KR20210144679A - TCRαβ+ 세포 고갈 효율을 향상시키는 방법 - Google Patents

TCRαβ+ 세포 고갈 효율을 향상시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210144679A
KR20210144679A KR1020217028506A KR20217028506A KR20210144679A KR 20210144679 A KR20210144679 A KR 20210144679A KR 1020217028506 A KR1020217028506 A KR 1020217028506A KR 20217028506 A KR20217028506 A KR 20217028506A KR 20210144679 A KR20210144679 A KR 20210144679A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
tcr
antibody
population
cell
Prior art date
Application number
KR1020217028506A
Other languages
English (en)
Inventor
야진 니
홍시우 닝
자넷 엠 리
마크 더블유 레오나르드
Original Assignee
알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20210144679A publication Critical patent/KR20210144679A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46443—Growth factors
    • A61K39/464434—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2893—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

동종이계 CAR T 세포 치료를 받는 환자에서 GvHD 위험을 최소화하는 데 유리할 수 있는 강력한 TCR+ 세포 고갈 및 TCR- 세포의 집단의 제조를 위한 개선된 방법이 본원에 제공된다. 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된 세포 집단에 존재하는 TCR+ 세포의 임의의 잔류 수준을 유의미하게 감소시키기 위해 세포의 집단으로부터 TCR+ 세포를 고갈시키는 것의 효율을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 연관된 키트 및 세포 집단이 또한 제공된다.

Description

TCRαβ+ 세포 고갈 효율을 향상시키는 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 3월 21일에 출원된 미국 임시출원 제62/821,768호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)를 포함하는 것을 포함하여 조작된 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR(예를 들어, TCRαβ)을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법에 관한 것이다.
악성물 연관된 항원을 인식하도록 유전자 변형된 면역 세포의 입양 전달은 암을 치료하기 위한 새로운 접근법으로서의 장래성을 보여준다(예를 들어, 문헌[Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010)]; 문헌[Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)] 참조). 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다(예를 들어, 본원에 인용되어 포함된 문헌[Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993)] 및 문헌[Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)] 참조). CAR을 포함하는 면역 세포, 예를 들어 CAR-T 세포(CAR-T)는 암 세포와 같은 표적 세포를 인식하고 사멸하는 이의 능력을 보유하거나 향상시키면서 항원 특이성을 이들에게 부여하도록 조작된다. 그러나, 암 치료에서 조작된 동종이계 CAR-T 세포의 광범위한 사용에 있어서 이식편대숙주 질환(GvHD: graft versus host disease) 또는 숙주대이식편 질환(HvGD: host versus graft disease)을 발생시킬 가능성은 심각한 안전성 또는 유효성 방해를 나타낸다. 따라서, 특히 동종이계 치료에 대해 GvHD 및 HvGD의 위험을 감소시키는 효과적인 방법을 개발할 필요가 있다.
면역 세포의 집단으로부터의 TCR+(TCRαβ+) 세포 고갈을 위한 개선된 방법, TCR+ 세포에서 고갈된 면역 세포의 집단을 제조하기 위한 방법, 이를 위한 시약을 포함하는 키트, 고도로 순수한 TCR-(TCRαβ-) 세포의 집단 및 개시된 방법을 이용하여 제조된 세포의 집단을 이용하는 치료 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, GvHD의 위험을 감소시켜 동종이계 세포 치료에 유용한 세포의 제조에 사용될 수 있고, 키메라 항원 수용체를 이용하는 치료(예를 들어, 동종이계 CAR-T 세포 치료)에 사용될 수 있는, TCR+ 세포 고갈에 특히 적합한 방법이 본원에 기재된다.
일 양태에서, 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 제조하는 방법이 제공되고, 일 실시형태에서 상기 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계; 및 면역 세포의 집단으로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD3 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 면역 세포의 집단을 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및 면역 세포의 집단으로부터 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 상기 방법은 면역 세포의 집단을 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및 비표지된 면역 세포로부터 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법이 제공되고, 일 실시형태에서 상기 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계; 비표지된 면역 세포로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD3 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계; 및 비표지된 면역 세포를 수집하여서 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 제조하는 방법이 제공되고, 일 실시형태에서 상기 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및 면역 세포의 집단으로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
다른 추가의 양태에서, 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법이 제공되고, 일 실시형태에서 상기 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 비표지된 면역 세포로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계; 및 비표지된 면역 세포를 수집하여서 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 비오틴 접합되고, 상기 방법은 표지된 세포를 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제는 항비오틴 항체, 아비딘 및 스트렙타비딘으로부터 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막에 접합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막에 직접 접합된다.
분리를 이용하는 방법에서, 분리하는 단계는 자기 분리 또는 음향파 분리 중 하나를 이용하여 달성될 수 있다.
실시형태에서, 개시된 방법의 면역 세포는 동종이계 면역 세포이고, 면역 세포는 내인성 TCR, 내인성 CD52, 또는 내인성 TCR 및 내인성 CD52 둘 다의 발현을 감소시키거나 제거하도록 유전자 변형될 수 있고, 내인성 TCR 또는 내인성 CD52, 또는 내인성 TCR 및 내인성 CD52 발현 둘 다의 감소 또는 제거는 TALEN, CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc finger nuclease), MegaTAL, 메가뉴클레아제, Cpf1, 상동성 재조합 또는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN: single stranded oligodeoxynucleotide)를 사용하여 달성된다.
개시된 방법의 면역 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 1.0% 이하의 TCR+ 세포, 0.9% 이하의 TCR+ 세포, 0.8% 이하의 TCR+ 세포, 0.7% 이하의 TCR+ 세포, 0.6% 이하의 TCR+ 세포, 0.5% 이하의 TCR+ 세포, 0.4% 이하의 TCR+ 세포, 0.3% 이하의 TCR+ 세포, 0.2% 이하의 TCR+ 세포, 또는 0.1% 이하의 TCR+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 직후 0.01% 내지 0.001%의 TCR+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 후 배양 1일 내지 10일 후 0.1% 내지 0.01%의 TCR+ 세포를 포함하고; 일부 실시형태에서 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 후 배양 1일 후 0.1% 내지 1.0% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 후 배양 10일 후 0.1% 내지 1.0% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다.
개시된 방법의 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다.
다른 양태에서, 개시된 방법에 의해 제조된 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단이 제공된다.
일 양태에서, 적어도 99%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단이 제공되고, 적어도 99.9%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단이 제공되고, 적어도 99.99%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단이 제공되고, 적어도 99.999%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단이 제공된다. 실시형태에서, T 세포의 집단은 키메라 항원 수용체를 발현한다.
다른 양태에서, 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키기 위한 키트가 제공된다. 키트는 항-CD52 항체를 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키기 위한 키트가 제공된다. 개시된 키트에서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제와 접합되고; 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제는 항비오틴 항체, 스트렙타비딘 및 아비딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 실시형태에서, 작용제는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막에 접합될 수 있다.
개시된 키트에서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 지지체에 직접 접합되고, 지지체는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막 중 하나일 수 있다.
고형 암 또는 혈액 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 암을 치료하는 방법이 추가로 제공되고, 상기 방법은 개시된 방법을 이용하여 제조된 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단 또는 개시된 방법을 이용하여 제조된 조작된 T 세포의 집단의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법은 동종이계 치료에서 상당한 진전을 나타낸다. 따라서, 고형 암 또는 혈액 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 암을 치료하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 본원에 제공된 임의의 개시된 방법을 이용하여 제조된 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 상이한 유닛 작동 시나리오에 의한 동종이계 CAR T 제조 공정의 도식적 표시를 도시한다.
도 2a는 고갈 후 다양한 일자에 고갈된 세포 집단에서의 잔류 TCR+ 세포 빈도를 도시하고, 화살표는 고갈 후 0일과 비교하여 고갈 후 2일에서의 (항-TCR 항체만을 이용한) 대조군 방법과 비교된 (상이한 항체 조합을 이용한) 상이한 고갈 방법의 TCR+ %의 배수 변화를 나타낸다.
도 2b는 고갈된 세포 집단에서의 잔류 TCR+ 세포 빈도를 도시하고, 화살표는 대조군 방법과 비교할 때 상이한 고갈 방법 사이의 고갈 후 0일과 비교된 고갈 후 9일에서의 TCR+ %의 배수 변화를 나타낸다.
도 3a는 항-TCR 항체 염색에 의해 측정된 고갈 후 0일 및 1일에 상이한 항체를 사용한 TCR+ 세포 고갈 효율의 유세포분석법 도표를 도시한다.
도 3b는 숫자 막대 방식으로 고갈 후 0일 및 1일에 고갈된 세포 집단에서의 잔류 TCR+ 세포 빈도를 도시한다.
도 4는 고갈 후 0일 및 1일에 항-TCR 항체 및/또는 항-CD3 항체 단일 염색 또는 이중 염색에 의해 검출되는 고갈된 집단에서의 잔류 TCR+ 빈도 및 CD3+ 빈도를 나타내는 유세포분석법 도표를 도시한다.
도 5a는 동결 전 및 후 고갈 후 1일에 항-TCR 항체 및/또는 항-CD3 항체 단일 염색 또는 이중 염색에 의해 측정된 고갈된 세포 집단에서의 TCR+ 빈도, CD3+ 빈도, CD3+/TCR- 빈도 및 CD3/TCR+ 빈도의 유세포분석법 도표를 도시한다.
도 5b는 숫자 막대 방식으로 동결 전 및 후 고갈 후 1일에 항-TCR 항체 염색에 의해 측정된 고갈된 세포 집단에서의 TCR+ 세포 빈도를 도시한다.
도 5c는 숫자 막대 방식으로 동결 전 및 후 고갈 후 1일에 항-CD3 항체 염색에 의해 측정된 고갈된 세포 집단에서의 CD3+ 세포 빈도를 도시한다.
도 5d는 숫자 막대 방식으로 동결 전 및 후 고갈 후 1일에 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 이중 염색에 의해 측정된 고갈된 세포 집단에서의 CD3+/TCR- 세포 빈도를 도시한다.
도 5e는 숫자 막대 방식으로 동결 전 및 후 고갈 후 1일에 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 이중 염색에 의해 측정된 고갈된 세포 집단에서의 CD3+/TCR+ 세포 빈도를 도시한다.
도 6은 10일 고갈후 배양 동안 항-TCR 항체 염색을 사용한 TCR+ 빈도에 대한 유세포분석법 도표를 도시한다.
도 7은 10일 고갈후 배양 동안 항-CD3 항체 염색을 사용한 CD3+ 빈도에 대한 유세포분석법 도표를 도시한다.
도 8은 10일 고갈후 배양 동안 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 염색 둘 다를 사용한 이중 TCR+ 빈도 및 CD3+ 빈도에 대한 유세포분석법 도표를 도시한다. 도 9a는 숫자 막대 방식으로 고갈 후 배양 동안 항-TCR 항체 염색을 사용한 TCR+ 세포 빈도를 도시한다.
도 9b는 숫자 막대 방식으로 고갈 후 배양 동안 항-CD3 항체 염색을 사용한 CD3+ 세포 빈도를 도시한다.
도 9c는 숫자 막대 방식으로 고갈 후 배양 동안 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 염색 둘 다를 사용한 CD3+/TCR- 세포 빈도를 도시한다.
도 9d는 숫자 막대 방식으로 고갈 후 배양 동안 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 염색을 둘 다를 사용한 CD3+/TCR+ 세포 빈도를 도시한다.
도 10a는 10일 고갈후 배양 동안 생존가능 세포 밀도의 면에서 세포 성장 상태를 도시한다.
도 10b는 10일 고갈후 배양 동안 세포 생존능력의 면에서 세포 성장 상태를 도시한다.
도 10c는 10일 고갈후 배양 동안 세포 직경의 면에서 세포 성장 상태를 도시한다.
도 10d는 10일 고갈후 배양 동안 총 세포 증식 배수의 면에서 세포 성장 상태를 도시한다.
도 11a는 항-CD52 염색에 의해 측정된 고갈 후 0일 및 1일에 상이한 항체를 사용한 CD52 고갈 효율을 나타내는 유세포분석법 도표를 도시한다.
도 11b는 숫자 막대 방식으로 항-CD52 항체 염색에 의해 측정된 고갈 후 0일 및 1일에 고갈된 세포 집단에서의 잔류 CD52+ 세포 빈도를 도시한다.
도 12는 항-CD52 항체 염색에 의해 모니터링된 10일 고갈후 배양 동안 잔류 CD52+ 세포 빈도에 대한 유세포분석법 도표를 도시한다.
