,能高效扩增,培养出大量功能增强型TIL细胞,所获得的功能增强型TIL细胞能克服恶性实体瘤组织微环境免疫抑制。
本发明所述的一种功能增强型肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL细胞)的培养方法包括以下步骤:
A.启动培养阶段:从肿瘤组织分离淋巴细胞,加入启动培养基,种于12孔培养板,4ml/孔,进行启动淋巴细胞培养,培养10天或14天获得启动TIL细胞,收获启动的TIL细胞冻存备用;所述启动培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入自体血清和IL-2;
B.诱导培养阶段:用诱导培养基悬浮步骤A获得的淋巴细胞,置于37℃、5%CO2孵箱进行TIL细胞诱导培养1天;所述诱导培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入自体血清、CD3单抗和CD28单抗;
C.扩增培养阶段:用扩增培养基进行半量换液,对步骤B所获得的TIL细胞进行扩瓶培养和扩袋培养,共培养13天或14天;所述扩增培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入IL-2;
D.功能增强阶段:在培养第14天或第15天,收集TIL细胞,生理盐水洗涤,用功能增强培养基重悬TIL细胞后,孵育30分钟;所述功能增强培养基包括:生理盐水、人血清白蛋白、PD-1抗体;
E.细胞收获和鉴定:收集TIL细胞,进行功能检测,获得所述的功能增强型TIL细胞。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤A中,所述从肿瘤组织分离淋巴细胞包括:在培养皿中剪碎肿瘤组织,室温离心1800rpm×8分钟弃上清,加入10ml胶原酶IV液吹匀;置37℃水浴消化2小时;消化后收取上清,过100μm的筛子;生理盐水洗两次,室温离心1800rpm×8分钟,弃上清,取沉淀用X-VIVO悬浮,淋巴细胞分离液2:3进行Ficoll梯度离心,取中间层淋巴细胞,生理盐水洗两次,备用。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤B中,所述TIL细胞诱导培养包括:取淋巴细胞5×106个与Feeder细胞(用′γ射线灭活的T细胞)1×108个混合,用所述诱导培养基悬浮细胞于25cm2培养瓶中,20ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤C中,用扩增培养液进行半量换液,在25cm2培养瓶,20ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养,培养至第4至第5天;用扩增培养液将细胞由25cm2培养瓶扩增至175cm2培养瓶,100ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养,培养至第7至第8天;用扩增培养液将细胞由175cm2培养瓶扩增至细胞培养袋,1000~1500ml/袋,置于37℃、5%CO2孵箱培养至第13天或14天,获得扩增培养的TIL细胞。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤C中,所述TIL细胞扩增培养过程中,同时对细胞抽样送检,抽取4ml/袋,进行细菌和真菌等检测,确定细菌、真菌检测结果是否为阴性。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤E中,所述收集所获得的功能增强型TIL细胞包括:收集培养的细胞于一次性无菌离心杯中,2300rpm×8min离心收集;弃上清液,将沉淀细胞收集到6~8支无菌的50ml离心管中,用0.9%注射用生理盐水洗涤2次,离心800g×8min;弃上清液,将细胞收集到置于0.9%注射用生理盐水中,充分混匀,备用。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤A中,所述启动培养基包括:10%自体血清、500-1000IU/ml IL-2。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤B中,所述诱导培养基包括:10%自体血清、10-30ng/ml CD3单抗、10-30ng/ml CD28单抗。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤C中,所述扩增培养基包括:2000-4000IU/ml IL-2。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征,所述步骤D中,所述功能增强培养基包括:100ml生理盐水,5ml 20%人血清白蛋白,10-20mg PD-1抗体。
