CN108392493A - 一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶，包括可注射水凝胶和离体的人间充质干细胞来源细胞外囊泡，所述的离体的人间充质干细胞来源细胞外囊泡的密度为5×1010个颗粒/毫升。本发明还提供了上述一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法。人间充质干细胞来源细胞外囊泡能够运载生长因子、核酸等生物活性物质促进血管修复和神经再生，从而恢复勃起功能。本发明通过阴茎海绵体注射人间充质干细胞来源细胞外囊泡解决难治性勃起功能障碍患者阴茎血管内皮和神经损伤的技术问题。本发明利用可注射水凝胶包裹人间充质干细胞来源细胞外囊泡为治疗勃起功能障碍提供安全、有效、使用方便的治疗药物制剂。

Description

一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于治疗勃起功能障碍的药物，具体来说是一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶及其制备方法。。
背景技术
目前勃起功能障碍的一线治疗手段是口服磷酸二酯酶-5抑制剂，例如他达拉非、西地那非等。该类型药物主要结构为非选择性或者选择性磷酸二酯酶-5抑制剂，治疗勃起功能障碍的原理为通过抑制阴茎磷酸二酯酶-5活性，通过减少降解来增加环磷酸鸟苷浓度。细胞外囊泡（extracellular vesicles）是细胞在增殖过程中释放入细胞外空间的囊状结构。根据直径大小，可以分为：外泌体（exosome，直径：50-100 nm）及微颗粒（microparticle，直径：100-1000 nm）。细胞外囊泡作为载体，运载着包括信号蛋白、脂质、核酸等成分，能够被远处的目标细胞所摄取内吞，从而能改变靶细胞的生物学行为。
目前勃起功能障碍的临床一线治疗药物磷酸二酯酶5抑制剂发挥作用依赖于完整的血管内皮，不能逆转血管内皮和神经损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶及其制备方法，所述的这种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶及其制备方法要解决现有技术中用于治疗勃起功能障碍的药物副作用大，效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶，包括可注射水凝胶和离体的人间充质干细胞来源细胞外囊泡，所述的离体的人间充质干细胞来源细胞外囊泡在可注射水凝胶中的密度为5×1010个颗粒/毫升。
进一步的，所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶中的溶剂为磷酸盐缓冲液，在所述的磷酸盐缓冲液中，含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾，所述的磷酸二氢钾的浓度为0.27g/L，所述的磷酸氢二钠的浓度为1.42g/L，所述的氯化钠的浓度为8g/L，所述的氯化钾的浓度为0.2g/L；所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶中的溶质由对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇和羟乙基壳聚糖组成，在所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶中，所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇的质量百分比浓度为5%-20%，对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇的数均分子量为200-20000，所述的羟乙基壳聚糖的质量百分比浓度为1%-5%。
进一步的，所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶包括但不局限于对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖、氧化海藻酸-明胶、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、或者丝素蛋白等天然高分子。
本发明还提供了上述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)一个提取人间充质干细胞来源细胞外囊泡的步骤：从离体的病人自体组织或者细胞库获得P4代脂肪来源间充质干细胞，在临床级人间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞融合达到80-90%时，加入无血清DMEM培养基，20~48 h后收集细胞上清液，细胞上清液经过300 g在4℃环境下离心10 min，16500 g在4℃环境下离心10 min去除细胞和细胞碎片，120000 g在4℃环境下离心70 min收集细胞外囊泡；
2)一个对人间充质干细胞来源的细胞外囊泡进行定量的步骤；人间充质干细胞来源细胞外囊泡在磷酸盐缓冲液从稀释1000倍，根据布朗运动和弥散系数在Nanosight仪器中自动分析，参数设置如下：温度25.9-26.0℃，粘滞度0.869-0.872 cP，25帧每秒，测试时间为60 s(定量的目的是为了测量该囊泡的浓度，以便以下实验控制同一浓度)；
3)一个制备含细胞外囊泡的可注射水凝胶的步骤；
4)一个采用可注射水凝胶包裹人间充质干细胞来源的细胞外囊泡的步骤：将可注射水凝胶倒入无菌样品容器中，保持温度为37℃，加入人间充质干细胞来源细胞外囊泡，搅拌均匀，调整密度为5×1010 个颗粒/毫升；即得用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶。
进一步的，所述的人间充质干细胞为脂肪来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或者尿源性间充质干细胞。
进一步的，所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶包括但不局限于对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶、氧化海藻酸-明胶水凝胶、海藻酸、透明质酸、壳聚糖或者丝素蛋白。
进一步的，所述的细胞外囊泡包括微颗粒和外泌体。
