JP6489486B2 - ペンタペプチド／ヘキサペプチドにより変形性関節症を治療するための新規用途 - Google Patents
ペンタペプチド／ヘキサペプチドにより変形性関節症を治療するための新規用途 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ペンタペプチド／ヘキサペプチドにより変形性関節症を治療するための新規用途（Use of a peptide having 5 or 6 amino acids for treating the degenerative joint disease）に関する。
変形性関節症(degenerative joint disease)とは関節軟骨の持続的な病変を指し、且つ骨腫瘍に伴って増殖する。骨増殖の多くは関節辺縁または軟骨下方に発生する。変形性関節症の発生原因は非常に複雑であるが、主に発病時の患者の年齢に関係する。変形性関節症は高齢者に発生することが多い。変形性関節症の発生は、検査で関節軟骨の摩損及び繊維化、骨腫瘍(骨棘)の発生及び／或いは軟部組織の炎症が発見されることで確認される。
年齢変化が軟骨の病変に確実に影響を及ぼすことは知られているが、但し、変形性関節症の本当の病因は現在までに未だ未解明である。
変形性関節症の多くは体重を支える関節または手指の間の関節に発生し、特に末端の指関節に発生する。関節痛及び活動制限は臨床における主な兆候である。病理学検査で関節の変形、関節辺縁の腫れ、及び押した際の痛みと関節雑音の有無などを確認する。
現在変形性関節症治療用の薬物として、非ステロイド性抗炎症薬(例えば、ＣＯＸ２薬物製剤)、関節内局部注射用ステロイド、及び関節内注射栄養潤滑剤(即ち、ヒアルロン酸製剤)を含む。
従来の特許文献１では、例えば、２つまたは３つのアラニン(Ala；A)残基（Alanine residue）を含むテトラペプチドにより関節炎を治療するための用途の発明が記載されている。
また、従来の特許文献２では、例えば、８つのアミノ酸残基及び２つの結合基を含む環状ペプチドにより関節リウマチを治療するための用途の発明が記載されている。
なお、従来の特許文献３及び４では、例えば、ペンタペプチド(QHNPR)により組織或いは器官(骨等)の水とミネラルのアンバランスさを予防または治療するための用途の発明が記載されている。Ｑはグルタミン酸(G l n)を表し、Ｈはヒスチジン(H I s)を表し、Ｎはアスパラギン酸(A s n)を表し、Ｐはプロリン(P r o)を表し、Ｒはアルギニン酸(A r g)を表す。
しかしながら、先行技術には、高リシン(L y s；K)及びトレオニン(T h r；T)を使用したペンタペプチド／ヘキサペプチドにより変形性関節症を治療することについて、教示も掲示もされていない。
そこで、本発明者は上記の欠点が改善可能と考え、鋭意検討を重ねた結果、ペンタペプチド／ヘキサペプチド(KTTKS(F))を変形性関節症治療用途に応用することに成功し、これにより、変形性関節症治療の新たな選択肢を提供する。
本発明は、以上の従来技術の課題を解決する為になされたものである。即ち、本発明は、ペンタペプチド／ヘキサペプチドにより変形性関節症を治療するための新規用途を提供することを目的とする。
これにより、本発明は主に、以下の技術手段により前述の目的及び効果を具体的に実現する。
