CN114507635B - 一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物神经系统内皮细胞单细胞悬液的制备方法，属于生物技术领域。该方法包括：将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入内皮细胞培养液，过滤后得到细胞混合物；将所述细胞混合物与细胞梯度分离液混合，纯化分离内皮细胞。该方法操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经内皮细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究神经内皮细胞的特性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法。
背景技术
血管在神经活性方面发挥了举足轻重的作用。2001年美国国家神经疾病和中风研究所的一次会议中正式提出神经血管单元这一概念。之后，神经血管单元变成了神经科学中的一个热点领域。这些研究揭示了神经元的工作是一个多维的、高度协调的过程，需要多种细胞的参与并连接不同的信号通路。例如血脑屏障可以避免神经元受到血液中有害物质的损伤。但是神经系统中组成血管细胞最重要的神经内皮细胞是否与神经元相互作用及是否有不同的神经内皮细胞亚型参与中枢神经的功能如认知仍不甚清楚。神经系统内皮细胞作为神经系统中组成血管最重要的细胞，在很多疾病如中风、神经退行性疾病及精神类疾病中都发挥着重要的作用，研究其单细胞特性有助于我们全面了解神经系统内皮细胞的作用机制。
每个细胞都是独一无二的，越来越多的研究表明，每个细胞、即使是相同细胞系或个体来源的细胞，彼此的基因组、转录组和表观基因组都会有所差异。单细胞转录组学可以对细胞类型进行详细分类，是比较分析不同细胞类型功能的一种重要方法。Grubman等通过对阿尔兹海默症患者和健康人的内嗅皮层进行单细胞测序发现，和正常人相比，APOE基因在阿尔兹海默症患者内嗅皮层的寡突胶质前体细胞和星形胶质细胞中表达量显著性降低，而在小胶质细胞中的表达量却明显升高；Ximerakis等通过对年轻小鼠和老年小鼠的大脑进行单细胞测序发现，内皮细胞分泌的配体和星形胶质细胞上表达的受体之间的相互作用对衰老至关重要。这些结果都提示单细胞测序技术对我们精准地了解某一脑区不同细胞的功能及他们之间的相互作用都起到不可比拟的作用，但是目前尚未有专门针对哺乳动物神经组织中神经内皮细胞单细胞悬液进行制备的方法。
发明内容
本发明针对上述缺陷，提供一种动物神经系统内皮细胞单细胞悬液的制备方法。该方法操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经内皮细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究神经内皮细胞的特性。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，包括：
将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入内皮细胞培养液，过滤后得到细胞混合物；
将细胞混合物与细胞梯度分离液混合，纯化分离内皮细胞；
其中，细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:0.9～1.1加到第二溶液的上方，第一溶液中含有质量浓度为8～10％的硅胶颗粒，第二溶液中含有质量浓度为12～14％的硅胶颗粒，硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮。
优选地，在本发明较佳的实施例中，第一溶液的配制方法为将含有硅胶颗粒的细胞分离液与内皮细胞培养液按照体积比13～17：183～187混合；
优选地，第二溶液的配制方法为将含有硅胶颗粒的细胞分离液与内皮细胞培养液按照体积比19～23：177～181混合；
细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.2～1.4g/mL。
优选地，在本发明较佳的实施例中，纯化分离内皮细胞的步骤包括：
将细胞混合物与细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离液，将内皮细胞梯度分离液在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间部分的内皮细胞层，洗涤。
优选地，在本发明较佳的实施例中，洗涤内皮细胞层的步骤包括：
将内皮细胞层与内皮细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统内皮细胞单细胞混悬液。
优选地，在本发明较佳的实施例中，纯化分离内皮细胞步骤中的离心采用水平转子离心机。
优选地，在本发明较佳的实施例中，在制备细胞混合物的过程中，将新鲜神经组织与细胞解离消化液混合后于30～34℃下恒温培养30～60min，期间每隔 1～4分钟机械混匀一次。
优选地，在本发明较佳的实施例中，恒温培养后，离心过程中离心力为 150～250g，离心时间为3～5min。
