CN112386611A - 治疗骨关节炎的间充质干细胞组合物及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗骨关节炎的间充质干细胞组合物及其制法和用途。具体地说，本发明一方面涉及一种可用于配制细胞治疗组合物的组合物，其包含氯化钠、磷酸钠和水等。进一步的，本发明涉及一种可用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，其包含：间充质干细胞、人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐和水等。此外，本发明还提供了所述细胞治疗组合物在制备用于治疗骨关节炎和软骨缺损的药剂中的用途。另外，还提供了前述组合物在制备用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物中的用途。本发明组合物以及细胞治疗组合物可以用于治疗骨关节炎，并且这些组合物和细胞治疗组合物呈现如本发明所述优异技术效果，例如优良稳定性以一种或多种优良的药学效果。

Description

治疗骨关节炎的间充质干细胞组合物及其制法和用途
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，其涉及用于治疗和/或预防急性和/或慢性骨关节病方法，该方法中使用的药物组合物，以及该组合物用于治疗骨关节炎的用途。特别是涉及使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物。本发明组合物中包含间充质干细胞，尤其是由胎盘或脐带中获取的间充质干细胞，该种用于治疗骨关节炎的胎盘或脐带间充质干细胞组合物呈现如说明书所述优良性能。
背景技术
骨关节炎是最常见的关节炎形式，其特征在于关节软骨、软骨下骨的缓慢退行性过程，并伴有边缘骨赘形成和低程度的炎症。据信，慢性形式的骨关节炎影响到15％的人口。其中，四分之一为严重残疾。大多数骨关节炎病例的原因不明，并被称为“原发性骨关节炎”。当骨关节炎的原因已知时，其被称为“继发性骨关节炎”。继发性骨关节炎由其它疾病或情形引起。可导致继发性骨关节炎的情形包括关节结构的反复性损伤或手术、出生时关节异常(先天性异常)、痛风、糖尿病和其它激素紊乱。其它形式的关节炎包括系统性疾病，例如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。
骨关节炎主要涉及髋部、膝部、脊柱和指/趾间关节。骨关节炎的最常见症状是受影响关节在反复使用后产生疼痛。关节疼痛通常在日间的晚些时候更加严重。受影响关节可发生肿胀、发热以及发出咯吱声。关节在长期不活动后也会发生疼痛和僵硬。在严重的骨关节炎中，软骨垫的完全丧失导致骨间发生摩擦，造成静止时的疼痛或在有限运动时的疼痛。
骨关节炎的特征在于在数年间软骨发生缓慢的降解。在正常软骨中，在基质的合成与降解之间存在微妙的平衡；但是在骨关节炎中，软骨的降解超过了合成。合成与降解之间的平衡受年龄影响，并由滑膜和软骨细胞产生的几种因子(包括细胞因子、生长因子、聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)和基质金属蛋白酶)所调控。除了水以外，胞外基质还含有蛋白聚糖，其由连接到玻璃酸钠所形成之骨架上的糖胺聚糖形成，并包封(entrap)于胶原框架或纤丝基质(fibrillary matrix)中。关节软骨中的一种重要蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖(aggrecan)，其与玻璃酸钠结合并有助于赋予软骨以可压缩性和弹性。聚集蛋白聚糖被聚集蛋白聚糖酶所切割，这导致其降解以及随后的软骨侵蚀。软骨基质中聚集蛋白聚糖的损失是骨关节炎(OA)中观察到的最初病理生理变化之一。
玻璃酸钠(Sodium Hyaluronate)，分子式为(C14H20NNaO11)n，重量平均分子量为80万～120万，其是由N-乙酰葡萄糖醛酸反复交替而形成的一种高分子多糖体生物材料。玻璃酸钠为关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一。在关节腔内起润滑作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨变性变化表面，改善病理性关节液，增加润滑功能。玻璃酸钠为作为润滑剂和减震器的滑液提供粘弹性。在滑液中，玻璃酸钠覆盖关节软骨的表面并与胶原纤丝(collagen fibril)和硫酸蛋白聚糖共用软骨中的深部空间。它保护软骨并阻止蛋白聚糖从软骨基质流失到滑液中，维持正常的软骨基质。在患骨关节炎的膝关节滑液中，玻璃酸钠、糖胺聚糖和硫酸角质素的浓度比正常膝关节滑液中要低。此外，使用兔滑膜细胞的实验显示，促炎细胞因子IL-1β和TNF-α刺激玻璃酸钠合成酶的表达，其可导致玻璃酸钠在炎性条件下发生片段化。外源玻璃酸钠可有利于产生新合成的玻璃酸钠。玻璃酸钠及衍生物已被用作骨关节炎治疗中的治疗性辅助物，用以提高关节连接表面的润滑度进而减少关节疼痛。几个体外培养研究也表明，玻璃酸钠通过抑制由纤连蛋白片段介导之软骨溶解而具有有益的作用。玻璃酸钠还显示具有抗炎作用，以及对前列腺素合成以及蛋白聚糖释放和降解的抑制作用。
玻璃酸钠被广泛地用于治疗膝部骨关节炎。英国的两项一般性调查显示，约有15％患有骨关节炎的患者接受过玻璃酸钠制备物的关节内治疗。由于它具有粘弹性，因此可以取代滑液。此外，它还可以减轻对疼痛的感知。还报道了有益的分子作用和细胞作用。玻璃酸钠常常通过关节内注射来施用，然而有关其临床相关性的证据却存在矛盾。现有技术中最近出版了系统性综述和统合分析(meta-analysis)，其作者得出的结论是，关节内的玻璃酸钠充其量具有很小的作用，而具有临床意义的作用是指疼痛的视觉模拟评分提高至少15mm。这些数据成为对骨关节炎患者关节内施用玻璃酸钠的基础。有时，在注射一年后才能观察到效用，并且在一些实验中必须每周进行3～5次注射。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示，间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能，可促进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而来源于人脐带、胎盘或羊膜的间充质干细胞，成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，成为了骨髓源间充质干细胞的很好的替代物；它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化；而且细胞在体外易于扩增，扩增后分化能力、增殖能力保持稳定，适合大规模制备。
已知有将间充质干细胞或玻璃酸钠用于治疗骨关节炎的文献报道。然而在将二者组合并且成功地应用于临床时，却需要面临诸多技术性问题。因此，提供一种包含间充质干细胞和玻璃酸钠并且可用于治疗骨关节炎的方法和组合物，仍然是本领域技术人员迫切期待的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物，特别是该细胞治疗组合物可以用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损，更特别地，本发明提供的是一种即用型干细胞组合物以用于注射治疗骨关节炎。已经出人意料地发现本发明组合物具有优异的性能。