동종이계 CAR T 세포 치료를 받는 환자에서 GVHD 위험을 최소화할 수 있는 강력한 TCRα/β+ 세포 고갈에 대한 개선된 방법 및 개시된 방법을 이용하여 제조된 세포의 집단이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 본 개시내용은 TCR- 세포 집단에서 TCR+ 세포의 잔류 수준을 유의미하게 감소시키도록 TCR+ 세포 고갈 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본원에 사용되는 단수 용어(“a” 및 “an”)는 하나 이상을 의미하도록 사용된다. 예를 들어, “세포” 또는 “항체”의 언급은 “하나 이상의 세포” 또는 “하나 이상의 항체”를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 “TCR 고갈된”은, 본 개시내용에 제공된 방법을 이용하여 생성된 세포의 집단의 언급에 사용될 때, 공여자로부터 수집된 세포의 집단보다 내인성 TCRα/β 이종이합체를 발현하는 세포를 더 적게 포함하는 세포의 집단을 의미한다. 예를 들어, TCR 고갈된 세포(TCRα/β 고갈된 세포)의 집단은 내인성 TCRα/β 복합체를 발현하는 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 1% 미만을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 “TCR+” 및 “TCR”은, 본 개시내용에 제공된 방법을 이용하여 생성된 집단을 포함하는 세포 또는 세포의 집단의 언급에 사용될 때, CD3 복합체의 하나 이상의 성분이 세포 표면 상에 발현될 수 있거나 발현되지 않을 수 있지만 적어도 내인성 TCRα/β 이종이합체를 발현하는 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 “TCR-”은, 본 개시내용에 제공된 방법을 이용하여 생성된 집단을 포함하여 세포 또는 세포의 집단의 언급에 사용될 때, CD3 복합체의 하나 이상의 성분이 세포 표면 상에 발현될 수 있거나 발현되지 않을 수 있지만 적어도 TCRα/β 이종이합체가 부족한 세포를 지칭한다.
상호교환 가능하게 사용되는 본원에 사용된 용어 “항-TCR 항체” 및 “항-TCR”은 인간 TCRα 사슬 단독, 인간 TCRβ 사슬 단독 또는 인간 TCRα/β 이종이합체에 결합하고 이를 인식하는 항체를 지칭한다. 항-TCR 항체는 쥣과 항체, 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
상호교환 가능하게 사용되는 본원에 사용된 용어 “항-CD3 항체” 및 “항-CD3”은 인간 CD3γ 사슬, 인간 CD3δ 사슬, CD3ζ 사슬, CD3ε 사슬 또는 정상 인간 ε/ε/ζ/ζ/γ/δ CD3 복합체의 2개 이상의 성분을 포함하는 인간 CD3 복합체에 결합하고 이를 인식하는 항체를 지칭한다. 항-CD3 항체는 쥣과 항체, 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
용어 “환자” 및 “대상체”는 상호교환 가능하게 사용되고, 인간 및 비인간 동물 대상체뿐만 아니라 공식적으로 장애가 진단된 사람, 공식적으로 장애가 인정되지 않은 사람, 의학적 주의를 받은 사람, 질환을 발생시킬 위험에 있는 사람 등을 포함한다.
용어 “치료한다” 및 “치료”는 치료학적 치료, 예방학적 치료, 및 대상체가 장애 또는 다른 위험 인자를 발생시킬 위험을 감소시키는 적용을 포함한다. 치료는 완전한 장애 치유를 요하지 않고, 증상 또는 근본적인 위험 인자를 제거하는 실시형태를 포함한다. 용어 “예방한다”는 사건 가능성의 100% 제거를 요하지 않는다. 오히려, 이것은 화합물 또는 방법의 존재 하에 사건 발생 가능성이 감소한다는 것을 나타낸다.
조작된 TCR- 세포-기반 동종이계 CAR-T 산물은 차세대 CAR-T 치료제를 생성하기 위한 전략을 예시한다. 그러나, 이식편대숙주 질환(GvHD) 위험 및 숙주대이식편 질환(HvGD)과 같은 가능한 면역 반응은 동종이계 CAR-T 세포 치료에 대한 상당한 안전성 또는 유효성 우려 중 하나를 나타낸다. GvHD는 T 세포 αβ 수용체(TCRαβ)를 통해 HLA 불일치를 인식하고 환자의 조직을 공격할 가능성을 갖는 공여자 유래된 T 세포로부터 생긴다. 소수의 불일치가 여전히 면역 반응을 촉발할 수 있으므로, GVHD 및 HvGD는 HLA 일치된 공여자 환경에서도 심각하고 심지어 치명적일 수 있다.
TCR+ 세포를 제거(TCRαβ+ 세포를 고갈)하기 위한 현재의 방법, 예컨대 CliniMACS Prodigy® 및 TCR 시약 키트는 항-TCR 항체를 사용하여 TCR- 세포(TCRαβ- 세포)로부터 TCR+ 세포(TCRαβ+ 세포)를 분리하도록 항-TCR 항체 단독을 사용하고, 최종 약물 제품에서 99% 이상의 TCR- 세포 순도를 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Radestad et al, (2014) J Immunol Res, Vol 2014: 578741] 참조). 그러나, TCR- 최종 약물 제품에 존재하는 1% 미만의 TCR+ 세포 잔류 수준은 특히 고용량 수준에서 동종이계 CAR-T 세포 치료와 연관된 GvHD의 위험을 여전히 제시할 수 있다.
본 개시내용은 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 조작된 면역 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공하고, 개시된 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계; 및 조작된 면역 세포의 집단으로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD3 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법을 제공하고, 개시된 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계; 비표지된 면역 세포로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD3 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계; 및 비표지된 면역 세포를 수집하여서 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 항-TCR 항체와 CD3 이외의 임의의 다른 관심 표적(들)(예를 들어, MHC1, MHC2, CD52 또는 PD1)에 지향된 하나 이상의 항체로 표지된 면역 세포의 집단을 포함하도록 또한 적응될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포의 집단을 TCR 항체 및 CD3 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 TCRαβ+ 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 항-TCR 항체와 CD3 이외의 임의의 다른 관심 표적(들)(예를 들어, MHC1, MHC2, CD52 또는 PD1)에 지향된 하나 이상의 항체로 표지된 면역 세포의 집단을 포함하도록 또한 적응될 수 있다.
본 개시내용은 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 조작된 면역 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공하고, 개시된 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및 조작된 면역 세포의 집단으로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법을 제공하고, 개시된 방법은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 비표지된 면역 세포로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계; 및 비표지된 면역 세포를 수집하여서 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 CD52 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 TCRαβ+ 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 실시예에서 입증된 이들 방법의 유효성은 인간 세포에서 CD52 및 TCR이 물리적으로 서로 회합하지 않는다는 사실로 인해 예상치 못했었고, 어떤 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, CD52 및 TCR이 생물학적으로 직접 관련되지 않는다고 이해된다. 따라서, 본 개시내용의 다른 양태에서, 개시된 방법은 항-TCR 항체와 보통 TCR과 연관되지 않은 관심 표적에 지향된 다른 항체의 사용을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 TCRαβ+ 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 방법은 조작된 TCRαβ- 세포-기반 동종이계 CAR T 산물을 생성하기 위해 특히 사용되는 TCRαβ+ 세포 고갈에 대해 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체를 함께 적용한다. 본 개시내용 전에, 0.1% 내지 0.01%의 TCR+ 세포 잔류를 남기며 99.9% 내지 99.99%의 TCR- 세포 순도의 수준까지 조작된 T 세포(비변형된 T 세포 산물이 아님)에서의 TCR+ 세포의 임상 규모 고갈은 극도로 어렵고, 동종이계 치료의 개발에 대한 도전을 나타냈다. 본 개시내용은 이 문제에 대한 해결책을 제공한다.
이러한 종류의 낮은 수준 잔류 TCR+ 세포(예를 들어, 고갈 후 1일에 측정된 0.1% 내지 0.01%의 범위의 TCR+ 세포)를 달성하는 것은 조작된 동종이계 CAR T 산물(예를 들어, TCRα/β- CAR T 세포)의 상당한 진전을 나타내고, GvHD에 대한 가능성을 감소시켜 환자에게 향상된 임상 이익을 제공한다.
효과적이고 안전하고 순수한 조작된 동종이계 면역 세포(예를 들어, 암 항원에 표적화된 CAR을 발현하는 동종이계 CAR-T 세포)의 제조에 GvHD(및 HvGD)의 위험을 감소시킬 뿐만 아니라, 항종양 효력을 향상시키기 위한 효과적인 방법이 특히 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 동종이계 CAR-T 세포를 제조하는 방법 및 GvHD 및/또는 HvGD의 위험을 감소시키거나 이의 발생을 방지하는 산물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 동종이계 CAR-T 세포는 고형 종양 또는 혈액 암에 대해 향상된 항종양 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAR-T 세포는 내인성 TCR, CD52, MHC1, MHC2 또는 PD1 유전자 발현 중 하나 이상의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, CAR-T 세포는 TCR+, CD52+, MHC1+, MHC2+, 및/또는 PD1+인 세포가 고갈된 집단을 포함한다.
조작된 면역 세포의 집단으로부터 하나 이상의 내인성으로 발현된 TCR, CD3, CD52, MHC1, MHC2 또는 PD1(예를 들어, TCR+, CD3+, CD52+, MHC1+, MHC2+ 및/또는 PD1+인 세포)을 발현하는 세포의 집단을 고갈시키는 방법, 및 이에 대한 항체 시약을 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
T 세포 수용체 신호전달
T 세포 수용체 복합체(본원에 기재된 바와 같은 TCR)는, 가능하게는 T 세포의 활성화 및 항원에 대한 면역 반응으로 이어지는, MHC 분자에 의한 T 세포에 제시된 항원의 인식을 전담하는 T 세포의 표면 상의 항원 수용체 분자이다. 인간 T 세포 수용체는 각각 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 도메인을 갖는 2개의 막관통 이종이합체성 당단백질 사슬인 α 사슬과 β 사슬(또한 γδ 사슬의 작음 부분이 있음)로 이루어진 이종이합체이다. 이것은 TCR의 짧은 세포질 꼬리로 인해 펩타이드-MHC 복합체에 결합할 때 바로 신호전달할 수 없다. TCR은 대신에 TCR이 펩타이드-MHC 복합체에 결합할 때 세포내 신호를 전달하는 총제적으로 CD3이라 불리는 신호전달 분자의 그룹과 연관된다.
CD3은 1개의 γ 및 δ 분자와 2개의 ε 분자로 이루어지는데, 이들 분자는 모두 이의 세포외 도메인에서 면역글로불린 도메인에 약간의 제한된 서열 상동성을 갖는다. 이들 분자는 음으로 하전된 잔기를 갖는 작은 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 갖는다. 이 음으로 하전된 잔기는 막에서 TCR의 막관통 영역에서 양으로 하전된 잔기와 염 브리지를 형성한다. TCR-CD3 수용체 복합체는 이황화 결합에 의해 연결된 이합체를 형성하는 2개의 다른 비변이 단백질 ζ 및 η에 의해 완성된다. 따라서, TCR-CD3 복합체는 T 세포 표면에서 세포내 ζζ 동종이합체 또는 ζη 이종이합체를 갖는 CD3γε 및 CD3δε 이합체와 회합되어 αβ(또는 γδ) 이종이합체로서 발현된다.
이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 일부 조사자들은 TCR 발현이 파괴되면 CD3 표면 발현이 또한 무효화될 수 있다고 여긴다. 그러나, 본원에 기재된 것처럼, 잔류 CD3 표면 발현이 여전히 잔류 TCR+ 세포를 나타낼 수 있고, TCR+ 고갈 효율이 항-TCR 항체와 조합된 항-CD3 항체를 사용하여 개선될 수 있음이 예상치 못하게 발견되었다.
면역 세포를 분류하고 고갈시키는 방법
본원에 기재된 것처럼, 일 양태에서 본 개시내용은 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCRα/β 이합체를 발현하는 세포를 고갈시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계(표지는 순차적으로 또는 단일 조작으로 동시에 수행될 수 있음), 비표지된 세포로부터 항-TCR 및 항-CD3 표지된 세포를 분리하는 단계, 및 비표지된 세포를 수집하여서 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
초기에, 내인성 TCRα 유전자 또는 TCRβ 유전자에 결핍되도록 변형된 조작된 면역 세포는 TCR 고갈 시약에 노출된다. 일부 실시형태에서, TCR 고갈 시약은 면역 세포의 표면 상에 내인성으로 발현된 TCRα 폴리펩타이드, TCRβ 폴리펩타이드, 또는 TCRα/β 이종이합체를 표적화하는 항체를 포함한다. 본원에 기재된 것처럼, 항-CD3 항체(및/또는 선택적으로 항-CD52 항체) 항체와 조합하여 항-TCR 항체를 사용한 TCR 고갈은 예상치 못하게 항-TCR 항체 단독에 의해 수행된 고갈과 비교하여 TCR+ 고갈 효율을 증가시킨다.