优选地，在本发明较佳的实施例中，在制备细胞混合物的过程中，用孔径为35～45μm的细胞筛进行过滤。
优选地，在本发明较佳的实施例中，内皮细胞培养液中至少含有：青霉素/ 链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清。
优选地，在本发明较佳的实施例中，细胞解离消化液是在内皮细胞培养液中加入1～5mg/mL的Pronase E蛋白酶和20～30U/mL的DNase I配制的。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
每个细胞都是独一无二的，即使是同一器官或组织中的同种类型细胞也都具有异质性。大脑作为生物体最重要的器官，其中包含了多种类型的细胞，均具有其独有的特征，如内皮细胞，特别是为脑血管内皮细胞，其和胶质细胞一起形成血脑屏障，保护大脑不受外来有害物质的侵害及细菌病毒的侵入；同时，脑内皮细胞还给大脑提供氧气和能量物质，并排出大脑内的代谢废物等。但是一直以来，对中枢神经系统中脑内皮细胞的分类一直是空白，对其进行单细胞测序有助于了解脑内皮细胞和其他器官或组织内皮细胞的区别及探讨脑内皮细胞的种类和功能差异，为解决脑血管疾病比如中风，神经退行性疾病如阿尔兹海默症、帕金森症提供帮助；再比如成熟神经元细胞，其高度分化，不可进行细胞分裂，且对氧气比较敏感，在消化过程中神经元细胞容易因为缺氧而死亡。在大脑组织中，内皮细胞与神经细胞在结构和功能上精密相连，且二者的细胞大小、沉降系数差异非常小，如何在保持神经细胞活力的同时有效去除神经元以及其它神经细胞，对能否成功分离得到纯的内皮细胞单细胞至关重要。
本申请提供的这种分离方法，通过将新鲜神经组织与含有蛋白酶和DNA酶的细胞解离消化液混合消化后，得到神经组织细胞混合物。该细胞解离消化液无需预先通氧，其氧气含量小，由于神经元细胞对氧气比较敏感，在消化的过程中大部分神经元细胞会因缺氧而死亡。随后，通过用第一溶液和第二溶液混合配制的细胞梯度分离液对上述神经组织细胞混合物进行分离，由于细胞梯度分离液中含有的硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮，渗透压很低,粘度也很小，扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，且不穿透生物膜，对细胞无毒害，能够特异性地调节细胞梯度分离液对不同类型以及死细胞的沉降性，从而实现纯化内皮细胞的目的。
这种动物神经系统内皮细胞单细胞悬液的制备方法，操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经内皮细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究神经内皮细胞的特性。
说明书附图
图1为实施例1中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
图2为使用实施例1得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞进行亚型分类后各亚型的特异性表达基因。
图3为使用实施例1得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞中高表达的基因进行KEGG分析的结果。
图4为使用实施例1得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞中高表达的基因进行GO分析的结果。
图5为实验组1中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
图6为对照组1中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
图7为对照组2中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
图8为对照组3中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
图9为对照组4中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
图10为对照组5中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞的UMAP 图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的技术方案为：
一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，包括：
步骤S1：将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入内皮细胞培养液，过滤后得到细胞混合物。