本发明是通过如下方案实现的。
在本发明的第一方面，提供了细胞治疗组合物在制备用于治疗骨关节炎和软骨缺损的药剂中的用途，所述细胞治疗组合物中包括：间充质干细胞(可简称为MSC，其来源例如可以是脐带或胎盘)、人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐和水。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，所述间充质干细胞的密度为0.5～2×107个/mL，例如0.5～1.5×107个/mL，例如0.75～1.25×107个/mL。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，所述人血白蛋白的浓度为0.5％。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，所述玻璃酸钠的浓度为0.2～0.8％。例如0.3～0.7％。在本发明中当提及％时，如未另外说明，是指质量/体积百分数。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，所述氯化钠的浓度为0.6～1.0％。例如0.7～0.9％。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，所述磷酸钠盐是磷酸与氢氧化钠形成的盐。在一个实施方案中，该磷酸钠盐的磷酸根浓度为5～10mmol/L。在一个实施方案中，该磷酸钠盐的磷酸根浓度为6～9mmol/L。在一个实施方案中，该磷酸钠盐是磷酸二氢钠或者磷酸氢二钠或其组合。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，还包含门冬氨酸钾。在一个实施方案中，所述细胞治疗组合物中包含0.1～0.5％门冬氨酸钾，例如包含0.2～0.4％门冬氨酸钾，例如包含0.3％门冬氨酸钾。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，还包含没食子酸。在一个实施方案中，所述细胞治疗组合物中包含0.02～0.05％没食子酸，例如包含0.03～0.04％没食子酸，例如包含0.035％没食子酸。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物的pH值为6.5～7.2。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物的pH值为6.5～7.2。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备第一置换液和第二置换液；
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1000～1500rpm离心2～5分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以0.5～2×107个/mL的浓度混悬，分装，即得；
其中，所述第一置换液包含如下组分：人血白蛋白、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水，所述第二置换液包含如下组分：人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第一置换液和第二置换液在与细胞混合前的温度为20～25℃。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物是在无菌条件下制备得到的。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物是在无菌条件下制备得到的可注射使用的无菌液体。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第一置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第一置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第二置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.2～0.8％玻璃酸钠、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第二置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.3～0.7％玻璃酸钠、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第一置换液和第二置换液中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物、第一置换液和第二置换液的pH值为6.5～7.2。作为酸碱调节剂的盐酸和/或氢氧化钠可以是它们的溶液例如2M浓度的溶液。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第一置换液和第二置换液在用于配制细胞治疗组合物前预先经除菌处理。
在本发明中，所述第一置换液和第二置换液的配制是本领域技术人员容易操作的，例如，在一个实施方案中，基本操作通常可以是：将计算量的除了人血白蛋白以外的其它固体物料加配料体积80％量的注射用水使完全溶解，检查溶液pH值必要时使用酸碱调节剂调节pH值至6.5～7.2，加注射用水至配料体积90％量，接着121℃热压灭菌10～15分钟，冷却后在无菌操作条件下加入规定量无菌人血白蛋白，补加注射用水至全量，混均，即得。
进一步的，本发明第二方面提供了一种细胞治疗组合物，其可用于治疗骨关节炎和软骨缺损，该细胞治疗组合物中包括：间充质干细胞(可简称为MSC，其来源例如可以是脐带或胎盘)、人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐和水。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述间充质干细胞的密度为0.5～2×107个/mL，例如0.5～1.5×107个/mL，例如0.75～1.25×107个/mL。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述人血白蛋白的浓度为0.5％。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述玻璃酸钠的浓度为0.2～0.8％。例如0.3～0.7％。在本发明中当提及％时，如未另外说明，是指质量/体积百分数。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述氯化钠的浓度为0.6～1.0％。