CN115315509B - 肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途 - Google Patents

肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

涉及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的制备方法及其用途，具体涉及一种培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与一种或多种T细胞激活剂以及一种或多种免疫检查点抑制剂接触。还涉及使用肿瘤浸润淋巴细胞预防和/或治疗肿瘤的方法。

Description

肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途。
背景技术
使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤是一种治疗预后不良患者的有效方法。但是过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤需要大量的肿瘤浸润淋巴细胞。因此如何提供一种稳健可靠的肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法是亟待解决的问题。
发明内容
本申请提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法，所述培养方法具有选自以下组的一种或多种的效果：使TIL细胞的数量改善，使TIL细胞的分泌能力提高，使TIL细胞的杀伤能力提高，使NK细胞比例增加，改变TIL细胞的比例，使CD4+细胞的比例增加，使CD8+细胞的比例降低，使中心记忆T细胞比例增加，使调节性T细胞的比例降低，使活化T细胞比例增加，使肿瘤特异性T细胞比例增加，和使干细胞样T细胞比例增加。
本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与一种或多种T细胞激活剂以及一种或多种免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增、第二阶段体外扩增和第三阶段体外扩增，且在所述第三阶段体外扩增中，使经所述第二阶段体外扩增的TIL与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL基本上同时与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述一种或多种免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，所述第三阶段体外扩增进行至多约24小时。
在一种实施方式中，所述第三阶段体外扩增进行约12小时至约24小时。
在一种实施方式中，与在体外扩增阶段未曾与所述T细胞激活剂和/或所述免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述一种或多种免疫检查点抑制剂接触过的TIL显示出改善的扩增效果。
在一种实施方式中，所述改善的扩增效果包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，和提高的肿瘤细胞杀伤能力。
在一种实施方式中，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，所述方法还包含：在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述使TIL与所述一种或多种T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述一种或多种T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述一种或多种T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，所述固相介质包含聚合物。
在一种实施方式中，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
在一种实施方式中，以约2∶1-约1∶2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约1∶100-约1∶2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的物质。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含具有以约100pM或更低的KD值结合PD-1的能力的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含具有以约100pM或更低的EC50值结合PD-1的能力的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含具有以约1nM或更低的IC50值抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2结合的能力的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ IDNO：3和17中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ IDNO：2和16中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ IDNO：1和15中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ IDNO：6和20中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ IDNO：5和19中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ IDNO：4和18中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含VH，且所述VH包含SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含VL，且所述VL包含SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自以下组：(1)包含下述重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1和15中任一项所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2和16中任一项所示的HCDR2，以及氨基酸序列如SEQ IDNO：3和17中任一项所示的HCDR3，且所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4和18中任一项所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：5和19中任一项所示的LCDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：6和20中任一项所示的LCDR3；(2)包含下述重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的VH，且所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的VL。
在一种实施方式中，其中所述抗体选自：嵌合抗体，人源化抗体和全人源抗体。
在一种实施方式中，其中所述抗原结合片段选自：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab′)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一种实施方式中，每一种所述免疫检查点抑制剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地至少为约0.1μg/mL。
在一种实施方式中，每一种所述免疫检查点抑制剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约0.1μg/mL-约20μg/mL。
在一种实施方式中，其还包含：在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂且与所述一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL基本上同时与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述TIL与所述一种或多种T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，其还包含：在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂和/或所述一种或多种T细胞生长因子接触且与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂和/或所述一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述一定时间为至少约2小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约6小时至约72小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约12小时至约48小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、或约72小时。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40∶1-约400∶1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL为源自所述肿瘤组织的碎片的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
本申请还提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与一种或多种T细胞生长因子接触；经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群与所述一种或多种T细胞生长因子接触和/或一种或多种T细胞激活剂接触；经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与所述一种或多种T细胞激活剂以及一种或多种免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，在步骤(C)中，使所述TIL基本上同时与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述一种或多种免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，所述步骤(C)进行至多约24小时。
在一种实施方式中，所述步骤(C)进行约12小时至约24小时。
在一种实施方式中，与在步骤(C)中未曾与所述T细胞激活剂和/或所述免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在步骤(C)中与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述一种或多种免疫检查点抑制剂接触过的TIL显示出改善的扩增效果。
在一种实施方式中，所述改善的扩增效果包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，和提高的肿瘤细胞杀伤能力。
在一种实施方式中，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述使TIL与所述一种或多种T细胞激活剂接触包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将所述一种或多种T细胞激活剂添加至所述TIL的细胞培养基中；(2)将表达所述一种或多种T细胞激活剂的工程化细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；(3)将包含所述一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约30ng/mL。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞激活剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约30ng/mL-约300ng/mL。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约500纳米至约10微米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径为约1纳米至约500纳米。
在一种实施方式中，所述固相介质的直径通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，所述固相介质包含聚合物。
在一种实施方式中，每mg所述固相介质中包含的每一种所述T细胞激活剂的量各自独立地至少为约25μg。
在一种实施方式中，以约2∶1-约1∶2的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约1∶100-约1∶2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将包含所述一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的物质。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含具有以约100pM或更低的KD值结合PD-1的能力的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含具有以约100pM或更低的EC50值结合PD-1的能力的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含具有以约1nM或更低的IC50值抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2结合的能力的免疫检查点抑制剂。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ IDNO：3和17中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ IDNO：2和16中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ IDNO：1和15中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ IDNO：6和20中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ IDNO：5和19中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ IDNO：4和18中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含VH，且所述VH包含SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含VL，且所述VL包含SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自以下组：(1)包含下述重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1和15中任一项所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2和16中任一项所示的HCDR2，以及氨基酸序列如SEQ IDNO：3和17中任一项所示的HCDR3，且所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4和18中任一项所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：5和19中任一项所示的LCDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：6和20中任一项所示的LCDR3；(2)包含下述重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的VH，且所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的VL。
在一种实施方式中，其中所述抗体选自：嵌合抗体，人源化抗体和全人源抗体。
在一种实施方式中，其中所述抗原结合片段选自：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab′)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一种实施方式中，每一种所述免疫检查点抑制剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地至少为约0.1μg/mL。
在一种实施方式中，每一种所述免疫检查点抑制剂在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为约0.1μg/mL-约20μg/mL。
在一种实施方式中，在步骤(B)中，使所述TIL基本上同时与所述一种或多种T细胞激活剂以及所述一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。
在一种实施方式中，所述一种或多种T细胞生长因子包含IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述TIL与所述一种或多种T细胞生长因子接触包含将所述T细胞生长因子添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，其还包含：在步骤(A)、步骤(B)和/或步骤(C)中，使所述TIL与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在步骤(B)中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂和/或所述一种或多种T细胞生长因子接触且与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在步骤(B)中，使所述TIL与所述一种或多种T细胞激活剂和/或所述一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述一定时间为至少约2小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约6小时至约72小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约12小时至约48小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、或约72小时。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含使所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL与所述饲养细胞共培养包含将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40∶1-约400∶1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL为源自所述肿瘤组织的碎片的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积为约1立方毫米至约27立方毫米。
本申请还提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL经过本申请的方法获得。
本申请还提供一种组合物，其包含本申请的TIL。
本申请还提供一种药物组合物，其包含本申请的TIL和/或本申请的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
本申请还提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，包含向受试者施用本申请的TIL、本申请的组合物和/或本申请的药物组合物。
本申请还提供了本申请的TIL、本申请的组合物和/或本申请的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤为实体瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
本申请还提供了本申请的TIL、本申请的组合物和/或本申请的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤为实体瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
本申请还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包含向受试者施用本申请的TIL、本申请的组合物和/或本申请的药物组合物。
在一种实施方式中，所述肿瘤为实体瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-1B显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的胞内因子表达能力。
图2A-2B显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的胞内因子表达能力。
图3A-3C显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的IL-2分泌检测结果。