항-TCR 항체, 항-CD3 항체 또는 항-CD52 항체(또는 TCR 고갈 조작에 관심 표적에 지향된 임의의 다른 항체)는 직접적으로 또는 자기 고갈 시약, 예컨대 자기 고갈 작용제, 예컨대 자기 마이크로비드(반드시는 아니지만 일반적으로 직경이 약 50 nm인 나노입자) 또는 임의의 다른 표면, 예컨대 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막과 간접적으로 접합된 이차 항체(예를 들어, 항비오틴 항체)를 사용한 추가의 표지 및/또는 분리를 수월하게 하도록 비오틴에 접합될 수 있다. 자기 마이크로비드를 사용할 때, 마이크로비드는 TCR- 세포로부터 TCR+ 세포의 분리를 수월하게 하고; TCR+ 세포는 자기 칼럼과 접촉할 때 칼럼에 보유될 수 있지만, 비표지된 TCR- 세포는 수집 백으로 통과한다. 음향파 입자는 음향파에 노출될 때 TCR- 세포로부터 TCR+의 분리를 수월하게 할 수 있다. 항비오틴 항체가 개시된 방법의 맥락에서 제공되지만, 스트렙타비딘, 아비딘, 및 비오틴을 인식하는 다른 단백질과 같은 다른 비오틴 결합 파트너가 본원에 제공된 방법의 모두에서 항비오틴 항체 대신에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 세포는 다른 세포 표면 마커에 대해 선택적으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포의 집단의 하위집단은 자체가 하나 이상의 단일클론 항체에 특이적인 하나 이상의 에피토프(예를 들어, 예시적인 미모토프 서열; 예를 들어, 본원에 인용되어 포함된 국제공개 WO2016/120216호 참조)를 포함하는 항원 특이적 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포를 포함할 수 있다. 상기 방법은 면역 세포의 집단을 에피토프에 특이적인 단일클론 항체와 접촉시키는 단계 및 항원 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포에 농후화된 세포의 집단을 얻도록 단일클론 항체에 결합하는 면역 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 에피토프에 특이적인 상기 단일클론 항체는 형광단에 선택적으로 접합된다. 이 실시형태에서, 단일클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 형광 활성화 세포 분류(FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting)에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 에피토프에 특이적인 상기 단일클론 항체는 자기 입자에 선택적으로 접합된다. 이 실시형태에서, 단일클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 자기 활성화 세포 분류(MACS: Magnetic Activated Cell Sorting)에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR을 발현하는 면역 세포를 분류하는 방법에 사용된 단일클론 항체는 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 무로모납-CD3, 토시투모맙, 아비식시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세르톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 겜투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라투주맙, 보델리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10 및/또는 우스테키누맙으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 mAb는 리툭시맙이다. 다른 실시형태에서, 상기 mAb는 QBEND-10이다.
유세포분석법은 세포의 집단 내의 특정 세포 유형을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 유세포분석법은 주로 광학 수단에 의해 세포의 성분 또는 구조적 특징을 정량화하기 위한 방법이다. 구조적 특징을 정량화하여 상이한 세포 유형을 구별할 수 있으므로, 혼합물에서 상이한 표현형의 세포를 계수하고 분류하도록 유세포분석법 및 세포 분류를 사용할 수 있다.
유세포분석법 분석은 1) 선택된 세포 유형을 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지하는 것, 및 2) 집단에서의 세포의 총 수에 대해 표지된 세포의 수를 결정하는 것의 2가지의 주요 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 세포 유형을 표지하는 방법은 표지된 항체를 특이적 세포 유형에 의해 발현된 마커에 결합시키는 것을 포함한다. 항체는 형광 화합물로 직접 표지되거나, 예를 들어 제1 항체를 인식하는 형광 표지된 제2 항체를 사용하여 간접적으로 표지될 수 있다.
개시된 방법의 일부 실시형태에서, TCR+ 세포를 분류하거나 분리하는 것, 선택적으로 TCR- 세포로부터 CAR을 발현하는 것은 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 이용하여 달성될 수 있다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)는 초상자성 나노입자 및 칼럼을 사용하여 표면 항원(CD 분자)에 따라 다양한 세포 집단을 분리하기 위한 방법이다. MACS는 매우 순수한 세포 집단을 얻도록 사용될 수 있다. 단일 세포 현탁액에서의 세포는 마이크로비드에 의해 자기로 표지될 수 있다. 샘플을 강자성 재료로 이루어진 칼럼에 적용하고, 이것을 세포에 파괴적이지 않은 코팅으로 덮어서, 세포의 신속하고 온화한 분리를 허용한다. 비표지된 세포는 칼럼을 통과하지만, 자기로 표지된 세포는 칼럼 내에 보유된다. 비표지된 세포 분획으로 관통물(flow-through)을 수집할 수 있다. 세척 단계 후, 칼럼을 분리기로부터 제거하고, 자기로 표지된 세포는 칼럼으로부터 용리된다.
T 세포와 같은 특이적 세포 집단의 정제에 대한 상세한 프로토콜은 Basu S 등의 문헌(2010)에서 발견될 수 있다. (문헌[Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS), J. Vis. Exp. (41): 1546]).
개시된 방법의 일부 실시형태에서, TCR+ 세포를 분류하거나 분리하는 것, 선택적으로 TCR- 세포로부터 CAR을 발현하는 것은 자기-기반 분리 방법 대신에 음향파 분리를 이용하여 달성될 수 있다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 혼합물의 성분을 분리하기 위해 음향파 분리가 3차원 정상파에 의존한다고 이해된다. 개시된 방법의 맥락에서, 항-TCR 항체, 항-CD52 항체 또는 항-CD3 항체와 같은 항체는 음향파 입자와 같은 표면에 접합될 수 있다. 음향파 입자는 비드일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 항-TCR 항체, 항-CD52 항체 또는 항-CD3 항체 중 하나 이상을 보유하는 음향파 입자에 노출되어, 음향파 입자를 관심 표적을 발현하는 임의의 세포와 회합시킨다. 이후, 세포를 음향 챔버에 넣고 음향파에 노출시킨다. 비드 연관된 세포 및 항체-비드 입자로 표지되지 않은 세포의 상이한 특성을 고려하여, 음향파는 수집될 수 있는 표지된 세포와 표지되지 않은 세포를 분리하지만, 표지된 세포(예를 들어, TCR+ 또는 CD52+ 세포)는 표지된 세포로부터 우회될 수 있다.
면역 세포
본원에 기재된 TCR+ 세포 고갈 방법에 적합한 세포는 면역 세포를 포함한다.
(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 세포(예를 들어, 면역 세포)를 대상체로부터 얻을 수 있다. 말초혈 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액(pleural effusion), 비장 조직 및 종양을 포함하여 많은 비제한적인 대상체 기반 공급원으로부터 세포를 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 당업자에게 입수 가능하고 공지된 임의의 수의 T 세포주를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 건강한 공여자로부터 유래되거나 암을 진단받은 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 상이한 표현형 특징을 제시하는 혼합된 세포 집단의 부분일 수 있다.
실시형태에서, 조작된 면역 세포를 궁극적으로 받는 대상체로부터 면역 세포를 얻는다(즉, 자가 치료). 실시형태에서, 조작된 면역 세포를 받는 대상체로부터 상이한 개체인 공여자로부터 면역 세포를 얻는다(즉, 동종이계 치료).
성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 세포를 얻을 수 있다. 성분채집술 생성물은 통상적으로 T 세포를 포함하는 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 소정의 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하도록 세척되고, 후속하는 가공을 위해 적절한 완충액 또는 배지에 위치할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 조작된 면역 세포(예컨대, CAR 또는 TCR)를 생성하도록 유전자 변형을 위해 PBMC를 직접 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, PBMC를 단리시킨 후, T 세포만을 포함하는 집단을 생성하도록 T 림프구는 선택적으로 추가로 단리될 수 있고, 세포독성 림프구 및 헬퍼 T 림프구 둘 다는 유전자 변형 및/또는 증식 전에 또는 후에 미경험 세포, 기억 세포 및 효과기 T 세포 하위집단으로 추가로 분류될 수 있다.
소정의 실시형태에서, PERCOLL® 구배를 통한 원심분리를 이용하여 적혈구를 용리시키고 단핵구를 고갈시켜 PBMC로부터 T 세포를 단리할 수 있다. 당해 분야에 공지된 양성 선택 또는 음성 선택 기법에 의해 CD28+, CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD62L+, CD5+, CD45RA―, CCR7+, CD95+, IL2Rβ+ 및 CD45RO+ T 세포와 같은 특이적 T 세포 하위집단을 더 단리할 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농후화는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지향된 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포 상의 세포 표면 마커에 지향된 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석법을 통한 세포 분류 및/또는 세포 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+세포를 농후화하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리하기 위해 유세포분석법 및 세포 분류를 또한 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포의 집단은 본원에 제공된 고갈 방법을 적용하기 전에 또는 적용한 후에 CD8+ 세포에 농후화된다.
일부 실시형태에서, T 세포의 집단은 본원에 제공된 고갈 방법을 적용하기 전에 또는 적용한 후에 CD4+ 세포에 농후화된다.
일부 실시형태에서, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 집단은 이들 유형의 세포의 각각과 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 미경험 세포, 줄기 세포 기억, 중심 기억, 효과기 기억 세포 및 효과기 세포로 추가로 분류될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미경험 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RA+, CD95-, IL2Rβ-, CCR7+ 및 CD62L+를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기 세포 기억 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RA+, CD95+, IL2Rβ+, CCR7+ 및 CD62L+를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RO+, CD95+, IL2Rβ+, CCR7+ 및 CD62L+를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효과기 기억 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RO+, CD95+, IL2Rβ+, CCR7- 및 CD62L-를 포함한다. 일부 실시형태에서, T 효과기 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RA+, CD95+, IL2Rβ+, CCR7- 및 CD62L-를 포함한다. 따라서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인함으로써 미경험 세포, 줄기 세포 기억, 중심 기억, 효과기 기억 세포 및 T 효과기 세포로 분류될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 개시된 방법은 이들 T 세포 하위유형 중 하나 이상의 고갈을 향상시키도록 이용될 수 있다.
PBMC가 NK 세포 또는 NK T 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 추가로 포함할 수 있다고 이해될 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체의 암호화 서열을 보유하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NK T 세포의 집단으로 도입될 수 있다. 인간 대상체에서 사용하기 위한 저장 및/또는 제조를 위해 CAR을 발현하는 T 세포의 냉동보존에 표준 절차를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 송아지 태아 혈청 및 소 태아 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 T 세포의 시험관내 형질도입, 배양 및/또는 증식을 수행한다. 다양한 실시형태에서, 냉동보존 매질은 예를 들어 CryoStor® CS2, CS5 또는 CS10, 또는 DMSO를 포함하는 다른 매질, 또는 DMSO를 포함하지 않는 매질을 포함할 수 있다.
조작된 면역 세포
본원에 기재된 TCR+ 세포 고갈 방법은 조작된 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 포함하는 치료제를 포함하는 암을 치료하기 위한 면역 세포 치료제를 제조하는 데 특히 유용할 수 있다.
조작된 면역 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있고, 개시된 방법은 자가 치료 또는 동종이계 치료에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포(또는 이의 집단)는 T 세포(예를 들어, 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, 수지상 세포, 살해 수지상 세포, 비만 세포 또는 대식세포이거나 이들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 또한 γ/δ T 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 예를 들어 제한 없이 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비인간 배아 줄기 세포, 보다 특히 비인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도 만능성 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell), 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 CD34+ 또는 CD34-일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 말초혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 바이러스(렌티바이러스 또는 감마 레트로바이러스) 형질도입, 전기천공, 초음파처리, 유전자총(예를 들어, Gene Gun), 지질 형질주입, 중합체 형질주입, 나노입자 또는 폴리플렉스로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 핵산 벡터에 의해 형질주입되거나 형질도입된다. 일부 실시형태에서, 세포는 비-T 세포로부터 재프로그래밍된 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 T 세포로부터 재프로그래밍된 T 세포이다.
결합제(항체 및 이의 단편을 포함)
실시형태에서, 개시된 방법은 항체 또는 항원 결합제(예를 들어, 항원 결합 도메인을 포함하거나 항체 또는 이의 단편을 포함)의 사용을 포함한다. 하기 기술된 것처럼, 다양한 실시형태에서 조작된 면역 세포는 또한 결합제를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 “항체”는 특정 표적 항원에 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정준 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 당해 분야에 공지된 것처럼, 자연에서 생성된 바와 같은 온전한 항체는 흔히 “Y 형상” 구조라 칭하는 서로 회합하는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드(각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드(각각 약 25 kD)로 이루어진 대략 150 kD의 사합체성 물질이다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개의 아미노산 길이) - 아미노 말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 선단에 위치함), 이어서 CHI, CH2 및 카복시 말단 CH3(Y의 줄기의 기부에 위치함)인 3개의 불변 도메인으로 이루어진다. “스위치”로 공지된 짧은 영역은 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지에 연결한다. 이 힌지 영역에서의 2개의 이황화 결합은 온전한 항체에서 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 서로에 연결한다. 각각의 경쇄는 아미노 말단 가변(VL) 도메인, 이어서 카복시 말단 불변(CL) 도메인인 2개의 도메인으로 이루어진다. 당업자는 항체 구조 및 서열 요소에 매우 인숙하고, 제공된 서열에서 “가변” 영역 및 “불변” 영역을 인식하고, 동일한 항체 사슬 서열의 상이한 제시가 예를 들어 동일한 항체 사슬 서열의 상이한 제시에 대해 하나의 잔기 또는 적은 잔기가 이동된 위치에서 경계를 나타낼 수 있도록 이러한 도메인 사이에 이러한 “경계”의 정의에서 약간의 유연성이 있을 수 있다는 것을 이해한다.