例如0.7～0.9％。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述磷酸钠盐是磷酸与氢氧化钠形成的盐。在一个实施方案中，该磷酸钠盐的磷酸根浓度为5～10mmol/L。在一个实施方案中，该磷酸钠盐的磷酸根浓度为6～9mmol/L。在一个实施方案中，该磷酸钠盐是磷酸二氢钠或者磷酸氢二钠或其组合。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其中还包含门冬氨酸钾。在一个实施方案中，所述细胞治疗组合物中包含0.1～0.5％门冬氨酸钾，例如包含0.2～0.4％门冬氨酸钾，例如包含0.3％门冬氨酸钾。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其中还包含没食子酸。在一个实施方案中，所述细胞治疗组合物中包含0.02～0.05％没食子酸，例如包含0.03～0.04％没食子酸，例如包含0.035％没食子酸。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其pH值为6.5～7.2。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物的pH值为6.5～7.2。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备第一置换液和第二置换液；
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1000～1500rpm离心2～5分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以0.5～2×107个/mL的浓度混悬，分装，即得；
其中，所述第一置换液包含如下组分：人血白蛋白、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水，所述第二置换液包含如下组分：人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其是在无菌条件下制备得到的。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，其是在无菌条件下制备得到的可注射使用的无菌液体。
根据本发明第一方面的用途，其中所述第一置换液和第二置换液在与细胞混合前的温度为20～25℃。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第一置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第一置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第二置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.2～0.8％玻璃酸钠、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第二置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.3～0.7％玻璃酸钠、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第一置换液和第二置换液中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物、第一置换液和第二置换液的pH值为6.5～7.2。作为酸碱调节剂的盐酸和/或氢氧化钠可以是它们的溶液例如2M浓度的溶液。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第一置换液和第二置换液在用于配制细胞治疗组合物前预先经除菌处理。
根据本发明第二方面的细胞治疗组合物，所述第一置换液和第二置换液是照如下方式制备得到的：将计算量的除了人血白蛋白以外的其它固体物料加配料体积80％量的注射用水使完全溶解，检查溶液pH值必要时使用酸碱调节剂调节pH值至6.5～7.2，加注射用水至配料体积90％量，接着121℃热压灭菌10～15分钟，冷却后在无菌操作条件下加入规定量无菌人血白蛋白，补加注射用水至全量，混均，即得。
进一步的，本发明第三方面提供了一种用于配制细胞治疗组合物的置换液，其包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水。
根据本发明第三方面的置换液，其包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水。
根据本发明第三方面的置换液，其包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.2～0.8％玻璃酸钠、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水。
根据本发明第三方面的置换液，其包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.3～0.7％玻璃酸钠、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水。
根据本发明第三方面的置换液，其中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述置换液的pH值为6.5～7.2。作为酸碱调节剂的盐酸和/或氢氧化钠可以是它们的溶液例如2M浓度的溶液。
根据本发明第三方面的置换液，其在用于配制细胞治疗组合物前预先经除菌处理。
根据本发明第三方面的置换液，其是照如下方式制备得到的：将计算量的除了人血白蛋白以外的其它固体物料加配料体积80％量的注射用水使完全溶解，检查溶液pH值必要时使用酸碱调节剂调节pH值至6.5～7.2，加注射用水至配料体积90％量，接着121℃热压灭菌10～15分钟，冷却后在无菌操作条件下加入规定量无菌人血白蛋白，补加注射用水至全量，混均，即得。
根据本发明第三方面的置换液，其中不包含玻璃酸钠的可称为第一置换液，包含玻璃酸钠的可称为第二置换液。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中包含：间充质干细胞(可简称为MSC，其来源例如可以是脐带或胎盘)、人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐和水。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中，所述间充质干细胞的密度为0.5～2×107个/mL，例如0.5～1.5×107个/mL，例如0.75～1.25×107个/mL。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中，所述人血白蛋白的浓度为0.5％。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中，所述玻璃酸钠的浓度为0.2～0.8％。例如0.3～0.7％。在本发明中当提及％时，如未另外说明，是指质量/体积百分数。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中，所述氯化钠的浓度为0.6～1.0％。例如0.7～0.9％。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中还包含门冬氨酸钾。在一个实施方案中，所述细胞治疗组合物中包含0.1～0.5％门冬氨酸钾，例如包含0.2～0.4％门冬氨酸钾，例如包含0.3％门冬氨酸钾。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中还包含没食子酸。在一个实施方案中，所述细胞治疗组合物中包含0.02～0.05％没食子酸，例如包含0.03～0.04％没食子酸，例如包含0.035％没食子酸。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物pH值为6.5～7.2。