图4A-4C显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的TNF分泌检测结果。
图5A-5C显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的IFNγ分泌检测结果。
图6A-6B显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的细胞杀伤能力检测结果。
图7A-7C显示的是，对于不同供者，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL细胞增殖情况。
图8A-8B显示的是，对于不同供者，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL细胞增殖情况。
图9A-9B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞活率和细胞分型情况。
图10A-10B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中活化相关(41BB+)细胞比例情况。
图11A-11C显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中活化相关(CD25+和/或CD27+)细胞比例情况。
图12A-12B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中耗竭相关(TIM3+)细胞比例情况。
图13A-13B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中分泌TNF-α细胞比例情况。
图14A-14D显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中分泌IFN-γ细胞比例情况。
图15A-15C显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞因子(IL-2和/或IL-4)分泌量情况。
图16A-16C显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞因子(IL-17和/或IL-6)分泌量情况。
图17A-17D显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞因子(TNF-α和/或IFN-γ)分泌量情况。
图18A-18D显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-4和/或TNF-α)分泌量情况。图18E-18F显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-2和/或IL-6)分泌量情况。
图19A-19D显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-6和/或TNF-α)分泌量情况。
图20A-20C显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-2、IL-4和/或IFN-γ)分泌量情况。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“表达”通常是指编码目标多肽的基因在细胞内发生的转录和/或翻译过程。可以通过测量存在于细胞中的相应mRNA的量来确定宿主细胞中编码目标多肽的基因的转录水平。例如，可通过PCR或通过RNA杂交对编码目标多肽的基因转录的mRNA进行定量测量(参见Sambrook等，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))。可以通过多种方法测量编码目标多肽的基因的翻译水平，例如通过ELISA，通过多肽生物活性测试，或通过蛋白质印迹或放射免疫测试法(参见Sambrook等，同上)。
在本申请中，术语“一个阶段的体外扩增”、“单个阶段的体外扩增”、或“第一阶段体外扩增”等中的“阶段”通常是指TIL在体外经过的一段扩增过程。在一种实施方式中，每一个阶段之间可以是通过TIL细胞数量的变化来划分的，在一种实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一些实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的条件来划分的。在一种实施方式中，当细胞培养基中添加了或补充添加了T细胞激活剂和/或T细胞生长因子后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，当TIL细胞进行了离心和/或细胞洗涤后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的天数来划分的。在一种实施方式中，当TIL细胞体外培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约30天、约40天、约50天或约100天后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。
在本申请中，术语“第一阶段体外扩增”通常是指从组织中获得初级TIL后，使用T细胞生长因子进行扩增的阶段。在一种实施方式中，本申请的组织可以选自以下组：肿瘤组织和胸腔积液，本申请的胸腔积液可以是有转移癌的患者的胸腔积液。在一种实施方式中，本申请的扩增可以是自体或者异体进行的体内扩增，或者可以是体外扩增。本申请的第一阶段体外扩增也可以称为preREP(快速扩增前)阶段。
在本申请中，术语“第二阶段体外扩增”通常是指从受试者体内取出的组织并进行扩增后，再次进行扩增的阶段。在一种实施方式中，与经第一阶段体外扩增的TIL相比，本申请的经第二阶段体外扩增的TIL细胞数量增加，例如可以增加至少约10倍(或至少约20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约100倍。在一种实施方式中，第二阶段体外扩增可以与第一阶段体外扩增的培养条件不同，例如加入的培养物质可以不同。本申请的第二阶段体外扩增也可以称为REP(快速扩增)阶段。
在本申请中，术语“体内”通常是指发生在受试者体内的事件。
在本申请中，术语“体外”通常是指在受试者体外发生的事件。
在本申请中，术语“离体”通常是指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。在一种实施方式中，该细胞、组织和/或器官可以通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。
在本申请中，术语“分泌”通常是指细胞将表达的多肽或蛋白转移到细胞外环境。
在本申请中，术语“分泌能力”通常是指细胞表达多肽或蛋白并将本申请的多肽或蛋白转移到细胞外环境的能力。
在本申请中，术语“辐照”通常是指通过射线对物质进行的处理。例如，在一种实施方式中，辐照可以是指通过X射线、α射线、β射线或γ射线对物质进行辐照。
在本申请中，术语“工程化细胞”通常是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的细胞。在一种实施方式中，工程化细胞可以经过基因修饰以表达本申请的T细胞激活剂和/或T细胞生长因子的TIL。
在本申请中，术语“共培养”通常是指将两个或更多个不同群体的细胞在它们之间有一定程度的接触的情况下培养。本申请的两个或更多个不同群体的细胞的“接触”，在一种实施方式中可以通过直接接触，即其中一个群体的细胞与另一个群体的细胞直接物理接触。或者在一种实施方式中可以通过共用培养基所介导的间接接触。本申请的共用的培养基可以含有由共培养细胞的至少一个群体所产生和释放的代谢产物，并用于培养另一个群体的细胞。
在本申请中，术语“接触”通常是指两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。在一种实施方式中可以通过直接接触，例如可以将一种或多种饲养细胞、T细胞激活剂和/或T细胞生长因子加入TIL细胞的培养基，例如可以将包含一种或多种饲养细胞、T细胞激活剂和/或T细胞生长因子的培养基加入和/或替换TIL细胞的培养基，例如，可以将包含一种或多种饲养细胞、T细胞激活剂和/或T细胞生长因子的培养基用于TIL细胞的培养；在一种实施方式中可以通过间接接触，例如可以将饲养细胞产生和释放的代谢产物，用于培养TIL细胞。
在本申请中，术语“混合物”通常是指两个或更多个不同物质的组合。例如，本申请的CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段可以在混合后作为混合物加入细胞培养基。
在本申请中，术语“同时接触”、“共同接触”、“与...接触同时”、“同时”和“共同”通常是指向受试者和/或细胞施用两种以上物质，使得物质同时存在于受试者和/或细胞培养的环境中。同时接触可以包括以不同的组合物同时施用、以不同的组合物在不同时间施用，或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物施用。例如，本申请中“同时接触”通常可以是指基本上同时接触。
在本申请中，术语“扩增”通常是指在一段时间内细胞的数量增加若干倍。在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约100倍。在本申请中，术语“经扩增”通常是指本申请的细胞经过上述一种或多种扩增。
在本申请中，术语“聚合物”通常是指由连接在一起的单独化学部分组成的分子，本申请的聚合物部分可相同或不同。在一种实施方式中，术语“聚合物”可以指尾尾相连而形成线性分子的单独化学部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)结构形式连接在一起的单独化学部分。在一种实施方式中聚合物可以包括例如多糖、葡聚糖、水凝胶、聚乙二醇、或泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。本申请包含的物质可以与本文所描述的或本领域已知的任何聚合物一起配制，或与它们一起给予。
在本申请中，术语“抑制剂”通常是指包括部分或完全阻断、抑制或中和本文所述的任何分子，例如蛋白质。例如，本申请所抑制的分子包含但不限于PD-1。合适的抑制剂分子可以包括拮抗剂抗体或抗体片段、小分子的片段或衍生物、肽、反义寡核苷酸、小的有机分子等。鉴定本申请的抑制剂的方法包括使表达本申请所抑制的分子的细胞与候选抑制剂分子接触，检测本申请所抑制的分子相关的一种或多种生物学活性可检测的变化。例如，本申请的抑制剂可以是PD-1抑制剂，该抑制剂可以阻断PD-1与其配体结合。例如，合适的PD-1抑制剂可以是PD-1抗体。
在本申请中，术语“免疫检查点抑制剂”通常是指整体或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白质的分子。已知多种检查点蛋白质可以包含，如PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。免疫检查点抑制剂可以包括抗体或源自于抗体的多肽。
在本申请中，术语“IC50值”或“IC50值”通常是指目标物获得生物学过程50％抑制需要的浓度。可以使用Cheng-Prusoff方程(Biochem.Pharmacol.(1973)22：3099)将IC50值换算成绝对抑制常数(Ki)。
在本申请中，术语“EC50值”通常是指结合物质(例如抗体)在体外或体内分析背景下诱导的应答在基线值和最大值之间的50％的反应的半最大有效浓度。减小的EC50值可以表示较高的药物亲和力和功效。
在本申请中，术语“KD值”或“KD值”通常是指解离常数，其可通过表面等离子体共振进行测定。通常，表面等离子体共振分析使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)，通过表面等离子体共振(SPR)，测量配体(固定化于生物传感器基质上的物质)和分析物(溶液中的物质)之间的实时结合相互作用。也可以通过固定化分析物(生物传感器基质上的物质)和呈递配体，进行表面等离子体分析。
在本申请中，术语“PD-1”或“PD1”通常是指编程性细胞死亡蛋白1，是一种288个氨基酸的I型膜蛋白，首次在1992年有描述(Ishida et al.，EMBO J.，11(1992)，3887-3895)。PD-1是扩大的CD28/CTLA-4T细胞调节物家族的一个成员且具有两种配体，PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)。该蛋白质的结构包括一个胞外IgV域，接着是一个跨膜区和一个胞内尾。胞内尾含有位于免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序和免疫受体基于酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，提示PD-1阴性负调节TCR信号。这与配体结合后SHP-1和SHP-2磷酸酶对PD-1的胞质尾的结合一致。术语“编程性死亡1”，“编程性细胞死亡1”，“蛋白PD-1”，“PD-1”，PD1”，PDCD1”，“hPD-1”和“hPD-I”可以互换使用，而且包括人PD-1的变体，同等型，物种同系物，和与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。人PD1的氨基酸序列可以在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q15116中显示。
在本申请中，术语“PD-L1”或“PDL1”通常是指程序性细胞死亡1配体1，也可称为B7同源物1、B7-H1、分化簇274、(3)274或CD274，其与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌。“PD-L1”包括任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人和食蟹猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-L1以及由细胞加工所产生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。“PD-L1”包括完整的PD-L1及其片段，还包括PD-L1的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-L1共同表位的类似物。PD-L1的基本结构包括4个结构域：胞外Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。示例性的人PD-L1氨基酸序列可在NCBI登录号NP_001254653或UniProt登录号Q9NZQ7下找到。
在本申请中，术语“抗体”通常是指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋白。此类抗体包括但不限于人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变型抗体、嫁接偶联抗体(即偶联或融合至其它蛋白质、放射性标记物、细胞毒素的抗体)、和体外生成的抗体。抗体可来自任何类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE，及来自任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如卡帕(κ)或拉姆达(λ)的轻链。本申请的抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。抗体的恒定区可进行改变，例如突变，以修饰抗体的特性(例如以提高或降低下述一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应器细胞功能、或补体功能)。通常，抗体特异性结合预定抗原，例如与病症有关的抗原，病症例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神经变性性的、代谢的和/或恶性的病症。
在本申请中，术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”通常是指鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，可以建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，可以根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，可以在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
在本申请中，术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，通常是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库。
在本申请中，术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区可以都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本申请所述抗体或配体可以为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术可以为：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phagedisplay)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
在本申请中，术语“CDR”通常是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences ofproteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242)提供，Chothia等人，“Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，”J.Mol.Biol.196：901(1987)；和MacCallum等人，“Antibody-Antigen Interactions：Contact Analysis and Binding Site Topography，”J.Mol.Biol.262：732(1996))。如本申请中使用的，CDR的Kabat定义可以应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR H1、CDR H2、CDR H3或H1、H2、H3)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指具有特异结合抗原(例如，PD-L1)能力的一个或多个多肽片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“可变区”通常是指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异的区域。轻链中的“可变区”可以包含轻链可变区VL；重链中的“可变区”可以包含重链可变区VH。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al，Sequences of Immunological Interest，Fifth Edition，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))。
在本申请中，术语“Fab”通常是指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“Fab’”或“Fab′片段”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段可以比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可以包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“(Fab’)2”通常是指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab′)2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab′)2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv”或“Fv片段”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域或VL域组成的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature，1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人，Trends Biotechnol.，2003，21(11)：484-490。
在本申请中，术语“VHH”通常是指包含重链抗体的可变抗原结合结构域的抗体(参见Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。
在本申请中，术语“抗CD3抗体”通常是指靶向CD3的抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，其针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体。抗CD3抗体可以包括OKT3。抗CD3抗体可以包括SP34。抗CD3抗体还可以包括其他抗CD3抗体包括例如在一种实施方式中otelixizumab、teplizumab和visilizumab。
在本申请中，术语“IL-2”或“IL2”通常是指称为白细胞介素2的T细胞生长因子，并包括所有形式的IL-2，可以包括在一种实施方式中人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖型修饰或变体，或其活性片段。编码IL-2基因的GeneID可以为3558。
在本申请中，术语“抗原呈递细胞”、“抗原递呈细胞”、或“APC”通常是指，在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC可以加工抗原并将其递呈至T细胞。在一种实施方式中，抗原呈递细胞可以包括选自以下组：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。