本发明所采用的T细胞无血清培养基可选自目前已商业化的各种产品,包括但不限于:X-VIVO 15(Lonza,Walkersville,MD);OpTmizer(Life Technologies);AIM V(LifeTechnologies,Grand Island,NY);TexMACS GMP(Miltenyi Biotec,Cambridge,MA);StemCell Growth Media(SCGM;Life Technologies)。
与现有技术相比,本发明所述的培养方法能获得功能增强型TIL细胞,该细胞能有效提高TIL细胞的杀伤肿瘤细胞的活性,并促进TIL细胞分泌大量抗肿瘤的细胞因子:IL-2、TNF-α和IFN-γ,以及分泌抗肿瘤的颗粒酶B,同时减少TIL细胞分泌免疫抑制分子IL-10。因此,本发明所述的培养方法能获得具有更强的杀伤肿瘤细胞的活性、分泌更多的抗肿瘤细胞因子的能力的功能增强型TIL细胞。
附图说明
图1是功能增强型TIL细胞和普通TIL细胞对肺癌细胞的杀伤活性的比较。
图2是功能增强型TIL细胞和普通TIL细胞杀伤肺癌过程中CD107a、GranzymB和IFN-γ的表达。
图3是功能增强型TIL细胞和普通TIL细胞对IFN-γ、IL-2和TNF-α和IL-10的分泌水平。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉本领域技术的人员可由本说明书所提示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1:功能增强型TIL细胞的培养
本发明提供了一种功能增强型TIL细胞的培养方法,根据细胞培养的不同阶段依次先后使用所述启动培养基、诱导培养基、扩增培养基和功能增强培养基。所述的培养方法包括以下步骤:
1)启动培养阶段:采集肿瘤组织分离浸润的淋巴细胞,在培养皿中剪碎肿瘤组织,室温离心1800rpm×8分钟弃上清,加入10ml IV胶原酶液吹匀;置37℃水浴消化2小时;消化后收取上清,过100μm的无菌筛子;生理盐水洗两次(室温离心1800rpm×8分钟,弃上清),取沉淀用X-VIVO悬浮,淋巴细胞分离液2:3进行Ficoll梯度离心,取中间层淋巴细胞;生理盐水洗两次,加入启动培养基,种于12孔培养板,4ml/孔,进行启动淋巴细胞培养,培养10天或14天获得启动TIL细胞,收获启动的TIL细胞冻存备用。
启动培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入自体血清和IL-2。
优选地,该启动培养基的组成成分包括:X-VIVO、10%自体血清、500-1000IU/mlIL-2。所述启动培养基的作用在于通过合理配比利用具有稳定TIL细胞的生物学功能,保持TIL细胞存活,促使其分泌细胞因子等。TIL细胞可以在所述启动培养基中启动培养10至14天获得启动培养的TIL细胞,冻存备用。
2)细胞诱导培养阶段:取经启动培养的TIL细胞5×106个与Feeder细胞(一种通过′Y射线灭活的T细胞)1×108个混合,用诱导培养基悬浮细胞于25cm2培养瓶中,20ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱,培养1天。
诱导培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入自体血清、CD3单抗和CD28单抗。
优选的,所述诱导培养基包括以下含量的各组分:X-VIVO、10%自体血清、10-30ng/ml CD3单抗、10-30ng/ml CD28单抗。所述诱导培养基的作用在于通过合理配比利用具有诱导免疫细胞激活作用的物质,对TIL细胞进行诱导激活,促使其分泌相应的抗肿瘤的细胞因子进而加快细胞的增殖。TIL细胞可以在所述诱导培养基中诱导培养1天)获得经诱导的TIL细胞。
3)细胞扩增培养阶段:取经诱导培养的TIL细胞用扩增培养液悬浮在25cm2培养瓶,20ml/瓶,进行半量换液,置于37℃、5%CO2孵箱,培养至第4至第5天;扩瓶培养:用扩增培养液将细胞由25cm2培养瓶扩增至175cm2培养瓶,100ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱,培养至第7至第8天;扩袋培养:用扩增培养液将细胞由175cm2培养瓶扩增至细胞培养袋,1000~1500ml/袋,置于37℃、5%CO2孵箱培养至第13天或14天,获得扩增培养的TIL细胞。抽样送检,抽取4ml/袋,详细填写好验单项目,同时进行细菌和真菌等检测。
扩增培养基是在TIL细胞无血清培养基的基础上加入IL-2。
优选地,扩增培养基包括以下含量的各组分:X-VIVO、2000-4000IU/ml IL-2。通过合理配比和利用能够促进TIL细胞扩增的物质实现细胞的大量体外增殖。诱导培养后的细胞可以在所述扩增培养基中培养13天或14天获得扩增培养TIL细胞。
