CN114507642A - 一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物神经系统周细胞单细胞悬液的制备方法，属于生物技术领域。该方法包括：将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入总细胞培养液，过滤后得到细胞混合物A；将所述细胞混合物A首先与内皮细胞梯度分离液混合，纯化分离得到含有周细胞的内皮细胞层。随后利用碘克沙醇溶液进一步分离得到纯的周细胞，该方法操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经周细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究神经周细胞的特性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法。
背景技术
血管在神经活性方面发挥了举足轻重的作用。2001年美国国家神经疾病和中风研究所的一次会议中正式提出神经血管单元这一概念。之后，神经血管单元变成了神经科学中的一个热点领域。这些研究揭示了神经元的工作是一个多维的、高度协调的过程，需要多种细胞的参与并连接不同的信号通路。这其中对周细胞的研究最少。血脑屏障是血液循环系统和中枢神经系统之间的一个选择透过性区域，血脑屏障由内皮细胞组成，起到保护大脑和中枢神经系统及其功能的作用，周细胞在血脑屏障形成以及维持其选择透过性的功能上具有重要作用。曾经有观点认为星形胶质细胞在血脑屏障形成中有关键作用，但是后来发现，周细胞在血脑屏障形成中的作用更大，周细胞负责内皮细胞间的囊泡运输以及紧密连接的形成。此外周细胞抑制中枢神经系统免疫细胞对于血脑屏障形成的影响，并且还抑制增加血管渗透性的相关分子表达。所以周细胞在血脑屏障形成过程中有着至关重要的作用。
周细胞同样在维持血脑屏障功能方面起着重要的作用，它是通过控制血液的流动来发挥这一作用的。周细胞是一种可以收缩的细胞，通过细胞的收缩，周细胞可以控制哪些微粒能够在血管中流动，这种调控对于维持神经系统的功能是十分有用的，因为这可以阻止一些分子尤其是大分子进入大脑中，以免对大脑造成损伤。如果没有周细胞，通过转胞吞作用一些大的血浆蛋白可以很容易进入大脑。此外，周细胞在促进微循环、减缓大脑衰老方面也有重要作用。
某些周细胞可以调控内皮细胞增殖分化，进而调控血管生成。例如，微脉管周细胞，这种周细胞由于缺乏肌动蛋白可能不能收缩，这些细胞通过间隙连接与内皮细胞进行联系，调控内皮细胞增殖或者选择性的抑制，如果没有这一调控，血管增生以及血管畸形就会发生。中风作为我国的第一大死因，研究周细胞的功能能为治疗中风提供新的方法和策略。
但是中枢神经系统中周细胞的种类及其功能尚不完全清楚，单细胞测序技术对我们精准地了解某种类型的细胞的功能及他们之间的相互作用都起到不可比拟的作用，但是目前尚未有专门针对哺乳动物神经组织中周细胞单细胞悬液进行制备的方法。
发明内容
本发明针对上述缺陷，提供一种动物神经系统周细胞单细胞悬液的制备方法。该方法操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经周细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究周细胞的特性。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，包括：
将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入总细胞培养液，过滤后得到细胞混合物A；
将细胞混合物A与内皮细胞梯度分离液混合，纯化分离后，得到包含有周细胞和内皮细胞的细胞混合物B，其中内皮细胞梯度分离液由内皮细胞分离液与总细胞培养液复配形成，内皮细胞分离液中含有质量浓度为1.2～1.4g/mL的硅胶颗粒，硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮。；
将细胞混合物B与周细胞梯度分离液混合，纯化分离周细胞单细胞；
其中，周细胞梯度分离液由周细胞分离液与总细胞培养液复配形成，周细胞分离液中含有体积百分数为58～62％的碘克沙醇。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述周细胞梯度分离液是通过将第三溶液按照体积比3:3.8～4.2加到第四溶液的上方，第三溶液中周细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为1～2：18～19；第四溶液中周细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为9～11：89～91。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述内皮细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:2～4加到第二溶液的上方，第一溶液中内皮细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为2～3：47～48；第二溶液中内皮细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为7～8:42～43。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述制备细胞混合物B的步骤包括：
