CN110840915A - 一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向间充质干细胞外泌体，该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞15％‑25％、氨基酸1‑2％、葡萄糖3‑8％、无水氯化钙1‑5％、亮氨酸3‑6％、氯化钾2‑4％、次黄嘌呤1‑2％、胸苷1‑3％、核黄素2‑6％、苯丙氨酸4‑8％、氯化钠0.09‑2％、乳酸钠0.1‑2％、氯化钙0.09‑2％、必须氨基酸0.01‑5％、非必须氨基酸0.01‑5％、人血清白蛋白0.1‑5％，其余为去离子水；本发明还公开了靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：定量称取，间充质干细胞培养，除菌，囊泡颗粒分离，重悬处理，获取分泌体制剂，注射使用；本发明制备出的靶向间充质干细胞外泌体得到较大提升，在其制备过程中通过除菌级亲水性过滤器对其培养基的上清液杀菌处理，避免其滋生有害细菌。

Description

一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及靶向间充质干细胞外泌体制备技术领域，具体为一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用。
背景技术
间充质干细胞作为一种成体干细胞，广泛存在于结绵组织和器官间质，具有多向分化潜能自我复制能力、造血支持和免疫调控等特点MSC目前已经被应用于造血系统疾病、抗移植排斥器官缺血性损伤的修复和自身免疫性疾病的免疫调节治疗等临床试验中，在再生医学领域有着重要的作用；间充质干细胞，相关的研究表明,MSC分泌的外泌体通过携带miRNA发挥作用,能够缓解肢体、心肌和肾的缺血性损伤，促进损伤组织成纤维细胞增殖、迁移和体外的血管形成；但现有技术中，血性治疗常采用药物或者手术治疗，治疗效果一般，对病人身体产生的创伤较大；且传统的靶向间充质干细胞外泌体在生产过程中会携带一些对人体不利的细菌，在治疗过程中产生不利影响；且传统的传统的靶向间充质干细胞外泌体在生产过程中的过滤方法简单，过滤效果差；为此，本发明提出一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种靶向间充质干细胞外泌体，该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞15％-25％、氨基酸1-2％、葡萄糖3-8％、无水氯化钙1-5％、亮氨酸3-6％、氯化钾2-4％、次黄嘌呤1-2％、胸苷1-3％、核黄素2-6％、苯丙氨酸4-8％、氯化钠0.09-2％、乳酸钠0.1-2％、氯化钙0.09-2％、必须氨基酸0.01-5％、非必须氨基酸0.01-5％、人血清白蛋白0.1-5％，其余为去离子水。
优选的，包括间充质干细胞15％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙5％、亮氨酸6％、氯化钾4％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素2％、苯丙氨酸8％、氯化钠0.09％、乳酸钠0.1％、氯化钙2％、必须氨基酸5％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白5％，其余为去离子水。
优选的，包括间充质干细胞18％、氨基酸1.8％、葡萄糖4％、无水氯化钙4％、亮氨酸5％、氯化钾3％、次黄嘌呤2％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸7％、氯化钠1％、乳酸钠1％、氯化钙1％、必须氨基酸4％、非必须氨基酸1％、人血清白蛋白4％，其余为去离子水。
优选的，包括间充质干细胞20％、氨基酸1.5％、葡萄糖6％、无水氯化钙3％、亮氨酸4％、氯化钾2％、次黄嘌呤1％、胸苷1.5％、核黄素4％、苯丙氨酸5％、氯化钠1.5％、乳酸钠1.5％、氯化钙2％、必须氨基酸3％、非必须氨基酸3％、人血清白蛋白2％，其余为去离子水。
优选的，包括间充质干细胞25％、氨基酸1％、葡萄糖8％、无水氯化钙1％、亮氨酸3％、氯化钾2％、次黄嘌呤2％、胸苷1％、核黄素6％、苯丙氨酸4％、氯化钠2％、乳酸钠2％、氯化钙0.09％、必须氨基酸0.01％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白0.1％，其余为去离子水。
一种如上所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温19℃～31℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；
S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm；
S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心25-29分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心60-68分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，62-66分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；
S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；
S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；
S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所采用的配方均为国标规定原料，且本发明制备出的靶向间充质干细胞外泌体得到较大提升，在其制备过程中通过除菌级亲水性过滤器对其培养基的上清液杀菌处理，避免其滋生有害细菌，且采用高速离心法实现外泌体的分离，效果极佳，且本发明制备靶向间充质干细胞外泌体的成本有所降低，增加企业收益，适合推广。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明提供一种技术方案：一种靶向间充质干细胞外泌体，该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞15％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙5％、亮氨酸6％、氯化钾4％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素2％、苯丙氨酸8％、氯化钠0.09％、乳酸钠0.1％、氯化钙2％、必须氨基酸5％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白5％，其余为去离子水。
一种如上所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温19℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；
S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为0.1μm；
S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心25分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心60分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，62分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；
S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；
S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；
S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。
实施例二
本发明提供一种技术方案：一种靶向间充质干细胞外泌体，该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞18％、氨基酸1.8％、葡萄糖4％、无水氯化钙4％、亮氨酸5％、氯化钾3％、次黄嘌呤2％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸7％、氯化钠1％、乳酸钠1％、氯化钙1％、必须氨基酸4％、非必须氨基酸1％、人血清白蛋白4％，其余为去离子水。
一种如上所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温22℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；