在本申请中，术语“扩增效果”通常是指细胞经过扩增后出现的效果。扩增效果的变化可以包括，细胞的数量和/或比例变化，分泌能力变化，杀伤能力变化或表达能力的变化，或它们的任何组合。本申请的变化可以是提高或者降低。
在本申请中，术语“纳米颗粒”通常是指至少一个尺寸小于100nm的微观颗粒。通常，纳米颗粒具有50nm至500nm(即0.05μm至0.5μm)范围内的直径；在生理环境中结构稳定；且可以容纳更小的分子(如药物或其他生物活性剂)，然后可以将该分子递送至希望的部位。例如，本申请的纳米颗粒可以包含CD28抗体或其抗原结合片段。例如，本申请的纳米颗粒可以包含CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段。例如，抗CD28抗体可以包括OKT3。例如，抗CD28抗体可以包括15E8。
在本申请中，术语“人工抗原呈递细胞”通常是指人工构建的用于呈递外源抗原的免疫细胞，例如，呈递外源抗原的方式可以是人工抗原呈递细胞的表面包含外源抗原与主要组织相容性复合物(MHC)的复合物。在一个实施方案中，可以包括分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其可以包含表达HLA-A/B/C(编码其的基因GeneID可以为3105、3106或3107)、CD64(编码其的基因GeneID可以为2209)、CD80(编码其的基因GeneID可以为941)、ICOS-L(编码其的基因GeneID可以为23308)和CD58(编码其的基因GeneID可以为965)的细胞，并可以被修饰以表达一种以上T细胞激活剂，本申请的以上可以包含本数。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指含有第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即，不同于第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的第二多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物，或者通常不是第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的一部分)的氨基酸序列的多肽或蛋白质。在某些情形中，融合蛋白可以包含与异源蛋白、多肽或肽融合的预防性或治疗性药物。其中，本申请的异源蛋白、多肽或肽可以是或不是不同类型的预防性或治疗性药物。例如，可将具有免疫调节活性的两种不同蛋白质、多肽或肽融合到一起形成融合蛋白。在某些情形中，与异源蛋白、多肽或蛋白质融合前的初始多肽或蛋白质的活性相比，融合蛋白可以保留或提高了活性。例如，本申请的融合蛋白可以是融合了CD28抗体或其抗原结合片段，以及CD3抗体或其抗原结合片段的融合蛋白。
在本申请中，术语“杀伤能力”通常是指通过使本申请的细胞接触有效量的物质从而杀伤靶细胞来实现。在一个实施方案中，本申请的物质可以是TIL细胞。本申请的杀伤可以包括通过自身或者促进其它细胞或物质的CDC、凋亡、ADCC、和/或吞噬作用，或通过两种或更多种这些机制的组合以杀伤细胞。
在本申请中，术语“施用”通常是指通过本领域已知的任意途径，将物质递送给有此需要的受试者。药用载体和制剂或组合物也是本领域众所周知的。给药途径可以包括：静脉内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、透皮的、粘膜的、瘤内的和/或粘膜的。
在本申请中，术语“试剂盒”通常是指一起被包装在容器、接受器或其它容器中的两种或更多种组分，其中一种对应于本申请的物质。例如，包含本申请的TIL细胞。
在本申请中，术语“受试者”通常是指细胞或动物，可以是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如肿瘤动物模型，和本领域技术人员已知的其它动物模型。
在本申请中，术语“饲养细胞(feeder)”通常是指体外生长和分泌至少一种因子至培养基并且可以用于支持培养另一种所关注的细胞生长的培养细胞。在一种实施方式中，饲养细胞可以包括抗原呈递细胞。
在本申请中，术语“特异性结合”通常是指识别特异性抗原，但是基本不识别或结合样品中其它分子的抗体。例如，如果一种抗体可以特异性结合来自一个物种的本申请的特异性抗原，则本申请的抗体还可以特异性结合来自其它的一个或多个物种的本申请的抗原或同源抗原。这种种间反应性本身可以不会改变抗体作为特异性的分类。在某些情形中，特异性结合至抗原的抗体还可以结合至抗原的不同等位形式。
在本申请中，术语“完整的培养过程”通常是指将细胞从患者体内分离的肿瘤组织中分离开始，经过一次或一次以上的扩增，最终获得可以施用于受试者的细胞的完整过程。
在本申请中，术语“细胞培养基”通常是指细胞例如哺乳动物细胞在其中生长的营养液。细胞培养基的配制在本领域中是熟知的。典型地，细胞培养基包括缓冲液、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素以及必要的微量元素。细胞培养基可以含有或不含有血清、蛋白胨、和/或蛋白质。细胞培养基可以补充有另外的组分或浓度增加的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等，这取决于有待培养的细胞的要求和/或所希望的细胞培养参数。
在本申请中，术语“药物组合物”或“药物制剂”通常是指一种制备物，本申请的制备物可以允许有效成分的生物活性有效，并且可以不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。这类制剂是无菌的。“可药用的”赋形剂(载体、添加物)是可以合理地施用至受试哺乳动物以提供有效剂量的所用有效成分的那些赋形剂。
在本申请中，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”通常是指最初作为白细胞获得的细胞群，本申请的细胞已经离开受试者的血流并迁移到肿瘤中。TIL可以包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL可以包括初级TIL和次级TIL。“初级TIL”可以是从受试者组织样品获得的那些TIL细胞，“次级TIL”可以是本申请中已扩增或经扩增的任何TIL细胞群。在一些实施方式中，本申请的肿瘤浸润淋巴细胞可以是未经分离纯化的，或者可以是与肿瘤细胞相互浸润的。在一种实施方式中，本申请的TIL可以是指TIL细胞群。
在本申请中，术语“中心记忆T细胞”通常是指具有长期记忆性的，并能够接受抗原再刺激的T细胞。中心记忆T细胞可以具有CD45RA-CCR7+的表型，例如可以是通过CD45RA-和CCR7+来鉴定中心记忆T细胞。中心记忆T细胞可以相比普通T细胞具有更强的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“调节性T细胞”通常是指一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。调节性T细胞可以具有CD4+CD25+Foxp3+的表型，例如可以是通过CD4+、CD25+和Foxp3+来鉴定调节性T细胞。调节性T细胞可以具有抑制T细胞的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“活化T细胞”通常是指经过活化而可以具有抗肿瘤生长的能力的T细胞。活化T细胞可以具有PD-1+、LAG3+或CD28+的表型，例如可以是通过PD-1+、LAG3+或CD28+来鉴定活化T细胞。活化T细胞可以具有抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“肿瘤特异性T细胞”通常是指可以特异性抗肿瘤生长的T细胞。肿瘤特异性T细胞可以具有CD103+CD39+的表型，例如，可以是通过CD103+和CD39+来鉴定肿瘤特异性T细胞。肿瘤特异性T细胞可以相比普通T细胞具有更特异性的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“干细胞样T细胞”通常是指可以具有自我增殖和/或分化的潜能的一类T细胞。干细胞样T细胞可以具有TCF1+的表型，例如可以是通过TCF1+来鉴定干细胞样T细胞。肿瘤特异性T细胞可以相比普通T细胞具有更强和/或更长期的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语肿瘤“碎片”通常是指从受试者体内取出肿瘤组织后，可以通过机械破碎、酶解和/或其它破碎方法，形成的肿瘤碎片。
在本申请中，术语“组合物”或“药物组合物”通常是指至少一种细胞以及至少一种和任选多于一种的其他药学上可接受的化学组分如运载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指不干扰活性成分的一种或多种非毒性材料。例如，药学上可接受的载体可以不干扰扰活性成分的生物活性；例如，药学上可接受的载体可以不干扰扰活性成分所具有的生物活性的有效性。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂可以包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的。
在本申请中，术语“功能活性片段”通常是指具有全长蛋白质或核酸的部分区域，但保留或部分保留全长蛋白质或核酸的生物活性或功能的片段。例如，功能活性片段可以保留或部分保留全长蛋白质结合另一种分子的能力。例如，生长因子IL-2的功能活性片段，可以保留或部分保留全长IL-2的引起细胞增殖的生物活性功能。
在本申请中，术语“T细胞激活剂”通常是指与T细胞上的相应结合受体结合，并介导T细胞共刺激反应的物质。T细胞激活剂可以是T细胞产生有效免疫应答所需的除抗原受体之外的物质。T细胞激活剂可以是指T细胞共刺激分子。T细胞激活剂可以包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA(编码其的基因GeneID可以为151888)、Toll配体受体、OX40(编码其的基因GeneID可以为7293)、CD2(编码其的基因GeneID可以为914)、CD7(编码其的基因GeneID可以为924)、CD27(编码其的基因GeneID可以为939)、CD28(编码其的基因GeneID可以为940)、CD30(编码其的基因GeneID可以为943)、CD40(编码其的基因GeneID可以为958)、CDS、ICAM-1(编码其的基因GeneID可以为3383)、LFA-1(CD11a/CD18)(编码其的基因GeneID可以为3689)、4-1BB(CD137)(编码其的基因GeneID可以为3604)、B7-H3(编码其的基因GeneID可以为80381)、ICOS(CD278)(编码其的基因GeneID可以为29851)、GITR(编码其的基因GeneID可以为8784)、BAFFR(编码其的基因GeneID可以为115650)、LIGHT(编码其的基因GeneID可以为8740)、HVEM(LIGHTR)(编码其的基因GeneID可以为8764)、KIRDS2、SLAMF7(编码其的基因GeneID可以为57823)、NKp80(KLRF1)(编码其的基因GeneID可以为51348)、NKp44(编码其的基因GeneID可以为9436)、NKp30(编码其的基因GeneID可以为259197)、NKp46(编码其的基因GeneID可以为9437)、CD19(编码其的基因GeneID可以为930)、CD4(编码其的基因GeneID可以为920)、CD8α(编码其的基因GeneID可以为925)、CD8β(编码其的基因GeneID可以为926)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL7Rα(编码其的基因GeneID可以为)、ITGA4(编码其的基因GeneID可以为3676)、VLA1(编码其的基因GeneID可以为3672)、CD49a(编码其的基因GeneID可以为3672)、IA4(编码其的基因GeneID可以为3732)、CD49D(编码其的基因GeneID可以为3676)、ITGA6(编码其的基因GeneID可以为3655)、VLA-6(编码其的基因GeneID可以为3655)、CD49f(编码其的基因GeneID可以为3655)、ITGAD(编码其的基因GeneID可以为3681)、CD11d(编码其的基因GeneID可以为3681)、ITGAE(编码其的基因GeneID可以为3682)、CD103(编码其的基因GeneID可以为3682)、ITGAL(编码其的基因GeneID可以为3683)、CD11a(编码其的基因GeneID可以为3683)、LFA-1(编码其的基因GeneID可以为3683)、ITGAM(编码其的基因GeneID可以为3684)、CD11b(编码其的基因GeneID可以为3684)、ITGAX(编码其的基因GeneID可以为3687)、CD11c(编码其的基因GeneID可以为3687)、ITGB1(编码其的基因GeneID可以为3688)、CD29(编码其的基因GeneID可以为3688)、ITGB2(编码其的基因GeneID可以为3689)、CD18(编码其的基因GeneID可以为3689)、LFA-1(编码其的基因GeneID可以为3689)、ITGB7(编码其的基因GeneID可以为3695)、NKG2D(编码其的基因GeneID可以为22914)、NKG2C(编码其的基因GeneID可以为3822)、TNFR2(编码其的基因GeneID可以为7133)、TRANCE/RANKL(编码其的基因GeneID可以为8600)、DNAM1(CD226)(编码其的基因GeneID可以为10666)、SLAMF4(CD244、2B4)(编码其的基因GeneID可以为51744)、CD84(编码其的基因GeneID可以为8832)、CD96(Tactile)(编码其的基因GeneID可以为10225)、CEACAM1(编码其的基因GeneID可以为634)、CRTAM(编码其的基因GeneID可以为56253)、Ly9(CD229)(编码其的基因GeneID可以为4063)、CD160(BY55)(编码其的基因GeneID可以为11126)、PSGL1(编码其的基因GeneID可以为6404)、CD100(SEMA4D)(编码其的基因GeneID可以为10507)、CD69(编码其的基因GeneID可以为969)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)(编码其的基因GeneID可以为114836)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)(编码其的基因GeneID可以为6504)、BLAME(SLAMF8)(编码其的基因GeneID可以为56833)、SELPLG(CD162)(编码其的基因GeneID可以为6404)、LTBR(编码其的基因GeneID可以为4055)、LAT(编码其的基因GeneID可以为27040)、GADS(编码其的基因GeneID可以为9402)、SLP-76(编码其的基因GeneID可以为3937)、PAG/Cbp(编码其的基因GeneID可以为55824)、CD19a、和特异性结合CD3的配体、特异性结合CD28的配体、特异性结合HVEM的配体、特异性结合CD40L的配体、特异性结合OX40的配体、和特异性结合4-1BB的配体。共刺激胞内信号传导结构域可以是指T细胞激活剂的胞内部分。胞内信号传导结构域可以包含从中衍生的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
在本申请中，术语“T细胞生长因子”通常是指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物。在一种实施方式中，T细胞生长因子可以选自以下组的一种或多种：IL-2(编码其的基因GeneID可以为3558)、IL-4(编码其的基因GeneID可以为3565)、IL-7(编码其的基因GeneID可以为3574)、IL-10(编码其的基因GeneID可以为3586)、IL-12(编码其的基因GeneID可以为3592或3593)、IL-15(编码其的基因GeneID可以为3600)、和γ干扰素(编码其的基因GeneID可以为3458)。
在本申请中，术语“基本上同时”通常是指接触过程的一段时间内TIL可以与两种以上的物质同时接触，但是可以不限于在整个接触过程中TIL总是与两种以上的物质同时接触。在一种实施方式中，基本上同时可以是指一段时间内TIL可以与至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的两种以上的物质的每种物质同时接触。
在本申请中，术语“固相介质”或“介质”通常是指具有结合功能的固相材料。例如，本申请固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用，将一种或一种以上的物质结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以结合一种或一种以上的T细胞激活剂。例如，本申请的固相介质可以是指通过共价结合和/或非共价结合的作用将CD28抗体或其抗原结合片段以及CD3抗体或其抗原结合片段结合在介质内和/或介质表面的材料。例如，本申请的固相介质可以是包含OKT3抗体和15E8抗体的直径为约500纳米至约10微米的微球。例如，本申请的固相介质可以是聚合物材料。例如，本申请的固相介质可以是直径至少约500纳米的微球。例如，本申请的固相介质可以是纳米基质。例如，本申请的固相介质可以是包含OKT3抗体和15E8抗体的直径为约1纳米至约500纳米的纳米基质。
在本申请中，术语“纳米基质”通常是指一种直径在约1纳米到约500纳米的材料。在本申请中，纳米基质可以具有结合功能，例如，本申请的纳米基质可以结合一种或一种以上的T细胞激活剂。在本申请中，纳米基质可以包含聚合物，例如，本申请的纳米基质可以包含可降解聚合物。在本申请中，纳米基质可以包含多糖、和/或葡聚糖。
在本申请中，术语“基因编辑”通常是指利用一个或多个核酸酶和/或切口酶，将靶DNA(例如细胞的TCRβ基因组)插入、替换或去除DNA的一种基因工程。
在本申请中，术语“基因敲除”通常是指使基因沉默和/或无法表达出其编码的蛋白质的基因工程手段。例如，基因敲除可以是指细胞内或体内基因的定向破坏，导致其功能完全丧失。例如，本申请的基因敲除可以使用位点特异性核酸酶。例如，本申请的基因敲除可以使用锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)和/或基于CRISPR/Cas的系统。例如，本申请的基因敲除可以使用CRISPR/Cas9的系统。
在本申请中，术语“树突状细胞”通常是指存在于体内、体外、离体或宿主或受试者内的或可衍生自造血干细胞或单核细胞的抗原递呈细胞。树突状细胞及其前体可以从各种淋巴器官例如脾脏、淋巴结以及骨髓和外周血分离。本申请的树突状细胞可以具有特征形态，例如在树突细胞体的多个方向上延伸的薄层(板状伪足)。通常，树突细胞可以表达高水平的MHC和共刺激(例如B7-1和B7-2)分子。树突状细胞可以在体外诱导T细胞的抗原特异性分化，并且能够在体外和体内引发原代T细胞应答。
在本申请中，术语“体外扩增”通常是指经过培养以产生细胞的数量的变化，经扩增的细胞也可以产生细胞的数量和/或比例变化，分泌能力变化，杀伤能力变化或表达能力的变化，或它们的任何组合。本申请的变化可以是提高或者降低。在本申请中，体外扩增可以是为了扩增目的；为了检测TIL细胞的功能，例如检测TIL细胞释放细胞因子能力，而对TIL细胞进行的操作步骤(例如向TIL细胞的培养基中加入一种或一种以上物质以检测TIL细胞释放细胞因子能力)，可以不属于本申请的体外扩增。
在本申请中，术语“外周单个核细胞”或“外周血单个核细胞”通常是指外周血中具有单个核的细胞。例如，在本申请中，本申请的外周血单个核细胞可以包括淋巴细胞、单核细胞和/或树突状细胞。
在本申请中，术语“细胞因子”通常是指由一个细胞群释放的对另一个细胞起细胞间调节剂作用的蛋白。本申请的细胞因子可以是淋巴细胞因子(lymphokines)、单核细胞因子(monokines)和多肽激素。本申请的细胞因子可以包括白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-21、和/或IL-12。在本申请中，术语细胞因子可以包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，天然序列细胞因子的生物活性等价物，以及其功能活性片段。
在本申请中，术语“直径”通常是指本申请物质的截面的直径。例如，当本申请的物质不是球形时，则术语“直径”通常是指本申请物质的最大截面的最大直径和/或平均直径。确定物质的直径的方法可以是本领域通用的方法，例如透射电子显微镜。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。本申请的肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。本申请的肿瘤可能是实体的，也可能是血液的。术语“肿瘤”可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
在本申请中，术语“肿瘤组织”通常是指来自对象中的肿瘤，包括对象中的任何实体肿瘤和/或非实体肿瘤的任何组织的样品。
在本申请中，术语“CD28激动剂”通常是指结合细胞表面CD28蛋白并且在细胞中引发应答的化合物。例如，本申请的CD28激动剂可以是结合CD28的小分子制剂。例如，本申请的CD28激动剂可以是结合CD28的抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，术语“T细胞亚群比例”通常是指根据不同T细胞亚群占TIL细胞或TIL细胞群中的比例。例如，本申请不同的T细胞亚群具有不同的免疫活性和/或分化能力。例如，本申请的T细胞亚群可以根据T细胞表面标志物进行区分。例如，中心记忆T细胞可以具有CD45RA-CCR7+的表型。例如，调节性T细胞可以具有CD4+CD25+Foxp3+的表型。例如，活化T细胞可以具有CD25+、CD28+、TIM3+、PD-1+或41BB+的表型。例如，肿瘤特异性T细胞可以具有CD103+CD39+的表型。例如，干细胞样T细胞可以具有TCF1+的表型。