其中，新鲜神经组织来自动物组织，且该新鲜神经组织是经过无菌的D-PBS 灌流处理后获得的新鲜动物组织。优选地，获得动物组织的方法为：三溴乙醇麻醉动物后，迅速剪开腹腔，暴露心脏后，注射器插入左心室，剪破右心耳，预冷的不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)进行心脏灌流至完全去除血液，冰上迅速取出大脑，切取感兴趣区域的部位，低温下用刮胡刀片切碎目的组织。利用无钙镁离子的D-PBS缓冲液对哺乳动物进行灌流，彻底去除血细胞，避免了其对后续单细胞测序的影响。如果消化后再单独去除血细胞会导致内皮细胞纯度下降或降低内皮细胞的得率。
灌流后应先在冰上迅速取出哺乳动物的大脑或脊髓，切取感兴趣区域的神经组织，在冰上用刮胡刀片迅速将感兴趣区域切碎，由于神经细胞对氧气比较敏感，在消化的过程中大部分神经细胞会因缺氧而死亡，在梯度分离时会与内皮细胞分离，进而达到纯化内皮细胞的目的。
进一步地，在制备细胞混合物的过程中，将新鲜神经组织与细胞解离消化液混合后于30～34℃下恒温培养30～60min，期间每隔1～4分钟机械混匀一次。优选地，恒温培养的温度为32℃，培养时间为35～45min。其中机械混匀是指在恒温培养过程中将装有培养液的载体(如离心管、试管等)手动晃动或涡旋震动，有利于提高消化效率，使消化更完全。
进一步地，恒温培养后，离心过程中离心力为150～250g，离心时间为 3～5min。优选地，离心力为180～230g，离心时间为4min。离心过程中，神经组织细胞沉降在底部，与其他消化产生的质量较小的杂质分离。离心后去除上清，加入内皮细胞培养液吹打机械解离。为减少移液枪头对细胞的损伤，在使用枪头吹打哺乳动物组织时应先将枪头的尖端在酒精灯上抛光或者使用巴斯德枪头。
进一步地，在制备细胞混合物的过程中，用孔径为35～45μm的细胞筛进行过滤。优选地，细胞筛的孔径为40μm，除去大块组织和杂质。
优选地，内皮细胞培养液中至少含有：青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清。
优选地，细胞解离消化液是在内皮细胞培养液中加入1～5mg/mL的Pronase E蛋白酶和20～30U/mL的DNase I配制的。Pronase E蛋白酶主要是消化黏连细胞的蛋白质，DNaseI混合物的作用主要是消化粘连细胞的DNA，减少双细胞或多细胞的比例，从而提高单细胞的得率。
这种内皮细胞培养液和细胞解离消化液中均不需要预先通氧气，在消化的过程中大部分神经细胞会因缺氧而死亡，在梯度分离时会与内皮细胞分离，进而达到纯化内皮细胞的目的。
步骤S2：将细胞混合物与细胞梯度分离液混合，纯化分离内皮细胞；
其中，细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:0.9～1.1加到第二溶液的上方，第一溶液中含有质量浓度为8～10％的硅胶颗粒(优选地，质量浓度为8.5～9.5％)，第二溶液中含有质量浓度为12～14％的硅胶颗粒(质量浓度为 8.5～9.5％)，硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮。乙烯吡咯烷酮作为一种合成水溶性高分子化合物，其既溶于水，又溶于大部分有机溶剂，毒性很低，生理相溶性好，乙烯吡咯烷酮有优良的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性，不会对分离的细胞产生毒性。
进一步地，第一溶液的配制方法为将含有硅胶颗粒的细胞分离液与内皮细胞培养液按照体积比13～17：183～187混合；优选地，按照体积比14～16：184～186 混合。进一步地，第二溶液的配制方法为将含有硅胶颗粒的细胞分离液与内皮细胞培养液按照体积比19～23：177～181混合；优选地，按照体积比19～21： 1780～1810混合。
细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.2～1.4g/mL。
进一步地，纯化分离内皮细胞的步骤包括：
将细胞混合物与细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离液，将内皮细胞梯度分离液在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间部分的内皮细胞层，洗涤。优选地，离心力为2200～2500g、离心时间为15～17min。
优选地，洗涤内皮细胞层的步骤包括：
将内皮细胞层与内皮细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min (优选为在180～230g下离心2min)，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统内皮细胞单细胞混悬液。
更为优选地，纯化分离内皮细胞步骤中的离心采用水平转子离心机。在该步骤中，不使用定角的离心机，主要是因为定角转子可能会使细胞聚集于某一侧而导致分离效果不佳。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，包括：
1.配制单细胞解离专用的消化缓冲液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入44.5mL的DMEM培养基，5mL的FBS，500μL青霉素/链霉素双抗及终浓度为2mg/mL的Pronase E蛋白酶和终浓度为25U/mL的DNase I混合物，配制好消化缓冲液6mL/管进行分装，-20℃及以下温度保存备用。