将细胞混合物A与内皮细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离体系，将内皮细胞梯度分离体系在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间含有内皮细胞和周细胞的内皮细胞层，洗涤。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述洗涤内皮细胞层的步骤包括：
将内皮细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到内皮细胞单细胞混悬液和细胞混合物B。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述制备周细胞单细胞的步骤包括：
将细胞混合物B加至周细胞梯度分离液的上方，得到完整的周细胞梯度分离体系，将周细胞梯度分离体系在室温下700～900g离心15～20min，去除最上层的细胞培养基，以及中间层的血管内皮细胞，保留最下面1mL的周细胞层，洗涤。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述洗涤周细胞层的步骤包括：
将周细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统周细胞单细胞混悬液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在制备细胞混合物B以及周细胞单细胞的步骤中，离心均采用水平转子离心机。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述总细胞培养液中至少含有：青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
在大脑组织中，周细胞与神经内皮细胞、血管平滑肌细胞在结构和功能上精密相连，且三者的细胞大小、沉降系数差异非常小。且，相对于内皮细胞，周细胞的数量较少，这就使得采用现有的细胞分离方法难以从神经内皮细胞中分离出周细胞单细胞。如何在保持周细胞活力的同时有效去除神经元以及其它神经细胞，对能否成功分离得到纯的周细胞单细胞至关重要。
本申请提供的这种分离方法，通过将新鲜神经组织与含有蛋白酶和DNA酶的细胞解离消化液混合消化后，得到神经组织细胞混合物。该细胞解离消化液无需预先通氧，其氧气含量小，由于神经元细胞对氧气比较敏感，在消化的过程中大部分神经元细胞会因缺氧而死亡。随后，通过用第一溶液和第二溶液首先将含有周细胞的内皮细胞分离出来，由于内皮细胞梯度分离液中含有的硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮，渗透压很低,粘度也很小，扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，且不穿透生物膜，对细胞无毒害，能够特异性地调节细胞梯度分离液对不同类型以及死细胞的沉降性，从而实现纯化内皮细胞的目的。随后，通过用第三溶液和第四溶液将周细胞与血管内皮细胞分离，最终得到纯净的周细胞，由于周细胞梯度分离液中含有碘克沙醇，可用于形成连续或不连续的梯度，从而实现纯化周细胞的目的。
这种动物神经系统周细胞单细胞悬液的制备方法，操作简便、成本低、效率高，且无需借助特定的仪器、适合工业化生产，通过该方法制备得到的神经周细胞单细胞可用来进行单细胞测序或者其他分析，有利于深入研究神经周细胞的特性。
附图说明
图1为实施例1中得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞的UMAP图，从图中可知几乎所有的细胞都能被周细胞的标志物Kcnj8标记上，说明得到的细胞纯度高。
图2为使用实施例1得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞进行亚型分类后的结果。
图3为使用实施例1得到的小鼠大脑皮层中的神经系统内皮单细胞中高表达的基因进行GO分析的结果。
图4为实验例二采用对照例1提供的周细胞梯度分离液，得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞的UMAP图。
图5为实验例二采用对照例2提供的周细胞梯度分离液，得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞的UMAP图。
图6为实验例二采用对照例3提供的周细胞梯度分离液，得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞的UMAP图。