进一步的，所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶的制备为：将对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到质量浓度为5%-20%的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶液；另外将羟乙基壳聚糖溶解在另外一组磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为1-5 %的羟乙基壳聚糖溶液，将所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇与羟乙基壳聚糖溶液等质量在25℃的条件振荡混合均匀，静止10-120s，即可得到对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶。
进一步的，所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4。
具体的，在阴茎海绵体注射过程中，取上述2mL包裹有人间充质干细胞来源细胞外囊泡的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶通过21 G针头缓慢注射到勃起功能障碍患者阴茎海绵体内，在阴茎根部用橡皮筋轻轻扎紧5 min后松开。
本发明通过阴茎海绵体注射人间充质干细胞来源细胞外囊泡解决难治性勃起功能障碍患者阴茎血管内皮和神经损伤的技术问题，利用可注射水凝胶包裹人间充质干细胞来源细胞外囊泡为治疗勃起功能障碍提供安全、有效、使用方便的治疗药物制剂。
磷酸二酯酶-5抑制剂发挥作用依赖于正常功能的阴茎血管内皮，无法逆转阴茎血管内皮和神经损伤，对于糖尿病导致的勃起功能障碍、前列腺癌术后勃起功能障碍等临床治疗效果不确切。作为勃起功能障碍临床二线治疗手段，阴茎海绵体注射血管活性药物、真空负压吸引或低能量冲击波治疗依旧无法彻底修复阴茎血管内皮和神经损伤。利用间充质干细胞阴茎海绵体注射的方式可以促进阴茎血管内皮和神经损伤修复，然而，不仅面临着免疫排斥、成瘤风险和伦理限制，而且操作繁琐，需要细胞储存复苏设备。人间充质干细胞来源细胞外囊泡保留了促进血管内皮和神经修复的有效成分，规避了上述风险，制备成制剂后，只需冷藏保存，阴茎海绵体注射操作简便。
人间充质干细胞来源细胞外囊泡能够运载生长因子、核酸等生物活性成分促进血管修复和神经再生，从而恢复勃起功能。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明采用的人间充质干细胞来源细胞外囊泡具有促进血管内皮修复和神经再生的功效，能够促进勃起功能恢复。
附图说明
图1为人间充质干细胞来源细胞外囊泡电镜图，标尺为100 nm。
图2为人间充质干细胞来源细胞外囊泡Nanosight粒径分布图。
图3为包裹有人间充质干细胞来源细胞外囊泡的可注射水凝胶治疗糖尿病勃起功能障碍大鼠2周后勃起功能恢复情况。（A）单纯注射可注射水凝胶、（B）注射包裹有人脂肪干细胞来源细胞外囊泡的可注射水凝胶、（C）正常大鼠的海绵体内压和动脉压记录曲线。（D）三组海绵体内压比平均动脉压比值对比。*表示与注射包裹有人脂肪干细胞来源细胞外囊泡的可注射水凝胶组相比具有显著性差异，P值小于0.05。
本发明采用的临床级人间充质干细胞无血清培养基购买自上海逍鹏生物科技有限公司，地址为上海市浦东新区祖冲之路1505弄80号1幢3楼，商品名称为：人类间充质干细胞无血清基础培养基 (以色列Biological Industries公司，货号：05-200-1A)，为临床级人间充质干细胞培养基，无血清、无异源动物成分，且能保持人间充质干细胞典型特征，已取得美国FDA临床注册号（DMF NO：29469）。
具体实施方式
实施例1
一种用于治疗勃起功能障碍的药物及其制备方法，包括如下步骤：
（1）人间充质干细胞来源细胞外囊泡提取：从病人自体组织或者细胞库获得P4代脂肪来源间充质干细胞在临床级人间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞融合达到80-90%时，加入无血清DMEM培养基，24 h后收集细胞上清液。细胞上清液经过300 g在4℃环境下离心10 min，16500 g在4℃环境下离心10 min去除细胞和细胞碎片，120000 g在4℃环境下离心70 min收集细胞外囊泡。
（2）人间充质干细胞来源细胞外囊泡定量：将人间充质干细胞来源细胞外囊泡在磷酸盐缓冲液中稀释1000倍，根据布朗运动和弥散系数在Nanosight仪器（NS300，NanoSight Ltd，Wiltshire，UK）中自动分析。参数设置如下：温度25.9-26.0℃，粘滞度0.869-0.872 cP，25帧每秒，测试时间为60 s。（图1为人间充质干细胞来源细胞外囊泡电镜图，标尺为100 nm；图2为人间充质干细胞来源细胞外囊泡Nanosight粒径分布图）。
（3）可注射水凝胶制备：将对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到质量浓度为5%-20%对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶液；将羟乙基壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为1%-5%的羟乙基壳聚糖溶液，将所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶液与羟乙基壳聚糖溶液溶液等质量在25℃的条件振荡混合均匀，静止10-120s，即可得到可注射水凝胶。
（4）可注射水凝胶包裹人间充质干细胞来源细胞外囊泡：2 ml对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶倒入无菌样品瓶中，保持温度为37℃，加入人间充质干细胞来源细胞外囊泡，搅拌均匀，调整密度为5×1010 个颗粒/毫升。
（5）阴茎海绵体注射：取上述2 mL包裹有人间充质干细胞来源细胞外囊泡的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶通过21 G针头缓慢注射到勃起功能障碍患者阴茎海绵体内，在阴茎根部用橡皮筋轻轻扎紧5 min后松开。
进一步的，以上人间充质干细胞不局限于脂肪来源间充质干细胞，包括骨髓来源间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿源性间充质干细胞等。
进一步的，以上可注射水凝胶包括但不局限于对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖，包括氧化海藻酸-明胶水凝胶，海藻酸、透明质酸、壳聚糖、丝素蛋白等天然高分子水凝胶。
进一步的，以上细胞外囊泡包括微颗粒和外泌体。
实施例2 治疗斯普拉格-道利大鼠糖尿病勃起功能障碍。
（1）取P4代人脂肪干细胞来源细胞外囊泡，按实施例1的上述步骤制备与对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶混合，制备包裹人脂肪干细胞来源细胞外囊泡的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖可注射水凝胶制剂。