在本申请中，术语“TIL细胞数量”通常是指本申请的TIL细胞中细胞数量。在本申请中，TIL细胞数量可以是指本申请任一阶段获得的TIL群中的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指经第一阶段体外扩增的第二TIL群的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指经第二阶段体外扩增的第三TIL群的细胞数量。例如，TIL细胞数量可以是指本申请任意一种培养方法最终获得的TIL的细胞。在本申请中，TIL细胞数量可以通过本领域常用的方法测量，例如可以包括但不限于细胞计数板手动细胞计数和/或自动细胞计数器计数。
在本申请中，术语“约”和“大约”通常是指在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，可以包括在50％内，可以包括在20％内，可以包括在10％内，可以包括在5％内。术语“约”或“大约”所包含的可允许变化可以取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。术语“以上”、“以下”、“至多”和“至少”可以包括本数。
发明详述
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中，在至少一个阶段的所述体外扩增中，使所述TIL与一种或多种T细胞激活剂以及一种或多种免疫检查点抑制剂接触。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与一种或多种T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL细胞群；(B)使所述第二TIL群与本申请一种或多种T细胞生长因子接触和/或一种或多种T细胞激活剂接触；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL细胞群；(C)使所述第三TIL群与本申请一种或多种T细胞激活剂以及一种或多种免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中的术语中，本申请的第一阶段体外扩增可以与以上方面的方法中的步骤(A)任意替换使用。在一种实施方式中的术语中，本申请的第二阶段体外扩增可以与以上方面的方法中的步骤(B)任意替换使用。在一种实施方式中的术语中，本申请的经第一阶段体外扩增的TIL可以与经以上方面的方法中步骤(A)得到的第二TIL群任意替换使用。在一种实施方式中的术语中，本申请的经第二阶段体外扩增的TIL可以与经以上方面的方法中步骤(B)得到的第三TIL群任意替换使用。在一种实施方式中的术语中，如有需要，本申请的第三阶段体外扩增可以与以上方面的方法中任意增加的步骤(C)任意替换使用。在一种实施方式中的术语中，如有需要，本申请的经第三阶段体外扩增的TIL可以与经以上方面的方法中任意增加的步骤(C)得到的第四TIL群任意替换使用。
在一种实施方式中，可以使本申请的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增、第二阶段体外扩增和第三阶段体外扩增，且在本申请的第三阶段体外扩增中，可以使经本申请的第二阶段体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，可以使本申请的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增、第二阶段体外扩增和第三阶段体外扩增，且在本申请的第一阶段体外扩增中，可以使经本申请的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触，且在本申请的第三阶段体外扩增中，可以使经本申请的第二阶段体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，可以使本申请的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增、第二阶段体外扩增和第三阶段体外扩增，且在本申请的第二阶段体外扩增中，可以使经本申请的第一阶段体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触，且在本申请的第三阶段体外扩增中，可以使经本申请的第二阶段体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，可以使本申请的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增、第二阶段体外扩增和第三阶段体外扩增，且在本申请的第一阶段体外扩增中，可以使经本申请的源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触，且在本申请的第二阶段体外扩增中，可以使经本申请的第一阶段体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触，且在本申请的第三阶段体外扩增中，可以使经本申请的第二阶段体外扩增的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂和/或本申请的免疫检查点抑制剂接触。
在一种实施方式中，每一个阶段体外扩增之间可以是通过TIL细胞数量的变化米划分的，在一种实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一些实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、或者至少约1000倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，每一个阶段的体外扩增之间也可以是通过TIL细胞培养的条件的变化来划分的。在一种实施方式中，当细胞培养基中添加了或补充添加了T细胞激活剂和/或T细胞生长因子后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了IL-2后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了CD28激动剂后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了免疫检查点抑制剂后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了饲养细胞后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，当TIL细胞进行了离心和/或细胞洗涤的操作后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的天数来划分的。在一种实施方式中，当TIL细胞体外培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约30天、约40天、约50天或约100天后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。
在一种实施方式中，本申请的第二阶段体外扩增可以进行至多约13天。在一种实施方式中，本申请第二阶段体外扩增进行的天数可以是从第二阶段体外扩增的开始时刻进行计算。例如，第二阶段体外扩增开始的当时，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约0天。例如，第二阶段体外扩增开始后进行了约24小时，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约1天。例如，第二阶段体外扩增开始的当天，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约0天。在一种实施方式中，本申请第二阶段体外扩增进行的天数可以是通过第二阶段体外扩增进行的天数进行计算。例如，第二阶段体外扩增开始后的第二天，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约1天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行至多约13天、至多约12天、至多约11天、至多约10天、至多约9天、至多约8天、至多约7天、至多约6天、至多约5天、至多约4天、至多约3天、至多约2天或至多约1天。在一种实施方式中，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约3天至约13天。在一种实施方式中，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约1天至约13天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约2天至约13天、约3天至约13天、约4天至约13天、约5天至约13天、约6天至约13天、约7天至约13天、约8天至约13天、约9天至约13天、约10天至约13天、约11天至约13天、或约12天至约13天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约2天至约3天、约2天至约4天、约2天至约5天、约2天至约6天、约2天至约7天、约2天至约8天、约2天至约9天、约2天至约10天、约2天至约11天、约2天至约12天、或约2天至约13天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约3天至约4天、约3天至约5天、约3天至约6天、约3天至约7天、约3天至约8天、约3天至约9天、约3天至约10天、约3天至约11天、约3天至约12天、或约3天至约13天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约13天、约12天、约11天、约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或约1天。在一种实施方式中，本申请的第二阶段体外扩增可以认为是REP(rapid expansion protocol)阶段。在一种实施方式中，本申请的第一阶段体外扩增可以认为是preREP阶段。
在一种实施方式中，本申请的第三阶段体外扩增可以进行至多约24小时。在一种实施方式中，本申请第三阶段体外扩增进行的天数可以是从第三阶段体外扩增开始进行计算。例如，第三阶段体外扩增开始的当时，可以认为是第三阶段体外扩增进行了约0天。例如，第三阶段体外扩增开始后进行了约24小时，可以认为是第三阶段体外扩增进行了约1天。例如，第三阶段体外扩增开始的当天，可以认为是第三阶段体外扩增进行了约0天。例如，第三阶段体外扩增开始后的第二天，可以认为是第三阶段体外扩增进行了约1天。例如，本申请的第三阶段体外扩增可以进行至多约24小时、至多约23小时、至多约22小时、至多约21小时、至多约20小时、至多约19小时、至多约18小时、至多约17小时、至多约16小时、至多约15小时、至多约14小时、至多约13小时、或至多约12小时。在一种实施方式中，本申请的第三阶段体外扩增可以进行约12小时至约24小时。例如，本申请的第三阶段体外扩增可以进行约12小时至约24小时、约13小时至约24小时、约14小时至约24小时、约15小时至约24小时、约16小时至约24小时、约17小时至约24小时、约18小时至约24小时、约19小时至约24小时、约20小时至约24小时、约21小时至约24小时、约22小时至约24小时、约23小时至约24小时、约12小时至约22小时、约13小时至约22小时、约14小时至约22小时、约15小时至约22小时、约16小时至约22小时、约17小时至约22小时、约18小时至约22小时、约19小时至约22小时、约20小时至约22小时、约21小时至约22小时、约12小时至约20小时、约13小时至约20小时、约14小时至约20小时、约15小时至约20小时、约16小时至约20小时、约17小时至约20小时、约18小时至约20小时、约19小时至约20小时、约12小时至约18小时、约13小时至约18小时、约14小时至约18小时、约15小时至约18小时、约16小时至约18小时、约17小时至约18小时、约12小时至约16小时、约13小时至约16小时、约14小时至约16小时、约15小时至约16小时、约12小时至约14小时、或约13小时至约14小时。在一种实施方式中，本申请的第二阶段体外扩增可以认为是REP(rapid expansion protocol)阶段。在一种实施方式中，本申请的第三阶段体外扩增可以认为是reREP阶段。
在一种实施方式中，与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL可以显示出改善的扩增效果。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指源自同一供体的且未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指源自同一供体的经过同样方式分离的且未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指源自同一供体的同一肿瘤来源的且未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指源自同一供体的同一肿瘤来源的经过同样方式分离的且未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指将源自同一供体的TIL细胞分为两组，其中一组未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞可以为未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指将源自同一供体的经过同样方式分离的TIL细胞分为两组，其中一组未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞可以为未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指将源自同一供体的同一肿瘤来源的TIL细胞分为两组，其中一组未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞可以为未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL。在一种实施方式中，未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL可以是指将源自同一供体的同一肿瘤来源的经过同样方式分离的TIL细胞分为两组，其中一组未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的TIL细胞可以为未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL。
在一种实施方式中，本申请的改善的扩增效果可以包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，和提高的肿瘤细胞杀伤能力。
在一种实施方式中，本申请的增加的TIL细胞数量可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的细胞数量可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的增加的TIL细胞数量可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的细胞数量可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指TIL细胞的选自以下组的细胞因子分泌能力提高：CD107a、GZMB、IL-4、IL-17、IL-6、IL-2、TNF和IFNγ。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的细胞因子分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的细胞因子分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的CD107a分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的CD107a分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的GZMB分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的GZMB分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的IL-4、IL-17、IL-6、和/或IL-2分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的IL-4、IL-17、IL-6、和/或IL-2分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的TNF分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的TNF分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的IFNγ分泌能力可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的细胞因子分泌能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的IFNγ分泌能力可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的TIL的细胞因子分泌能力的测定可以是通过测量TIL细胞的细胞因子表达能力。例如，本申请的免疫细胞的细胞因子分泌能力可以通过细胞流式检测的方法测定。在一种实施方式中，本申请的TIL的细胞因子分泌能力通过测量TIL细胞的细胞因子释放能力测定。在一种实施方式中，本申请的TIL的细胞因子分泌能力是通过CBA法(Cytometric Bead Array)测定。
在一种实施方式中，本申请的提高的肿瘤细胞杀伤能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的肿瘤细胞杀伤率可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。在一种实施方式中，本申请的提高的肿瘤细胞杀伤能力可以是指与在体外扩增阶段未曾与本申请T细胞激活剂和/或本申请免疫检查点抑制剂接触的相应TIL相比，在至少一个体外扩增阶段中与本申请T细胞激活剂以及本申请免疫检查点抑制剂接触过的本申请TIL的肿瘤细胞杀伤率可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。在一种实施方式中，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤率可以通过CFSE和DAPI染色法测量。在一种实施方式中，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤可以是指TIL杀伤实体瘤细胞的能力。在一种实施方式中，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤可以是指TIL杀伤宫颈癌细胞的能力。在一种实施方式中，本申请的TIL的肿瘤细胞杀伤可以是指TIL杀伤Hela细胞的能力。
在一种实施方式中，本申请的改善的T细胞亚群比例可以包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，降低的耗竭T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，本申请的增加的中心记忆T细胞比例可以是TIL细胞中CD45RA-CCR7+细胞的比例的增加。例如，在TIL细胞中中心记忆T细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
在一种实施方式中，本申请的减少的调节性T细胞的比例可以是TIL细胞中CD4+CD25+Foxp3+细胞的比例的减少。例如，在TIL细胞中调节性T细胞比例可以减少至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
在一种实施方式中，本申请的减少的耗竭T细胞的比例可以是TIL细胞中TIM3+细胞的比例的减少。例如，在TIL细胞中耗竭T细胞比例可以减少至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％。
在一种实施方式中，本申请的增加的活化T细胞比例可以是TIL细胞中CD25+、CD28+、CD27+、PD-1+或41BB+细胞的比例的增加。例如，在TIL细胞中活化T细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中CD25+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中CD28+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中CD27+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中PD-1+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。例如，在TIL细胞中41BB+细胞比例可以增加至少约100％、至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、至少约1％、至少约0.5％、至少约0.4％、至少约0.3％、至少约0.2％、或至少约0.1％，或可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。