本発明はペンタペプチド／ヘキサペプチド(KTTKS(F))により変形性関節症を治療するための用途である。以下では特定の具体的な実施態様を例に本発明の技術内容を説明し、本技術分野に習熟する者が本明細書に記載の内容から本発明の長所及び効果を容易に理解できるようにする。しかしながら、本発明は他の異なる具体的な実施態様を加えて施行または応用可能である。本発明の特許出願範囲の内容を逸脱せず、本発明の具体的な実施形態の設計及び需要に基づいて変化を加えることもできる。
また、本発明に記載する医薬組成物は、治療有効量のペンタペプチド／ヘキサペプチド(KTTKS(F))及び医薬上許容可能な担体（carrier）を含む。前記医薬上許容可能な担体は固体担体と、半固体担体と、液体担体とを含み、前記等固体担体、半固体担体、及び液体担体の種類及び適正用量は本技術分野では従来の慣用のものである。前記医薬組成物は錠剤、タブレット、丸薬、粉末、または顆粒の形態を呈する。前記医薬組成物はゼリー、パップ剤、または貼付剤の形態を呈する。前記医薬組成物は水溶性緩衝液の形態を呈し、前記水溶性緩衝液は限定されないが、リン酸塩またはクエン酸塩の水溶液を含む。
また、本発明に使用される生化学の定義の略称は、リシン(Lys；K)、トレオニン(T h r；T)、セリン(S e r；S)、及びフェニルアラニン(P h e；F)である。
本発明に記載のペンタペプチド（KTTKS）及びヘキサペプチド（KTTKSF）は先行技術、例えば、ＴＷ２０１１２９３６８ Ａ１及びＴＷ２０１３３３０４５ Ａ１に記載の方法により準備を行う。
本発明に使用される関節液中のＳＯＤ、ＮＯ、及びＭＤＡの測定方法及び軟骨細胞基質中のコラーゲン及びプロテオグリカンの測定方法は、本技術分野では従来の慣用のものである。
（実施例１）
１、動物モデル
１５匹の健康な成獣のニュージーランドホワイトウサギを３組に分ける。正常な対照群(Ａ組)、モデル対照群(Ｂ組)、及びペプチド関節腔注射群(Ｃ組)に分け、各群５匹とする。手術前に４時間禁食させ、Ｋｅｔａｍｉｎｅ(10 mg/kg)及びＡｔｒｏｐｉｎｅ(0.2 mg/kg)の筋肉注射を行う。麻酔が効いてから、動物を手術台の上に固定させ、膝蓋骨靭帯の後縁に８ｃｍの縦方向の切り口を形成させ、皮膚を持ち上げ、膝蓋骨の後縁に沿って関節包及び滑膜を開き、膝関節を９０度湾曲させて、大腿骨下端の軟骨を露出させる。直径３ｍｍ、深さ３ｍｍの２つの円柱形欠損を形成させ、欠損箇所の凝血を除去し、無菌の生理食塩水で関節内腔を洗浄した後、段階的に丁寧に縫合する。手術後にペニシリン抗感染症薬を１週間注射する。５日後に正常な飲食を再開させ、自分で立たせる。
１、動物モデル
１５匹の健康な成獣のニュージーランドホワイトウサギを３組に分ける。正常な対照群(Ａ組)、モデル対照群(Ｂ組)、及びペプチド関節腔注射群(Ｃ組)に分け、各群５匹とする。手術前に４時間禁食させ、Ｋｅｔａｍｉｎｅ(10 mg/kg)及びＡｔｒｏｐｉｎｅ(0.2 mg/kg)の筋肉注射を行う。麻酔が効いてから、動物を手術台の上に固定させ、膝蓋骨靭帯の後縁に８ｃｍの縦方向の切り口を形成させ、皮膚を持ち上げ、膝蓋骨の後縁に沿って関節包及び滑膜を開き、膝関節を９０度湾曲させて、大腿骨下端の軟骨を露出させる。直径３ｍｍ、深さ３ｍｍの２つの円柱形欠損を形成させ、欠損箇所の凝血を除去し、無菌の生理食塩水で関節内腔を洗浄した後、段階的に丁寧に縫合する。手術後にペニシリン抗感染症薬を１週間注射する。５日後に正常な飲食を再開させ、自分で立たせる。
２、実験方法
手術後の第２週から開始し、Ａ組及びＢ組には如何なる処理も行わず、Ｃ組には２５０ ｐｐｍ／ｋｇのペンタペプチド（KTTKS）を関節腔に注射し、７日毎に１回注射し、計１２週間薬物を投与する。０．５ｍｌの生理食塩水を関節腔に注射し、０．２ｍｌの関節液を収集する。関節包を切開し、滑膜を取り出すと共に脛骨の関節面を完全に取り出し、肉眼及び内視鏡で関節軟骨の病変程度を観察し、且つスライスした後にヘマトキシリン‐エオジン染色(HE Stain、Hematoxylin and Eosin Stain)及びトルイジン青染色をそれぞれ行い、光学顕微鏡で観察する。
手術後の第２週から開始し、Ａ組及びＢ組には如何なる処理も行わず、Ｃ組には２５０ ｐｐｍ／ｋｇのペンタペプチド（KTTKS）を関節腔に注射し、７日毎に１回注射し、計１２週間薬物を投与する。０．５ｍｌの生理食塩水を関節腔に注射し、０．２ｍｌの関節液を収集する。関節包を切開し、滑膜を取り出すと共に脛骨の関節面を完全に取り出し、肉眼及び内視鏡で関節軟骨の病変程度を観察し、且つスライスした後にヘマトキシリン‐エオジン染色(HE Stain、Hematoxylin and Eosin Stain)及びトルイジン青染色をそれぞれ行い、光学顕微鏡で観察する。
３、実験結果
＜肉眼による観察結果＞
１２週間後、Ａ組の膝関節表面は滑らかになり、弾力があり、関節腔中に少量の関節液が観察された。Ｂ組の欠損群は部分的に修復されていたが、但し、欠損の中央部には陥没及び隙間が尚残留していた。Ｃ組は全ての欠損が完全に修復されており、断面構造と正常な関節には違いがなく、表面の軟骨及びその下の海綿骨が均しく完全に修復されており、且つ骨化及び修復の痕跡も見られなかった。
＜肉眼による観察結果＞
１２週間後、Ａ組の膝関節表面は滑らかになり、弾力があり、関節腔中に少量の関節液が観察された。Ｂ組の欠損群は部分的に修復されていたが、但し、欠損の中央部には陥没及び隙間が尚残留していた。Ｃ組は全ての欠損が完全に修復されており、断面構造と正常な関節には違いがなく、表面の軟骨及びその下の海綿骨が均しく完全に修復されており、且つ骨化及び修復の痕跡も見られなかった。
＜組織形態学的観察＞
Ａ組の関節組織は正常な関節組織と特徴が相似し、表面は軟骨組織が成熟しており、中間部には順に成熟骨端軟骨板が配列され、下方は骨化が良好な海綿骨となり、且つ軟骨組織の厚さは正常である。Ｂ組の欠損群の修復された組織は繊維軟骨及び繊維組織が主であり、正常な組織との間の境界が連続しており、部分的な標本の欠損領域には多くの繊維軟骨組織が充填されているが、但し、欠損領域の骨端軟骨板の形成が明確ではなく、且つ下方の海綿骨の骨化も不良である。Ｃ組の修復された組織は正常な関節組織の特徴とは明らかに差異がなく、表面軟骨組織、骨端軟骨板、及び下方の海綿骨が全て正常な組織学的形態に達しており、新生軟骨の厚さは正常な軟骨と同じであり、軟骨及び骨の境界箇所も区分されていない。
Ａ組の関節組織は正常な関節組織と特徴が相似し、表面は軟骨組織が成熟しており、中間部には順に成熟骨端軟骨板が配列され、下方は骨化が良好な海綿骨となり、且つ軟骨組織の厚さは正常である。Ｂ組の欠損群の修復された組織は繊維軟骨及び繊維組織が主であり、正常な組織との間の境界が連続しており、部分的な標本の欠損領域には多くの繊維軟骨組織が充填されているが、但し、欠損領域の骨端軟骨板の形成が明確ではなく、且つ下方の海綿骨の骨化も不良である。Ｃ組の修復された組織は正常な関節組織の特徴とは明らかに差異がなく、表面軟骨組織、骨端軟骨板、及び下方の海綿骨が全て正常な組織学的形態に達しており、新生軟骨の厚さは正常な軟骨と同じであり、軟骨及び骨の境界箇所も区分されていない。
＜生化学指標検査＞
Ｂ組と対照すると、Ｃ組の関節軟骨形態は明らかに改善しており、且つ関節液中のＳＯＤも明確に増加し、ＮＯ及びＭＤＡも顕著に低下している。
Ｂ組と対照すると、Ｃ組の関節軟骨形態は明らかに改善しており、且つ関節液中のＳＯＤも明確に増加し、ＮＯ及びＭＤＡも顕著に低下している。
結論
１、組織形態学の実験結果から明らかなように、ペンタペプチド（KTTKS）を関節腔に注射すると、損傷した軟骨組織が顕著に修復され、変形性関節症の治療効果が十分確かめられる。
２、ペンタペプチド（KTTKS）は滑膜中のＭＤＡを明確に低下させ、関節腔内の脂質過酸化による損傷程度も低下させ、これにより遊離基の軟骨細胞及び基質に対する損傷を軽減させ、関節軟骨の保護作用を達成させる。
３、ペンタペプチド（KTTKS）はウサギの関節内腔のＳＯＤ濃度を顕著に高め、炎症により発生した遊離基を消滅させ、軟骨を保護させて軟骨の病変の抑制及び防止を達成させる。
４、 ペンタペプチド（KTTKS）はウサギの関節内腔のＮＯ濃度を明確に高め、ＮＯの軟骨に対する破壊を低減させる。
１、組織形態学の実験結果から明らかなように、ペンタペプチド（KTTKS）を関節腔に注射すると、損傷した軟骨組織が顕著に修復され、変形性関節症の治療効果が十分確かめられる。
２、ペンタペプチド（KTTKS）は滑膜中のＭＤＡを明確に低下させ、関節腔内の脂質過酸化による損傷程度も低下させ、これにより遊離基の軟骨細胞及び基質に対する損傷を軽減させ、関節軟骨の保護作用を達成させる。
３、ペンタペプチド（KTTKS）はウサギの関節内腔のＳＯＤ濃度を顕著に高め、炎症により発生した遊離基を消滅させ、軟骨を保護させて軟骨の病変の抑制及び防止を達成させる。
４、 ペンタペプチド（KTTKS）はウサギの関節内腔のＮＯ濃度を明確に高め、ＮＯの軟骨に対する破壊を低減させる。
（実施例２）
一、実験方法
先ず、ウサギの成長板軟骨細胞を取得し、持続的に培養し、ペンタペプチド（KTTKS）単独作用群、コラーゲン単独作用群、ペンタペプチド（KTTKS）＋コラーゲン連合作用群を設け、ペンタペプチド（KTTKS）２５０ｐｐｍ、コラーゲン(100 ng/ml)、及びペンタペプチド（KTTKS）(250 ppm)＋コラーゲン(100 ng/ml)をそれぞれ添加し、且つ陰性対照群を設け、新生軟骨組織が遠心管底部まで成長した後、２４孔培養板内に移して培養を継続し、隔日で培地を交換し、予定の培養時間(３日、７日及び１４日)に達した後、標本を取り出して各項目の検査を行う。
一、実験方法
先ず、ウサギの成長板軟骨細胞を取得し、持続的に培養し、ペンタペプチド（KTTKS）単独作用群、コラーゲン単独作用群、ペンタペプチド（KTTKS）＋コラーゲン連合作用群を設け、ペンタペプチド（KTTKS）２５０ｐｐｍ、コラーゲン(100 ng/ml)、及びペンタペプチド（KTTKS）(250 ppm)＋コラーゲン(100 ng/ml)をそれぞれ添加し、且つ陰性対照群を設け、新生軟骨組織が遠心管底部まで成長した後、２４孔培養板内に移して培養を継続し、隔日で培地を交換し、予定の培養時間(３日、７日及び１４日)に達した後、標本を取り出して各項目の検査を行う。
次いで、組織学及び組織化学検査を行う。標本を収集してＨＥ染色を行い、免疫組織化学(S-P法)検査を行う。
その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８法を使用して軟骨細胞のＤＮＡ含量を測定する。
続いて、軟骨細胞基質の合成を行う。水分以外では、軟骨細胞基質中の最も主要な成分は、コラーゲン、及びグリコサミノグリカンとコアタンパク質とで構成されるプロテオグリカンである。新生組織中のコラーゲン及びプロテオグリカン含量の測定を行って、基質含量及び代謝状況の定量分析を行う。
最後に、ヒドロキシプロリン（h y d r o x y p r o l i n e）法により軟骨細胞のコラーゲンの合成の測定を行う。ヒドロキシプロリンのコラーゲン中での比率は比較的一定であるため(コラーゲンの重量の約１０％を占める)、ヒドロキシプロリンの定量により軟骨細胞のコラーゲンの生産量の分析が可能である。ヒドロキシプロリン検査試薬箱の説明書に厳格に従って操作し、且つ各サンプルのコラーゲン含量を計算する。
二、実験結果
１、ペンタペプチド（KTTKS）の軟骨細胞の増殖に対する影響。ペンタペプチド（KTTKS）を添加することによる軟骨細胞の増殖は顕著であり、その軟骨細胞のＤＮＡ含量は対照群とは統計学的差異が示される(図１参照)。前記結果からペンタペプチド（KTTKS）が軟骨細胞の増殖を有効的に促進させることが分かる。
２、ペンタペプチド（KTTKS）の軟骨細胞基質合成に対する影響。ペンタペプチド（KTTKS）を添加することでコラーゲン及びプロテオグリカンの合成が顕著に促進され、且つ更に軟骨細胞の増殖が有効的に促進され、前記結果には対照群との統計学的な差異が示される(図２及び図３参照)。
１、ペンタペプチド（KTTKS）の軟骨細胞の増殖に対する影響。ペンタペプチド（KTTKS）を添加することによる軟骨細胞の増殖は顕著であり、その軟骨細胞のＤＮＡ含量は対照群とは統計学的差異が示される(図１参照)。前記結果からペンタペプチド（KTTKS）が軟骨細胞の増殖を有効的に促進させることが分かる。
２、ペンタペプチド（KTTKS）の軟骨細胞基質合成に対する影響。ペンタペプチド（KTTKS）を添加することでコラーゲン及びプロテオグリカンの合成が顕著に促進され、且つ更に軟骨細胞の増殖が有効的に促進され、前記結果には対照群との統計学的な差異が示される(図２及び図３参照)。
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
なし
Claims (6)
- 変形性関節症の治療用医薬組成物の製造のための、ペンタペプチド（KTTKS）の使用。
- 前記治療を経た患者の関節液中のＳＯＤ含量が増加し、且つＮＯ及びＭＤＡ含量が低下することを特徴とする、請求項１に記載のペンタペプチド（KTTKS）の使用。
- 前記治療を経た患者の関節軟骨細胞が増殖することを特徴とする、請求項１に記載のペンタペプチド（KTTKS）の使用。
- 治療有効量のペンタペプチド（KTTKS）及び医薬上許容可能な担体（ carrier）を含むことを特徴とする、変形性関節症の治療用医薬組成物。
- 前記医薬組成物は錠剤、タブレット、丸薬、粉末、顆粒、ゼリー、パップ剤、貼付剤、または水溶性緩衝液の形態を呈することを特徴とする、請求項４に記載の変形性関節症の治療用医薬組成物。
- 前記水溶性緩衝液はリン酸塩またはクエン酸塩の水溶液であることを特徴とする、請求項５に記載の変形性関節症の治療用医薬組成物。
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