2.配制内皮细胞培养液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入44.5mL 的DMEM培养基，5mL的FBS，500μL青霉素/链霉素双抗，4℃下保存。
3.三溴乙醇麻醉动物后，迅速剪开腹腔，暴露心脏后，注射器插入左心室，剪破右心耳，预冷的不含钙镁离子的D-PBS进行心脏灌流至完全去除血液，冰上迅速取出大脑，切取感兴趣区域的部位，低温下用刮胡刀片切碎目的组织。
4.将切碎后的组织与单细胞解离专用的消化缓冲液混合，32℃恒温培养箱中孵育45min，中间每隔2分钟上下颠倒混匀一次。
5.在上述步骤进行的同时，于无菌超净台中配置如表1所示的第一溶液和第二溶液后，将第一溶液缓慢倒入位于15mL离心管的第二溶液中，得到细胞梯度分离液。表1中细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.3g/mL。
表1.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 150 | 1850 | 2000 |
| 第二溶液 | 210 | 1790 | 2000 |
6.神经组织消化后200g短暂离心4min，去掉上清，加入6mL内皮细胞培养液吹打机械解离至无明显组织块。
7.将预先用无钙镁离子的D-PBS浸润过的20μm的无菌细胞筛在超净工作台中套至50mL离心管中，用1mL的移液枪在无菌环境下将上述内皮细胞培养液加入孔径为40μm的细胞筛中过滤杂质及未被消化的组织。
8.将过滤过的内皮细胞培养液非常小心地加入到第4步的细胞梯度分离液中，配制成完整的内皮细胞梯度分离液，此时离心管中共计10mL溶液。将上述完整的内皮细胞梯度分离液在室温下水平转子离心机2500g离心15min。
9.离心后的内皮细胞梯度分离液上层6mL为含有碎片的内皮细胞培养基，中间层2mL是内皮细胞细胞，最下层2mL是各类神经系统细胞及死细胞。将最上层的培养基吸弃，中间层的2mL溶液转移至新的15mL离心管中。
11.在上述溶液中加入6mL内皮细胞培养液，小心混匀后，200g，室温条件下水平转子离心2min，用1mL移液枪洗弃上清，沉淀用不含血清的DMEM 混合均匀，台盘蓝染色计算存活率。
实施例2
本实施例提供一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，包括：
1.配制单细胞解离专用的消化缓冲液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入44.5mL的DMEM培养基，5mL的FBS，500μL青霉素/链霉素双抗及终浓度为1mg/mL的Pronase E蛋白酶和终浓度为30U/mL的DNase I混合物，配制好消化缓冲液6mL/管进行分装，-20℃及以下温度保存备用。
2.配制内皮细胞培养液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入44.5mL 的DMEM培养基，5mL的FBS，500μL青霉素/链霉素双抗，4℃下保存。
3.三溴乙醇麻醉动物后，迅速剪开腹腔，暴露心脏后，注射器插入左心室，剪破右心耳，预冷的不含钙镁离子的D-PBS进行心脏灌流至完全去除血液，冰上迅速取出大脑，切取感兴趣区域的部位，低温下用刮胡刀片切碎目的组织。
4.将切碎后的组织与单细胞解离专用的消化缓冲液混合，33℃恒温培养箱中孵育40min，中间每隔2分钟上下颠倒混匀一次。
5.在上述步骤进行的同时，于无菌超净台中配置如表2所示的第一溶液和第二溶液后，将第一溶液缓慢倒入位于15mL离心管的第二溶液中，得到细胞梯度分离液。表2中细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.3g/mL。
表2.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 170 | 1830 | 2000 |
| 第二溶液 | 190 | 1810 | 2000 |
6.神经组织消化后250g短暂离心3min，去掉上清，加入6mL内皮细胞培养液吹打机械解离至无明显组织块。
7.将预先用无钙镁离子的D-PBS浸润过的20μm的无菌细胞筛在超净工作台中套至50mL离心管中，用1mL的移液枪在无菌环境下将上述内皮细胞培养液加入孔径为45μm的细胞筛中过滤杂质及未被消化的组织。
8.将过滤过的内皮细胞培养液非常小心地加入到第4步的细胞梯度分离液中，配制成完整的内皮细胞梯度分离液，此时离心管中共计10mL溶液。将上述完整的内皮细胞梯度分离液在室温下水平转子离心机2500g离心15min。
9.离心后的内皮细胞梯度分离液上层6mL为含有碎片的内皮细胞培养基，中间层2mL是内皮细胞细胞，最下层2mL是各类神经系统细胞及死细胞。将最上层的培养基吸弃，中间层的2mL溶液转移至新的15mL离心管中。
11.在上述溶液中加入6mL内皮细胞培养液，小心混匀后，250g，室温条件下水平转子离心1min，用1mL移液枪洗弃上清，沉淀用不含血清的DMEM 混合均匀，台盘蓝染色计算存活率。