图7为实验例二采用对照例4提供的周细胞梯度分离液，得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞的UMAP图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的技术方案为：
一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，包括：
步骤S1：将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入总细胞培养液，过滤后得到细胞混合物A；
其中，新鲜神经组织来自动物组织，且该新鲜神经组织是经过灌流处理后获得的新鲜动物组织。优选地，获得动物组织的方法为：三溴乙醇麻醉动物后，迅速剪开腹腔，暴露心脏后，注射器插入左心室，剪破右心耳，预冷的不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)进行心脏灌流至完全去除血液，冰上迅速取出大脑，切取感兴趣区域的部位，低温下用刮胡刀片切碎目的组织。利用无钙镁离子的D-PBS缓冲液对哺乳动物进行灌流，彻底去除血细胞，避免了其对后续测序的影响。如果消化后再单独去除血细胞会导致周细胞纯度下降或降低周细胞的得率。
灌流后应先在冰上迅速取出哺乳动物的大脑或脊髓，切取感兴趣区域的神经组织，在冰上用刮胡刀片迅速将感兴趣区域切碎，由于神经细胞对氧气比较敏感，在消化的过程中大部分神经细胞会因缺氧而死亡，在梯度分离时会与包含周细胞的内皮细胞分离，进而纯化得到内皮细胞，最后进一步对周细胞利用碘克沙醇溶液进行分离纯化。
进一步地，在制备细胞混合物的过程中，将新鲜神经组织与细胞解离消化液混合后于30～34℃下恒温培养30～60min，期间每隔1～4分钟机械混匀一次。优选地，恒温培养的温度为32℃，培养时间为35～45min。其中机械混匀是指在恒温培养过程中将装有培养液的载体(如离心管、试管等)手动晃动或涡旋震动，有利于提高消化效率，使消化更完全。
进一步地，恒温培养后，离心过程中离心力为150～250g，离心时间为 3～5min。优选地，离心力为180～230g，离心时间为4min。离心过程中，神经组织细胞沉降在底部，与其他消化产生的质量较小的杂质分离。离心后去除上清，加入总细胞培养液吹打机械解离。为减少移液枪头对细胞的损伤，在使用枪头吹打哺乳动物组织时应先将枪头的尖端在酒精灯上抛光或者使用巴斯德枪头。
进一步地，在制备细胞混合物A的过程中，用孔径为35～45μm的细胞筛进行过滤。优选地，细胞筛的孔径为40μm，除去大块组织和杂质。
优选地，总细胞培养液中至少含有：青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清。
优选地，细胞解离消化液是在总细胞培养液中加入1～5mg/mL的Pronase E 蛋白酶和20～30U/mL的DNase I配制的。Pronase E蛋白酶主要是消化黏连细胞的蛋白质，DNaseI混合物的作用主要是消化粘连细胞的DNA，减少双细胞或多细胞的比例，从而提高单细胞的得率。
这种总细胞培养液和细胞解离消化液中均不需要预先通氧气，在消化的过程中大部分神经细胞会因缺氧而死亡，在梯度分离时会与包含有周细胞的内皮细胞层分离，进而达到纯化细胞混合物A的目的。
步骤S2：将细胞混合物A与内皮细胞梯度分离液混合，纯化分离后，得到包含有周细胞和内皮细胞的细胞混合物B。
其中内皮细胞梯度分离液由内皮细胞分离液与总细胞培养液复配形成，内皮细胞分离液中含有质量浓度为1.2～1.4g/mL的硅胶颗粒，优选地，质量浓度为1.3g/mL。硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮；乙烯吡咯烷酮作为一种合成水溶性高分子化合物，其既溶于水，又溶于大部分有机溶剂，毒性很低，生理相溶性好，乙烯吡咯烷酮有优良的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性，不会对分离的细胞产生毒性。
进一步地，内皮细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:2～4加到第二溶液的上方，第一溶液中内皮细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为 2～3：47～48，优选地按照体积比1：19混合；第二溶液中内皮细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为7～8:42～43，优选地按照体积比3：17混合。
进一步地，制备细胞混合物B的步骤包括：
将细胞混合物A与内皮细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离体系，将内皮细胞梯度分离体系在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间混合有内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞的内皮细胞层，洗涤。优选地，离心力为2200～2500g、离心时间为15～17min。
优选地，洗涤内皮细胞层的步骤包括：