온전한 항체 사합체는 2개의 중쇄-경쇄 이합체로 이루어지는데, 여기서 중쇄 및 경쇄는 단일 이황화 결합에 의해 서로에 연결되고; 2개의 다른 이황화 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로에 연결하여서, 이합체는 서로에 연결되고 사합체가 형성된다. 자연에서 생성된 항체는 또한 통상적으로 CH2 도메인 상에서 글리코실화된다. 자연 항체에서의 각각의 도메인은 압축된 역평형 베타 배럴에서 서로에 패킹된 2개의 베타 시트(예를 들어, 3-가닥, 4-가닥 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 “면역글로불린 폴드”를 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 “보체 결정 영역”(CDR1, CDR2 및 CDR3)으로 공지된 3개의 초가변 루프 및 다소 비변이인 4개의 “프레임워크” 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 함유한다. FR 영역은 자연 항체가 접힐 때 도메인에 대한 구조 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 CDR 루프 영역은 Y 구조의 선단에 위치한 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성하도록 3차원 공간에 함께 있다. 자연 발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고, 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함하여 효과기 세포 상의 수용체에 결합한다. 당해 분야에 공지된 것처럼, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 다른 결합 속성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 제조되고/되거나 사용된 항체는 이러한 변형된 글리코실화 또는 조작된 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 포함하여 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 목적을 위해, 소정의 실시형태에서, 자연 항체에서 발견되는 것과 같은 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체는, 이러한 폴리펩타이드가 자연 발생하든(예를 들어, 유기체가 항원에 반응하여 생성되든), 또는 재조합 조작, 화학 합성, 또는 다른 인공 시스템 또는 방법론에 의해 제조되든, “항체”로 칭해지고/칭해지거나 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 다중클론이고; 일부 실시형태에서, 항체는 단일클론이다. 일부 실시형태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체에 특징적인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체 서열 요소는 당해 분야에 공지된 것처럼 인간화되거나 영장류화되거나 키메라이거나 기타 등등이다.
게다가, 본원에 사용되는 용어 “항체”는 대안적인 제시로 항체 구조 특징 및 기능 특징을 이용하기 위한 임의의 분야 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 사용되는 항체는 비제한적인 예로서 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체(예를 들어, Zybodies® 등); 항체 단편, 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이의 세트; 단쇄 가변 단편(scFV); 폴리펩타이드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체(예를 들어, 상어 단일 도메인 항체, 예컨대 IgNAR 또는 이의 단편); 낙타과 항체(본원에서 나노바디 또는 VHH라고도 칭함); 상어 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals(SMIPs™); 단쇄 또는 Tandem 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobodies® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되는 형식으로 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 자연에서 생성되었으면 가지는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 공유 변형, 예를 들어 글리칸, 페이로드(예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료학적 모이어티, 촉매 모이어티 등), 또는 다른 펜던트 기(예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등)의 부착을 함유할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 “항체 작용제”는 일반적으로 특정 항원에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 작용제는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체에 특징적인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 당해 분야에 공지된 것처럼 인간화, 영장류화, 키메라 등인 항체 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 용어 “항체 작용제”는 대안적인 제시로 항체 구조 특징 및 기능 특징을 이용하기 위한 분야 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식 중 하나 이상을 지칭하도록 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 항체 작용제는 비제한적인 예로서 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체(예를 들어, Zybodies® 등); 항체 단편, 예컨대 Fab 단편, Fab’ 단편, F(ab’)2 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이의 세트; 단쇄 Fv; 폴리펩타이드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체(예를 들어, 상어 단일 도메인 항체, 예컨대 IgNAR 또는 이의 단편); 낙타과 항체; 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals(SMIPs™); 단쇄 또는 Tandem 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobodies® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되는 형식으로 있다.
본 개시내용의 방법을 수행하는 데 사용되는 항체 또는 항체 작용제는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 단일 사슬이다. 소정의 실시형태에서, 항원 결합 분자는 scFv, Fab, Fab’, Fv, F(ab’)2, dAb, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항체 및 항체 작용제는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체 부분을 포함한다. 항체 단편은 Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, 디아바디, 선형 항체, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 및 scFv 단편, 및 다른 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 항체는 또한 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 dAb(도메인 항체), 단쇄, Fab, Fa, F(ab’)2 단편 및 scFv를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 항체는 전체 항체, 또는 면역글로불린, 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 비제한적인 예로서 온전한 항체의 단백분해 소화, 및 당해 분야에 공지된 것처럼 재조합 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 파지)에 의한 생성을 포함하는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항체 작용제는 키메라 항체일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 원천 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 원천 또는 종으로부터 유래되는 항체일 수 있다. 일 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 원숭이와 같은 비인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 종류 또는 하위종류가 모 항체의 것에서 변하는 “클래스 스위치된” 항체일 수 있다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 항체는 인간화 항체일 수 있다(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제5,821,337호, 미국 특허 제7,527,791호, 미국 특허 제6,982,321호 및 미국 특허 제7,087,409호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)]; 문헌[Padlan, Mol. Immunol, 28:489-498 (1991)]; 문헌[Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005)]; 문헌[Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005)]; 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] 참조). 인간화된 항체는 비인간 초가변 영역으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체이다. 소정의 실시형태에서, 인간화된 항체는 적어도 1개 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 초가변 영역(예를 들어, CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 항체의 것에 상응하고, 프레임워크 영역(FR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항체 작용제는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)]; 및 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol, 20:450-459 (2008)] 참조). 인간 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비인간 원천으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것일 수 있다. 인간 항체의 이 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 구체적으로 배제한다. 인간 항체는 당해 분야에 잘 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본원에 기재된 것처럼, 개시된 방법은 면역 세포의 집단으로부터 TCR+ 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 면역 세포는 CAR+ 세포이고 동종이계 치료와 같은 치료학적 분야에 사용하기 위해 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 본원에 사용된 것처럼, 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원(예를 들어, 암 세포 상의 표적 항원; 암 항원)을 특이적으로 인식하는 단백질을 포함한다. CAR은 표적 항원에 결합될 때 그 항원을 보유하는 세포(예를 들어, 암 세포)를 공격하고 파괴하도록 면역 세포를 활성화할 수 있다. CAR은 또한 효력을 증가시키기 위해 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 공동자극 도메인, 예컨대 4-1BB, CD28 또는 OX 40, 및/또는 신호전달 도메인, 예컨대 CD3제타를 도입할 수 있다. 문헌[Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626)]; 문헌[Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797, Song et al., Blood 119:696-706 (2012)]; 문헌[Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3:95 (2011)]; 문헌[Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)] 및 문헌[Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)]; 미국 특허 제7,741,465호 및 미국 특허 제6,319,494호를 참조한다.
본원에 기재된 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 세포외 도메인을 막관통 도메인에 연결하는 힌지 도메인 및 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 세포외 도메인은 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR은 안전성 스위치 및/또는 단일클론 항체 특이적 에피토프를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 선택적 CAR은 리더 펩타이드 또는 신호 펩타이드를 포함한다.
CAR 항원 결합 도메인
상기 기술된 것처럼, 본원에 기재된 CAR은 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에 사용되는 “항원 결합 도메인”은 규정된 표적 항원에 결합하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 과증식성 질환(예를 들어, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 또는 다른 고형 암 또는 혈액 암)에 관여된 세포 상의 항원에 결합한다. 개시된 방법은 또한 CAR+ 세포인 TCR+ 세포를 고갈시켜 CAR+/TCR- 세포의 집단을 제공하도록 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 가변 중쇄, 가변 경쇄, 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 경쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.
항원 결합 도메인이 제2 표적에 결합하는 것보다 하나의 표적에 더 단단히 결합할 때 이것을 “선택적”이라 말한다.
CAR의 항원 결합 도메인은 암 항원을 선택적으로 표적화한다. 일부 실시형태에서, 암 항원은 EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 또는 CD34로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CAR은 EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 또는 CD34를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 암 항원은 탄산무수화효소 IX(CAIX), 종양태아성 항원(CEA), CDS, CD7, CDIO, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40: epithelial glycoprotein-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM: epithelial cell adhesion molecule), 수용체 티로신-단백질 키나제 erb- B2,3,4, 엽산 결합 단백질(FBP: folate-binding protein), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR: fetal acetylcholine receptor), 엽산 수용체, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER-2: human Epidermal Growth Factor Receptor 2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase), 인터류킨-13 수용체 아단위 알파-2(IL-13Ra2), κ-경쇄, 키나제 인서트 도메인 수용체(KDR: kinase insert domain receptor), 루이스(CA19.9), LI 세포 부착 분자(LICAM: LI cell adhesion molecule), 흑색종 항원 패밀리 A, 1(MAGE-AI), 뮤신 16(Muc-16), 뮤신 1(Muc-1), 메소텔린(MSLN), NKG2D 리간드, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA: prostate stem cell antigen), 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen), 종양 연관된 당단백질 72(TAG-72: tumor- associated glycoprotein 72), 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF- R2: vascular endothelial growth factor R2) 및 윌름스 종양 단백질(WT-1: Wilms tumor protein)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항원 결합 도메인 중 어느 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CAR을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 이를 제조하는 방법이 본원에 또한 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 실행하여 생성된 세포의 집단을 형성할 수 있는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)는 예를 들어 RQR8과 같은 안전성 스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 본원에 그 전체가 인용되어 포함된 국제공개 WO2013153391A를 참조한다. 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)에서, 안정성 스위치 폴리펩타이드는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 표면에서 발현될 수 있다.
CAR 힌지 도메인
본 개시내용의 CAR의 세포외 도메인은 “힌지” 도메인(또는 힌지 영역)을 포함할 수 있다. 상기 용어는 일반적으로 CAR에서의 막관통 도메인을 CAR에서의 세포외 항원 결합 도메인에 연결하도록 작용을 하는 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 특히, 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 도메인에 대해 더 큰 가요성 및 접근성을 제공하는 데 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 300개 이하의 아미노산-일부 실시형태에서 10개 내지 100개의 아미노산 또는 일부 실시형태에서 25개 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 자연 발생 분자의 전부 또는 일부, 예컨대 CD8, CD4, CD28, 4-1BB 또는 IgG의 세포외 영역(특히, IgG의 힌지 영역; 힌지 영역이 다수의 면역글로불린 패밀리, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 이의 단편의 일부 또는 전부를 함유할 수 있는 것으로 이해될 것임)의 전부 또는 일부, 또는 항체 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 힌지 도메인은 자연 발생 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 전체적으로 합성 힌지 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 힌지 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)의 부분이다. 다른 특정 실시형태에서, 상기 힌지 도메인 및 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬의 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR의 힌지 도메인은 CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 또는 FcγRIIIα의 하위서열, 특히 임의의 CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 또는 FcγRIIIα의 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 인간 CD8α 힌지, 인간 IgG1 힌지, 인간 IgG4, 인간 PD-1 또는 인간 FcγRIIIα 힌지를 포함한다. 일부 실시형태에서 본원에 개시된 CAR은 scFv, CD8α 인간 힌지 도메인 및 막관통 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 신호전달 도메인을 포함한다.
CAR 막관통 도메인
본원에 제공된 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인으로 설계된다. 이것은 유사하게 CAR의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 동일한 표면 막 단백질 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 짧은 링커는 CAR의 임의의 또는 일부 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다.
막관통 영역은 합성(비자연 발생)일 수 있거나, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사-1(PD-1), 유도성 T 세포 공동자극제(ICOS: inducible T cell costimulator), 림프구 작용 연관된 항원-1(LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 1 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다(이들을 포함하거나 이들의 단편에 상응할 수 있다).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에서의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에서의 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다.
CAR 세포내 도메인
CAR의 세포내 (세포질) 도메인은 CAR을 포함하는 면역 세포의 적어도 하나의 정상 효과기 기능의 활성화를 제공할 수 있다. T 세포의 효과기 기능은 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해성(cytolytic) 활성 또는 헬퍼 활성을 지칭할 수 있다.