S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为0.3μm；
S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心26分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心62分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，63分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；
S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；
S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；
S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。
实施例三
本发明提供一种技术方案：一种靶向间充质干细胞外泌体，该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞20％、氨基酸1.5％、葡萄糖6％、无水氯化钙3％、亮氨酸4％、氯化钾2％、次黄嘌呤1％、胸苷1.5％、核黄素4％、苯丙氨酸5％、氯化钠1.5％、乳酸钠1.5％、氯化钙2％、必须氨基酸3％、非必须氨基酸3％、人血清白蛋白2％，其余为去离子水。
一种如上所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温26℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；
S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为0.6μm；
S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心27分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心65分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，64分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；
S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；
S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；
S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。
实施例四
本发明提供一种技术方案：一种靶向间充质干细胞外泌体，该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞25％、氨基酸1％、葡萄糖8％、无水氯化钙1％、亮氨酸3％、氯化钾2％、次黄嘌呤2％、胸苷1％、核黄素6％、苯丙氨酸4％、氯化钠2％、乳酸钠2％、氯化钙0.09％、必须氨基酸0.01％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白0.1％，其余为去离子水。
一种如上所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温26℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；
S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为1μm；
S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心29分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心68分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，66分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；
S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；
S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；
S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于；该靶向间充质干细胞外泌体的配方包括以下组份：间充质干细胞15％-25％、氨基酸1-2％、葡萄糖3-8％、无水氯化钙1-5％、亮氨酸3-6％、氯化钾2-4％、次黄嘌呤1-2％、胸苷1-3％、核黄素2-6％、苯丙氨酸4-8％、氯化钠0.09-2％、乳酸钠0.1-2％、氯化钙0.09-2％、必须氨基酸0.01-5％、非必须氨基酸0.01-5％、人血清白蛋白0.1-5％，其余为去离子水。
2.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞15％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙5％、亮氨酸6％、氯化钾4％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素2％、苯丙氨酸8％、氯化钠0.09％、乳酸钠0.1％、氯化钙2％、必须氨基酸5％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白5％，其余为去离子水。
3.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞18％、氨基酸1.8％、葡萄糖4％、无水氯化钙4％、亮氨酸5％、氯化钾3％、次黄嘌呤2％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸7％、氯化钠1％、乳酸钠1％、氯化钙1％、必须氨基酸4％、非必须氨基酸1％、人血清白蛋白4％，其余为去离子水。
4.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞20％、氨基酸1.5％、葡萄糖6％、无水氯化钙3％、亮氨酸4％、氯化钾2％、次黄嘌呤1％、胸苷1.5％、核黄素4％、苯丙氨酸5％、氯化钠1.5％、乳酸钠1.5％、氯化钙2％、必须氨基酸3％、非必须氨基酸3％、人血清白蛋白2％，其余为去离子水。
5.根据权利要求1所述的一种靶向间充质干细胞外泌体，其特征在于：包括间充质干细胞25％、氨基酸1％、葡萄糖8％、无水氯化钙1％、亮氨酸3％、氯化钾2％、次黄嘌呤2％、胸苷1％、核黄素6％、苯丙氨酸4％、氯化钠2％、乳酸钠2％、氯化钙0.09％、必须氨基酸0.01％、非必须氨基酸0.01％、人血清白蛋白0.1％，其余为去离子水。
6.一种如权利要求1-5任意一条所述的靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取，将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：间充质干细胞培养，将间充质干细胞、氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温19℃～31℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况，取上清液；
S3：除菌，取步骤二中得到的制剂送入除菌级亲水性过滤器中过滤除菌；亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm；
S4：囊泡颗粒分离，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，提取上清液，10000g，4度，离心25-29分钟，0.22微米膜过滤后；提取上清液，10000g，4度，离心60-68分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；提取上清液，10000g，4度，62-66分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体；
S5：重悬处理，利用乳酸钠林格注射液对步骤三得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；
S6：获取分泌体制剂，靶向间充质干细胞外泌体在步骤五得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、乳酸钠、氯化钙、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂；
S7：注射使用，取出制剂保存管，然后使用注射器进行消毒，注射器吸入制剂保存管中的制剂，注射到患者关节处即可。
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