在一种实施方式中，本申请的方法还可以包含：在至少一个阶段的本申请体外扩增中，使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请的体外扩增中，T细胞激活剂可以包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。使本申请的TIL与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂接触且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。在一种实施方式中，在本申请第一阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂接触且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。在一种实施方式中，在本申请第二阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂接触且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。在一种实施方式中，在本申请第三阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂接触且与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请的体外扩增中，可以使本申请的TIL基本上同时与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂以及本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。在一种实施方式中，在本申请第一阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL基本上同时与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂以及本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。在一种实施方式中，在本申请第二阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL基本上同时与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂以及本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。在一种实施方式中，在本申请第三阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL基本上同时与本申请的一种或多种免疫检查点抑制剂以及本申请的一种或多种T细胞激活剂接触。
在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含选自以下组的一种或多种：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、以及它们的功能活性片段。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含选自以下组：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4-1BB的抗体以及它们的抗原结合片段。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含CD3激动剂。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以是Miltenyi Biotech的OKT3、可以是BD的SP34。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以是包含Miltenyi Biotech的OKT3的HCDR1-3和/或Miltenyi Biotech的OKT3的LCDR1-3，例如可以是包含BD的SP34的HCDR1-3和/或MiltenyiBiotech的OKT3的LCDR1-3，例如可以是包含Miltenyi Biotech的OKT3的VH和/或MiltenyiBiotech的OKT3的VL，例如可以是包含BD的SP34的VH和/或Miltenyi Biotech的OKT3的VL。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含CD28激动剂。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以是Sigma-Aldrich的15E8。在一种实施方式中，本申请的T细胞激活剂可以包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段，例如可以是包含Sigma-Aldrich的15E8的HCDR1-3和/或Sigma-Aldrich的15E8的LCDR1-3，例如可以是包含Sigma-Aldrich的15E8的VH和/或Sigma-Aldrich的15E8的VL。
在一种实施方式中，使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触可以包含选自以下组的一种或多种方式：(1)将本申请的T细胞激活剂添加至本申请的TIL的细胞培养基中；(2)将表达本申请的T细胞激活剂的工程化细胞添加至本申请的TIL的细胞培养基中；(3)将包含本申请的T细胞激活剂的固相介质添加至本申请的TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触可以包含将包含本申请的T细胞激活剂的固相介质添加至本申请的TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触可以包含将包含本申请的CD28抗体与CD3抗体的固相介质添加至本申请的TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约30ng/mL。例如，本申请的CD28抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约30ng/mL；例如，本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约30ng/mL。例如，本申请的CD28抗体初始浓度的选择可以与本申请的CD3抗体初始浓度的选择相互独立；例如，本申请的CD28抗体与本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意组合。例如，本申请的CD28抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL。例如，本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL。例如，本申请的CD28抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL，且本申请的CD3抗体在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以任意选自约30ng/mL-约300ng/mL，本申请的CD28抗体初始浓度的选择可以与本申请的CD3抗体初始浓度的选择相互独立。在一种实施方式中，本申请的固相介质的直径可以为约500纳米至约10微米。在一种实施方式中，本申请的固相介质的直径可以通过透射电子显微镜测量。在一种实施方式中，本申请的固相介质的直径可以为约1纳米至约500纳米。在一种实施方式中，本申请的固相介质的直径可以为约100纳米至约500纳米。在一种实施方式中，本申请的固相介质的直径可以为约200纳米至约500纳米。在一种实施方式中，本申请的固相介质的直径可以通过透射电子显微镜测量。
在一种实施方式中，本申请的固相介质可以包含聚合物。在一种实施方式中，本申请的固相介质可以包含葡聚糖。
在一种实施方式中，每mg本申请的固相介质包含至少约25μg的本申请的T细胞激活剂。例如，每mg本申请的固相介质包含的每一种的T细胞激活剂的量可以是相互独立的。
在一种实施方式中，以约1∶100-约1∶2000的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，以约2∶1-约1∶2的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。
例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约2∶1-约1∶2的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约2∶1-约1∶2、以约2∶1-约1∶1、或以约1∶1-约1∶2的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请一种或多种T细胞激活剂，例如CD3激动剂和/或CD28激动剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。
例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约1∶100-约1∶2000的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请一种或多种T细胞激活剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，当本申请的固相介质的直径为约100纳米至约500纳米时，可以以约1∶100-约1∶2000、以约1∶200-约1∶2000、以约1∶300-约1∶2000、以约1∶400-约1∶2000、以约1∶500-约1∶2000、以约1∶600-约1∶2000、以约1∶700-约1∶2000、以约1∶800-约1∶2000、以约1∶900-约1∶2000、以约1∶1000-约1∶2000、以约1∶1200-约1∶2000以约1∶1400-约1∶2000、以约1∶1600-约1∶2000、或以约1∶1800-约1∶2000的本申请固相介质与本申请TIL的比例，将包含本申请一种或多种T细胞激活剂，例如CD3激动剂和/或CD28激动剂的固相介质添加至本申请TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，本申请的免疫检查点抑制剂包含抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的物质。例如，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含PD-1抑制剂；例如，本申请的免疫检查点抑制剂可以包含PD-1的抗体和/或其抗原结合片段。在一种实施方式中，本申请的免疫检查点抑制剂包含具有以约100pM或更低的KD值结合PD-1的能力的物质，例如，约100pM或更低的KD值、约90pM或更低的KD值、约80pM或更低的KD值、约50pM或更低的KD值、约30pM或更低的KD值、或约10pM或更低的KD值。在一种实施方式中，本申请的免疫检查点抑制剂包含具有以约100pM或更低的EC50值结合PD-1的能力的物质，例如，约100pM或更低的EC50值、约90pM或更低的EC50值、约80pM或更低的EC50值、约50pM或更低的EC50值、约30pM或更低的EC50值、或约10pM或更低的EC50值。在一种实施方式中，本申请的免疫检查点抑制剂包含具有以约1nM或更低的IC50值抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2结合的能力的物质，例如，约1nM或更低的IC50值、约0.9nM或更低的IC50值、约0.8nM或更低的IC50值、约0.5nM或更低的IC50值、约0.3nM或更低的IC50值、或约0.1nM或更低的IC50值。
在一种实施方式中，本申请的免疫检查点抑制剂可以为PD-1抗体或其抗原结合蛋白。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，本申请CDR可以是根据Chothia定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1，且本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：1和15中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR2，且本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：2和16中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR3，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：3和17中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：1和15中任一项所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：2和16中任一项所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：3和17中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6或Hu_6H6相同的HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的HCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQID NO：16所示的氨基酸序列，且本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在本申请中，本申请抗体或其抗原结合蛋白包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR。本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的，或本申请CDR可以是根据Kabat定义的。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR1，且本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：4和18中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR2，且本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：5和19中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR3，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：6和20中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：4和18中任一项所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：5和19中任一项所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：6和20中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6或Hu_6H6相同的LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的LCDR1-3，其中本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQID NO：19所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：1和15中任一项所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQID NO：2和16中任一项所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：3和17中任一项所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：4和18中任一项所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：5和19中任一项所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：6和20中任一项所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据IMGT命名法定义的；本申请CDR可以是根据Kabat定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6或Hu_6H6相同的HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的HCDR1-3和LCDR1-3，其中本申请HCDR1可以包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，本申请HCDR2可以包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，本申请HCDR3可以包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，本申请LCDR1可以包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，本申请LCDR2可以包含SEQID NO：19所示的氨基酸序列，且本申请LCDR3可以包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；本申请CDR可以是根据Kabat命名法定义的；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Hu_6H6相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的VH，且本申请VH可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6相同的VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Hu_6H6相同的VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的VL，且本申请VL可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH和轻链可变区VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与一种6H6相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Hu_6H6相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的VH和VL，且本申请VH可包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，本申请VL可包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：9、13和23中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Hu_6H6相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的重链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：10、14和24中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6相同的轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Hu_6H6相同的轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的轻链，且本申请轻链可包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：9、13和23中任一项所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQID NO：10、14和24中任一项所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与6H6相同的重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Hu_6H6相同的重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
例如，本申请的抗体或其抗原结合蛋白可以包含与Pembrolizumab相同的重链和轻链，且本申请重链可包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，本申请轻链可包含SEQ IDNO：24所示的氨基酸序列；例如，本申请的抗原结合蛋白可以具有PD-1结合能力。