적합한(예를 들어, 활성화) 세포내 도메인이 CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사-1(PD-1), 유도성 T 세포 공동자극제(ICOS), 림프구 작용 연관된 항원-1(LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 1 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 유래된(이들을 포함하거나 이들의 전부 또는 단편에 상응하는) 신호전달 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 것으로 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 도메인(들)과 조합되어 41BB/CD137 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 41BB/CD137의 완전한 자연적 아미노산 서열은 NCBI 기준 서열: NP_001552.2에 기재되어 있다. 완전한 자연적 41BB/CD137 핵산 서열은 NCBI 기준 서열: NM_001561.5에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인/세포질 도메인은 CD28 도메인을 홀로 또는 본 개시내용의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. CD28의 완전한 자연적 아미노산 서열은 NCBI 기준 서열: NP_006130.1에 기재되어 있다. 완전한 자연적 CD28 핵산 서열은 NCBI 기준 서열: NM_006139.1에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 도메인/세포질 도메인은 CD3 제타 도메인의 전부 또는 단편을 홀로 또는 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 41BB(진뱅크: AAA53133.) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 분자의 부분을 포함한다.
CAR을 포함하는 조작된 면역 세포
내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 CAR(예를 들어, CAR-T 세포 또는 CAR+ 세포)을 발현하는 조작된 면역 세포 및 조작된 면역 세포의 집단이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CAR T 세포를 포함하고, 각각의 CAR T 세포는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고, 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 CAR T 세포의 집단을 포함하고, 각각의 CAR T 세포는 2개 이상의 상이한 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고, 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CAR의 집단을 포함하고, 각각의 CAR T 세포는 동일한 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고, 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된다.
조작된 면역 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포 또는 조작된 면역 세포의 집단은 T 세포(예를 들어, 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL)), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, 수지상 세포, 살해 수지상 세포, 비만 세포 또는 B 세포이고, CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조합을 포함하는 집단으로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 방법을 이용하여 생성된 조작된 면역 세포 또는 조작된 면역 세포의 집단은 예를 들어 제한 없이 줄기 세포로부터 유래할 수 있다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비인간 배아 줄기 세포, 보다 특히 비인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도 만능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 방법을 이용하여 생성된 조작된 면역 세포 또는 면역 세포의 집단은 말초혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 제대혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 전기천공, 초음파처리, 유전자총(예를 들어, Gene Gun), 지질 형질주입, 중합체 형질주입, 나노입자, 바이러스 형질주입(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, AAV) 또는 폴리플렉스로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 핵산 벡터에 의해 형질주입되거나 형질도입된다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 초과의 줄기 세포 기억 세포 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 100%, 약 15% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 50%, 약 75% 내지 약 100%, 또는 약 50% 내지 약 75%의 줄기 세포 기억 세포 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 초과의 줄기 세포 기억 세포 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 60%, 또는 약 20% 내지 약 70%의 줄기 세포 기억 세포 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 TCM 세포 및/또는 TSCM 세포에 농후화되어 조작된 면역 세포는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%의 조합된 TCM 세포와 TSCM 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 TCM 세포 및/또는 TSCM 세포에 농후화되어 조작된 면역 세포는 적어도 약 70%의 조합된 TCM 세포와 TSCM 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 TCM 세포 및/또는 TSCM 세포에 농후화되어 조작된 면역 세포는 적어도 약 75%의 조합된 TCM 세포와 TSCM 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 TCM 세포 및/또는 TSCM 세포에 농후화되어 조작된 면역 세포는 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60%의 TSCM 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 CAR을 이의 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 TCM 세포 및/또는 TSCM 세포에 농후화되어 조작된 면역 세포는 적어도 약 30%, 35%, 40% 또는 45%의 TSCM 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 염증성 T 림프구이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 세포독성 T 림프구이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 조절 T 림프구이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 헬퍼 T 림프구이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조작된 면역 세포는 하나 이상의 파괴된 유전자 또는 불활성화된 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원(예를 들어, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3 또는 CD34, CD70)에 대한 유전자는 유도된 CAR 활성화를 피하도록 동일한 항원을 표적화하는 CAR(예를 들어, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3 또는 CD34, CD70 CAR)을 도입하도록 넉아웃될 수 있다. 본원에 기재된 것처럼, 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조작된 면역 세포는 MHC1(β2M), MHC2(CIITA), EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, 또는 CD34, CD70, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 파괴된 유전자 또는 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나 CAR 또는 다중 사슬 CAR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 다중 사슬 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 CD52와 TCRα, CDR52와 TCRβ, PD-1과 TCRα, PD-1과 TCRβ, MHC-1과 TCRα, MHC-1과 TCRβ, MHC2와 TCRα, MHC2와 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 파괴된 유전자 또는 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나 CAR 또는 다중 사슬 CAR을 발현한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 선택적 DNA 절단에 의해 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하여 하나 이상의 유전자를 파괴시키거나 불활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), MegaTAL 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제 또는 TALEN®), 또는 CRISPR(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 엔도뉴클레아제일 수 있다.
일부 실시형태에서, TCR+ 세포 또는 이의 집단은 내인성 TCRα 유전자 및/또는 TCRβ 유전자(들)를 파괴하거나 불활성화시켜 세포에서 비기능적이 된다. 본 개시내용의 고갈 방법은 TRCα 유전자의 불활성화 후에 세포의 집단으로부터 임의의 남은 TCR+ T 세포를 제거하기에 특히 유용하다. 본원에 개시된 방법을 이용하여 생성된 조작된 면역 세포는 숙주대이식편(HvG) 거부 및 이식편대숙주질환(GvHD)을 예방하거나 감소시켜 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있고; 따라서 본 개시내용의 범위 내에 숙주대이식편(HvG) 거부 및 이식편대숙주질환(GvHD)을 예방하거나 감소시켜 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 있고, 상기 방법은 파괴된 또는 불활성화된 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자를 포함하는 조작된 면역 세포의 유효량을 상기 환자에게 투여하여 상기 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 내인성 TCR 발현이 부족하거나 감소된 조작된 면역 세포의 집단의 순도를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 1.0% 미만의 TCR+ 세포, 0.9% 미만의 TCR+ 세포, 0.8% 미만의 TCR+ 세포, 0.7% 미만의 TCR+ 세포, 0.6% 미만의 TCR+ 세포, 0.5% 미만의 TCR+ 세포, 0.4% 미만의 TCR+ 세포, 0.3% 미만의 TCR+ 세포, 0.2% 미만의 TCR+ 세포, 또는 0.1% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 이러한 집단은 개시된 방법의 산물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 0.1% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 0.09% 미만의 TCR+ 세포, 0.08% 미만의 TCR+ 세포, 0.07% 미만의 TCR+ 세포, 0.06% 미만의 TCR+ 세포, 0.05% 미만의 TCR+ 세포, 0.04% 미만의 TCR+ 세포, 0.03% 미만의 TCR+ 세포, 0.02% 미만의 TCR+ 세포, 0.01% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 이러한 집단은 개시된 방법의 산물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 약 0.01% 내지 0.001%의 TCR+ 세포를 포함한다. 이러한 집단은 개시된 방법의 산물일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공하고, 또한 하나 이상의 내인성 유전자의 발현의 감소 또는 제거를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 플라스미드 벡터를 통해 전이유전자로서 면역 세포로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 예를 들어 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선별을 제공하는 선별 마커를 또한 함유할 수 있다.
TCR- 조작된 면역 세포 및 TCR- 조작된 면역 세포(CAR T 세포를 포함)의 집단의 제조
면역 세포(CAR+ 세포와 같은 조작된 면역 세포를 포함)의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 것처럼, 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계, 비표지된 세포로부터 항-TCR 및 항-CD3 표지된 세포를 분리하는 단계 및 비표지된 세포를 수집하는 단계는 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단을 수득하는 것을 수월하게 한다. 다양한 실시형태에서, 분리하는 단계는 일반적으로 자기 비드, 음향파 입자, 막(이들 모두는 표지된 세포에 의해 인식된 모이어티에 접합될 수 있음), FACS 및 다른 공지된 분리 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 생성된 세포는 또한 본 개시내용의 양태를 형성한다.
면역 세포(CAR+ 세포와 같은 조작된 면역 세포를 포함)의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 것처럼, 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계, 비표지된 세포로부터 항-TCR 및 항-CD52 표지된 세포를 분리하는 단계 및 비표지된 세포를 수집하는 단계는 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단을 수득하는 것을 수월하게 한다. 다양한 실시형태에서, 분리하는 단계는 일반적으로 자기 비드, 음향파 입자, 막(이들 모두는 표지된 세포에 의해 인식된 모이어티에 접합될 수 있음), FACS 및 다른 공지된 분리 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 생성된 세포는 또한 본 개시내용의 양태를 형성한다.
면역 세포(CAR+ 세포와 같은 조작된 면역 세포를 포함)의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법이 본원에 또한 제공된다. 본원에 기재된 것처럼, 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계, 비표지된 세포로부터 항-TCR, 항-CD3 표지된 세포 및 항-CD52 표지된 세포를 분리하는 단계 및 비표지된 세포를 수집하는 단계는 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단을 수득하는 것을 수월하게 한다. 다양한 실시형태에서, 분리하는 단계는 일반적으로 자기 비드, 음향파 입자, 막(이들 모두는 표지된 세포에 의해 인식된 모이어티에 접합될 수 있음), FACS 및 다른 공지된 분리 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 생성된 세포는 또한 본 개시내용의 양태를 형성한다.
본원에 기재된 조작된 면역 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 세포를 대상체로부터 얻을 수 있다. CAR을 발현하는 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 동종이계 과정 또는 자가 과정으로부터 유래될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 내인성 TCR이 고갈될 수 있다.
단리된 면역 세포의 유전자 변형
본원에 기재된 것처럼, T 세포와 같은 면역 세포는 공지된 방법을 이용하여 본원에 제공된 방법의 수행 전에 유전자 변형될 수 있거나, 면역 세포는 유전자 변형되기 전에 시험관내 활성화되고 증식될 수 있다(또는 iPSC 또는 전구 세포의 경우에 분화될 수 있다). 일부 실시형태에서, 면역 세포는 내인성 TCR(TRAC), MHC1(β2M), MHC2, PD1, 및/또는 CD52의 발현을 감소시키거나 제거하도록 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 내인성 단백질의 발현은 감소되거나 제거될 수 있다. 예를 들어, TRAC 및 CD52의 발현은 감소하거나 제거될 수 있다. 다른 예에서, 형질도입된 CAR에 의해 표적화된 단백질 및 TRAC의 발현은 감소하거나 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 내인성 단백질(예를 들어, TCRα, MHC1, MHC2, PD1, CD52)의 발현을 감소시키거나 제거하도록 유전자 편집 기술(예를 들어, CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN®, MegaTAL, 메가뉴클레아제)을 이용하여 유전자 변형된다. 다른 실시형태에서, T 세포와 같은 면역 세포는 본원에 기재된 키메라 항원 수용체로 유전자 조작되고(예를 들어, CAR을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나 비바이러스 수단을 사용하여 형질도입되고), 이후 시험관내 활성화되고/되거나 증식된다.
본 개시내용의 작제물 및 조작된 면역 세포를 제조하기 위한 소정의 방법은 PCT 출원 국제공개 WO2015/120096호(PCT/US15/14520)에 기재되어 있고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 CAR을 발현하는 유전자 조작된 세포를 저장하는 방법을 제공한다. 이것은 해동 시 세포가 생존가능하게 있도록 면역 세포를 냉동보존하는 것을 포함한다. 악성물로 고통받는 환자의 미래의 치료를 위해 이러한 세포의 영구적인 원천을 제공하도록 CAR을 발현하는 면역 세포의 분획을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 냉동보존할 수 있다. 냉동보존된 형질전환된 면역 세포는 필요할 때 더 많은 이러한 세포에 대해 해동되고 성장하고 증식될 수 있다. 실시예 및 도면에 의해 입증되는 것처럼, 본원에 제공된 고갈 방법을 이용하여 생성된 세포의 집단은 냉동보존되고 이후 치료 분야를 위해 해동될 수 있다.
동종이계 CAR T 세포
동종이계 CAR T 치료, 또는 AlloCARs™을 제조하기 위한 공정은 건강한 공여자로부터 건강한 선택되고 선별되고 시험된 T 세포를 수확하는 것을 수반한다. 다음에, T 세포는 혈액 종양 또는 고형 종양에서 발현된 소정의 세포 표면 단백질(예를 들어, 표적 항원, 예컨대 EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP alpha, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 또는 CD34)을 인식하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 동종이계 T 세포는 이식편대숙주 질환(GvHD)의 위험을 감소시키고 공여자와 다른 환자에게 주어질 때 동종이계 거부(HvGD)를 방지하도록 TALEN®, 징크 핑거, CRISPR 또는 다른 유전자 편집 기술과 같은 유전자 편집 도구를 이용하여 유전자 편집된다.
