CN115068616A

CN115068616A - 间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防或治疗骨关节疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN115068616A
Application number: CN202210685325.2A
Authority: CN
Inventors: 陈萌萌
Original assignee: Guangzhou Huishan Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Huishan Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2022-09-20

Abstract

本发明涉及细胞医学技术领域，具体公开了一种间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用。将间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药能够明显提高软骨细胞的存活率，改善软骨细胞形态，具有低免疫原性并且拥有调节作用，同时间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药能够显著降低IL‑1β和TNF‑a的表达，并且可以提高ECM和II型胶原酶的含量，减轻骨关节炎的症状，兼顾了软骨再生和抗炎止痛，有效镇痛，有助于改善生活质量，有助于改善生活质量，能应用于制备预防治疗炎症性关节炎优选为骨关节炎药物中，而且扩大了间充质干细胞及其外泌体预防治疗的可选择范围。

Description

间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防或治疗骨关节疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及细胞医学技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防或治疗骨关节疾病药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)，是以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性退行性骨关节病，在临床上非常常见。目前认为本病的发生与衰老、肥胖、炎症、创伤、关节过度使用、代谢障碍及遗传等因素有关。OA多见于中老年女性，慢性关节疼痛严重影响患者的生活质量，病情严重者可导致关节畸形，关节功能丧失。

骨关节炎的治疗目的在于缓解疼痛、阻止和延缓疾病的进展、保护关节功能及改善生活质量。治疗方案应个体化，充分考虑患者的患病危险因素、受累关节的部位、关节结构改变、炎症情况、疼痛程度、伴发病等具体情况。最新的骨关节炎诊疗指南建议，治疗原则应以非药物治疗联合药物治疗为主，必要时手术治疗。

对于骨关节炎的治疗措施主要以药物治疗和物理治疗为主，必要时进行手术治疗。1)药物治疗主要是非甾体类抗炎镇痛药、糖皮质激素、透明质酸、氨基葡萄糖以及IL-1抑制药和受体拮抗药等，这些药物均存在一定的治疗局限和副作用，如重复注射皮质类固醇可能会导致软骨变性；非甾体抗炎药可能会导致肝肾功能损伤。2)物理治疗，随着骨关节炎的规范化治疗深入开展，非药物治疗尤其是物理疗法逐渐占有越来越重要的地位，但物理治疗对患者的依从性要求较高，患者依从性好，治疗效果较好，对首诊症状较重的OA效果不大。3)手术治疗，主要针对药物疗效不佳或者严重关节障碍的情况，早期治疗有截骨矫形术和关节复位术，中期治疗有关节清理术、软骨和软骨细胞移植术；晚期有关节置换术、关节切除成形术和关节融合术等。手术无一例外都是难度较大，且长期有效性不确切或者费用高昂的方式。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防/治疗骨关节疾病药物中的应用。本发明将间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药治疗骨关节疾病兼顾了软骨再生和抗炎止痛，有效镇痛有助于改善生活质量，为治疗骨关节炎的新思路。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防/治疗骨关节疾病药物中的应用。

本发明将间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药可以提高软骨细胞的存活率，同时还可以减少关节内炎症、减轻骨关节炎的疼痛程度。

与间充质干细胞相比，间充质干细胞来源外泌体相对间充质干细胞的优势如下，1.性质更稳定：外泌体可保护其内容物、某些活性成分快速降解；2.保存运输更方便：外泌体在-20℃下储存6个月、-80℃长期保存，同时不会损失其生化活性；3.更容易量产：外泌体可在培养基内大量富集；4.更加安全，大量研究证明其非致瘤性、安全性。

经过实验验证，间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药能够明显提高软骨细胞的存活率，改善软骨细胞形态，具有低免疫原性并且拥有调节作用，同时间充质干细胞衍生的外泌体联合非甾体抗炎药能够显著降低IL-1β和TNF-a的表达，并且可以提高ECM和II型胶原酶的含量，减轻骨关节炎的症状。