在一种实施方式中，本申请的抗体选自以下组：嵌合抗体，人源化抗体和全人源抗体。在一种实施方式中，本申请的抗原结合片段选自以下组：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab′)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一种实施方式中，每一种本申请的免疫检查点抑制剂在本申请的TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地至少为约0.1μg/mL。例如，PD-1抗体在本申请的TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约0.1μg/mL、至少约0.2μg/mL、至少约0.3μg/mL、至少约0.4μg/mL、至少约0.5μg/mL、至少约0.6μg/mL、至少约0.7μg/mL、至少约0.8μg/mL、至少约0.9μg/mL、至少约1μg/mL、至少约2μg/mL、至少约3μg/mL、至少约4μg/mL、至少约5μg/mL、至少约6μg/mL、至少约7μg/mL、至少约8μg/mL、至少约9μg/mL、至少约10μg/mL、至少约11μg/mL、至少约12μg/mL、至少约13μg/mL、至少约14μg/mL、至少约15μg/mL、至少约16μg/mL、至少约17μg/mL、至少约18μg/mL、至少约19μg/mL或至少约20μg/mL。在一种实施方式中，每一种本申请的免疫检查点抑制剂在本申请的TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地至少为约0.1μg/mL-约20μg/mL。例如，PD-1抗体在本申请的TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为约0.1μg/mL-约20μg/mL、约0.2μg/mL-约20μg/mL、约0.3μg/mL-约20μg/mL、约0.5μg/mL-约20μg/mL、约0.7μg/mL-约20μg/mL、约1μg/mL-约20μg/mL、约3μg/mL-约20μg/mL、约5μg/mL-约20μg/mL、约7μg/mL-约20μg/mL、约10μg/mL-约20μg/mL、约15μg/mL-约20μg/mL、约17μg/mL-约20μg/mL、约19μg/mL-约20μg/mL、约0.1μg/mL-约15μg/mL、约0.2μg/mL-约15μg/mL、约0.3μg/mL-约15μg/mL、约0.5μg/mL-约15μg/mL、约0.7μg/mL-约15μg/mL、约1μg/mL-约15μg/mL、约3μg/mL-约15μg/mL、约5μg/mL-约15μg/mL、约7μg/mL-约15μg/mL、约10μg/mL-约15μg/mL、约0.1μg/mL-约10μg/mL、约0.2μg/mL-约10μg/mL、约0.3μg/mL-约10μg/mL、约0.5μg/mL-约10μg/mL、约0.7μg/mL-约10μg/mL、约1μg/mL-约10μg/mL、约3μg/mL-约10μg/mL、约5μg/mL-约10μg/mL、约7μg/mL-约10μg/mL、约0.1μg/mL-约5μg/mL、约0.2μg/mL-约5μg/mL、约0.3μg/mL-约5μg/mL、约0.5μg/mL-约5μg/mL、约0.7μg/mL-约5μg/mL、约1μg/mL-约5μg/mL、约3μg/mL-约5μg/mL、约0.1μg/mL-约1μg/mL、约0.2μg/mL-约1μg/mL、约0.3μg/mL-约1μg/mL、约0.5μg/mL-约1μg/mL、约0.7μg/mL-约1μg/mL、约0.1μg/mL-约0.5μg/mL、约0.2μg/mL-约0.5μg/mL、或约0.3μg/mL-约0.5μg/mL。
在一种实施方式中，本申请的方法还可以包含：在至少一个阶段的本申请体外扩增中，使本申请TIL与一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第一阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第二阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第三阶段体外扩增中，可以使本申请的TIL与本申请的一种或多种T细胞激活剂接触且与本申请的一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请体外扩增中，使本申请TIL基本上同时与本申请一种或多种T细胞激活剂以及本申请一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第一阶段体外扩增中，使本申请TIL基本上同时与本申请一种或多种T细胞激活剂以及本申请一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第二阶段体外扩增中，使本申请TIL基本上同时与本申请一种或多种T细胞激活剂以及本申请一种或多种T细胞生长因子接触。例如，在本申请第三阶段体外扩增中，使本申请TIL基本上同时与本申请一种或多种T细胞激活剂以及本申请一种或多种T细胞生长因子接触。
在一种实施方式中，本申请的T细胞生长因子可以选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、γ干扰素、以及它们的功能活性片段。在一种实施方式中，本申请的T细胞生长因子可以包含IL-2和/或其功能活性片段。例如，IL-2的功能活性片段可以包含本领域已知的可以与T细胞的IL-2受体结合的IL-2的片段。
在一种实施方式中，本申请的TIL与本申请一种或多种T细胞生长因子接触可以包含将本申请T细胞生长因子添加至本申请TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，本申请的T细胞生长因子在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL。在一种实施方式中，本申请IL-2在本申请TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约350IU/mL、至少约400IU/mL、至少约500IU/mL、至少约600IU/mL、至少约700IU/mL、至少约800IU/mL、至少约900IU/mL、至少约1000IU/mL、至少约1100IU/mL、至少约1200IU/mL、至少约1300IU/mL、至少约1400IU/mL、至少约1500IU/mL、至少约2000IU/mL、至少约2500IU/mL、至少约2600IU/mL、至少约2700IU/mL、至少约2800IU/mL、至少约2900IU/mL、至少约3000IU/mL、至少约3100IU/mL、至少约3200IU/mL、至少约3300IU/mL、至少约3400IU/mL、至少约3500IU/mL、至少约4000IU/mL、至少约4500IU/mL、至少约5000IU/mL、至少约5500IU/mL、至少约6000IU/mL、至少约6500IU/mL、至少约7000IU/mL、至少约7500IU/mL、至少约8000IU/mL、至少约8500IU/mL、或至少约9000IU/mL。
在一种实施方式中，本申请的方法还可以包含：在至少一个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请TIL与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触且与本申请饲养细胞共培养，在一种实施方式中，单个阶段的本申请体外扩增可以指在同一个阶段的本申请的体外扩增，例如，可以同在本申请的第一阶段体外扩增、可以同在本申请的第二阶段体外扩增、或可以同在本申请的第三阶段体外扩增等。
在一种实施方式中，本申请的在本申请第一阶段体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触且与本申请饲养细胞共培养。在一种实施方式中，本申请的在本申请第二阶段体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触且与本申请饲养细胞共培养。在一种实施方式中，本申请的在本申请第三阶段体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触且与本申请饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与本申请饲养细胞共培养。在一种实施方式中，在本申请第一阶段体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与本申请饲养细胞共培养。在一种实施方式中，在本申请第二阶段体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与本申请饲养细胞共培养。在一种实施方式中，在本申请第三阶段体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与本申请饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在单个阶段的本申请体外扩增中，可以使本申请TIL与本申请一种或多种T细胞激活剂和/或一种或多种T细胞生长因子接触一定时间之后，再与本申请饲养细胞共培养。在一种实施方式中，本申请的一定时间可以为至少约2小时。在一种实施方式中，本申请的一定时间可以为至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约13小时、至少约14小时、至少约15小时、至少约16小时、至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约60小时或至少约72小时。在一种实施方式中，本申请的一定时间可以为约6小时至约72小时。在一种实施方式中，本申请的一定时间可以为约6小时到约7小时、约6小时到约8小时、约6小时到约9小时、约6小时到约10小时、约6小时到约11小时、约6小时到约12小时、约6小时到约13小时、约6小时到约14小时、约6小时到约15小时、约6小时到约16小时、约6小时到约17小时、约6小时到约18小时、约6小时到约19小时、约6小时到约20小时、约6小时到约21小时、约6小时到约22小时、约6小时到约23小时、约6小时到约24小时、约6小时到约36小时、约6小时到约48小时、约6小时到约60小时或约6小时到约72小时。在一种实施方式中，本申请的一定时间可以为约12小时到约13小时、约12小时到约14小时、约12小时到约15小时、约12小时到约16小时、约12小时到约17小时、约12小时到约18小时、约12小时到约19小时、约12小时到约20小时、约12小时到约21小时、约12小时到约22小时、约12小时到约23小时、约12小时到约24小时、约12小时到约36小时、约12小时到约48小时、约12小时到约60小时或约12小时到约72小时。在一种实施方式中，本申请的一定时间可以为约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时。
在一种实施方式中，本申请的饲养细胞可以包含抗原呈递细胞。在一种实施方式中，本申请的饲养细胞可以包含选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。在一种实施方式中，本申请的饲养细胞可以为外周单个核细胞。在一种实施方式中，本申请的饲养细胞可以为经过辐照的饲养细胞。例如，本申请的饲养细胞可以为分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，本申请的人工抗原呈递细胞可以包含表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和/或CD58的细胞，并可以被修饰以表达一种以上本申请的T细胞激活剂。在一种实施方式中，本申请的饲养细胞可以经过辐照，例如，可以经过伽马射线辐照，或可以经过X射线辐照。
在一种实施方式中，本申请的TIL与本申请的饲养细胞共培养可以包含使本申请的饲养细胞的表面与本申请的TIL的表面相接触。在一种实施方式中，本申请的TIL与本申请的饲养细胞共培养包含将本申请的饲养细胞添加至本申请的TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，本申请可以以约40∶1-约400∶1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，本申请可以以约40∶1-约400∶1、以约40∶1-约300∶1、以约40∶1-约200∶1、以约40∶1-约100∶1、以约40∶1-约90∶1、以约40∶1-约80∶1、以约40∶1-约70∶1、以约40∶1-约60∶1、以约40∶1-约50∶1、以约50∶1-约400∶1、以约60∶1-约400∶1、以约70∶1-约400∶1、以约80∶1-约400∶1、以约90∶1-约400∶1、以约100∶1-约400∶1、以约200∶1-约400∶1、或以约300∶1-约400∶1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，本申请的TIL可以为源自肿瘤组织的碎片的TIL。在一种实施方式中，可以通过将肿瘤组织处理成肿瘤碎片获得本申请的TIL。在一种实施方式中，本申请的肿瘤碎片的体积约为1-27立方毫米。在一种实施方式中，本申请的肿瘤碎片的体积约为约1立方毫米、约2立方毫米、约3立方毫米、约4立方毫米、约5立方毫米、约6立方毫米、约7立方毫米、约8立方毫米、约9立方毫米、约10立方毫米、约11立方毫米、约12立方毫米、约13立方毫米、约15立方毫米、约17立方毫米、约19立方毫米、约20立方毫米、约21立方毫米、约23立方毫米、约24立方毫米、约25立方毫米、约26立方毫米或27立方毫米。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与T细胞生长因子接触、与T细胞激活剂接触且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与T细胞激活剂接触以及与免疫检查点抑制剂接触，步骤(C)可以进行至多约24小时。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与T细胞激活剂接触且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与T细胞激活剂接触以及与免疫检查点抑制剂接触，步骤(C)可以进行至多约24小时。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与T细胞激活剂(例如可以包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质、CD3抗体或CD3抗体和CD28抗体的混合物)接触且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与T细胞激活剂(例如可以包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质、CD3抗体或CD3抗体和CD28抗体的混合物)接触以及与PD-1抗体接触，所述PD-1抗体的重链可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：7、11和21中任一项所示的VH，且所述PD-1抗体的轻链可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：8、12和22中任一项所示的VL，步骤(C)可以进行至多约24小时。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与T细胞激活剂(例如可以包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质、CD3抗体或CD3抗体和CD28抗体的混合物)接触且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与T细胞激活剂(例如可以包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质、CD3抗体或CD3抗体和CD28抗体的混合物)接触以及与PD-1抗体接触，所述PD-1抗体的重链可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：7、11和21中任一项所示的VH，且所述PD-1抗体的轻链可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：8、12和22中任一项所示的VL，所述PD-1抗体在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以至少为约0.1μg/mL，步骤(C)可以进行至多约24小时。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触且使所述TIL与饲养细胞共培养；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触以及与PD-1抗体接触，所述PD-1抗体的重链可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7、11和21中任一项所示的VH，且所述PD-1抗体的轻链可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO：8、12和22中任一项所示的VL，所述PD-1抗体在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以至少为约0.1μg/mL，步骤(C)可以进行至多约24小时。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触且在步骤(B)进行至少约2小时之后使所述TIL与饲养细胞共培养，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触以及与PD-1抗体接触，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg，所述PD-1抗体的重链可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：1和15中任一项所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2和16中任一项所示的HCDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：3和17中任一项所示的HCDR3，且所述PD-1抗体的轻链可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4和18中任一项所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：5和19中任一项所示的LCDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：6和20中任一项所示的LCDR3，所述PD-1抗体在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以至少为约0.1μg/mL，步骤(C)可以进行至多约24小时。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其可以包含：(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与IL-2接触、与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触且在步骤(B)进行至少约2小时之后使所述TIL与饲养细胞共培养，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为至少约300IU/mL，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg，可以以约1∶100-约1∶2000的所述纳米基质与所述TIL的比例添加至所述TIL的细胞培养基中，所述饲养细胞可以包含外周单个核细胞，可以以约40∶1-约400∶1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质接触以及与PD-1抗体接触，所述纳米基质的直径可以为约1纳米至约500纳米，每mg所述纳米基质可以分别包含CD3抗体以及CD28抗体各为约25μg，可以以约1∶100-约1∶2000的所述纳米基质与所述TIL的比例添加至所述TIL的细胞培养基中，所述PD-1抗体的重链可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1和15中任一项所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2和16中任一项所示的HCDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：3和17中任一项所示的HCDR3，且所述PD-1抗体的轻链可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO：4和18中任一项所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO：5和19中任一项所示的LCDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO：6和20中任一项所示的LCDR3，所述PD-1抗体在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以至少为约0.1μg/mL，步骤(C)可以进行至多约24小时。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。从受试者组织样品获得的TIL细胞的方法可以是患者手术取得原位肿瘤样本或转移肿瘤样本，重量可以至少约1g，也可以多块组织合并。肿瘤组织在样本运输液，例如可以是商业常用的肿瘤组织运输液、肿瘤组织保存液或肿瘤组织转运液，内约2-8度运输，48小时内处理。组织块可以机械破碎至每块约1-27立方毫米大小，转移入透气培养袋或Grex中，加入T细胞无血清培养基和浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2培养约3-14天。收集培养基中细胞，转移入透气培养袋、或Grex、或Xuri设备，T细胞无血清培养基可以添加本申请的CD28抗体、CD3抗体以及CD28抗体、包含CD3抗体以及CD28抗体的磁珠(例如Dynabeads)和/或包含CD3抗体以及CD28抗体的纳米基质(例如transACT)以及浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2，活化本申请的一定时间后，添加辐照PBMC(TIL与PBMC按照比率约1∶40-约1∶400)，扩增培养约3-14天。可以使用细胞处理系统收集培养基中细胞，并且可以使用本申请的CD3抗体和PD-1抗体(例如可以是至少为约0.1μg/mL)，以及任选地CD28抗体培养本申请的TIL细胞，例如可以培养约12至约24小时。之后清洗冻存，并检测。最终产品CD3比例可以大于80％，细胞活率可以大于70％，大于80％的T细胞可以为记忆效应T细胞和效应T细胞。经刺激后可以分泌IFNγ，和/或可以具有活化T细胞比例上调的特征。
一方面，本申请提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，本申请的TIL可以根据本申请的培养方法培养得到。在一种实施方式中，本申请提供的TIL可以包含一种或一个批次的本申请的培养方法培养得到TIL。在一种实施方式中，本申请提供的TIL可以包含多种或多个批次的本申请的培养方法培养得到并以任意比例组合的TIL。