实施例3
本实施例提供一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，包括：
1.配制单细胞解离专用的消化缓冲液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入44.5mL的DMEM培养基，5mL的FBS，500μL青霉素/链霉素双抗及终浓度为3mg/mL的Pronase E蛋白酶和终浓度为20U/mL的DNase I混合物，配制好消化缓冲液6mL/管进行分装，-20℃及以下温度保存备用。
2.配制内皮细胞培养液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入44.5mL 的DMEM培养基，5mL的FBS，500μL青霉素/链霉素双抗，4℃下保存。
3.三溴乙醇麻醉动物后，迅速剪开腹腔，暴露心脏后，注射器插入左心室，剪破右心耳，预冷的不含钙镁离子的D-PBS进行心脏灌流至完全去除血液，冰上迅速取出大脑，切取感兴趣区域的部位，低温下用刮胡刀片切碎目的组织。
4.将切碎后的组织与单细胞解离专用的消化缓冲液混合，33℃恒温培养箱中孵育20min，中间每隔2分钟上下颠倒混匀一次。
5.在上述步骤进行的同时，于无菌超净台中配置如表3所示的第一溶液和第二溶液后，将第一溶液缓慢倒入位于15mL离心管的第二溶液中，得到细胞梯度分离液。表3中细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.3g/mL。
表3.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 130 | 1870 | 2000 |
| 第二溶液 | 230 | 1770 | 2000 |
6.神经组织消化后150g短暂离心5min，去掉上清，加入6mL内皮细胞培养液吹打机械解离至无明显组织块。
7.将预先用无钙镁离子的D-PBS浸润过的20μm的无菌细胞筛在超净工作台中套至50mL离心管中，用1mL的移液枪在无菌环境下将上述内皮细胞培养液加入孔径为35μm的细胞筛中过滤杂质及未被消化的组织。
8.将过滤过的内皮细胞培养液非常小心地加入到第4步的细胞梯度分离液中，配制成完整的内皮细胞梯度分离液，此时离心管中共计10mL溶液。将上述完整的内皮细胞梯度分离液在室温下水平转子离心机2000g离心20min。
9.离心后的内皮细胞梯度分离液上层6mL为含有碎片的内皮细胞培养基，中间层2mL是内皮细胞细胞，最下层2mL是各类神经系统细胞及死细胞。将最上层的培养基吸弃，中间层的2mL溶液转移至新的15mL离心管中。
11.在上述溶液中加入6mL内皮细胞培养液，小心混匀后，150g，室温条件下水平转子离心3min，用1mL移液枪洗弃上清，沉淀用不含血清的DMEM 混合均匀，台盘蓝染色计算存活率。
实验例一
下面对本申请实施例1中得到的神经系统内皮单细胞进行如下测试：
1.将上述步骤中得到的细胞进行台盘蓝染色，活性达到80％后，按照10Xgenomics单细胞测序仪器的要求进行后续操作，对得到的单细胞进行测序，生信分析，Seurat软件降维处理后得到二维的细胞分布结果，用已知的内皮细胞标志物对所得到的细胞进行标记，观察内皮细胞所占比例；
2.利用Seurat软件对所得到的的内皮细胞进行亚型分类，并计算出每一群细胞的特异性高表达基因；
3.利用David网站对内皮细胞高表达的基因进行信号通路分析，观察其参与的主要信号通路有哪些；
结果如图1～图3所示：
图1为使用本发明得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞，从图中可知，几乎所有的细胞都能被内皮细胞的标志物Cldn5标记上，说明得到的细胞纯度高。
图2是使用本方法得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞进行亚型分类后各亚型的特异性表达基因。由此说明大脑中的内皮细胞种类多、功能复杂，对其进一步研究有重要的临床意义。
图3和图4为使用本方法得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞中高表达的基因进行KEGG和GO分析的结果，从图中可知得到的细胞中高表达的基因大部分都是参与炎症调节的通路，再次证明所得到的的都是神经系统内皮细胞这一结论。
实验例二
本实验例采用实施例1的方法对比五种不同细胞分离液对内皮细胞进行分离效果：
实验组：采用本申请实施例1中提供的细胞梯度分离液。
对照组1：采用表4所示的第一溶液和第二溶液配制细胞梯度分离液。其中，细胞分离液与实施例1一致。
表4.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 100 | 1900 | 2000 |
| 第二溶液 | 180 | 1820 | 2000 |
对照组2：采用表5所示的第一溶液和第二溶液配制细胞梯度分离液，其中，细胞分离液与实施例1一致。