将内皮细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min(优选为在180～230g下离心2min)，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统内皮细胞单细胞混悬液和细胞混合物B。
细胞混合物B中主要为周细胞，同时还含有部分内皮细胞、平滑肌细胞等，血管主要是由内皮细胞及周细胞/平滑肌细胞组成，周细胞代表一种特异性的、同平滑肌细胞密切相关的间质细胞类型，有缠绕血管内皮细胞管腔的指状突起。在正常组织中，周细胞为内皮提供旁分泌支持信号。由于这三类细胞的沉降系数差异很小，普通方法很难分离，业界尚未有成熟的分离三种细胞的方法，为此我们利用梯度离心对三类细胞进行了纯化分离，以除去其中混有的内皮细胞和平滑肌细胞，得到纯的周细胞单细胞。
更为优选地，纯化分离内皮细胞步骤中的离心采用水平转子离心机。在该步骤中，不使用定角的离心机，主要是因为定角转子可能会使细胞聚集于某一侧而导致分离效果不佳。
步骤S3：将细胞混合物B与周细胞梯度分离液混合，纯化分离周细胞单细胞。
其中，周细胞梯度分离液由周细胞分离液与总细胞培养液复配形成，周细胞分离液中含有体积百分数为58～62％的碘克沙醇，优选地，碘克沙醇的体积分数为60％。碘克沙醇可形成连续或不连续的梯度；非离子，等渗溶液，具有代谢惰性，且对细胞无毒，能够特异性的分离病毒，细胞器，大分子或细胞等，从而实现纯化周细胞的目的。
进一步地，周细胞梯度分离液是通过将第三溶液按照体积比3:3.8～4.2加到第四溶液的上方，第三溶液中周细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为 1～2：18～19(优选为1.5～18.5)；第四溶液中周细胞分离液与总细胞培养液之间的体积比为9～11：89～91(优选为1:9)。
进一步地，制备周细胞单细胞的步骤包括：
将细胞混合物B加至周细胞梯度分离液的上方，得到完整的周细胞梯度分离体系，将周细胞梯度分离体系在室温下700～900g离心15～20min，(优选为在750～850g离心14～16min)，去除最上层的细胞培养基，以及中间层的血管内皮细胞，保留最下面0.5～1.5mL(优选为0.8～1.2mL)的周细胞层，洗涤。
优选地，洗涤周细胞层的步骤包括：
将周细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下150～200g离心1～3min(优选为在180～230g下离心2min)，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统周细胞单细胞混悬液。
更为优选地，纯化分离周细胞步骤中的离心采用水平转子离心机。在该步骤中，不使用定角的离心机，主要是因为定角转子可能会使细胞聚集于某一侧而导致分离效果不佳。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，包括：
(1)配制单细胞解离专用的消化缓冲液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入53.4mL的DMEM培养基，6mL的FBS，600μL青霉素/链霉素双抗及终浓度为2mg/mL的Pronase E蛋白酶和终浓度为25U/mL的DNase I混合物，配制好消化缓冲液6mL/管进行分装，-20℃及以下温度保存备用。
(2)配制总细胞培养液：在无菌的50mL离心管中依次分别加入53.4mL 的DMEM培养基，6mL的FBS，600μL青霉素/链霉素双抗，4℃下保存。
(3)三溴乙醇麻醉动物后，迅速剪开腹腔，暴露心脏后，注射器插入左心室，剪破右心耳，预冷的不含钙镁离子的D-PBS进行心脏灌流至完全去除血液，冰上迅速取出大脑，切取感兴趣区域的部位，低温下用刮胡刀片切碎目的组织。
(4)将切碎后的组织与单细胞解离专用的消化缓冲液混合，32℃恒温培养箱中孵育45min，中间每隔2分钟上下颠倒混匀一次。
(5)在上述步骤进行的同时，于无菌超净台中配置如表1所示的第一溶液和第二溶液后，将第一溶液缓慢加入位于15mL离心管的第二溶液上方，得到内皮细胞梯度分离液。表1中细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.3g/mL。
表1.内皮细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 内皮细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 100 | 1900 | 2000 |
| 第二溶液 | 300 | 1700 | 2000 |
(6)神经组织消化后200g短暂离心4min，去掉上清，加入6mL总细胞培养液吹打机械解离至无明显组织块。
(7)将预先用无钙镁离子的D-PBS浸润过的20μm的无菌细胞筛在超净工作台中套至50mL离心管中，用1mL的移液枪在无菌环境下将上述总细胞培养液加入孔径为40μm的细胞筛中过滤杂质及未被消化的组织，得到细胞混合物A。