在一些实施方式中，可以将使用本申请方法扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一些实施方式中，药物组合物可以是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本申请的PBMC扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方式中，T细胞可以以单次动脉内或静脉内输注施用，输注可以持续约30至60分钟。其他合适的施用途径可以包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
在一些实施方式中，可以施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方式中，例如当肿瘤是黑色素瘤时，可以施用约2.3×109至约13.7×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约1×109至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约2.3×109至约13.7×1010。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约1×109至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的数量可以为约1×106、约2×106、约3×106、约4×106、约5×106、约6×106、约7×106、约8×106、约9×106、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、约1×108、约2×108、约3×108、约4×108、约5×108、约6×108、约7×108、约8×108、约9×108、约1×109、约2×109、约3×109、约4×109、约5×109、约6×109、约7×109、约8×109、约9×109、约1×1010、约2×1010、约3×1010、约4×1010、约5×1010、约6×1010、约7×1010、约8×1010、约9×1010、约1×1011、约2×1011、约3×1011、约4×1011、约5×1011、约6×1011、约7×1011、约8×1011、约9×1011、约1×1012、约2×1012、约3×1012、约4×1012、约5×1012、约6×1012、约7×1012、约8×1012、约9×1012、约1×1013、约2×1013、约3×1013、约4×1013、约5×1013、约6×1013、约7×1013、约8×1013，或约9×1013。在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL数量的范围可以为约1×106至5×106、约5×106至1×107、约1×107至5×107、约5×107至1×108、约1×108至5×108、约5×108至1×109、约1×109至5×109、约5×109至1×1010、约1×1010至5×1010、约5×1010至1×1011、约5×1011至1×1012、约1×1012至5×1012，或约5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度可以小于组合物的例如约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约0.0002％，或约0.0001％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度可以大于组合物的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19.75％、约19.50％、约19.25％、约19％、约18.75％、约18.50％、约18.25％、约18％、约17.75％、约17.50％、约17.25％、约17％、约16.75％、约16.50％、约16.25％、约16％、约15.75％、约15.50％、约15.25％、约15％、约14.75％、约14.50％、约14.25％、约14％、约13.75％、约13.50％、约13.25％、约13％、约12.75％、约12.50％、约12.25％、约12％、约11.75％、约11.50％、约11.25％、约11％、约10.75％、约10.50％、约10.25％、约10％、约9.75％、约9.50％、约9.25％、约9％、约8.75％、约8.50％、约8.25％、约8％、约7.75％、约7.50％、约7.25％、约7％、约6.75％、约6.50％、约6.25％、约6％、约5.75％、约5.50％、约5.25％、约5％、约4.75％、约4.50％、约4.25％、约4％、约3.75％、约3.50％、约3.25％、约3％、约2.75％、约2.50％、约2.25％、约2％、约1.75％、约1.50％、约125％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约或0.0002％，或者约0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度范围可以为组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度范围可以为组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、或约0.1％至约0.9％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的量可以等于或小于约10g、约9.5g、约9.0g、约8.5g、约8.0g、约7.5g、约7.0g、约6.5g、约6.0g、约5.5g、约5.0g、约4.5g、约4.0g、约3.5g、约3.0g、约2.5g、约2.0g、约1.5g、约1.0g、约0.95g、约0.9g、约0.85g、约0.8g、约0.75g、约0.7g、约0.65g、约0.6g、约0.55g、约0.5g、约0.45g、约0.4g、约0.35g、约0.3g、约0.25g、约0.2g、约0.15g、约0.1g、约0.09g、约0.08g、约0.07g、约0.06g、约0.05g、约0.04g、约0.03g、约0.02g、约0.01g、约0.009g、约0.008g、约0.007g、约0.006g、约0.005g、约0.004g、约0.003g、约0.002g、约0.00.1g、约0.0009g、约0.0008g、约0.0007g、约0.0006g、约0.0005g、约0.0004g、约0.0003g、约0.0002g，或者约0.0001g。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的量可以大于约0.0001g、约0.0002g、约0.0003g、约0.0004g、约0.0005g、约0.0006g、约0.0007g、约0.0008g、约0.0009g、约0.001g、约0.0015g、约0.002g、约0.0025g、约0.003g、约0.0035g、约0.004g、约0.0045g、约0.005g、约0.0055g、约0.006g、约0.0065g、约0.007g、约0.0075g、约0.008g、约0.0085g、约0.009g、约0.0095g、约0.01g、约0.015g、约0.02g、约0.025g、约0.03g、约0.035g、约0.04g、约0.045g、约0.05g、约0.055g、约0.06g、约0.065g、约0.07g、约0.075g、约0.08g、约0.085g、约0.09g、约0.095g、约0.1g、约0.15g、约0.2g、约0.25g、约0.3g、约0.35g、约0.4g、约0.45g、约0.5g、约0.55g、约0.6g、约0.65g、约0.7g、约0.75g、约0.8g、约0.85g、约0.9g、约0.95g、约1g、约1.5g、约2g、约2.5g、约3g、约3.5g、约4g、约4.5g、约5g、约5.5g、约6g、约6.5g、约7g、约7.5g、约8g、约8.5g、约9g、约9.5g，或者约10g。
在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可以通过注射，例如可以静脉内注射。在一些实施方式中，TIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。在一些实施方式中，TIL的施用可以连续施用。
一方面，本申请提供一种药物组合物。在一些实施方式中，其可以包含本申请的TIL和/或本申请的组合物，与药学上可接受的载体。
一方面，本申请提供一种试剂盒，本申请的试剂盒可以包含本申请培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)方法的T细胞激活剂、T细胞生长因子和/或饲养细胞与记载本申请培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)方法的步骤的说明书。一方面，本申请提供一种试剂盒，本申请试剂盒可以包含本申请的TIL和/或本申请的药物组合物。
方法和制药用途
一方面，本申请提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，可以包括向受试者施用本申请的TIL和/或本申请的药物组合物。在一些实施方式中，影响肿瘤生长可以包含肿瘤的体积减少到施用前的例如约99％、约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％。
一方面，本申请提供本申请的TIL和/或本申请的药物组合物在制备药物中的应用，本申请的药物可以用于预防和/或治疗肿瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
一方面，本申请提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，可以包括向受试者施用本申请的TIL和/或本申请的药物组合物。在一些实施方式中，本申请的肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
一方面，本申请提供一种本申请的TIL和/或本申请的药物组合物，其可以用于预防和/或治疗肿瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，本申请的肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞的培养方法
饲养细胞接收及制备
1.1.1单采血接收
记录单采血信息，批号及体积，并复温至室温。
1.1.2 PBMC(外周血单个核细胞)手动分离及冻存
使用75％酒精消毒血袋，转移至生物安全柜内。使用无菌剪刀剪开血袋后，将单采血转移至50mL离心管内，使用20mL注射器注入20mL PBS或生理盐水清洗血袋，将洗涤液一并转入50mL离心管内。每个50mL离心管内液体体积可以不超过30mL。将单采血3000g离心10分钟。离心过程中准备6-8支50mL离心管，加入已复温的淋巴细胞分离液(天津灏洋Ficoll)，20mL/支。离心结束后，弃掉上层血浆，使用PBS或生理盐水稀释细胞沉淀，将稀释后的血细胞混合液缓慢滴加上淋巴细胞分离液上层，可以不破坏界面，每管约加25mL样品，可以不超过28mL。
离心使用水平转子，500-600g离心15-30分钟，温度18-22℃，离心结束后得到的白膜层将处于生理盐水及淋巴细胞分离液Ficoll的分界面处。吸弃上层血浆及生理盐水，用移液管吸取中间白膜层至另一干净的50mL离心管内。使用PBS或生理盐水稀释收集到的白膜层，600g离心10分钟，室温。离心结束后弃上清，PBS或生理盐水清洗细胞一次，500g离心5分钟，室温。
如红细胞较多，离心结束后可以进行裂红，按照细胞沉淀体积与红细胞裂解液1∶2至1∶3加入红细胞裂解液，混匀，室温裂解10分钟中，中间轻柔混匀离心管2-3次，保证裂解效果，裂解完成后加入PBS或生理盐水清洗细胞。裂红后清洗细胞两次，400g离心6分钟，最后一次离心前取样计数。
弃上清，基础培养基重悬细胞，调整细胞密度约2-3×107个细胞/mL，液面高度可以不超过1厘米，每T225培养瓶中体积可以低于200mL；平铺状态下，X射线辐照50-200Gy。离心弃上清，根据计数结果冻存细胞，约1-2×108个细胞/mL，1-2mL/支；将细胞放入程序降温盒内转移至-80℃冰箱内冻存。
1.1.3 PBMC自动分离及冻存
将血袋的管路与cpro分离套件(Cytiva)输入端无菌接管。若血量大于120mL，进行预浓缩步骤，可以将血液体积浓缩至120mL以内。可以使用neatcell程序进行PBMC分离及洗涤，洗涤液为生理盐水，中间体积20mL；重悬液为基础培养基，添加80mL/批。分离后每供者PBMC为一袋100mL，在平铺状态下，液面高度可以不超过1厘米，X射线辐照50-200Gy。辐照后取样计数，使用culture wash程序收集细胞并洗涤三次，洗涤液为生理盐水；设置中间体积及终体积，使得每1×109个细胞不少于2mL；加入等量至2倍冻存液混匀。使用1倍冻存液调整细胞密度约为1×107个细胞/mL至2×108个细胞/mL，分装20mL/袋，程序降温仪内冻存，液氮保存。
1.2肿瘤组织接收及处理
1.2.1组织接收
接收供者的肿瘤组织及血样，核对样品信息并记录，打印相应样品标签。
1.2.2组织处理及培养
使用75％酒精消毒样品管及采血管，转移至生物安全柜内。根据上述PBMC手动分离及冻存操作程序分离血样中PBMC细胞并进行冻存。取一种具有透气表面的培养瓶或培养袋，例如培养袋(Origen)，加入300mL已复温的完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2。取数个10厘米培养皿，加入适量培养基，使用无菌眼科镊从样品管中取出肿瘤组织于10厘米培养皿中，培养基量以刚没过肿瘤组织为准，观察组织形态并记录。洗涤组织并更换培养皿。使用眼科剪及眼科镊将进行初步剪切，去除脂肪组织及坏死组织，每块组织块继续剪碎至约27立方毫米大小。取非悬浮肿瘤组织块，使用20mL注射器去除内部活塞后，与培养袋连接，使用移液管将约1g组织块通过注射器转入培养袋内。将培养袋放入二氧化碳培养箱内进行培养。清理剪刀及镊子，并用75％酒精进行初步消毒后，超声清洗后进行灭菌，得到第一TIL群。
1.3第一阶段体外扩增及收获(preREP阶段)
1.3.1第一阶段体外扩增
根据细胞生长状态，每3-7天补液或半量换液，保证细胞营养。使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。第一阶段体外扩增的3-14天，例如可以第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天时取样计数，若细胞数目处于5×105至5×108之间时进入下述第一阶段体外扩增的收获步骤。
1.3.2第一阶段体外扩增的收获
收集第一阶段体外扩增结束细胞，离心，弃去培养基，使用PBS或生理盐水洗涤细胞一次，获得经第一阶段体外扩增的TIL(第二TIL群)，并取样计数留取约5×105至2×108个细胞进入下述第一阶段体外扩增步骤；取约5×105个细胞可以进行质量控制检测；其余细胞加入冻存液冻存。
1.4第二阶段体外扩增(REP阶段)
1.4.1第二阶段体外扩增的TIL活化
取5×105至2×108的第一阶段体外扩增的细胞量，使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，调整细胞密度为5×105至2×106个细胞/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2。各TIL加入IL-2的同时，可以添加CD3激动剂和/或CD28激动剂，例如，约30ng/mL的OKT3、约30ng/mL的CD28抗体、以约1∶2-2∶1的磁珠与TIL的比例加入磁珠(直径约1至10μm Dynabeads，Thermo Fisher)和/或以约1∶100-1∶2000的transACT(直径约100至500nm，Miltenyi)与TIL的比例加入transACT。
1.4.2第二阶段体外扩增的扩大培养
在第二阶段体外扩增加入IL-2与不同形式的T细胞激活剂后的若干时间Tn以后(Tn可以取0小时到14天，例如24小时或48小时)，复苏1-5名供者混合的饲养细胞；将活化的TIL细胞，饲养细胞转入G-Rex100培养瓶或者透气袋内，补充完全培养基，每1-3天取样计数，并根据细胞状态补液或半量换液直至细胞总数大于1×109或第二阶段体外扩增培养达13天，终止第二阶段体外扩增的培养。
1.4.3肿瘤浸润淋巴细胞的收获
取第二阶段体外扩增的细胞，离心后弃去培养基上清，并使用PBS或生理盐水或复方电解质溶液清洗三次，获得经第二阶段体外扩增的TIL(第三TIL群)，第三次清洗时取样计数，根据计数结果，最后一次离心后弃上清，取3×106细胞送质量控制检测；其余全部细胞加入冻存液，调整细胞密度1-3×108个细胞/mL冻存。
1.5第三阶段体外扩增
收集第二阶段体外扩增结束的TIL，或取冻存的第三TIL群并复苏，复苏后的TIL可以任选地缓解若干时间，例如约1小时、约2小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天或约4天。使用完全培养基调整细胞密度，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素；调整细胞密度为5×105至2×106个细胞/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔。各个试验组进行不同方式的刺激：
对照组：加入PBS或生理盐水；
PD-1抗体组：加入至少为约0.1μg/mL(例如约1μg/mL或约10μg/mL)的PD-1抗体(例如pembrolizumab，MSD，或6H6，重链全长如SEQ ID NO：9和13中任一项所示，且轻链全长如SEQ ID NO：10和14中任一项所示)；
纳米基质组：以约1∶100-1∶2000的transACT与TIL的比例加入transACT(直径约100至500nm，Miltenyi)；
纳米基质+PD-1抗体组：以约1∶100-1∶2000的transACT与TIL的比例加入transACT，以及加入至少为约0.1μg/mL(例如约1μg/mL或约10μg/mL)的PD-1抗体(例如pembrolizumab，MSD，或6H6，重链全长如SEQ ID NO：9和13中任一项所示，且轻链全长如SEQID NO：10和14中任一项所示)；
纳米基质+PD-1抗体组A：以约1∶100-1∶2000的transACT与TIL的比例加入transACT，以及加入至少为约0.1μg/mL(例如约1μg/mL或约10μg/mL)的PD-1抗体A(pembrolizumab，MSD)；
纳米基质+PD-1抗体组B：以约1∶100-1∶2000的transACT与TIL的比例加入transACT，以及加入至少为约0.1μg/mL(例如约1μg/mL或约10μg/mL)的PD-1抗体B(重链全长如SEQ ID NO：9和13中任一项所示，且轻链全长如SEQ ID NO：10和14中任一项所示)；
以上各个组，在第三阶段体外扩增的约12小时至约24小时时收获第四TIL群并取样计数，终止第三阶段体外扩增的培养。
1.6肿瘤浸润淋巴细胞的应用
可以将收获的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞给予受试者静脉滴注。
实施例2 TIL胞内因子表达检测
对于实施例1中各个试验组不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群进行胞内因子表达检测。
试验准备
配制胞内因子表达检测所需培养基：取T细胞培养基，按照体积比1∶500添加CD107a抗体(BD)。
检测步骤
取各个试验组的TIL离心后，使用600μL上述胞内因子表达检测所需培养基重悬为1×106个细胞/mL，加入96孔板内，100μL/孔，置于37℃培养箱孵育过夜。
孵育结束后，200μL/孔PBS洗涤一次，600g离心3分钟，弃上清。配制抗体混合工作液进行细胞表面染色CD3/CD4/CD8(BD)，抗体浓度为1∶100，viability(1∶10000)，50μL/组染色，2-8℃避光孵育30分钟。染色结束后清洗细胞，使用PBS重悬，进行流式上机检测。
图1A-1B显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的胞内因子表达能力。结果显示，相比于第三阶段体外扩增培养时不添加PD-1抗体和T细胞激活剂(对照组)、仅添加PD-1抗体(PD-1抗体组)和仅添加T细胞激活剂(纳米基质组)，在第三阶段体外扩增培养同时添加PD-1抗体和T细胞激活剂(纳米基质+PD-1抗体组)具有更高的胞内因子表达能力，例如，更高的CD107a表达能力。在第三阶段体外扩增中，PD-1抗体和T细胞激活剂在胞内因子表达能力的提高方面具有显著的协同作用。
图2A-2B显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的胞内因子表达能力。结果显示，相比于第三阶段体外扩增培养时不添加PD-1抗体和T细胞激活剂(对照组)，在第三阶段体外扩增培养同时添加不同种类的PD-1抗体和T细胞激活剂(纳米基质+PD-1抗体组A或纳米基质+PD-1抗体组B)具有相近的胞内因子表达能力的提高，例如，更高的CD107a表达能力。在第三阶段体外扩增中，不同的PD-1抗体与T细胞激活剂组合对于胞内因子表达能力都具有显著的增强作用。
实施例3 TIL细胞因子分泌检测
对于实施例1中各个试验组不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群进行细胞因子分泌检测。
标准品准备
人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品冻干粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀释液(BD)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/mL)并按顺序：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024梯度稀释，随后与Capture Beads(BD)混合及PE DetectionReagent检测试剂(BD)混合，转移至15mL锥底离心管，标记为“标准品管”。取1管仅含有Assay Diluent稀释液作为阴性对照。
检测步骤