내인성 T 세포 수용체 유전자(예를 들어, TCRα, TCRβ)의 발현은 GvHD를 피하기 위해 감소되거나 제거될 수 있다. 내인성 MHC1(β2M), MHC2 및/또는 PD1의 발현은 또한 HvGD를 피하기 위해 감소되거나 제거될 수 있어서 숙주 면역 세포가 외래 항원으로서 그래프트 세포 상의 MHC1 및 MHC2를 인식하는 것을 막는다. 내인성 발현 CD52(분화 클러스터 52) 유전자는 또한 CAR T 산물이 항-CD52 항체 치료에 저항성이 되게 하도록 감소되거나 제거된다. 항-CD52 항체 치료 림프구제거는 따라서 숙주 면역계를 억제하도록 사용될 수 있어서 CAR T가 이의 완전한 치료 영향을 달성하도록 생착되게 한다. 본원에 기재된 것처럼, 동종이계 치료에 사용하기 위한 조작된 면역 세포 또는 이의 집단은 적어도 상기 예시된 목적을 위해 다수의 넉아웃을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD279로도 공지된 예정 세포사 단백질 1(PD1)을 암호화하는 유전자의 내인성 발현은 항종양 효력을 향상시키기 위해 감소되거나 제거될 수 있다.
자가 CAR T 세포
자가 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료는 환자 자체의 세포(예를 들어, T 세포를 포함하는 백혈구)를 수집하는 것 및 하나 이상의 특이적 암 세포의 세포 표면 상에 발현된 표적 항원을 인식하고 암 세포를 사멸하는 CAR을 발현하기 위해 T 세포를 유전자 조작하는 것을 수반한다. 이후, 조작된 세포를 냉동보존하고 후속하여 환자에게 투여한다.
약제학적 조성물 및 치료
개시된 방법을 이용하여 제조된 세포의 집단을 포함하는 약제학적 조성물은 암을 갖는 환자를 치료하는 데 유용할 수 있다. 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된 집단의 조작된 세포의 원하는 치료 양은 일반적으로 적어도 2개의 세포(예를 들어, 적어도 1개의 CD8+ 중심 기억 T 세포 또는 적어도 1개의 CD4+ 헬퍼 T 세포 하위집단 또는 CD8+ 및 CD4+ 세포의 각각 중 하나)이거나, 보다 통상적으로 102개 초과의 세포, 및 106개 이하, 108 또는 109개 이하(포함)의 세포이고, 1010개 초과의 세포일 수 있다. 세포 수는 조성물이 의도되는 원하는 용도 및 여기에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 원하는 세포 밀도는 통상적으로 106 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 임상적으로 관련된 면역 세포 수는 누적적으로 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개 또는 1012개의 세포와 동등하거나 이를 초과하는 다수의 주입으로 배분될 수 있다. 본 개시내용의 방법을 이용하여 생성된 세포의 집단의 일부 분야에서, 특히 모든 주입된 세포가 특정 표적 항원에 재지향되므로, 106/킬로그램(환자마다 106 내지 1011)의 범위의 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 이 범위 내의 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 치료를 겪는 환자에 자가, 동종이계 또는 이종일 수 있다.
본원에 기재된 것처럼, 조작된 면역 세포의 집단은 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다(예를 들어, 세포는 TCR-이고/이거나 TCR+ 세포의 잔류 수준을 포함함). 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 1.0% 미만의 TCR+ 세포, 0.9% 미만의 TCR+ 세포, 0.8% 미만의 TCR+ 세포, 0.7% 미만의 TCR+ 세포, 0.6% 미만의 TCR+ 세포, 0.5% 미만의 TCR+ 세포, 0.4% 미만의 TCR+ 세포, 0.3% 미만의 TCR+ 세포, 0.2% 미만의 TCR+ 세포, 또는 0.1% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+ 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 0.09% 미만의 TCR+ 세포, 0.08% 미만의 TCR+ 세포, 0.07% 미만의 TCR+ 세포, 0.06% 미만의 TCR+ 세포, 0.05% 미만의 TCR+ 세포, 0.04% 미만의 TCR+ 세포, 0.03% 미만의 TCR+ 세포, 0.02% 미만의 TCR+ 세포, 0.01% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+ 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 약 0.01% 내지 0.001%의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+ 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 검출 불가능한 수준의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+ 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 99% 초과의 TCR- 세포, 99.9% 초과의 TCR- 세포, 99.91% 초과의 TCR- 세포, 99.92% 초과의 TCR- 세포, 99.93% 초과의 TCR- 세포, 99.94% 초과의 TCR- 세포, 99.95% 초과의 TCR- 세포, 99.96% 초과의 TCR- 세포, 99.97% 초과의 TCR- 세포, 또는 99.98% 초과의 TCR- 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR- 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 약 99.99% 내지 99.999%의 TCR- 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR-세포의 이 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
본 개시내용의 방법을 이용하여 생성된 TCR 고갈된 CAR 발현 세포 집단은 단독으로 또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합되어 투여될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 것처럼 조작된 T 세포와 같은 CAR 발현 TCR- 세포 집단을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 바람직하게는 주입 또는 정맥내 투여를 위해 제형화된다.
치료 방법
본 개시내용은 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포(예를 들어, 환자가 아니라 건강한 공여자로부터 얻은 세포)의 집단의 유효량을 질환(예를 들어, 암)의 치료하거나 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 조작된 면역 세포의 집단은 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된다(예를 들어, 세포는 TCR-이고/이거나 TCR+ 세포의 잔류 수준을 포함함).
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 1.0% 미만의 TCR+ 세포, 0.9% 미만의 TCR+ 세포, 0.8% 미만의 TCR+ 세포, 0.7% 미만의 TCR+ 세포, 0.6% 미만의 TCR+ 세포, 0.5% 미만의 TCR+ 세포, 0.4% 미만의 TCR+ 세포, 0.3% 미만의 TCR+ 세포, 0.2% 미만의 TCR+ 세포, 또는 0.1% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+ 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 0.09% 미만의 TCR+ 세포, 0.08% 미만의 TCR+ 세포, 0.07% 미만의 TCR+ 세포, 0.06% 미만의 TCR+ 세포, 0.05% 미만의 TCR+ 세포, 0.04% 미만의 TCR+ 세포, 0.03% 미만의 TCR+ 세포, 0.02% 미만의 TCR+ 세포, 0.01% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+ 세포의 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 약 0.01% 내지 0.001%의 TCR+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 검출 불가능한 수준의 TCR+ 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+세포의 이 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 99% 초과의 TCR- 세포, 99.9% 초과의 TCR- 세포, 99.91% 초과의 TCR- 세포, 99.92% 초과의 TCR- 세포, 99.93% 초과의 TCR- 세포, 99.94% 초과의 TCR- 세포, 99.95% 초과의 TCR- 세포, 99.96% 초과의 TCR- 세포, 99.97% 초과의 TCR- 세포, 또는 99.98% 초과의 TCR- 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+세포의 이 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포의 집단은 약 99.99% 내지 99.999%의 TCR- 세포를 포함한다. 상기 기술된 TCR+세포의 이 수준을 갖는 세포 집단은 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성 가능하다.
암을 포함하여 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 환자가 동종이계 치료로 치료될 때 GvHD에 직면할 가능성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 면역 세포의 집단의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, T 세포 매개된 면역 반응은 표적 세포 또는 암 항원을 발현하는 세포에 대해 지향된다. 일부 실시형태에서, TCR 고갈된 조작된 면역 세포 집단은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 고형 종양 세포 또는 혈액 종양 세포이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 악성물을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 면역 세포의 집단의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 악성물을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에 제공된 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 면역 세포의 집단의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, TCR 고갈된 면역 세포의 집단은 본원에 기재된 것처럼 적어도 하나의 키메라 항원 수용체, 및/또는 단리된 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR 함유 면역 세포의 집단은 악성물 또는 고형 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR 함유 면역 세포의 집단은 소세포 폐암, 흑색종, 저등급 신경교종, 교모세포종, 갑상선 수질암, 카르시노이드, 췌장에서의 분산형 신경내분비 종양, 방광 및 전립선, 고환암, 및 신경내분비 특징을 갖는 폐 선암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR 함유 면역 세포, 예를 들어 CAR-T 세포의 집단은 고형 종양 암을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR 함유 면역 세포, 예를 들어 CAR-T 세포의 집단은 비호지킨 림프종(NHL: Non-Hodgkin lymphoma), 신장 세포 암종(RCC: renal cell carcinoma), 급성 림프구성 백혈병(ALL: Acute lymphocytic leukemia), 다발성 골수종(MM: multiple myeloma) 또는 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia)을 치료하기 위해 사용된다.
대상체에게 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 방법이 또한 제공되고, 여기서 세포는 종양 상의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 고형 종양, 또는 혈액 악성물, 예컨대 림프종 또는 백혈병(혈액 암)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 세포의 집단은 종양 층에 전달된다. 일부 실시형태에서, 암은 대상체의 골수에 존재하고, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 세포의 집단은 여기에 전달된다. 일부 실시형태에서, 암은 환자의 면역 세포 또는 혈액 세포에 존재하고, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 세포의 집단은 여기에 전달된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 자가 면역 세포, 예를 들어 자가 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 개시된 방법의 사용이 특이 유리한 동종이계 면역 세포, 예를 들어 동종이계 T 세포이다.
치료제, 예를 들어 본 개시내용의 방법을 이용하여 생성된 TCR 고갈된 조작된 CAR T 세포의 집단의 “치료학적 유효량”, “유효 용량”, “유효량” 또는 “치료학적 유효 용량”은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용될 때 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 불능의 예방에 의해 입증되는 것처럼 질환 발생에 대해 대상체를 보호하거나 질환 회귀를 촉진하는 임의의 양이다. 질환 회귀를 촉진하는 치료제의 능력은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용하여, 예컨대 임상 실험 동안 인간 대상체에서, 인간에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 평가하여 평가될 수 있다.
상기 조성물에서 TCR 고갈된 조작된 세포의 원하는 치료 양은 적어도 2개의 세포(예를 들어, 적어도 1개의 CD8+ 중심 기억 T 세포 및 적어도 1개의 CD4+ 헬퍼 T 세포 하위집단 또는 적어도 2개의 CD4+ 세포 또는 적어도 2개의 CD8+ 세포)를 포함하거나, 보다 통상적으로 102개 초과의 세포, 및 106개 이하, 108 또는 109개 이하(포함)의 세포이고, 1010개 초과의 세포일 수 있다. 세포 수는 조성물이 의도되는 원하는 용도 및 여기에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 본원에 제공된 방법이 CD4+ 세포 단독, CD8+ 세포 단독 또는 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다를 포함하는 TCR 고갈된 조작된 면역 세포의 집단을 생성하기 위해 사용될 수 있다는 것에 주목한다. 원하는 세포 밀도는 통상적으로 106 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 임상적으로 관련된 면역 세포 수는 누적적으로 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개 또는 1012개의 세포와 동등하거나 이를 초과하는 다수의 주입으로 배분될 수 있다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 특히 모든 주입된 세포가 특정 표적 항원에 재지향되므로, 106/킬로그램(환자마다 106 내지 1011)의 범위의 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 이 범위 내의 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 치료를 겪는 환자에 자가, 동종이계 또는 이종일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR T 세포의 치료학적 유효량은 약 1 X 105개의 세포/kg, 약 2 X 105개의 세포/kg, 약 3 X 105개의 세포/kg, 약 4 X 105개의 세포/kg, 약 5 X 105개의 세포/kg, 약 6 X 105개의 세포/kg, 약 7 X 105개의 세포/kg, 약 8 X 105개의 세포/kg, 약 9 X 105 세포/kg, 2 X 106개의 세포/kg, 약 3 X 106개의 세포/kg, 약 4 X 106개의 세포/kg, 약 5 X 106개의 세포/kg, 약 6 X 106개의 세포/kg, 약 7 X 106개의 세포/kg, 약 8 X 106개의 세포/kg, 약 9 X 106개의 세포/kg, 약 1 X 107개의 세포/kg, 약 2 X 107개의 세포/kg, 약 3 X 107개의 세포/kg, 약 4 X 107개의 세포/kg, 약 5 X 107개의 세포/kg, 약 6 X 107개의 세포/kg, 약 7 X 107개의 세포/kg, 약 8 X 107개의 세포/kg, 또는 약 9 X 107개의 세포/kg이다.
일부 실시형태에서, CAR+/TCR- T 세포에 대한 표적 용량은 1×106 내지 2×108개의 세포/kg, 예를 들어 2×106개의 세포/kg의 범위이다. 이 범위 위 및 아래의 용량이 소정의 대상체에 적절할 수 있고, 적절한 용량 수준이 필요한 바대로 건강관리 제공자에 의해 결정될 수 있다고 이해될 것이다. 추가로, 세포의 다중 용량은 본 개시내용에 따라 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자에 대한 투여 시, 세포 표면에서 본원에 기재된 항원 특이적 CAR 중 어느 하나를 발현하는 본 개시내용의 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 세포의 집단은 환자의 내인성 항원 발현 세포를 감소시키거나 사멸하거나 용해시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 항원 발현 내인성 세포 또는 본원에 기재된 항원 특이적 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 항원을 발현하는 세포주의 세포의 감소 또는 용해 백분율은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 이것 초과이다. 일 실시형태에서, 항원 발현 내인성 세포 또는 항원 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 항원을 발현하는 세포주의 세포의 감소 또는 용해 백분율은 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%이다. 일 실시형태에서, 내인성 항원 발현 세포는 내인성 항원 발현 골수 세포이다.