(8)将细胞混合物A非常小心地加入到第(5)步的细胞梯度分离液中，配制成完整的内皮细胞梯度分离液，此时离心管中共计10mL溶液。将上述完整的内皮细胞梯度分离液在室温下水平转子离心机2500g离心15min。
(9)离心后的内皮细胞梯度分离液上层6mL为含有碎片的内皮细胞培养基，中间层2mL是内皮细胞细胞，最下层2mL是各类神经系统细胞及死细胞。将最上层的培养基吸弃，中间层的2mL溶液转移至新的15mL离心管中，与所述总细胞培养液混合后，在室温下200g离心2min，用不含胎牛血清的DMEM 培养基将所得沉淀混合均匀，得到血管细胞混合物B。
(10)于无菌超净台中配置如表2所示的第三溶液和第四溶液后，将第三溶液缓慢加入位于15mL离心管的第四溶液上方，得到周细胞梯度分离液。表 2中周细胞分离液中碘克沙醇的含量是60％。
表2.内皮细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 周细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第三溶液 | 75 | 925 | 1000 |
| 第四溶液 | 100 | 900 | 1000 |
(11)将(9)中得到的细胞混合物B非常小心地加入到第10步的周细胞梯度分离液中，配制成完整的周细胞梯度分离体系，此时离心管中共计4mL溶液。将上述完整的周细胞梯度分离体系在室温下水平转子离心机800g离心15 min。
(12)离心后的周细胞梯度分离体系上层2mL为内皮细胞溶液，中间层1 mL是血管内皮细胞，最下层1mL是周细胞。将最上面两层吸弃，下层的1mL 溶液转移至新的15mL离心管中。将周细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下200g离心2min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到周细胞单细胞混悬液。
(13)在上述溶液中加入5mL总细胞培养液，小心混匀后，200g，室温条件下水平转子离心2min，用1mL移液枪洗弃上清，沉淀用不含血清的DMEM 混合均匀，台盘蓝染色计算存活率。
实施例2
本实施例提供一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其步骤与实施例1基本一致，不同之处在于以下步骤：
(5)在上述步骤进行的同时，于无菌超净台中配置如表3所示的第一溶液和第二溶液后，将第一溶液缓慢加入位于15mL离心管的第二溶液上方，得到内皮细胞梯度分离液。表3中细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.4g/mL。
表3.内皮细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 内皮细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 80 | 1920 | 2000 |
| 第二溶液 | 280 | 1720 | 2000 |
(8)将细胞混合物A非常小心地加入到第(5)步的细胞梯度分离液中，配制成完整的内皮细胞梯度分离液，此时离心管中共计10mL溶液。将上述完整的内皮细胞梯度分离液在室温下水平转子离心机2000g离心20min。
(9)离心后的内皮细胞梯度分离液上层6mL为含有碎片的内皮细胞培养基，中间层2mL是内皮细胞细胞，最下层2mL是各类神经系统细胞及死细胞。将最上层的培养基吸弃，中间层的2mL溶液转移至新的15mL离心管中，与所述总细胞培养液混合后，在室温下250g离心1min，用不含胎牛血清的DMEM 培养基将所得沉淀混合均匀，得到血管细胞混合物B。
(10)于无菌超净台中配置如表4所示的第三溶液和第四溶液后，将第三溶液缓慢加入位于15mL离心管的第四溶液上方，得到周细胞梯度分离液。表 4中周细胞分离液中碘克沙醇的含量是62％。
表4.内皮细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 周细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第三溶液 | 50 | 950 | 1000 |
| 第四溶液 | 90 | 910 | 1000 |
(11)将(9)中得到的细胞混合物B非常小心地加入到第10步的周细胞梯度分离液中，配制成完整的周细胞梯度分离体系，此时离心管中共计4mL溶液。将上述完整的周细胞梯度分离体系在室温下水平转子离心机700g离心 12min。
(12)离心后的周细胞梯度分离体系上层2mL为内皮细胞溶液，中间层1 mL是血管内皮细胞，最下层1mL是周细胞。将最上面两层吸弃，下层的1mL 溶液转移至新的15mL离心管中。将周细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下250g离心1min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到周细胞单细胞混悬液。
实施例3