（2）在8周龄斯普拉格-道利大鼠上构建糖尿病勃起功能障碍模型，取100 μm上述包裹人间充质干细胞的可注射水凝胶制剂注射到大鼠阴茎海绵体。
（3）治疗2周后评价大鼠勃起功能，测量阴茎海绵体内压(ICP)和平均动脉压(MAP)，计算两者比值。
由图3可知，用该包裹有人脂肪干细胞来源细胞外囊泡的可注射水凝胶治疗糖尿病大鼠后，代表勃起功能的ICP/MAP指标显著性改善。*表示与注射包裹有人脂肪干细胞来源细胞外囊泡的可注射水凝胶组相比具有显著性差异，P值小于0.05。
单用对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶治疗2周后，大鼠阴茎海绵体内压/平均动脉压比值为0.5533±0.01528（A），利用人脂肪干细胞来源细胞外囊泡复合该水凝胶治疗2周后，大鼠阴茎海绵体内压/平均动脉压比值为0.9441±0.2183（B），正常大鼠同一时间点阴茎海绵体内压/平均动脉压比值为1.277±0.07638（C）。经过统计学分析，利用人脂肪干细胞来源细胞外囊泡复合该水凝胶能够显著促进大鼠勃起功能恢复（D）。

Claims (8)

1.一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶，其特征在于：包括可注射水凝胶和离体的人间充质干细胞来源细胞外囊泡，所述的离体的人间充质干细胞来源细胞外囊泡在可注射水凝胶中的密度为5×1010个颗粒/毫升。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶，其特征在于：所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶中的溶剂为磷酸盐缓冲液，在所述的磷酸盐缓冲液中，含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾，所述的磷酸二氢钾的浓度为0.27g/L，所述的磷酸氢二钠的浓度为1.42g/L，所述的氯化钠的浓度为8g/L，所述的氯化钾的浓度为0.2g/L；所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶中的溶质由对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇和羟乙基壳聚糖组成，在所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶中，所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇的质量百分比浓度为5%-20%，对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇的数均分子量为200-20000，所述的羟乙基壳聚糖的质量百分比浓度为1%-5%。
3.根据权利要求1所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶，其特征在于：所述的含细胞外囊泡的可注射水凝胶包括但不局限于对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖、氧化海藻酸-明胶、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、或者丝素蛋白等天然高分子。
4.权利要求1所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一个提取人间充质干细胞来源细胞外囊泡的步骤：从离体的病人自体组织或者细胞库获得P4代脂肪来源间充质干细胞，在临床级人间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞融合达到80-90%时，加入无血清DMEM培养基，20~48 h后收集细胞上清液，细胞上清液经过300 g在4℃环境下离心10 min，16500 g在4℃环境下离心10 min去除细胞和细胞碎片，120000 g在4℃环境下离心70 min收集细胞外囊泡；
2)一个对人间充质干细胞来源的细胞外囊泡进行定量的步骤；人间充质干细胞来源细胞外囊泡在磷酸盐缓冲液中稀释1000倍，根据布朗运动和弥散系数在Nanosight仪器中自动分析，参数设置如下：温度25.9-26.0℃，粘滞度0.869-0.872 cP，25帧每秒，测试时间为60 s；
3)一个制备含细胞外囊泡的可注射水凝胶的步骤；
4)一个采用可注射水凝胶包裹人间充质干细胞来源的细胞外囊泡的步骤：将可注射水凝胶倒入无菌样品容器中，保持温度为37℃，加入人间充质干细胞来源细胞外囊泡，搅拌均匀，调整密度为5×1010 个颗粒/毫升；即得用于治疗勃起功能障碍的药物。
5.根据权利要求4所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的人间充质干细胞为脂肪来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或者尿源性间充质干细胞。
6.根据权利要求4所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的可注射水凝胶包括但不局限于对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶、氧化海藻酸-明胶水凝胶、海藻酸、透明质酸、壳聚糖或者丝素蛋白等。
7.根据权利要求4所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的细胞外囊泡包括微颗粒和外泌体。
8.根据权利要求6所述的一种用于治疗勃起功能障碍的含细胞外囊泡的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于： 所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶的制备为：将对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到质量浓度为5%-20%的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇溶液；另外将羟乙基壳聚糖溶解在另外一组磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为1-5 %的羟乙基壳聚糖溶液，将所述的对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇与羟乙基壳聚糖溶液等质量在25℃的条件振荡混合均匀，静止10-120s，即可得到对羧基苯甲醛修饰的聚乙二醇-羟乙基壳聚糖水凝胶。
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