根据本发明第三方面的置换液，其所制得的细胞治疗组合物中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物的pH值为6.5～7.2。
根据本发明第三方面的置换液，所述细胞治疗组合物中是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备第一置换液和第二置换液；
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1000～1500rpm离心2～5分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以0.5～2×107个/mL的浓度混悬，分装，即得；
其中，所述第一置换液包含如下组分：人血白蛋白、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水，所述第二置换液包含如下组分：人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水。
根据本发明第三方面的置换液，所述细胞治疗组合物是在无菌条件下制备得到的。
根据本发明第三方面的置换液，所述细胞治疗组合物是在无菌条件下制备得到的可注射使用的无菌液体。
根据本发明第三方面的置换液，其在与细胞混合前的温度为20～25℃。
在本发明中，所述置换液，包括第一置换液和第二置换液，均可称为组合物。在本发明中，该组合物均可用于制备细胞治疗组合物。因此，在本发明的一些实施方案中，提供了处方组成为第一置换液或第二置换液的组合物在制备用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物中的用途。
即，本发明第四方面提供了本发明第三方面任一实施方案所述置换液的组合物在制备用于治疗骨关节炎的细胞治疗组合物中的用途。
根据本发明第四方面的用途，其中所述细胞治疗组合物如本发明第二方面任一项所述。
本发明的细胞治疗组合物为水混悬液，其中包含氯化钠，其浓度基本上与生理盐水相当。生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。因此，本发明细胞治疗组合物中的间充质干细胞基本上是分散于生理盐水即质量体积百分数为0.9％的氯化钠溶液中，其与人体组织的渗透压一致，以此生理盐水作为溶剂，不会对间充质干细胞产生损伤。
在本发明的一个实施方案中，所述的磷酸钠盐是磷酸二氢钠与磷酸氢二钠以重量比1：1的混合物。
在本发明中，所述间充质干细胞为原代～第十代的间充质干细胞。
在本发明的细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞可以来自已知的各种途径，例如其可以是来自于骨髓、脐带或胎盘。
在本发明的细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞的获取方法是众所周知的，例如参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取间充质干细胞的方法。
在本发明的细胞治疗组合物中，所述的间充质干细胞的获取方法是众所周知的，例如参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取间充质干细胞的方法。
在本发明中，例如，所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(胎盘来源)：
(a)用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶，以去除胎盘中残留的血液；
(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；
(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；
(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％的CO2培养箱中培养；
(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。必要时进行传代和/或在液氮中冻存以备用。
在本发明中，例如，所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(脐带来源)：
(1)脐带组织贴壁处理：取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；
(2)脐带组织培养：沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5％的37℃培养箱进行培养，培养至第3-7天时将平皿从培养箱取出，补加适量间充质干细胞培养基；在第9-11天时将平皿中的培养基移出，加入适量新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天进行一次全换液；
(3)细胞传代：当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70％时，使用消化酶TrypLEExpress使贴壁细胞脱离平皿底部；离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90％后，即得脐带间充质干细胞。必要时进行传代和/或在液氮中冻存以备用。必要时对所得间充质干细胞的以下项目中的一项或多项进行检测：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。
在本发明中，将所制得的细胞治疗组合物分装，是指将配制得到的细胞治疗组合物分装到预充注射器中，尤其是分装到一次性使用的预充注射器中。