다양한 추가의 치료제가 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 가능하게 유용한 추가의 치료제는 PD-1 억제제, 예컨대 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 및 아테졸리주맙을 포함하고; 이들 화합물은 본원에 제공된 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 조작된 면역 세포의 집단의 투여 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR 발현 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군(CRS: cytokine release syndrome) 또는 신경독성을 예방하거나 치료하도록 설계된 항-IL6 항체와 같은 치료 섭생 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 투여될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 방법을 이용하여 제조된 TCR 고갈된 CAR 함유 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물은 사이토카인과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 엽산 자극 호르몬(FSH: follicle stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬(TSH: thyroid stimulating hormone) 및 황체형성 호르몬(LH: luteinizing hormone); 간 성장 인자(HGF: hepatic growth factor); 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor); 프로락틴; 태반 락토겐; 뮬레리안관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀 연관된 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin); 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor), 예컨대 NGF-베타; 혈소판 성장 인자; 변환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린양 성장 인자-I 및 인슐린양 성장 인자-II; 에리쓰로포이에틴(EPO: erythropoietin); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF: colony stimulating factor), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 kit 리간드(KL: kit ligand)를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본원에 사용되는 용어 사이토카인은 자연 원천 또는 재조합 세포 배양, 및 자연적 서열 사이토카인의 생물학적 활성 균등물로부터의 단백질을 포함한다.
키트 및 제조 물품
본 개시내용은 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체 중 하나 이상을 포함하는 TCR 고갈 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본원에 제공된 고갈 방법에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체를 포함한다. 키트에서 항-TCR 항체 및/또는 항-CD3 항체의 하나 또는 둘 다는 비오틴에 선택적으로 접합될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 둘 다는 비오틴에 접합된다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체를 포함한다. 키트에서 항-TCR 및/또는 항-CD52 항체의 하나 또는 둘 다는 비오틴에 선택적으로 접합될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체 둘 다는 비오틴에 접합된다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체를 포함한다. 키트에서 항-TCR 및/또는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD52 항체의 하나 또는 모두는 비오틴에 선택적으로 접합될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체는 모두 비오틴에 접합된다.
다른 양태에서, 본원에 제공된 키트는 자기 나노매트릭스 마이크로비드, 세포 크기 비드 또는 다른 지지체, 예컨대 막, 음향파 입자 또는 비드, 플라스틱 플레이트 또는 칼럼에 접합된 항비오틴 항체를 추가로 포함할 수 있다. 항비오틴 항체는 접합된 형태로 제공될 수 있거나, 선택적으로 항체를 자기 나노매트릭스 마이크로비드, 세포 크기의 비드 또는 다른 지지체에 부착하는 데 도움이 되는 재료와 함께 네이키드 항체로서 제공될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체를 포함한다. 키트에서 항-TCR 항체 및/또는 항-CD3 항체의 하나 또는 둘 다는 자기 비드, 막, 음향파 입자, 플라스틱 플레이트 또는 칼럼에 선택적으로 직접 접합될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체를 포함한다. 키트에서 항-TCR 및/또는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD52 항체의 하나 또는 둘 다는 자기 비드, 막, 음향파 입자, 플라스틱 플레이트 또는 칼럼에 선택적으로 직접 접합될 수 있다.
항비오틴 항체의 사용이 본원에 개시된 방법의 하나의 실시형태를 형성하지만, 비오틴 표지된 모이어티를 포획하기 위한 다른 수단이 이용될 수 있음이 주목된다. 예를 들어, 스트렙타비딘, 아비딘 및 다른 비오틴 결합 모이어티는 개시된 방법에서 항비오틴 항체 대신에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 치료학적 조성물 및 키트를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 예는 치료제(예를 들어, 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조된 CAR을 추가로 포함할 수 있는 TCR 고갈된 세포의 집단)를 함유하는 용기(예를 들어, 밀봉 바이알)를 포함한다.
실시예
하기 실시예에 기재된 것처럼, 개시된 조합 항체 접근법은 TCR+ 세포 고갈 효율을 유의미하게 개선하였고, 이는 예상치 못하게 잔류 TCR+% 수준을 (고갈 후 1일에 측정된) TCR 항체 단독과 비교하여 0.1% 내지 1%에서 0.1% 내지 0.01%로 감소시켰다. 이들 실시예는 TCR+ 세포를 고갈시키기 위한 현재의 접근법에 비해 개시된 고갈 방법에 의해 제공된 상당한 이점을 입증한다. 이 이점은 환자가 GvHD를 나타낼 가능성의 감소의 형태로 동종이계 치료를 받는 환자에 이익을 제공할 수 있다.
실시예 1. 항-TCR과 CD3 항체의 조합은 TCR+ 세포 고갈 효율을 증가시킨다
CAR 조작된 면역 세포를 사용하여, TRAC 유전자 및 CD52 유전자에 지향된 TALENs®의 전기천공에 의해 내인성 TCR 유전자 및 CD52 유전자 발현을 넉아웃시켰다. 이후, TCR 및 CD52 넉아웃된 세포를 TCR 고갈 시약에 노출시켰다. 세포를 표 1에 도시된 것처럼 단독으로 또는 항-CD3 또는 항-CD52 항체와 조합하여 비오틴에 접합된 일차 항-TCR 항체와 접촉시켰다.
다음에, 일차 항-TCR 비오틴 모이어티를 통해 임의의 잔류 TCR+ 세포에 자기 마이크로비드를 결합시키도록 자기 마이크로비드(약 50 nm 직경의 나노입자)와 접합된 이차 항비오틴 항체를 일차 항체 표지된 세포에 추가로 첨가하였다. 이후, CliniMACS Prodigy® 기기를 사용하여 표지된 세포를 자기 칼럼에 적용하였다. TCR+ 세포는 자기 칼럼 내에 보유되지만, 비표지된 TCR- 세포는 생성물 수집 백을 통과하였다. TCR+ 세포를 나중에 칼럼으로부터 쓰레기 백으로 배출시켰다. 본 개시내용에 제공된 다양한 고갈 방법을 이용하여 TCR+ 세포 고갈 효율을 탐구하고, 항-TCRα, TCRβ 및/또는 CD3 항체를 사용하여 고갈 후 다양한 일자에 TCR― 세포 집단 분획에 존재하는 잔류 TCR+ 세포를 모니터링하였다. 도 1은 상이한 유닛 작동 시나리오에 의한 동종이계 CAR T 제조 공정의 도식적 표시를 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
도 2a에 도시된 것처럼, 다양한 상이한 고갈 방법을 이용하여 고갈된 TCR- 생성물 집단에 존재하는 TCR+ 세포의 퍼센트는 실질적으로 1% 이하보다 낮다. 도 2a는 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체가 고갈 방법에서 함께 사용될 때 낮은 1x TCR 항체 농도를 사용하는 대조군 고갈 방법에 비해 고갈 후 2일에 검출되는 것처럼 TCR+ 세포 빈도의 예상치 못한 204배 감소를 보여주고; 또한 세포가 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체로 치료될 때 동등한 감소가 관찰되었다. 도 2a는 또한 항-TCR 항체와 항-CD52 항체뿐만 아니라 3x 농도의 항-TCR 항체의 사용이 6.2배 감소를 보여주는 3xTCR 항체 치료와의 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 조합 및 2.7배 감소를 보여주는 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체 조합보다 덜 효과적이라는 것을 보여준다. 흥미롭게도, 도 2a는 항-CD52 항체 및 항-TCR 항체를 사용한 고갈이 항-TCR 항체 단독을 사용할 때보다 더 효과적이라는 것을 입증한다. 이 결과는 본원에 기술된 것처럼 CD52가 TCR 또는 TCR 복합체와 생물학적 연관을 갖지 않는다는 사실로 인해 놀랍고, 따라서 이들 2개의 항체를 함께 이용한 고갈 방법이 바로 항-TCR 항체 단독보다 TCR+ 세포를 고갈시키는 데 있어서 더 효과적이라는 것은 예상치 못했다. 도 2a에 도시된 결과는 또한 예상치 못하게 단순히 항-TCR 항체의 농도를 증가시키는 것이 항-CD3 항체와 조합된 항-TCR 항체의 더 낮은 농도의 사용보다 현저히 더 양호한 결과를 생성하지는 않는다는 것을 추가로 입증한다.
고갈 후 9일에 고갈된 집단을 또한 시험하였고, 그 결과는 도 2b에 도시되어 있다. 도 2b는 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체가 고갈 방법에서 사용될 때 TCR+ 세포 빈도의 8배 감소를 보여주고; 또한 세포가 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체로 치료될 때 동등한 감소가 관찰되었다. 도 2b는 또한 항-TCR 항체와 항-CD52 항체뿐만 아니라 3x 농도의 항-TCR 항체의 사용이 5배 감소를 보여주는 3xTCR 항체 치료와의 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 조합 및 2배 감소를 보여주는 항-TCR 및 항-CD52 조합보다 덜 효과적이라는 것을 보여준다. 이 결과는 단순히 항-TCR 항체의 농도를 증가시키는 것이 항-CD3 항체와 조합된 항-TCR 항체의 더 낮은 농도의 사용보다 현저히 더 양호한 결과를 생성하지 않는다는 것을 입증한다.
도 3a의 FACS 도표는 고갈 방법이 단독의 또는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD52 항체, 또는 증가된 (3x) 농도의 항-TCR 항체와 조합된 항-TCR 항체와 비교하여 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체를 사용하여 수행될 때 TCR+ 세포의 최소 존재를 가시화하였다. 고갈 후 0일 및 1일에 데이터를 획득하고, 고갈전 세포 샘플과 비교하였다. 이 결과는 단순히 항-TCR 항체의 농도를 증가시키는 것이 연구된 일자에 걸쳐 항-CD3 항체와 조합된 항-TCR 항체의 더 낮은 농도의 사용보다 현저히 더 양호한 결과를 생성하지 않는다는 것을 추가로 입증한다.
도 3b의 숫자 막대 그래프는 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체가 고갈 방법에서 함께 사용될 때 낮은 1x TCR 항체 농도를 사용하는 대조군 고갈 방법에 비해 고갈 후 0일 및 1일에 TCR+ 세포 빈도의 151배 및 23배 내지 32배 감소를 보여주고; 또한 세포가 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD52 항체로 치료될 때 70배의 동등한 감소가 관찰되었다. 현재의 TCR 고갈 조작이 개시된 방법 사이의 구별점이고, 당해 분야의 최신 기술인 것으로 이해되는 것처럼 단지 표준 1x TCR 항체 농도를 사용함이 주목된다. 도 3b는 또한 항-TCR 항체와 항-CD52 항체뿐만 아니라 3x 농도의 항-TCR 항체의 사용이 19배 및 7배 감소를 보여주는 3xTCR 항체 치료와의 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 조합 및 2.7배 및 1.6배 감소를 보여주는 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체 조합보다 덜 효과적이라는 것을 보여준다. 이 결과는 단순히 항-TCR 항체의 농도를 증가시키는 것이 연구된 일자에 걸쳐 항-CD3 항체와 조합된 항-TCR 항체의 더 낮은 농도의 사용보다 현저히 더 양호한 결과를 생성하지 않는다는 것을 추가로 입증한다.
도 4는 고갈 후 0일 및 1일에 수집된 데이터의 FACS 도표이고, 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체의 조합이 고(3X) 농도 또는 저(1X) 농도에서 항-TCR 항체 단독의 사용 및 항-CD52 항체와 조합된 항-TCR 항체의 사용보다 TCR 고갈의 더 높은 수준을 제공한다는 것을 추가로 입증한다. 고갈 후 잔류 TCR+ 세포는 항-TCR, 항-CD3 단일 염색 또는 항-TCR/CD3 이중 염색에 의해 가시화되었고, TCR+, CD3+ 또는 CD3+/TCR+ 중 어느 하나에 양성으로 염색되는 것으로 예상된다. TCRγδ T 세포가 항-CD3 항체를 통해 제거되는 것으로 예상되므로, CD3+/TCR-로 염색된 세포의 작은 집단은 고갈된 TCR- 세포 집단에 존재하는 남은 TCRγδ T 세포를 반영한다.