本实施例提供一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其步骤与实施例1基本一致，不同之处在于以下步骤：
(5)在上述步骤进行的同时，于无菌超净台中配置如表5所示的第一溶液和第二溶液后，将第一溶液缓慢加入位于15mL离心管的第二溶液上方，得到内皮细胞梯度分离液。表5中细胞分离液中硅胶颗粒的质量浓度为1.2g/mL。
表5.内皮细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 内皮细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 120 | 1880 | 2000 |
| 第二溶液 | 320 | 1680 | 2000 |
(8)将细胞混合物A非常小心地加入到第(5)步的细胞梯度分离液中，配制成完整的内皮细胞梯度分离液，此时离心管中共计10mL溶液。将上述完整的内皮细胞梯度分离液在室温下水平转子离心机2300g离心18min。
(9)离心后的内皮细胞梯度分离液上层6mL为含有碎片的内皮细胞培养基，中间层2mL是内皮细胞细胞，最下层2mL是各类神经系统细胞及死细胞。将最上层的培养基吸弃，中间层的2mL溶液转移至新的15mL离心管中，与所述总细胞培养液混合后，在室温下150g离心3min，用不含胎牛血清的DMEM 培养基将所得沉淀混合均匀，得到血管细胞混合物B。
(10)于无菌超净台中配置如表6所示的第三溶液和第四溶液后，将第三溶液缓慢加入位于15mL离心管的第四溶液上方，得到周细胞梯度分离液。表6中周细胞分离液中碘克沙醇的含量是58％。
表6.内皮细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 周细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第三溶液 | 100 | 900 | 1000 |
| 第四溶液 | 110 | 890 | 1000 |
(11)将(9)中得到的细胞混合物B非常小心地加入到第10步的周细胞梯度分离液中，配制成完整的周细胞梯度分离体系，此时离心管中共计4mL溶液。将上述完整的周细胞梯度分离体系在室温下水平转子离心机900g离心12min。
(12)离心后的周细胞梯度分离体系上层2mL为内皮细胞溶液，中间层1 mL是血管内皮细胞，最下层1mL是周细胞。将最上面两层吸弃，下层的1mL 溶液转移至新的15mL离心管中。将周细胞层与总细胞培养液混合后，在室温下200g离心3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到周细胞单细胞混悬液。
实验例一
下面对本申请得到的神经系统周单细胞进行如下测试：
1.将上述步骤中得到的细胞进行台盘蓝染色，活性达到80％后，按照10Xgenomics单细胞测序仪器的要求进行后续操作，对得到的单细胞进行测序，生信分析，Seurat软件降维处理后得到二维的细胞分布结果，用已知的周细胞标志物对所得到的细胞进行标记，观察周细胞所占比例。
2.利用Seurat软件对所得到的周细胞进行亚型分类，并计算出每一群细胞的特异性高表达基因。
3.利用David网站对周细胞高表达的基因进行信号通路分析，观察其参与的主要信号通路有哪些。
结果如图1～图3所示：
图1为使用本发明得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞，从图中可知利用神经系统周细胞已知的标志物Kcnj8几乎可以标记所有得到的单细胞。
图2是使用本方法得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞进行亚型分类，可以得到四个亚群。由此说明大脑中的周细胞种类多、功能复杂，对其进一步研究有重要的临床意义；
图3为使用本方法得到的小鼠大脑皮层中的神经系统周细胞中高表达的基因进行GO分析的结果，从图中可知得到的细胞中高表达的基因大部分都是参与血管生成的通路，再次证明所得到的的都是神经系统周细胞这一结论。
实验例二
本实验例采用实施例1的方法对比四种不同细胞分离液对周细胞的分离效果：
实验组：采用本申请实施例1中提供的细胞梯度分离液。
对照组1：只采用表7所示的第一溶液和第二溶液分离纯化周细胞。
表7.血管细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 血管细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第一溶液 | 150 | 1850 | 2000 |
| 第二溶液 | 210 | 1790 | 2000 |
对照组2：只采用表8所示的第三溶液和第四溶液分离纯化周细胞。
表8.周细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 周细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第三溶液 | 125 | 875 | 1000 |
| 第四溶液 | 120 | 880 | 1000 |
对照组3：采用如表9所示的第三溶液和第四溶液配制周细胞梯度分离液。其中，细胞分离液为Ficoll。