4)TIL细胞的收获和鉴定:第14天或第15天,认真查看细菌、真菌的检测结果报告单,在确定细菌、真菌检测结果为阴性后,认真观察细胞生长状态,抽样5ml,台酚兰染色法计数活细胞、死细胞总数量;收集2袋培养的细胞于一次性无菌离心杯(250ml)中,2300rpm×8min离心收集。同时使用1小时快速试剂检测细胞悬液内毒素。弃上清液,将离心杯里的细胞收集到6~8支无菌的50ml离心管中,用0.9%注射用生理盐水洗涤2次,离心800g×8min。弃上清液,将细胞收集到置于0.9%注射用的100ml的生理盐水中,充分混匀,用于功能增强TIL细胞的培养。
5)细胞功能增强培养阶段:第14天或第15天,收集TIL细胞,生理盐水洗涤2次,用功能增强培养液重悬TIL细胞后,置于37℃、5%CO2孵箱培养孵育30分钟获得功能增强型TIL细胞,用于临床回输、功能检测或冻存。
另外,部分TIL细胞用X-VIVO+2000IU/ml IL-2重悬,置于37℃、5%CO2孵箱孵育30分钟获得普通型TIL细胞,用于功能检测,作为对照实验研究。
功能增强培养基包括:生理盐水、人血清白蛋白、PD-1抗体。
优选的,所述功能增强型培养基包括以下含量的各组分:100ml生理盐水、5ml20%人血清白蛋白、10-20mg PD-1抗体。所述功能增强型培养基的作用在于提高TIL细胞的抗肿瘤活性,且具有突破肿瘤微环境免疫抑制的功能。
经过此5个步骤即完成了功能增强型TIL细胞的制备。
实施例2:比较经过功能增强培养阶段的TIL细胞(功能增强型TIL)与未经过功能增强培养阶段的TIL细胞(普通TIL细胞)对肺癌细胞的杀伤功能。
对经过肺癌肿瘤组织分离淋巴细胞、启动培养阶段、诱导培养阶段、扩增培养阶段、功能增强培养阶段等步骤培养14天或15天获得功能增强型TIL细胞。对经过肺癌肿瘤组织分离淋巴细胞、启动培养阶段、诱导培养阶段、扩增培养阶段等步骤培养获得普通TIL细胞;在培养的第14天分别收集功能增强型TIL细胞和普通型TIL细胞,进行如下杀伤实验。
将稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的肺癌细胞系A549和H209以不同的效靶比与普通型TIL或功能增强型TIL细胞(n=4)混合于圆底96孔板,37℃条件下孵育6小时,收取细胞,用细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-APC,PI)避光染色,在4℃孵育20分钟,流式检测GFP+A549和GFP+H209的凋亡比例。同时设置效应细胞孔、靶细胞孔。最后杀伤效果的计算公式为:杀伤率=(对照组CI值-实验组CI值)/对照组CI值。
如图1所示,功能增强型TIL细胞对肺癌细胞系A549和H209的杀伤功能显著高于普通TIL细胞。
实施例3:比较经过功能增强培养阶段的TIL细胞(功能增强型TIL)与未经过功能增强培养阶段的TIL细胞(普通TIL)细胞因子的分泌水平
对经过肺癌肿瘤组织分离淋巴细胞、启动培养阶段、诱导培养阶段、扩增培养阶段、功能增强培养阶段等步骤培养获得功能增强型TIL细胞。对经过肺癌肿瘤组织分离淋巴细胞、启动培养阶段、诱导培养阶段、扩增培养阶段等步骤培养获得普通TIL细胞。在培养的第14天分别收集功能增强型TIL细胞和普通型TIL细胞,分别用流失细胞术和ELISA实验检测2种细胞分泌细胞因子的能力。
将稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的肺癌细胞系A549和H209以5:1的效靶比与普通型TIL细胞或功能增强型TIL细胞(n=4)混合于圆底96孔板,37℃条件下孵育2小时后加入PMA,BFA和离子霉素,继续孵育6小时,收取细胞,用CD107a流式抗体避光染色,在4℃孵育20分钟,洗涤后流式检测CD107a+TIL细胞的比例;胞内因子染色时,收取细胞,用固定破膜试剂盒处理30分钟,洗涤2次,进行胞内因子染色,4℃避光孵育20分钟,洗涤后流式检测胞内因子阳性TIL细胞比例。
将肺癌细胞系A549和H209以5:1的效靶比与普通型TIL细胞或功能增强型TIL细胞(n=4)混合于圆底96孔板,37℃条件下孵育6小时,收取上清,用ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-2和TNF-α和IL-10的浓度。
流式细胞仪检测结果如图2所示,与普通TIL细胞相比,功能增强型TIL细胞能分泌更高水平的颗粒酶B和IFN-γ,表达更高水平的CD107a。ELISA检测结果如图3所示,与普通TIL细胞相比,功能增强型TIL细胞能分泌更高水平的抗肿瘤的细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α,但免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌水平则降低。
上述实施例只是本发明的较佳实施例,并不是对本发明技术方案的限制,只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案,均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种功能增强型肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL细胞)的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