表5.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 180 | 1820 | 2000 |
| 第二溶液 | 240 | 1760 | 2000 |
对照组3：采用如表6所示的第一溶液和第二溶液配制细胞梯度分离液。其中，细胞分离液为Ficoll。表6.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 130 | 1870 | 2000 |
| 第二溶液 | 230 | 1770 | 2000 |
对照组4：采用如表7所示的第一溶液和第二溶液配制细胞梯度分离液。其中，细胞分离液为sucrose。
表7.细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 细胞分离液(μL) | 内皮细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 130 | 1870 | 2000 |
| 第二溶液 | 230 | 1770 | 2000 |
对照组5：采用如表8所示的第一溶液和第二溶液配制细胞梯度分离液。其中，细胞分离液为Optiprep。
表8.细胞梯度分离液的配制
实验结果为：
实验组：如图5所示，用血管内皮细胞的标志物Cldn5标记得到的细胞发现Cldn5几乎可以标记所有的细胞，说明利用该条件得到的单细胞纯度高。
对照组1：如图6所示，用血管内皮细胞的标志物Cldn5标记得到的细胞发现Cldn5可以标记约80％的细胞，其他的细胞基本都是血管内皮细胞的同类型细胞，如周细胞。
对照组2：如图7所示，用血管内皮细胞的标志物Cldn5标记得到的细胞发现Cldn5可以标记约56％的细胞，其他类型的细胞包括周细胞和平滑肌细胞。
对照组3：如图8所示，用血管内皮细胞的标志物Cldn5标记得到的细胞发现Cldn5可以标记约38％的细胞，其他类型的细胞除了内皮细胞外，还包括神经元和胶质细胞。
对照组4：如图9所示，用血管内皮细胞的标志物Cldn5标记得到的细胞发现Cldn5可以标记约31％的细胞，得到的细胞以神经元和胶质细胞为主。
对照组5：如图10所示，用血管内皮细胞的标志物Cldn5标记得到的细胞发现Cldn5可以标记约24％的细胞，得到的细胞以神经元和胶质细胞为主。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，包括：
将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入内皮细胞培养液，过滤后得到细胞混合物；
将所述细胞混合物与细胞梯度分离液混合，纯化分离内皮细胞；
其中，所述细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:0.9～1.1加到第二溶液的上方，所述第一溶液中含有质量浓度为8～10％的硅胶颗粒，所述第二溶液中含有质量浓度为12～14％的硅胶颗粒，所述硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮；
所述第一溶液的配制方法为将含有所述硅胶颗粒的细胞分离液与所述内皮细胞培养液按照体积比13～17：183～187混合；
所述第二溶液的配制方法为将含有所述硅胶颗粒的细胞分离液与所述内皮细胞培养液按照体积比19～23：177～181混合；
所述细胞分离液中所述硅胶颗粒的质量浓度为1.2～1.4g/mL；
所述纯化分离内皮细胞的步骤包括：
将所述细胞混合物与细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离液，将所述内皮细胞梯度分离液在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间部分的内皮细胞层，洗涤；
洗涤所述内皮细胞层的步骤包括：
将所述内皮细胞层与所述内皮细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统内皮细胞单细胞混悬液；
在制备所述细胞混合物的过程中，将所述新鲜神经组织与所述细胞解离消化液混合后于30～34℃下恒温培养30～60min，期间每隔1～4分钟机械混匀一次；
所述内皮细胞培养液中至少含有：青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清；
所述细胞解离消化液是在所述内皮细胞培养液中加入1～5mg/mL的Pronase E蛋白酶和20～30U/mL的DNase I配制的。
2.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述纯化分离内皮细胞步骤中的离心采用水平转子离心机。
3.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述恒温培养后，离心过程中离心力为150～250g，离心时间为3～5min。
4.根据权利要求1所述的动物神经系统内皮细胞单细胞的分离方法，其特征在于，在制备所述细胞混合物的过程中，用孔径为35～45μm的细胞筛进行过滤。
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