间充质干细胞具有一定程度的抗炎作用，但早期强度不如非甾体抗炎药。非甾体抗炎药抑制环氧合酶的活性，减少前列腺素的合成，减轻炎性反应。非甾体抗炎药可能会导致肝肾功能损伤，而间充质干细胞来源外泌体研究显示具有肝保护、肾保护作用。因此，本发明将间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药治疗骨关节炎兼顾了软骨再生和抗炎止痛，有效镇痛有助于改善生活质量，为治疗骨关节炎的新思路。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞的来源包括脐带华通氏胶、脐带血、骨髓、牙龈、胎盘、羊膜、绒毛膜、外周血、脂肪和皮肤中的一种。间充质干细胞的来源包括人但不限于其它哺乳动物，本发明的间充质干细胞的来源不局限于上述来源，还包括本领域常见的间充质干细胞来源，均包含在本发明范围之内。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞来源外泌体的表达标记物为TSG1001、CD9、CD63和CD81。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞来源外泌体的剂型包括凝胶、注射液、冻干粉或乳剂，优选地，所述间充质干细胞来源外泌体的剂型为凝胶。本发明的间充质干细胞来源外泌体的剂型不局限于上述剂型，还包括本领域常见的剂型种类，均包含在本发明范围之内。

优选地，所述非甾体抗炎药包括选择性和非选择性非甾体抗炎药。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述非甾体抗炎药包括布洛芬、依托考昔、艾瑞昔布、塞来昔布、双氯芬酸、酮洛芬、吲哚美辛、萘普生、美洛昔康、萘丁美酮和吡罗昔康中的任意一种。

非甾体抗炎药选用上述药物时，可以较好地和间充质干细胞来源外泌体联合治疗骨关节炎，兼顾了软骨再生和抗炎止痛，有效镇痛有助于改善生活质量。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞来源外泌体的用量为100-1000μg，优选为100μg。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞来源外泌体为腔内注射、静脉输注或外用，优选为腔内注射(包括关节腔、蛛网膜下腔或脊髓间隙)。

第二目的，本发明提供了上述间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在降低骨关节炎患者的IL-1β和TNF-a的表达，提高ECM和II型胶原酶的含量，抑制滑膜细胞增殖中的应用。

第三目的，本发明提供了一种药物组合物，包括间充质干细胞来源外泌体和其他治疗骨关节炎药物，所述其他治疗骨关节炎药物包括非甾体抗炎药、正清风痛宁、甲氨蝶呤、氨基葡萄糖、透明质酸钠、糖皮质激素、基因药物、细胞药物、生物制剂、二磷酸盐、地舒单抗、蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角蛋白及其衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物或甲壳素衍生物。本发明其他治疗骨关节炎药物不仅包括上述列举的药物，还包括本领域常用的治疗骨关节炎药物，均包含在本发明范围之内。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物包含0.1至100mg/kg体重的多糖或糖胺聚糖。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物包含0.1至100mg/kg体重的抗炎化合物。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物中间充质干细胞来源外泌体的用量为100-1000μg。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物的注射周期为1-2次/周或者2-3周一次；疾病稳定期为3个月注射一次药物组合物。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述骨关节疾病选自骨关节炎、退行性关节炎、及其中涉及急性或慢性骨关节症状的其它炎症性疾病。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述其它炎症性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、骨质疏松、脊椎关节炎、强直性脊柱炎或痛风。

第四目的，本发明还提供了一种药盒，其包含：

含有上述的药物组合物的瓶；

将所述药物组合物递送至哺乳动物对象的炎性关节的装置，并且装置具有一贮存所述组合物的贮库器具；

可沿贮库纵轴移动以分配所述药物组合物的活塞器具，以及固定在贮库器具上用于将所述药物组合物递送至哺乳动物对象的空心针。

第五目的，本发明还提供了一种药物，所述药物由活性成分和辅料组成，生物材料所述活性成分含有上述药物组合物。

所述药物具有如下任一功能：

1)治疗和/或预防动物骨关节炎；

2)治疗和/或预防动物衰老相关的骨关节炎；

3)延缓软骨细胞的衰老：

4)延缓间充质干细胞的复制性衰老；

5)延缓滑膜细胞的病理性增殖。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防或治疗骨关节疾病药物中的应用，将间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药治疗骨关节炎兼顾了软骨再生和抗炎止痛，有效镇痛有助于改善生活质量，为治疗骨关节炎的新思路；间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药能够明显提高软骨细胞的存活率，改善软骨细胞形态，具有低免疫原性并且拥有调节作用，同时间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药能够显著降低IL-1β和TNF-a的表达，并且可以提高ECM和II型胶原酶的含量，减轻骨关节炎的症状，增强患者的生活质量。