실시예 2. 고갈 후 배양
이 실시예는 고갈된 면역 세포의 집단이 고갈 후 배양 동안 동일한 낮은 잔류 TCR+ 수준을 보유한다는 것을 입증한다. 고갈 후 1일에, 고갈 후 배양 동안 고갈된 세포를 동결하고 후에 해동하였다. 동결 전에 및 해동 직후에 TCR 및 CD3 발현 수준을 검출하였다. 도 5a 내지 도 5e에 도시된 것처럼, 동결-해동 사이클로 인한 TCR 및 CD3 빈도의 유의차가 없고; 도 5a는 FACS 도표에 의해 항-TCR, 항-CD3 단일 염색 또는 항-TCR/CD3 이중 염색을 사용한 동결 전 및 해동 후 TCR+ 세포, CD3+ 세포, CD3+/TCR- 세포 및 CD3+/TCR+ 세포의 빈도를 도시하고, 도 5b는 숫자 방식으로 항-TCR 항체를 사용한 동결 전 및 해동 후 TCR+ 세포의 빈도를 도시하고, 도 5c는 숫자 방식으로 항-CD3 항체를 사용한 동결 전 및 해동 후 CD3+ 세포의 빈도를 도시하고, 도 5d는 숫자 방식으로 항-TCR/CD3 항체를 사용한 동결 전 및 해동 후 CD3+/TCR- 세포의 빈도를 도시하고, 도 5e는 숫자 방식으로 항-TCR/CD3 항체를 사용한 동결 전 및 해동 후 CD3+/TCR+ 세포의 빈도를 도시한다.
고갈된 TCR- 세포 집단에서 잔류 TCR+ 세포 빈도가 배양 시간에 따라 증가하는지를 결정하기 위해, 고갈된 세포를 고갈 후 10일 동안 배양하였다. 전체 배양 공정 동안 2일 내지 3일마다 항-TCR(도 6) 항체 및 항-CD3(도 7) 항체 단일 염색 또는 항-TCR/CD3(도 8) 항체 이중 염색을 사용하여 TCR 및 CD3 세포 빈도를 검출하였다. 구체적으로, 도 6, 도 7 및 도 8의 FACS 도표는 TCR+, CD3+, 또는 CD3+/TCR+ 세포 빈도의 점진적인 증가 경향에도 불구하고 모든 고갈 방법에 대해 고갈 후 배양 동안 대략 5일 내지 7일에 피크에 도달한 뒤에 이어지고, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD52 항체의 조합을 사용하여 고갈된 배양물은 시간이 지나면서 저농도 또는 고농도에서의 항-TCR 항체 단독, 또는 항-CD52 항체와 조합된 항-TCR 항체로 치료된 배양물보다 TCR+ 세포 또는 CD3+ 세포의 동일한 더 낮은 빈도를 유지시켰다.
계속해서, 도 9a, 도 9b, 도 9c 및 도 9d의 막대 그래프는 숫자 방식으로 고갈 후 배양 동안 TCR+, CD3+, CD3+/TCR- 또는 CD3+/TCR+ 빈도를 도시한다.
추가로, 고갈 후 배양 기간 동안 각각의 계대배양에서 생존가능 세포 밀도(도 10a), 생존능력(도 10b), 세포 직경(도 10c) 및 총 증식 배수(도 10d)를 포함하는 세포 성장 상태를 또한 모니터링하였다. 종합적으로, 모든 연구된 고갈 방법에 대해 필적하는 세포 성장 특성치를 관찰하였다.
본원에 개시된 항체의 상이한 조합을 사용하는 것의 CD52 고갈의 효율을 또한 연구하였다. 구체적으로, CD52 고갈에 단독의 또는 다른 항체와 조합된 항-CD52 항체를 사용하였고, CD52+ 세포 제거에 대한 TCR+ 세포 고갈에 사용된 항-TCR 항체 및/또는 항-CD3 항체의 영향을 또한 연구하였다. 도 11a의 FACS 도표는 고갈 후 0일 및 1일에 고갈 후 잔류 CD52+ 세포 빈도를 보여준다. 도 11b의 막대 그래프는 숫자 방식으로 잔류 CD52+ 세포 빈도를 보여준다. 마지막으로, 도 12의 FACS 도표는 10일 고갈후 배양 동안 잔류 CD52+ 세포 빈도를 보여준다.
간략하게, 실시예 2로부터의 데이터는 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체 둘 다를 사용하는 것이 TCR+ 세포 고갈 효율을 향상시켰다는 것을 입증하였다. 항-TCR 항체 이외에 항-CD3 항체를 사용하는 것은 항-TCR 항체 단독을 사용하는 것보다 CD3+/TCR+ 세포를 더 광범위하게 제거하였다. 이 고갈 기전은 개선된 TCR+ 세포 고갈 효율을 제공하고, 치료학적 동종이계 분야에 대한 상당한 이점일 수 있다. 후 고갈된 세포는 고갈 후 배양 동안 모든 조건에 대해 유사한 성장을 보여주어, 고갈 방법이 세포 생존능력 및 성장에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.

Claims (39)

  1. 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 제조하는 방법으로서,
    (a) 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계; 및
    (b) 면역 세포의 집단으로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD3 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법으로서,
    (a) 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체로 표지하는 단계;
    (b) 비표지된 면역 세포로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD3 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계; 및
    (c) 비표지된 면역 세포를 수집하여서,
    내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 제조하는 방법으로서,
    (c) 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및
    (d) 면역 세포의 집단으로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키는 방법으로서,
    (d) 면역 세포의 집단을 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체로 표지하는 단계;
    (e) 비표지된 면역 세포로부터 항-TCR 항체 표지된 면역 세포 및 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계; 및
    (f) 비표지된 면역 세포를 수집하여서,
    내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 면역 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 세포의 집단을 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및 면역 세포의 집단으로부터 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 세포의 집단을 항-CD52 항체로 표지하는 단계; 및 비표지된 면역 세포로부터 항-CD52 항체 표지된 면역 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 비오틴 접합된, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 표지된 세포를 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제는 항비오틴 항체, 아비딘 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 작용제는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막에 접합된, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막에 직접 접합된, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 분리하는 단계는 자기 분리 또는 음향파 분리 중 하나를 이용하여 달성되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 동종이계 면역 세포인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 내인성 TCR의 발현을 감소시키거나 제거하도록 유전자 변형된, 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 내인성 CD52의 발현을 감소시키거나 제거하도록 유전자 변형된, 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 내인성 TCR 및 내인성 CD52 둘 다의 발현을 감소시키거나 제거하도록 유전자 변형된, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR 또는 내인성 CD52, 또는 내인성 TCR 및 내인성 CD52 발현 둘 다의 감소 또는 제거는 TALEN, CRISPR/Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc finger nuclease), MegaTAL, 메가뉴클레아제, Cpf1, 상동성 재조합 또는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN: single stranded oligodeoxynucleotide)를 사용하여 달성되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 1.0% 이하의 TCR+ 세포, 0.9% 이하의 TCR+ 세포, 0.8% 이하의 TCR+ 세포, 0.7% 이하의 TCR+ 세포, 0.6% 이하의 TCR+ 세포, 0.5% 이하의 TCR+ 세포, 0.4% 이하의 TCR+ 세포, 0.3% 이하의 TCR+ 세포, 0.2% 이하의 TCR+ 세포, 또는 0.1% 이하의 TCR+ 세포를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 직후 0.01% 내지 0.001%의 TCR+ 세포를 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 후 배양 1일 내지 10일 후 0.1% 내지 0.01%의 TCR+ 세포를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 후 배양 1일 후 0.1% 내지 1.0% 미만의 TCR+ 세포를 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 세포의 집단은 고갈 후 배양 10일 후 0.1% 내지 1.0% 미만의 TCR+ 세포를 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인, 방법.
  25. 면역 세포의 집단으로서, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된, 면역 세포의 집단.
  26. 적어도 99%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단.
  27. 적어도 99.9%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단.
  28. 적어도 99.99%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단.
  29. 적어도 99.999%의 TCR- 세포를 포함하는 조작된 T 세포의 집단.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단은 키메라 항원 수용체를 발현하는, 조작된 T 세포의 집단.
  31. 항-TCR 항체 및 항-CD3 항체를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키기 위한 키트.
  32. 제31항에 있어서, 항-CD52 항체를 추가로 포함하는, 키트.
  33. 항-TCR 항체 및 항-CD52 항체를 포함하는 면역 세포의 집단으로부터 내인성 TCR을 발현하는 세포를 고갈시키기 위한 키트.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제와 접합된, 키트.
  35. 제34항에 있어서, 비오틴을 특이적으로 인식하는 작용제는 항비오틴 항체, 스트렙타비딘 및 아비딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 작용제는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막에 접합된, 키트.
  37. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TCR 항체, 항-CD3 항체, 및/또는 항-CD52 항체는 지지체에 직접 접합된, 키트.
  38. 제37항에 있어서, 지지체는 자기 비드, 아가로스 비드, 음향파 입자, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 칼럼, 세포 배양 백 또는 막 중 하나인, 키트.
  39. 고형 암 또는 혈액 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 암을 치료하는 방법으로서, 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 내인성 TCR을 발현하는 면역 세포가 고갈된 면역 세포의 집단, 또는 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조작된 T 세포의 집단의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020217028506A 2019-03-21 2020-03-20 TCRαβ+ 세포 고갈 효율을 향상시키는 방법 KR20210144679A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962821768P 2019-03-21 2019-03-21
US62/821,768 2019-03-21
PCT/US2020/024059 WO2020191378A1 (en) 2019-03-21 2020-03-20 METHODS FOR ENHANCING TCRαβ+ CELL DEPLETION EFFICIENCY

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210144679A true KR20210144679A (ko) 2021-11-30

Family

ID=70296049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217028506A KR20210144679A (ko) 2019-03-21 2020-03-20 TCRαβ+ 세포 고갈 효율을 향상시키는 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200317780A1 (ko)
EP (1) EP3941488A1 (ko)
JP (1) JP2022524958A (ko)
KR (1) KR20210144679A (ko)
CN (1) CN113490502A (ko)
AU (1) AU2020240339A1 (ko)
BR (1) BR112021018684A2 (ko)
CA (1) CA3130701A1 (ko)
IL (1) IL286909A (ko)
MX (1) MX2021010998A (ko)
WO (1) WO2020191378A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4353253A1 (en) * 2022-10-10 2024-04-17 Charité - Universitätsmedizin Berlin Purification of tcr-modified t cells using tcr-specific car-nk cells

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
CA2572467A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-19 Virxsys Corporation Vector packaging cell line
WO2013074916A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
GB201206559D0 (en) 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
GB2508414A (en) * 2012-11-30 2014-06-04 Max Delbrueck Centrum Tumour specific T cell receptors (TCRs)
EP4215603A1 (en) 2014-02-04 2023-07-26 Kite Pharma, Inc. Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
EP3215166B1 (en) * 2014-10-31 2024-04-24 The Trustees of the University of Pennsylvania Altering gene expression in car-t cells and uses thereof
BR112017015453A2 (pt) 2015-01-26 2018-01-23 Cellectis células imunes modificadas knockout para receptor de células t, dotadas de receptores quiméricos de antígeno, de ligação a cd123 para o tratamento de linfoma mieloide agudo recorrente/refratário ou neoplasia blástica de células dendríticas plasmacitoides
AU2016297014B2 (en) * 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
CN107828730B (zh) * 2017-11-07 2019-04-30 南京北恒生物科技有限公司 具有抗体药物抗性的通用型cart/tcrt细胞及其构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL286909A (en) 2021-10-31
MX2021010998A (es) 2021-10-13
WO2020191378A1 (en) 2020-09-24
CN113490502A (zh) 2021-10-08
BR112021018684A2 (pt) 2021-11-23
CA3130701A1 (en) 2020-09-24
EP3941488A1 (en) 2022-01-26
JP2022524958A (ja) 2022-05-11
US20200317780A1 (en) 2020-10-08
AU2020240339A1 (en) 2021-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112639083A (zh) 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
KR20200120939A (ko) 변형된 만능성 줄기 세포, 및 제조 및 사용 방법
US20210393691A1 (en) Process for producing genetically engineered t cells
JP2021505168A (ja) 操作されたｔ細胞の組成物を製造するための方法
JP2021530233A (ja) Ｓｔｅａｐ１に対するキメラ受容体及びその使用方法
US20240043801A1 (en) Preparation method for tumor infiltrating lymphocyte and use thereof
US20200317780A1 (en) METHODS FOR ENHANCING TCRab+ CELL DEPLETION
US20220184124A1 (en) Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
WO2022166947A1 (zh) 肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其用途
US20200339944A1 (en) Methods of manufacturing allogeneic car t cells
US20230181641A1 (en) Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
RU2816370C2 (ru) Устойчивые к ритуксимабу химерные антигенные рецепторы и пути их применения
EP3342855B1 (en) Cell composition depleted from tcrab and cd45ra positive cells
CN116648502A (zh) 用于表征用于治疗的car t细胞的方法和试剂
Oldham Development and Testing of Novel Cancer Immunotherapies for Hematological Malignancies
KR20230142760A (ko) Car t 세포 의약품의 제형 및 프로세스
WO2023212675A1 (en) Methods for donor cell analysis
EP4069258A1 (en) Placenta-derived allogeneic car-t cells and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination