CN111494421A - 一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents
一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液及其制备方法，每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞4～6×105个，人血清白蛋白2～4g、山药多糖10～30mg、复合氨基酸60～90mg、氯化钠0.5～0.6g、葡萄糖酸钠0.5～0.6g、醋酸钠0.3～0.4g、氯化钾0.03～0.04g和氯化镁0.03～0.04；本发明制得专用于抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，能够有效保持脐带间充质干细胞的活性，稳定性好，且能够有效阻止炎症介质的释放，炎细胞浸润程度减轻，血管翳数量明显降低，对类风湿性关节炎的骨与软骨破坏具有良好的修复作用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液及其制备方法。
背景技术
目前经临床研究表明，间充质干细胞不仅能够通过免疫调节作用降低关节炎的发生率并减轻实验性关节炎的严重程度，亦能修复发生于类风湿性关节炎的骨与软骨破坏，预示着其用于治疗类风湿性关节炎具有广阔的前景。自从2003年从人脐带华通氏胶成功分离出间充质干细胞以来，脐带成为继骨髓和脂肪后又一富含间充质干细胞的生物组织，由于脐带间充质干细胞具有来源方便、数量丰富和免疫原性低等优点，具备产业化和临床使用的条件。现有脐带间充质干细胞已在大量的动物模型和临床研究中广泛应用，但对于类风湿性关节炎的治疗效果参差不齐，其关键在于脐带间充质干细胞的活性控制难度大，现有的注射液保存介质中充质干细胞易出现黏附、聚集成团，稳定性差的问题，从而影响了现有人脐带间充质干细胞注射液在抗类风湿性关节炎的疗效。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液及其制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞4～6×105个，人血清白蛋白2～4g、山药多糖10～30mg、复合氨基酸60～90mg、氯化钠0.5～0.6g、葡萄糖酸钠0.5～0.6g、醋酸钠0.3～0.4g、氯化钾0.03～0.04g和氯化镁0.03～0.04g。本发明是基于人脐带间充质干细胞注射液制备的优化设计，同时研究该人脐带间充质干细胞注射液治疗类风湿性关节炎的有效性，通过将人脐带间充质干细胞与一定浓度的人血清白蛋白、山药多糖、复合氨基酸复配，制备得专用于抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，能够有效保持了脐带间充质干细胞的活性，避免配制的注射液保存介质中充质干细胞易出现黏附、聚集成团，稳定性差的问题，提高人脐带间充质干细胞注射液的稳定性；并且应用于类风湿性关节炎的治疗药物中，其能够有效阻止炎症介质的释放，炎细胞浸润程度减轻，血管翳数量明显降低，对类风湿性关节炎的骨与软骨破坏具有良好的修复作用。
进一步说明，每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞5×105个，人血清白蛋白3g、山药多糖20mg、复合氨基酸70mg、氯化钠0.526g、葡萄糖酸钠0.502g、醋酸钠0.368g、氯化钾0.037g、氯化镁0.03g。
进一步说明，所述复合氨基酸包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、醋酸L-赖氨酸和L-丝氨酸中的至少5种混合。
进一步说明，所述人脐带间充质干细胞为P4～6代人脐带间充质干细胞。
进一步说明，所述山药多糖的提取方法为由山药的根茎粉，按料液比为1:15加纯水，于90～100℃水浴中回流提取2次后，采用壳聚糖絮凝分离纯化而得的山药多糖。
一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤；
(1)预混液的制备：将复合氨基酸、山药多糖、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁按比例混合得到预混液；
(2)干细胞混悬液的制备：获取人脐带间充质干细胞，采用基础培养基重悬间充质干细胞后，加入人血清白蛋白，获得干细胞混悬液，
(3)向干细胞混悬液中加入预混液中，并加水补足至100ml，即得到抗类风湿性关节炎的脐带间充质干细胞注射液。
进一步说明，步骤(2)中，所述人脐带间充质干细胞是采用P5代人脐带间充质干细胞。
一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液在治疗类风湿性关节炎药物的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对人脐带间充质干细胞注射液制备的优化设计，同时研究该人脐带间充质干细胞注射液治疗类风湿性关节炎的有效性，通过将人脐带间充质干细胞与人血清白蛋白、山药多糖、复合氨基酸复配，制备得专用于抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，其有效保持脐带间充质干细胞的活性，避免配制的注射液保存介质中充质干细胞易出现黏附、聚集成团，稳定性差的问题，并且应用于类风湿性关节炎的治疗药物中，其能够有效阻止炎症介质的释放，炎细胞浸润程度减轻，血管翳数量明显降低，对类风湿性关节炎的骨与软骨破坏具有良好的修复作用，软骨破坏及骨侵蚀的程度明显被抑制，作为临床应用人脐带间充质干细胞治疗类风湿性关节炎生物药物，奠定良好的工作基础，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的各实验组的小鼠后爪钼靶X线片情况图；
图2为本发明的各实验组的小鼠后爪micro-CT成像情况图；
图3为本发明的各实验组的小鼠踝关节组织病理切片HE染色图，×10；
图4为本发明的各实验组的小鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体水平；
图5为本发明的各实验组的小鼠血清中炎性细胞因子的水平变化；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞6×105个，人血清白蛋白4g、山药多糖30mg、复合氨基酸90mg、氯化钠0.6g、葡萄糖酸钠0.6g、醋酸钠0.4g、氯化钾0.04g和氯化镁0.04g。
所述复合氨基酸包括L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸和醋酸L-赖氨酸的混合；
所述人脐带间充质干细胞为P4代人脐带间充质干细胞。
实施例2-一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞4×105个，人血清白蛋白2g、山药多糖10mg、复合氨基酸60mg、氯化钠0.5g、葡萄糖酸钠0.5g、醋酸钠0.3g、氯化钾0.03g和氯化镁0.03g；
所述复合氨基酸包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、醋酸L-赖氨酸和L-丝氨酸的混合；
所述人脐带间充质干细胞为P6代人脐带间充质干细胞。
实施例3-一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取试剂材料：人脐带间充质干细胞5×105个，人血清白蛋白3g、山药多糖20mg、复合氨基酸70mg、氯化钠0.526g、葡萄糖酸钠0.502g、醋酸钠0.368g、氯化钾0.037g和氯化镁0.03g；
其中，所述复合氨基酸包括:L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、醋酸L-赖氨酸和L-丝氨酸的混合；
所述人脐带间充质干细胞为P5代人脐带间充质干细胞；
所述山药多糖的提取方法为由山药的根茎粉，按料液比为1:15加纯水，于95℃水浴中回流提取2次后，采用壳聚糖絮凝分离纯化而得的山药多糖；
(2)预混液的制备：将复合氨基酸、山药多糖、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁按比例混合得到预混液；
(3)干细胞混悬液的制备：获取P5人脐带间充质干细胞，采用基础培养基重悬间充质干细胞后，加入人血清白蛋白，获得干细胞混悬液，
(4)向干细胞混悬液中加入预混液中，并加水补足至100ml，即得到100ml中抗类风湿性关节炎的脐带间充质干细胞注射液。
一、测定细胞存活率
1.根据实施例3的抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，配制3组含有不同浓度复合氨基酸的100ml人脐带间充质干细胞注射液样品，复合氨基酸的浓度分别为：0.3mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.2mg/ml；其余组分配比均与实施例3相同，置于4℃保存，并保存24小时后进行等量取样，加入采用0.2％台盼兰染液，随机选取视野，分别测定细胞存活率，选取每组设5个重复，取其平均值，其结果如下表：
2.根据实施例3的抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，配制3组含有不同浓度山药多糖的100ml人脐带间充质干细胞注射液样品，山药多糖的浓度分别为：0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml；其余组分配比均与实施例3相同，置于4℃保存，并保存24小时后进行等量取样，加入采用0.2％台盼兰染液，随机选取视野，分别测定细胞存活率，选取每组设5个重复，取其平均值，其结果如下表：
由上表结果可以看出，复合氨基酸的浓度优选为0.6～0.9mg/ml，其细胞存活率在97％以上，随着复合氨基酸的浓度增加，其细胞存活率出现明显降低；山药多糖的浓度则优选为0.1～0.3mg/ml，其细胞存活率在97％以上，而随着其浓度增加，细胞存活率降低，因此，采用人脐带间充质干细胞与一定浓度的复合氨基酸和山药多糖复配，有利于保持脐带间充质干细胞的活性，避免配制的注射液保存介质中充质干细胞易出现黏附、聚集成团，提高人脐带间充质干细胞注射液的稳定性。
二、评价人脐带间充质干细胞注射液治疗类风湿性关节炎的有效性。
1.材料
取由本发明实施例3的制备方法获得的人脐带间充质干细胞注射液；
2.实验动物
SPF级DBA/1小鼠，雌雄各半，7～8周龄，体重18±3g,购北京维通利华实验动物技术有限公司。将实验小鼠随机分笼，饲养于实验室动物房，全部自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次，每隔两天更换垫料一次；
3.实验仪器
Sunrise酶标仪，瑞士Tecan公司；医用注射器，美国BD公司；电子天平秤(EL104型)，上海越平科学仪器有限公司；-20℃冰箱，青岛海尔集团；数码照相机，日本尼康公司；病理切片机、组织包埋机、自动脱水机，德国Leica公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；Micro-CT机，比利时SkyScan公司；钼靶X线光机，德国Siemens公司；游标卡尺，HAMILTION；3K15型台式冷冻离心机，Sigma公司。
4.实验方法
(1)Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠模型的构建
将小鼠置于自制的固定盒子中，左手拇指和食指轻轻提起背部皮肤，右手持注射器，将针头刺入皮下，并稍向前刺入，即可注入药物。每只实验小鼠背部取4-6点进行皮下注射，总共注射200μl胶原-完全弗氏佐剂混合乳剂，注射后将针头在皮下部位停留一会，以防液体溢出。注射成功后皮肤表面鼓起一小突起。
3周后，用同样的方法将不完全弗氏佐剂与牛Ⅱ型胶原乙酸溶液等量混合并乳化，于每只小鼠尾根部取3-5点进行皮下注射，总共100μl，进行加强免疫。
正常对照组小鼠按照上述方法注射无菌生理盐水。
(2)实验分组及给药方法
在模型小鼠接受第二次免疫佐剂后，随机分为模型组、甲氨蝶呤阳性对照组、低剂量组和高剂量组、同期饲养不接收任何处理小鼠作为空白组，每组12只。除空白组与模型组尾静脉注射生理盐水外，干细胞治疗组分别通过尾静脉注射含有数量为5x104和5x105充质干细胞的人脐带间充质干细胞注射液注射液，阳性对照组腹腔注射甲氨蝶呤1mg/kg，注射体积20ml/kg，每周一次，连续3周。
(3)体重观察
初免后每3天测量一次，连续测量6周，以观察小鼠体重的变化。
(4)实验小鼠后肢肿胀度的评估
用游标卡尺测量后爪的厚度，以评估其肿胀程度。于初次免疫后第21天开始，每7天测定一次，连续测定3周。
(5)小鼠踝关节钼靶X线摄片及micro-CT检查
a.小鼠踝关节钼钯X线摄片
小鼠腹腔注射5％水合氯醛(5ml/kg)进行麻醉，待小鼠肌张力降低后俯卧于拍照板上，将其四肢的各关节尽可能伸展开，对后肢进行钼靶X线摄片(电压24KV，电流16mA，曝光时间0.23ms)。观察小鼠后足软组织肿胀程度、关节间隙清晰度以及关节骨质破坏情况。
b.小鼠踝关节micro-CT的检查
各组小鼠于初次免疫的第42天处死，分离其后肢，并剥去皮肤，对每一标本标注。将标本置于含0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液中浸泡、固定。然后将固定好的小鼠后爪放置在micro-CT扫描床上进行扫描，扫描完成后用NRecon软件进行三维重建，然后用CT分析软件对图像进一步处理。
c.影像学评估
对小鼠的后肢进行钼靶X线检查后，根据表3对关节破坏和骨侵蚀程度进行评分。
表3关节损伤分级及评分标准
(6)组织病理学观察
a.组织标本的处理
处死小鼠后将后肢(后足和关节部位)取下后立即用10％甲醛溶液固定，组织与固定液之比大约为1:15。固定好的后肢置于10％的EDTA溶液浸泡进行脱钙2天，脱钙液体积与脱钙标本体积比例保持约30:1。
b.组织切片的观察及评分
用显微镜观察组织病理改变并拍照。根据组织微观的改变如滑膜的浸润和关节周围组织中中性粒细胞和单核细胞的浸润(炎症)，边缘带的血管翳(血管翳)，骨破坏和软骨的损伤，根据表4标准进行评分。
表4评分标准
(7)血清抗Ⅱ型胶原抗体水平的测定
实验结束时，各组小鼠均经眼眶摘眼球取血，用间接ELISA方法测定血清抗Ⅱ型胶原抗体的水平。
(8)血清细胞因子的测定
取实验结束时小鼠的血清，用ELISA方法按照说明书对TNF-α、IL-6、IL-23和IL-17A进行测定，结果以吸光度值和浓度的关系做标准曲线，根据标准曲线与样品OD值，计算出各细胞因子的相对浓度。
(10)数据统计学的处理
采用SPSS16.0统计软件处理系统，实验数据以各组数据均数±标准差
表示。统计分析采用One-way ANOVA或Mann-Whitney U检验，P<0.05有统计学意义。
5.实验结果
(1)实验小鼠体重的变化
如表5所示，与空白组比较，模型组小鼠在一免后的第四周左右体重开始下降，随着时间推移体重进一步下降。与模型组相比，间充质干细胞各治疗组小鼠体重下降有所缓解，随着治疗周期的延长，各治疗组小鼠体重呈逐渐增加趋势，间充质干细胞对小鼠体重下降的抑制作用呈现出一定的剂量依赖性。
表5各组实验小鼠体重变化
注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
(2)实验小鼠后肢肿胀度的变化
如表6所示，与空白组比较，模型小鼠于一免第3周趾关节和踝关节不断肿胀，模型组小鼠关节炎症的加重使足背及足底部明显增厚。与模型组相比，间充质干细胞各剂量组小鼠爪的厚度增加较缓慢，同时呈现剂量依赖性抑制作用。
表6实验小鼠后肢肿胀度的变化
注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05。
(3)小鼠后肢钼靶X线摄片表现及骨质破坏评分
钼靶X线片显示模型组小鼠后肢出现严重的软组织肿胀，踝关节和诸多趾关节都明显破坏、移位，关节间隙消失。间充质干细胞尾静脉注射4次后，钼靶X线片显示各剂量组小鼠后肢同样存在骨质破坏、软组织肿胀的表现，但以高剂量组病变程度较模型组相比明显降低，如图1所示。
(4)小鼠后肢micro-CT的表现
用micro-CT进一步检查小鼠后肢，如图2所示，模型组小鼠关节完全损毁，关节结构辨认不清，骨质表面粗糙，并出现空洞；而间充质各剂量治疗组小鼠虽然关节有损毁，骨质表面粗糙，但严重程度明显改善，尤其以高剂量组改善明显。
(5)实验小鼠踝关节组织病理切片
取小鼠后爪和踝关节，石蜡切片并行HE染色，光镜下观察，结果如图3所示：模型组小鼠关节间隙消失，滑膜中有明显的炎细胞浸润、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀；间充质干细胞低剂量治疗组小鼠关节间隙几乎消失，滑膜中也出现明显的炎细胞浸润、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀，但程度较模型组有所降低；而间充质干细胞中、高剂量治疗组小鼠关节间隙清晰，炎细胞浸润程度减轻，血管翳数量明显降低，软骨破坏及骨侵蚀的程度也明显的被抑制。
(6)血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平
实验结束后取小鼠血清进行抗Ⅱ型胶原抗体水平的检测，如图4所示，模型组小鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平很高，而间充质干细胞低和高剂量治疗组小鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平明显降低，尤其以高剂量组最为明显(P<0.001)。
(7)血清中细胞因子水平
实验结束时取小鼠血清采用ELISA方法检测细胞因子，如图5所示，模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均高于空白组，间充质干细胞治疗组小鼠血清中TNF-α和IL-6相比模型组有所降低，尤其是间充质干细胞高剂量组效果最为明显。
综上实验结果表明，本发明的人脐带间充质干细胞注射液应用于类风湿性关节炎具有明显治疗作用，其能够有效阻止炎症介质的释放，炎细胞浸润程度减轻，血管翳数量明显降低，对类风湿性关节炎的骨与软骨破坏具有良好的修复作用，软骨破坏及骨侵蚀的程度明显的被抑制，其具有良好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于：每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞4～6×105个，人血清白蛋白2～4g、山药多糖10～30mg、复合氨基酸60～90mg、氯化钠0.5～0.6g、葡萄糖酸钠0.5～0.6g、醋酸钠0.3～0.4g、氯化钾0.03～0.04g和氯化镁0.03～0.04g。
2.如权利要求1所述的一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于：每100ml脐带间充质干细胞注射液中包括：人脐带间充质干细胞5×105个，人血清白蛋白3g、山药多糖20mg、复合氨基酸70mg、氯化钠0.526g、葡萄糖酸钠0.502g、醋酸钠0.368g、氯化钾0.037g、氯化镁0.03g。
3.如权利要求1所述的一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于：所述复合氨基酸包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、醋酸L-赖氨酸和L-丝氨酸中的至少5种混合。
4.如权利要求3所述的一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞为P4～6代人脐带间充质干细胞。
5.如权利要求1所述的一种抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于：所述山药多糖的提取方法为由山药的根茎粉，按料液比为1:15加纯水，于90～100℃水浴中回流提取2次后，采用壳聚糖絮凝分离纯化而得的山药多糖。
6.一种如权利要求1～5中任意一项所述的抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤；
(1)预混液的制备：将复合氨基酸、山药多糖、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁按比例混合得到预混液；
(2)干细胞混悬液的制备：获取人脐带间充质干细胞，采用基础培养基重悬间充质干细胞后，加入人血清白蛋白，获得干细胞混悬液，
(3)向干细胞混悬液中加入预混液中，并加水补足至100ml，即得到抗类风湿性关节炎的脐带间充质干细胞注射液。
7.如权利要求6所述的抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述人脐带间充质干细胞是采用P5代人脐带间充质干细胞。
8.一种如权利要求1～7中任意一项所述的抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞注射液在治疗类风湿性关节炎药物的应用。
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