附图说明

图1为间充质干细胞来源外泌体特异性抗体TSG101的鉴定图；

图2为纳米颗粒跟踪分析法NTA分析间充质干细胞来源外泌体粒径和浓度的结果图；

图3为间充质干细胞来源外泌体透射电镜鉴定图；

图4为各个处理组给药后大鼠关节软骨组织中多功能蛋白聚糖(versican)的表达定位图；

图5为各个处理组给药后大鼠关节软骨组织中聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表达定位图；

图6为各个处理组给药后大鼠关节软骨组织中II型胶原的表达定位图；

图7为各个处理组给药后大鼠关节软骨组织中MMP-13的表达定位图；

图8为各个处理组给药后大鼠关节软骨组织中TIMP-1的表达定位图；

图9为各个处理组给药后膝关节HE染色结果图；

图10为各个处理组给药后膝关节甲苯胺蓝染色结果图；

图11为各个处理组给药后膝关节番红O染色结果图；

图12为各个处理组给药后大鼠外周关节标准视觉图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、间充质干细胞来源外泌体的提取：

1、间充质干细胞(MSC)的提取：

MSC 3D培养：

a)复苏P1细胞，按140万/T175培养瓶的密度计算，在37℃的5％CO₂培养箱中培养3天后进行消化，制备单细胞悬液。

b)MSCs按5×10⁴个细胞/mL的密度进行播种；细胞着床模式设定为60rpm、5分钟和0rpm、20分钟，循环58个周期。接种后2、6和24小时，通过测定样品上清液中的细胞数来评估附着效率。

c)搅拌器的速度被设定为50rpm/min，经过步骤b)处理后的MSCs在37℃的5％CO₂培养箱中培养4天。

d)对培养液进行离心，上清用于外泌体提取。

2、间充质干细胞来源外泌体的提取：

收集上清于原料蓝盖瓶中，通过先后顺序从0.05μm到1.0μm的微滤膜进行过滤，去除培养上清中的残留细胞、死细胞及细胞碎片。得到的中间品，之后选择100-500kd的超滤膜进行超滤，将样品浓缩至原本体积的十分之一。在浓缩液中加入等体积缓冲液进行换液操作，重复3次，最后经过0.1-0.22μm微滤膜除菌处理，收集溶液即得所述间充质干细胞来源外泌体。

3、间充质干细胞来源外泌体的鉴定：

a)使用Western blot法/流式细胞术对外泌体蛋白TSG101进行鉴定，结果如图1所示。

b)使用纳米颗粒跟踪分析法NTA分析外泌体粒径和浓度，结果如图2所示。

c)透射电镜鉴定间充质干细胞来源外泌体，结果如图3(100μm)所示。

实施例2、间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药治疗SD大鼠OA模型

构建OA疾病大鼠模型：

将4周龄的24只SD大鼠，体重为200-240g，随机分为4组(n＝6)，其中，每个处理组中的大鼠根据经典的Hulth法建立KOA模型，该模型是通过部分切除右膝内侧半月板而构建而成，其中对照组为假手术组。

其中，KOA模型(膝关节骨性关节炎)的制备包括以下步骤：

1)称重后，向各组大鼠腹腔注射35mg/kg-40mg/kg 1％戊巴比妥钠进行麻醉处理，当大鼠出现麻醉症状后，将其固定在鼠台上并使其保持仰卧姿势。进行手术前，剪除大鼠右侧后肢膝关节的毛发，对膝关节处用碘伏进行消毒处理。