根据本发明第一方面的用途，其中所述细胞治疗组合物中，所述预充式注射器的针筒材质为高分子聚合物(例如聚丙烯)、活塞材质为橡胶，本发明具体实例中如未特别说明，所用预充式注射器的针筒材质为高分子聚合物(例如聚丙烯)、活塞材质为橡胶。预充式注射器首次出现于第二次世界大战期间，目的是为了满足战地医院对现场无菌医疗的需要。预充式注射器再度被强力推向市场是在上世纪50年代初，当时Becton Dickinson公司为Jonas Salks博士的脊髓灰质炎疫苗项目提供玻璃预充式注射器。此后，预充式注射器继续得到应用，大多是在胰岛素和人生长素给药领域。不过，预充式注射器真正盛行起来是在过去5年中，它几乎成为注射剂供应商必需提供的一种产品。而多数创新性的液体药品，如果适合的话，将装在预充式注射器中上市。预充式注射器之所以走俏主要由于产品本身具有的优势，尤其是使用简便。医药市场正在发生变化，生物技术疗法以及仅能通过注射途径给药的候选药物数量增多，它们涉及的治疗领域非常广泛，如多发性硬化、不孕、骨质疏松、肝炎、类风湿性关节炎、癌症、贫血及血友病等。一些生物技术药物需要患者本人频繁注射给药，他们从预充式注射器的便利中受益最深，因为预充式注射器省却了一些操作步骤，让使用更快捷、更简便。患者的需要是推动预充式注射器发展的真正动力。从小瓶中量出药品装入注射器中是一件费时的工作，缺乏充分训练的人很容易出错。此外，一些疾病如类风湿性关节炎患者常常难以，甚至不能拿稳小瓶并量出准确剂量。制药厂家已经将一些药品由冻干剂型改为液体剂型，以便于装入预充式注射器中，例如Berlex的治疗多发性硬化药物Betaseron、诺和诺德的人生长素Norditropin以及基因泰克的人生长素Nutropin都已由冻干剂型改为液体剂型，装在预充式注射器中出售。注射器元件生产商加快步伐以满足对即用性元件不断增长的需求。法国Stelmi公司的即用型柱塞以及Becton Dickinson公司的Hypak SCF预充式注射器使得灌装现场无需进行清洗、除热原以及消毒操作。即用性元件经过清洗、环氧乙烷或γ射线消毒、验证后可以直接使用。预充式注射器的另一优势是可以显著减少产品过度充填量。使用预充式注射器，可以节省10％、15％，有时甚至是20％的原料药。有些将小瓶改为预充式注射器的厂家还降低了原料药产量，因为新剂型不再需要那么多原料药。Becton Dickinson公司的一项研究显示，与小瓶相比，预充式注射器中的剂量可以高出23％，因为在从小瓶向注射器转移过程中药品损失更少。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物优选的是可注射用的组合物，其在常温下呈注射液状态，所述注射溶液适于经关节内施用(经皮注射)给哺乳动物对象(优选人类患者)的关节内。例如，本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物也适于局部施用(经皮注射至哺乳动物对象、优选人类患者的发炎关节内或附近区域)，其中局部施用注射涉及表皮、肌肉或任何深部器官。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物对哺乳动物对象(特别是人类患者)经关节内施用所述药物组合物能够改善骨关节病相关的症状，例如缓解了骨关节疼痛、改善了关节活动性和/或功能、减少了关节中的炎性积液等等。
本发明还涉及用于治疗和/或预防选自上述疾病或症状之病症特别是骨关节炎的方法，该方法包括以下步骤：向哺乳动物对象(优选人类患者)施用足够量的本发明的间充质干细胞的细胞治疗组合物，其通过关节内施用(特别是在哺乳动物对象(优选人类患者)的膝部、髋部和脊柱中)来实现。
目前，玻璃酸钠广泛应用于临床，包括注射形式使用的药物，因此本发明组合物中添加玻璃酸钠用于注射给药在临床上时可以接受的。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明提供的间充质干细胞的细胞治疗组合物具有如本文所述一个或者多个优异的性质。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在本文中，如未特别说明，试验所用间充质干细胞为第五代的间充质干细胞。在本文中，如未特别说明，试验所用脐带间充质干细胞是参照CN102660497A(2012101599162)中所记载的方法从脐带中获取的间充质干细胞。在本文中，如未特别说明，试验所用胎盘间充质干细胞是参照CN102586184A(2012100446386)中所记载的方法从胎盘中获取的间充质干细胞。在本发明的试验中，如未特别说明，当用到pH调节剂时，使用2M盐酸和/或2M氢氧化钠。在本发明的试验中，如未特别说明，制备细胞治疗组合物时，均是在无菌条件下进行操作的。在本发明中细胞治疗组合物分装到预充注射器中时每支装量可以是0.5～3ml，在本发明具体实例中如未说明，每支装量1ml。在以下具体实施例中，如未特别说明，所用的磷酸钠盐是磷酸二氢钠与磷酸氢二钠以重量比1：1的混合物，并且磷酸根浓度如具体实例所述。
实施例1、脐带MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
脐带间充质干细胞(第五代)：1×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.5％，
氯化钠：0.8％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度7.5mmol/L，
门冬氨酸钾：0.3％，
没食子酸：0.035％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[将氯化钠、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合、门冬氨酸钾、没食子酸溶解于配料体积80％量的注射用水中，必要时使用酸碱调节剂调节pH值，制成包含这些物质的如上述处方比例和pH值的溶液，加注射用水至配料体积90％量，接着经121℃热压灭菌10～15分钟处理，冷却后在无菌操作条件下加入规定量无菌人血白蛋白，补加注射用水至全量，混均，即得第一置换液；将玻璃酸钠、氯化钠、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合、门冬氨酸钾、没食子酸溶解于配料体积80％量的注射用水中，必要时使用酸碱调节剂调节pH值，制成包含这些物质的如上述处方比例和pH值的溶液，加注射用水至配料体积90％量，接着经121℃热压灭菌10～15分钟处理，冷却后在无菌操作条件下加入规定量无菌人血白蛋白，补加注射用水至全量，混均，即得第二置换液；第一置换液和第二置换液在与细胞混合前的温度为20～25℃；第一置换液配方除了不包含干细胞和玻璃酸钠外与上述组合物所列处方相同；第二置换液配方除了不包含干细胞外与上述组合物所列处方相同]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1200rpm离心4分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例2、脐带MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
脐带间充质干细胞(第三代)：1.25×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.3％，