表9.周细胞梯度分离液的配制
| 溶液 | 周细胞分离液(μL) | 总细胞培养液(μL) | 合计(μL) |
| 第三溶液 | 75 | 925 | 1000 |
| 第四溶液 | 100 | 900 | 1000 |
对照组4：采用如表10所示的第三溶液和第四溶液配制周细胞梯度分离液。其中，细胞分离液为sucrose。
表10.周细胞梯度分离液的配制
实验结果为：
实验组(图1)：用周细胞的标志物Kcnj8标记得到的细胞发现Kcnj8几乎可以标记所有的细胞，说明利用该条件得到的单细胞纯度高；
对照组1(图4)：用周细胞的标志物Kcnj8标记得到的细胞发现Kcnj8可以标记约20％的细胞，其余的是神经细胞和血管细胞；
对照组2(图5)：用周细胞的标志物Kcnj8标记得到的细胞发现Kcnj8可以标记约36％的细胞，其余的是神经细胞和血管细胞如血管平滑肌细胞；
对照组3(图6)：用周细胞的标志物Kcnj8标记得到的细胞发现Kcnj8可以标记约58％的细胞，其余的大部分是血管细胞如血管平滑肌细胞和血管内皮细胞；
对照组4(图7)：用血管内皮细胞的标志物Kcnj8标记得到的细胞发现Kcnj8 可以标记约71％的细胞，其余的大部分是血管平滑肌细胞。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，包括：
将切碎后的新鲜神经组织与细胞解离消化液混合培养后，离心，加入总细胞培养液，过滤后得到细胞混合物A；
将所述细胞混合物A与内皮细胞梯度分离液混合，纯化分离后，得到包含有周细胞和内皮细胞的细胞混合物B，其中所述内皮细胞梯度分离液由内皮细胞分离液与所述总细胞培养液复配形成，所述内皮细胞分离液中含有质量浓度为1.2～1.4g/mL的硅胶颗粒，所述硅胶颗粒中包覆有乙烯吡咯烷酮；
将所述细胞混合物B与周细胞梯度分离液混合，纯化分离周细胞单细胞，其中，所述周细胞梯度分离液由周细胞分离液与总细胞培养液复配形成，所述周细胞分离液中含有体积百分数为58～62％的碘克沙醇。
2.根据权利要求1所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述周细胞梯度分离液是通过将第三溶液按照体积比3:3.8～4.2，加到第四溶液的上方，所述第三溶液中所述周细胞分离液与所述总细胞培养液之间的体积比为1～2：18～19；所述第四溶液中所述周细胞分离液与所述总细胞培养液之间的体积比为9～11：89～91。
3.根据权利要求1所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述内皮细胞梯度分离液是通过将第一溶液按照体积比1:2～4加到第二溶液的上方，所述第一溶液中所述内皮细胞分离液与所述总细胞培养液之间的体积比为2～3：47～48；所述第二溶液中所述内皮细胞分离液与所述总细胞培养液之间的体积比为7～8:42～43。
4.根据权利要求1所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，制备所述细胞混合物B的步骤包括：
将所述细胞混合物A与所述内皮细胞梯度分离液混合，得到完整的内皮细胞梯度分离体系，将所述内皮细胞梯度分离体系在室温下2000～2500g离心15～20min，去除最上层的内皮细胞培养基，以及最下层的其它神经系统细胞及死细胞，保留中间含有内皮细胞和周细胞的内皮细胞层，洗涤。
5.根据权利要求4所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，洗涤所述内皮细胞层的步骤包括：
将所述内皮细胞层与所述总细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到内皮细胞单细胞混悬液和所述细胞混合物B。
6.根据权利要求1所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，制备所述周细胞单细胞的步骤包括：
将所述细胞混合物B加至所述周细胞梯度分离液的上方，得到完整的周细胞梯度分离体系，将所述周细胞梯度分离体系在室温下700～900g离心15～20min，去除最上层的细胞培养基，以及中间层的血管内皮细胞，保留最下面1mL的周细胞层，洗涤。
7.根据权利要求6所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，洗涤所述周细胞层的步骤包括：
将所述周细胞层与所述总细胞培养液混合后，在室温下150～250g离心1～3min，用不含胎牛血清的DMEM培养基将所得沉淀混合均匀，得到神经系统周细胞单细胞混悬液。
8.根据权利要求4～7任一项所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，在制备所述细胞混合物B以及所述周细胞单细胞的步骤中，离心均采用水平转子离心机。
9.根据权利要求1所述的动物神经系统周细胞单细胞的分离方法，其特征在于，所述总细胞培养液中至少含有：青霉素/链霉素双抗、DMEM培养基和胎牛血清。
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