按照2μL/Beads/孔与每种Capture Beads(BD)混合，然后按照10μL/孔与PEDetection Reagent检测试剂(BD)混合，配制为混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板内，随后按照10μL/孔加入各实验组培养上清混合，室温下避光孵育3小时。
孵育结束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重悬，进行流式分析。
图3A-3C显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的IL-2分泌检测结果。结果显示，相比于第三阶段体外扩增培养时不添加PD-1抗体和T细胞激活剂(对照组)以及仅添加T细胞激活剂(纳米基质组)，在第三阶段体外扩增培养同时添加PD-1抗体和T细胞激活剂(纳米基质+PD-1抗体组)具有更高的细胞因子分泌能力，例如，更高的IL-2分泌能力。
图4A-4C显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的TNF分泌检测结果。结果显示，相比于第三阶段体外扩增培养时不添加PD-1抗体和T细胞激活剂(对照组)以及仅添加T细胞激活剂(纳米基质组)，在第三阶段体外扩增培养同时添加PD-1抗体和T细胞激活剂(纳米基质+PD-1抗体组)具有更高的细胞因子分泌能力，例如，更高的TNF分泌能力。
图5A-5C显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的IFNγ分泌检测结果。结果显示，相比于第三阶段体外扩增培养时不添加PD-1抗体和T细胞激活剂(对照组)以及仅添加T细胞激活剂(纳米基质组)，在第三阶段体外扩增培养同时添加PD-1抗体和T细胞激活剂(纳米基质+PD-1抗体组)具有更高的细胞因子分泌能力，例如，更高的IFNγ分泌能力。
实施例4 TIL细胞杀伤能力检测
对于实施例1中各个试验组不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群进行细胞杀伤能力检测。
细胞准备
准备用于检测的各个试验组获得的TIL和用于共培养的靶细胞(例如Hela肿瘤细胞)。
检测步骤
用CFSE(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，Sigma，21888-25MG-F)标记肿瘤细胞：用PBS清洗肿瘤细胞，重悬肿瘤细胞于500μL的PBS中；将CFSE加入500μL的PBS中，与500μL的肿瘤细胞PBS重悬液混合，至CFSE的终浓度为0.5μmol/L。37℃孵育6分钟后，加含10％FBS的培养基清洗，600g离心5分钟，用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基重悬肿瘤细胞浓度为5×105个细胞/mL。对各个试验组的TIL细胞600g离心5分钟，按照效靶比(TIL细胞与肿瘤细胞的比例)3∶1重悬TIL细胞(即重悬TIL细胞浓度为1.5×106个细胞/mL)。于U底96孔板(Corning)中加入肿瘤细胞和TIL细胞各100μL，每组设置三个复孔。同时设置一组只包含肿瘤细胞的对照组并按照实验不同分组加入不同试剂。将孔板200g离心1分钟，置于37℃孵育4小时至过夜。
孵育完成后，600g离心3分钟，弃上清，每孔加入20μL胰酶，37℃培养箱内孵育3-5分钟消化肿瘤细胞，消化完成后加入180μL含10％FBS的培养基终止消化。将Dapi(碧云天，C0060)用1∶100稀释，然后每孔加入20μL稀释后的Dapi。进行流式上机检测。
杀伤率％＝Dapi+CFSE+细胞数/总CFSE+×100％。
图6A-6B显示的是，对于不同供者，不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群的细胞杀伤能力检测结果。结果显示，相比于第三阶段体外扩增培养时不添加PD-1抗体和T细胞激活剂(对照组)，在第三阶段体外扩增培养同时添加不同种类的PD-1抗体和T细胞激活剂(纳米基质+PD-1抗体组A或纳米基质+PD-1抗体组B)具有相近的细胞杀伤能力的提高。在第三阶段体外扩增中，不同的PD-1抗体与T细胞激活剂组合对于细胞杀伤能力都具有显著的增强作用。
实施例5 TIL增殖能力检测
对于实施例1中第二阶段体外扩增(REP阶段)的不同培养方法进行探究试验。各个试验组在第二阶段体外扩增(REP阶段)进行不同方式的刺激：
CD3抗体组：加入CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL；
CD3抗体+PD-1抗体组M：加入CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，以及约1μg/mL的PD-1抗体(例如pembrolizumab，MSD，或6H6，重链全长如SEQ ID NO：9和13中任一项所示，且轻链全长如SEQ ID NO：10和14中任一项所示)；
CD3抗体+PD-1抗体组N：加入CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，以及约10μg/mL的PD-1抗体(例如pembrolizumab，MSD，或6H6，重链全长如SEQ ID NO：9和13中任一项所示，且轻链全长如SEQ ID NO：10和14中任一项所示)；
以上各个组，在第二阶段体外扩增开始后的第7天、第10天和第17天时收获并取样计数。
图7A-7C显示的是，对于不同供者，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入不同浓度的PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL细胞增殖情况。图7A-7C中纵坐标的数值表示，各个试验组第二阶段体外扩增获得的各个时间点的TIL细胞相比于第二阶段体外扩增开始前的第二TIL群，TIL细胞数量扩增至的扩增倍数。结果显示，在第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入不同浓度的PD-1抗体，获得的TIL增殖能力没有明显优势。
实施例6 第二阶段体外扩增(REP阶段)添加PD1抗体的TIL培养效果检测
对于实施例1中第二阶段体外扩增(REP阶段)的不同培养方法进行探究试验。各个试验组在第二阶段体外扩增(REP阶段)进行不同方式的刺激：
CD3抗体组：加入CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL；
CD3抗体+PD1(PD-1)抗体组：加入CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，以及约10μg/mL的PD-1抗体(例如pembrolizumab，MSD，或6H6，重链全长如SEQ ID NO：9和13中任一项所示，且轻链全长如SEQ ID NO：10和14中任一项所示)；以上各个组，在第二阶段体外扩增开始后的第6天、第10天和第13天时收获并取样计数。
图8A-8B显示的是，对于不同供者，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL细胞增殖情况。结果显示，在第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入PD-1抗体，获得的TIL增殖能力没有明显优势。
培养7天(7D)及13天(13D)进行流式检测细胞分型，并取样添加transACT(Miltenyi)进行刺激，流式检测胞内因子分泌比例(2E5个细胞/孔)及细胞因子分泌量(1E5个细胞/孔)。
图9A-9B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞活率和细胞分型情况。结果显示，第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入PD-1抗体，获得的TIL的细胞活率和CD3+比例没有明显优势。
图10A-10B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中活化相关(41BB+)细胞比例情况。
图11A-11C显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中活化相关(CD25+和/或CD27+)细胞比例情况。
结果显示，第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入PD-1抗体，获得的TIL的活化相关细胞比例没有明显优势。
图12A-12B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中耗竭相关(TIM3+)细胞比例情况。结果显示，第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入PD-1抗体，获得的TIL的耗竭相关细胞比例没有明显优势。
图13A-13B显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中分泌TNF-α细胞比例情况。
图14A-14D显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL中分泌IFN-γ细胞比例情况。
结果显示，第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入PD-1抗体，获得的TIL的细胞因子分泌细胞比例没有明显优势。
图15A-15C显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞因子(IL-2和/或IL-4)分泌量情况。
图16A-16C显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞因子(IL-17和/或IL-6)分泌量情况。
图17A-17D显示的是，在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入CD3抗体时额外加入PD-1抗体，相比仅加入CD3抗体的TIL的细胞因子(TNF-α和/或IFN-γ)分泌量情况。
结果显示，第二阶段体外扩增(REP阶段)额外加入PD-1抗体，获得的TIL的细胞因子分泌能力没有明显优势。
实施例7 第三阶段体外扩增添加PD1抗体的TIL培养效果检测
对于实施例1中各个试验组不同方式的第三阶段体外扩增培养获得的第四TIL群进行检测。第二阶段体外扩增(REP阶段)培养结束后，采用transACT(Miltenyi)或额外加入20μg/mL的PD-1抗体进行刺激，检测细胞因子分泌能力。
图18A-18D显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-4和/或TNF-α)分泌量情况。图18E-18F显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-2和/或IL-6)分泌量情况。
结果显示，在REP阶段培养结束后额外加入PD-1抗体，获得的TIL的细胞因子分泌能力明显增强。
实施例8 第二阶段体外扩增(REP阶段)添加PD1抗体以及第三阶段体外扩增添加PD1抗体的TIL培养效果检测
对于实施例1中第二阶段体外扩增(REP阶段)加入PD1(PD-1)抗体培养，且在第二阶段体外扩增(REP阶段)培养结束后，采用纳米基质(transACT，Miltenyi)或额外加入PD-1抗体(2μg/mL或20μg/mL)进行刺激，检测细胞因子分泌能力。
图19A-19D显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-6和/或TNF-α)分泌量情况。
图20A-20C显示的是，在REP阶段培养结束后，额外加入PD-1抗体进行刺激，相比仅加入transACT进行刺激的TIL的细胞因子(IL-2、IL-4和/或IFN-γ)分泌量情况。
结果显示，即使在第二阶段体外扩增(REP阶段)加入PD1(PD-1)抗体对TIL进行培养，在REP阶段培养结束后额外加入PD-1抗体，获得的TIL的细胞因子分泌能力也可以明显增强。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 苏州沙砾生物科技有限公司；
上海沙砾生物科技有限公司；
苏州拓域生物科技有限公司；
珠海沙砾生物科技有限公司
<120> 肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途
<130> 0170-PA-046CN
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的HCDR1
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的HCDR2
<400> 2
Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的HCDR3
<400> 3
Ala Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的LCDR1
<400> 4
Gln Ser Ile Ser Asn Asn
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的LCDR2
<400> 5
Tyr Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的LCDR3
<400> 6
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的VH
<400> 7
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的VL
<400> 8
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Lys Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 9
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的重链
<400> 9
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6H6的轻链
<400> 10
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Lys Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu_6H6的VH
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu_6H6的VL
<400> 12
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Arg Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu_6H6的重链
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu_6H6的轻链
<400> 14
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Arg Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的HCDR1
<400> 15
Asn Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的HCDR2
<400> 16
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的HCDR3
<400> 17
Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的LCDR1
<400> 18
Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的LCDR2
<400> 19
Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的LCDR3
<400> 20
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的VH
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的VL
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的重链
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pembrolizumab的轻链
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (12)

1.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(A)使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与IL-2接触；所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少300IU/mL；其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；
(B)使所述第二TIL群与IL-2接触和与包含抗CD3的抗体和抗CD28的抗体的固相介质接触；其中，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少300IU/mL；
所述固相介质的直径为100纳米至500纳米，每mg所述固相介质中包含的抗CD3的抗体和抗CD28的抗体的量各自独立地至少为25μg；以1:100至1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将所述固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中；其中所述固相介质为transACT；其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；
(C)使所述第三TIL群与包含抗CD3的抗体和抗CD28的抗体的固相介质以及抗PD-1的抗体接触；其中，所述固相介质的直径为100纳米至500纳米，每mg所述固相介质中包含的抗CD3的抗体和抗CD28的抗体的量各自独立地至少为25μg；以1:100至1:2000的所述固相介质与所述TIL的比例，将所述固相介质添加至所述TIL的细胞培养基中；其中，所述固相介质为transACT；所述抗PD-1的抗体包含SEQ ID NO：1所示的HCDR1、SEQ ID NO：2所示的HCDR2、SEQ ID NO：3所示的HCDR3、SEQ ID NO：4所示的LCDR1、SEQ ID NO：5所示的LCDR2和SEQ IDNO：6所示的LCDR3，或者所述抗PD-1的抗体包含SEQ ID NO：15所示的HCDR1、SEQ ID NO：16所示的HCDR2、SEQ ID NO：17所示的HCDR3、SEQID NO：18所示的LCDR1、SEQ ID NO：19所示的LCDR2和SEQ ID NO：20所示的LCDR3；所述抗PD-1的抗体在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为1μg/mL至10μg/mL；其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(C)进行12小时至24小时。
3.根据权利要求1所述的方法，与在步骤(C)中未曾与所述固相介质以及所述抗PD-1的抗体接触的相应TIL相比，在步骤(C)中与所述固相介质以及所述抗PD-1的抗体接触过的TIL显示出改善的扩增效果。
4.根据权利要求3所述的方法，所述改善的扩增效果包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，和提高的肿瘤细胞杀伤能力。
5.根据权利要求4所述的方法，所述改善的T细胞亚群比例包含选自以下组的一种或多种：增加的中心记忆T细胞比例，降低的调节性T细胞的比例，增加的活化T细胞比例，增加的肿瘤特异性T细胞比例，和增加的干细胞样T细胞比例。
6.根据权利要求1所述的方法，所述抗PD-1的抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO：9，且所述抗PD-1的抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：10；或者所述抗PD-1的抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO：13，且所述抗PD-1的抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：14。
7.根据权利要求1所述的方法，所述抗PD-1的抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO：23，且所述抗PD-1的抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：24。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(B)中，使所述TIL与所述固相介质和所述IL-2接触且与饲养细胞共培养；所述饲养细胞为经过辐照的外周血单个核细胞；所述TIL与所述饲养细胞共培养包含以40:1至400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在步骤(B)中，使所述TIL与所述固相介质和所述IL-2接触12小时至48小时之后，再与所述饲养细胞共培养。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(B)进行1天至13天。
11.根据权利要求1所述的方法，所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL为源自所述肿瘤组织的碎片的TIL。
12.根据权利要求11所述的方法，所述碎片的体积为1立方毫米至27立方毫米。
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