氯化钠：0.9％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度6mmol/L，
门冬氨酸钾：0.4％，
没食子酸：0.03％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1500rpm离心2分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1000rpm离心3分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1000rpm离心3分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例3、脐带MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
脐带间充质干细胞(第七代)：0.75×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.7％，
氯化钠：0.7％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度9mmol/L，
门冬氨酸钾：0.2％，
没食子酸：0.04％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1000rpm离心5钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1500rpm离心1分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1500rpm离心1分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例4、脐带MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
脐带间充质干细胞(第9代)：0.5×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.8％，
氯化钠：0.6％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度10mmol/L，
门冬氨酸钾：0.1％，
没食子酸：0.05％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1200rpm离心3分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例5、脐带MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
脐带间充质干细胞(第二代)：1.5×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.2％，
氯化钠：1％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度5mmol/L，
门冬氨酸钾：0.5％，
没食子酸：0.02％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1200rpm离心3分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例6、脐带MSC的细胞治疗组合物
分别照实施例1-5的配料和方法，不同的仅是不添加门冬氨酸钾，得到5个组合物(可分别称为实施例61～实施例65组合物)。
实施例7、脐带MSC的细胞治疗组合物
分别照实施例1-5的配料和方法，不同的仅是不添加没食子酸，得到5个组合物(可分别称为实施例71～实施例75组合物)。
实施例8、脐带MSC的细胞治疗组合物
分别照实施例1-5的配料和方法，不同的仅是不添加门冬氨酸钾亦不添加没食子酸，得到5个组合物(可分别称为实施例81～实施例85组合物)。
实施例11、胎盘MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
胎盘间充质干细胞(第五代)：1×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.5％，
氯化钠：0.8％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度7.5mmol/L，
门冬氨酸钾：0.3％，
没食子酸：0.035％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1200rpm离心4分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例12、胎盘MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
胎盘间充质干细胞(第三代)：1.25×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.3％，
氯化钠：0.9％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度6mmol/L，
门冬氨酸钾：0.4％，
没食子酸：0.03％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1500rpm离心2分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1000rpm离心3分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1000rpm离心3分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例13、胎盘MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
胎盘间充质干细胞(第七代)：0.75×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.7％，
氯化钠：0.7％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度9mmol/L，
门冬氨酸钾：0.2％，
没食子酸：0.04％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1000rpm离心5钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1500rpm离心1分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1500rpm离心1分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例14、胎盘MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