A.启动培养阶段:从肿瘤组织分离淋巴细胞,加入启动培养基,种于12孔培养板,4ml/孔,进行启动淋巴细胞培养,培养10天或14天获得启动TIL细胞,收获启动的TIL细胞冻存备用;所述启动培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入自体血清和IL-2;
B.诱导培养阶段:用诱导培养基悬浮步骤A获得的淋巴细胞,置于37℃、5%CO2孵箱进行TIL细胞诱导培养1天;所述诱导培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入自体血清、CD3单抗和CD28单抗;
C.扩增培养阶段:用扩增培养基进行半量换液,对步骤B所获得的TIL细胞进行扩瓶培养和扩袋培养,共培养13天或14天;所述扩增培养基是在T细胞无血清培养基的基础上加入IL-2;
D.功能增强阶段:在培养第14天或第15天,收集TIL细胞,生理盐水洗涤,用功能增强培养基重悬TIL细胞后,孵育30分钟;所述功能增强培养基包括:生理盐水、人血清白蛋白、PD-1抗体;
E.细胞收获和鉴定:收集TIL细胞,进行功能检测,获得所述的功能增强型TIL细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤A中,所述从肿瘤组织分离淋巴细胞包括:在培养皿中剪碎肿瘤组织,室温离心1800rpm×8分钟弃上清,加入10ml胶原酶IV液吹匀;置37℃水浴消化2小时;消化后收取上清,过100μm的筛子;生理盐水洗两次,室温离心1800rpm×8分钟,弃上清,取沉淀用X-VIVO悬浮,淋巴细胞分离液2:3进行Ficoll梯度离心,取中间层淋巴细胞,生理盐水洗两次,备用。
3.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤B中,所述TIL细胞诱导培养包括:取淋巴细胞5×106个与Feeder细胞(用′γ射线灭活的T细胞)1×108个混合,用所述诱导培养基悬浮细胞于25cm2培养瓶中,20ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养。
4.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于:所述步骤C中,用扩增培养液进行半量换液,在25cm2培养瓶,20ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养,培养至第4至第5天;用扩增培养液将细胞由25cm2培养瓶扩增至175cm2培养瓶,100ml/瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养,培养至第7至第8天;用扩增培养液将细胞由175cm2培养瓶扩增至细胞培养袋,1000~1500ml/袋,置于37℃、5%CO2孵箱培养至第13天或14天,获得扩增培养的TIL细胞。
5.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于:所述步骤C中,所述TIL细胞扩增培养过程中,同时对细胞抽样送检,抽取4ml/袋,进行细菌和真菌等检测,确定细菌、真菌检测结果是否为阴性。
6.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤E中,所述收集所获得的功能增强型TIL细胞包括:收集培养的细胞于一次性无菌离心杯中,2300rpm×8min离心收集;弃上清液,将沉淀细胞收集到6~8支无菌的50ml离心管中,用0.9%注射用生理盐水洗涤2次,离心800g×8min;弃上清液,将细胞收集到置于0.9%注射用生理盐水中,充分混匀,备用。
7.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤A中,所述启动培养基包括:10%自体血清、500-1000IU/ml IL-2。
8.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤B中,所述诱导培养基包括:10%自体血清、10-30ng/ml CD3单抗、10-30ng/ml CD28单抗。
9.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤C中,所述扩增培养基包括:2000-4000IU/ml IL-2。
10.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤D中,所述功能增强培养基包括:100ml生理盐水,5ml 20%人血清白蛋白,10-20mg PD-1抗体。
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