胎盘间充质干细胞(第9代)：0.5×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.8％，
氯化钠：0.6％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度10mmol/L，
门冬氨酸钾：0.1％，
没食子酸：0.05％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1200rpm离心3分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例15、胎盘MSC的细胞治疗组合物
终产物的配料比例：
胎盘间充质干细胞(第二代)：1.5×107个/mL，
人血白蛋白：0.5％，
玻璃酸钠：0.2％，
氯化钠：1％，
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠组合：磷酸根浓度5mmol/L，
门冬氨酸钾：0.5％，
没食子酸：0.02％，
pH值：6.7～7.0，
注射用水：余量。
制法：
(1)制备第一置换液和第二置换液；[分别参考实施例1方法制备]
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1200rpm离心3分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1200rpm离心2分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以上述处方所述浓度混悬，分装(到预充注射器中)，即得细胞治疗组合物。该组合物可以置4℃冰箱中冻存以备临床应用。
实施例16、胎盘MSC的细胞治疗组合物
分别照实施例11-15的配料和方法，不同的仅是不添加门冬氨酸钾，得到5个组合物(可分别称为实施例161～实施例165组合物)。
实施例17、胎盘MSC的细胞治疗组合物
分别照实施例11-15的配料和方法，不同的仅是不添加没食子酸，得到5个组合物(可分别称为实施例171～实施例175组合物)。
实施例18、胎盘MSC的细胞治疗组合物
分别照实施例11-15的配料和方法，不同的仅是不添加门冬氨酸钾亦不添加没食子酸，得到5个组合物(可分别称为实施例181～实施例185组合物)。
实施例21：测定细胞活率和细胞残存率
针对本发明实施例1-5以及实施例6～8配制得到的全部细胞治疗组合物，以及针对本发明实施例11-15以及实施例16～18配制得到的全部细胞治疗组合物，采用公知的台盼蓝拒染法计数蓝染细胞(死细胞)及不染蓝细胞(活细胞)，按下式计算组合物的细胞活率(CV，即活细胞的比例)：
细胞活率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％
对于每批组合物，于制备完毕时测定其细胞活率(CV0)作为0时的细胞活率；接着将组合物在4℃温度处放置48小时，测定48小时时的细胞活率(CV48)；以48小时细胞活率除以0小时细胞活率所得商再乘以100％所得百分数，作为该组合物经4℃放置48小时后的细胞残存率(％)，其可称为SR值或SR48等，计算式如下：SR48(％)＝CV48/CV0×100％
结果：
实施例1-5以及实施例6～8配制得到的全部细胞治疗组合物，它们0时的细胞活率(CV)均在97～100％范围内(例如实施例1和实施例81组合物分别为98.2％和97.4％)，各组合物之间无明显差异；实施例6-8配制得到的全部细胞治疗组合物的SR48均在41～53％范围内，例如实施例61组合物的SR48为45.4％，而实施例1-5配制得到的全部细胞治疗组合物的SR48均在89～94％范围内，例如实施例1组合物的SR48为92.1％。
实施例11-15以及实施例16～18配制得到的全部细胞治疗组合物，它们0时的细胞活率(CV)均在96～100％范围内(例如实施例11和实施例181组合物分别为99.2％和97.7％)，各组合物之间无明显差异；实施例16-18配制得到的全部细胞治疗组合物的SR48均在46～54％范围内，例如实施例161组合物的SR48为52.2％，而实施例11-15配制得到的全部细胞治疗组合物的SR48均在90～94％范围内，例如实施例11组合物的SR48为92.7％。
由此，出人意料地发现，在本发明包含人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸盐及其浓度的间充质干细胞的细胞治疗组合物中，当额外同时地添加门冬氨酸钾和没食子酸后，可以显著地提高组合物在4℃条件下贮藏的细胞存活稳定性，当不添加此二者或者仅添加其一时，细胞存活稳定性在临床上不可接受。
实施例22：测定细胞表面标记物
本文实施例1-5以及实施例6-8的全部细胞治疗组合物，以及本文实施例11-15以及实施例16-18的全部细胞治疗组合物，通过利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行检测，根据美国“The International Society for Cellular Therapy(ISCT)”在2006年发布的有关检定间充质干细胞的准则，该细胞在标记物检测中应符合以下要求：标记物CD73、CD90、CD105表达阳性，表达率均大于95％；标记物CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR表达阴性，表达率均小于2％。经测定，上述实施例1-5以及实施例6-8的全部细胞组合物，以及本文实施例11-15以及实施例16-18的全部细胞治疗组合物，各标记物检测结果均符合标准要求，标记物CD73、CD90、CD105的表达率均大于95％，标记物CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR的表达率均小于2％。
实施例23：无菌、支原体、病毒检测
无菌检测：依据《中国药典》2015年版四部之1101直接接种法，分别接种于硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中，每管接种量为0.2mL。硫乙醇酸盐流体培养基置于35℃培养箱内培养，胰酪大豆胨液体培养基置于25℃培养箱内培养，应当符合标准规定。
支原体检测：依据《中国药典》2015年版四部之3301培养法，分别接种于支原体液体培养基和支原体半流体培养基中，每管接种量为0.2mL。培养基置于35℃培养箱内培养7d，7d后进行2次传代培养，每天观察，共培养21d，应当符合标准规定。
病毒检测：采用PCR方法进行HIV、HBV、HCV、TP病毒学检测，应当均不得检出。
结果：实施例1-5以及实施例6-8的全部细胞治疗组合物，以及本文实施例11-15以及实施例16-18的全部细胞治疗组合物，其无菌检测结果均符合药典标准的规定，其支原体检测结果均符合药典标准的规定，其病毒检测均未检出。
实施例24：注射制剂检查
pH值：取实施例1-5以及实施例6-8的全部细胞治疗组合物，以及本文实施例11-15以及实施例16-18的全部细胞治疗组合物，依法(中国药典2010年版二部附录VI H)测定pH值。结果：全部细胞治疗组合物的pH值均在6.5～7.5范围内，例如实施例1组合物的pH值为6.83，实施例11组合物的pH值为6.96。
渗透压摩尔浓度：取实施例1-5以及实施例6-8的全部细胞治疗组合物，以及本文实施例11-15以及实施例16-18的全部细胞治疗组合物，依法(中国药典2010年版二部附录IX G)测定渗透压摩尔浓度。作为注射制剂可接受的结果通常应为250～350mOsmol/Kg。结果：全部细胞治疗组合物的渗透压摩尔浓度均在250～350mOsmol/Kg范围内，例如实施例1组合物的渗透压摩尔浓度为316mOsmol/Kg，实施例11组合物的渗透压摩尔浓度为303mOsmol/Kg。
穿针速度：将填充细胞治疗组合物1ml的预充注射器中恢复到20℃室温环境，接着给注射器套上28G针头(一种具有较细直径的针，方便关节内注射给药)，以2kg压力压迫注射器使药液流出，以流速(秒/ml)表征细胞治疗组合物的穿针速度。经测定，实施例1-5以及实施例6-8的全部细胞治疗组合物的空针速度均在44～52秒/ml范围内，例如实施例1组合物的穿针速度为47.3秒/ml；实施例11-15以及实施例16-18的全部细胞治疗组合物的空针速度均在41～53秒/ml范围内，例如实施例11组合物的穿针速度为44.6秒/ml。另外，本申请人在此参照CN 110755452A(中国专利申请号201911159876.X)之实施例3记载的配方和制法制备得到组合物，并用与本发明相同的方式填充至1ml的预充注射器中，在20℃室温环境，照上述方法测定穿针速度，结果>240秒/ml，表明此文献方法所得组合物临床使用便利性远不及本发明配方组合物。
以上结果表明本发明组合物完全适合注射给药用于治疗骨关节炎。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种组合物，其包含：0.5％人血白蛋白、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水；例如，其包含：0.5％人血白蛋白、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水；例如，其可用于配制细胞治疗组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其包含：0.5％人血白蛋白、0.2～0.8％玻璃酸钠、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水；例如，其包含：0.5％人血白蛋白、0.3～0.7％玻璃酸钠、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水；例如，其中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述置换液的pH值为6.5～7.2；例如，其在用于配制细胞治疗组合物前预先经除菌处理。
3.一种细胞治疗组合物(其可用于治疗骨关节炎和软骨缺损)，其包含：间充质干细胞(其来源例如可以是脐带或胎盘)、人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐和水；例如，所述间充质干细胞的密度为0.5～2×107个/mL，例如0.5～1.5×107个/mL，例如0.75～1.25×107个/mL；例如，所述人血白蛋白的浓度为0.5％；例如，所述玻璃酸钠的浓度为0.2～0.8％；例如，0.3～0.7％；例如，所述氯化钠的浓度为0.6～1.0％；例如，0.7～0.9％。
4.根据权利要求3的细胞治疗组合物，所述磷酸钠盐是磷酸与氢氧化钠形成的盐；例如，该磷酸钠盐的磷酸根浓度为5～10mmol/L；例如，该磷酸钠盐的磷酸根浓度为6～9mmol/L；例如，该磷酸钠盐是磷酸二氢钠或者磷酸氢二钠或其组合。
5.根据权利要求3的细胞治疗组合物，其中还包含门冬氨酸钾；例如，所述细胞治疗组合物中包含0.1～0.5％门冬氨酸钾，例如包含0.2～0.4％门冬氨酸钾，例如包含0.3％门冬氨酸钾；例如，其中还包含没食子酸；例如，所述细胞治疗组合物中包含0.02～0.05％没食子酸，例如包含0.03～0.04％没食子酸，例如包含0.035％没食子酸；例如，其pH值为6.5～7.2；例如，其中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物的pH值为6.5～7.2。
6.根据权利要求3的细胞治疗组合物，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备第一置换液和第二置换液；
(2)将冻存的细胞置37℃水浴中融化，1000～1500rpm离心2～5分钟；
(3)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，再次加入适量第一置换液使细胞混悬，1000～1500rpm离心1～3分钟；
(4)离心完毕后，弃上层液保留沉淀的细胞，加入第二置换液使细胞以0.5～2×107个/mL的浓度混悬，分装，即得；
其中，所述第一置换液包含如下组分：人血白蛋白、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水，所述第二置换液包含如下组分：人血白蛋白、玻璃酸钠、氯化钠、磷酸钠盐、门冬氨酸钾、没食子酸、水。
7.根据权利要求6的细胞治疗组合物，其是在无菌条件下制备得到的；例如，其是在无菌条件下制备得到的可注射使用的无菌液体；例如，其中所述第一置换液和第二置换液在与细胞混合前的温度为20～25℃；例如，所述第一置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水；例如，所述第一置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水；例如，所述第二置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.2～0.8％玻璃酸钠、0.6～1.0％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为5～10mmol/L、0.1～0.5％门冬氨酸钾、0.02～0.05％没食子酸、水；例如，所述第二置换液包括如下组分：0.5％人血白蛋白、0.3～0.7％玻璃酸钠、0.7～0.9％氯化钠、磷酸钠盐且磷酸根浓度为6～9mmol/L、0.2～0.4％门冬氨酸钾、0.03～0.04％没食子酸、水；例如，所述第一置换液和第二置换液中还包含酸碱调节剂，例如盐酸和/或氢氧化钠，例如其添加量是使所述细胞治疗组合物、第一置换液和第二置换液的pH值为6.5～7.2；例如，所述第一置换液和第二置换液在用于配制细胞治疗组合物前预先经除菌处理。
8.权利要求3～7任一项所述细胞治疗组合物在制备用于治疗骨关节炎和软骨缺损的药剂中的用途。
9.权利要求1～2任一项所述组合物在制备用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物中的用途。
10.根据权利要求9的用途，其中所述细胞治疗组合物如权利要求3～7任一项所述。
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