2)在显微镜下，将右膝关节近侧1cm处用眼科剪纵切右膝关节内侧髌旁皮肤，避开内侧横纵动脉，切断内侧副韧带，打开关节腔，沿着内侧副韧带的上缘切开关节囊。

3)将关节囊切开，露出髌骨，将其外翻固定，继续切开关节囊，直至膝盖骨完全暴露。

4)将大鼠右侧膝关节弯曲，使胫骨前交叉韧带和内侧半月板暴露出来，用手术刀片将前交叉韧带切断，并切除半月板。

5)切除半月板后，对大鼠进行止血处理，并清洗关节腔，然后将髌骨放置在原来的位置并依次缝合各层组织，并在无菌条件下包扎患处。

6)手术后，大鼠肌肉注射氨苄西林(1.5mg/kg)3d，以防止切口感染，然后允许大鼠自由进食。

治疗：

术后第4周，每个处理组中的大鼠术后4周进行一次性关节腔注射给药及进行灌胃治疗，具体处理分组如下：

对照组：关节腔注射100μl生理盐水进行处理。

MSC组：关节腔注射100μl 1×10⁶个MSCs(剂型可为凝胶)；

间充质干细胞来源外泌体组(MSC-Evs组)：关节腔注射100μg外泌体(剂型可为凝胶)进行处理。

间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药组(NSAIDs+MSC-EV组)：关节腔注射100μg外泌体(剂型可为凝胶)+非甾体抗炎药塞来昔布24mg·kg^-1灌胃进行治疗。

指标检测：

1)标本采集处理：

1.关节软骨免疫组化检测和组织学分析：

在血清采集完之后，将各组大鼠腹部注射水合氯醛麻醉后，用颈部脱臼法处死大鼠，用咬骨钳和手术刀切取大鼠膝关节软组织和内侧股骨软骨组织，置于10％的福尔马林溶液中固定，利用免疫组化法检测大鼠关节软骨组织中II型胶原、MMP-13、TIMP-1、Aggrecan和versican的表达定位。

参考图4-8，阳性结果为软骨细胞胞质内出现棕黄色深染粒。结果显示，对照组中大鼠关节Ⅱ型胶原表达显著降低，MSC组、间充质干细胞来源外泌体组及间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药组给药均可明显增加Ⅱ型胶原的表达；对照组大鼠关节MMP-13表达增加，各给药组均可显著减少MMP-13的表达。

2.软骨改变性程度分析：

采集膝关节标本，置于多聚甲醛中固定过夜。在4％乙二胺四乙酸溶液中脱钙一个月，脱钙液每天更换一次。将脱钙关节包埋在石蜡中。使用苏木精和曙红(HE)、番红O和甲苯胺蓝对关节股骨内侧髁的切片(4微米)进行染色。根据组织学分析，使用改良的Mankin评分评估软骨退化的严重程度，即：(a)表面完整性(评分1-10分)；(b)细胞结构(评分0-4分)；(c)细胞克隆(评分0-4分)；番红O染色(评分0-5分)。评分越高，表明软骨改变性程度越高。

HE染色结果如图9所示，甲苯胺蓝染色结果如图10所示，番红O染色结果如图11所示。

参考表1。

表1

The photomicrograph of H&E stained were scored by Mankin gradingsystem,including structure,chondrocytes,tidemark.^*P<0.05。

2)模型关节炎的评估：

1.外周关节标准视觉评分：

大鼠处死后，取大鼠膝关节标本，包括股骨髁和胫骨平台。肉眼观察有无关节积液和滑膜增生。在手术显微镜下观察大体标本股骨内、外髁及胫骨内、外侧平台软骨表面退变情况，按Pelletier大体评分标准进行评分，关节面完整，色泽如常(0分)；关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗(1分)；关节面糜烂，骨缺损深达软骨表层或中层(2分)；关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层(3分)；软骨剥脱，软骨下骨暴露(4分)。结果参考图12。

2.影像学检测：

实验结束前以3％戊巴比妥钠麻醉动物，对大鼠手术侧膝关节X线检查，观察动物关节腔大小、骨赘形成、骨质硬化等变化，以判定模型成型情况；给药结束前同法处理动物，行手术侧膝关节X线检查。并以凯尔格伦-劳伦斯(Kelgren-Lawrence)分级标准进行评分，完全正常，无X线片改变(0分)；可疑的关节腔狭窄(joint space narrowing，JSN)和可能的唇样性增生(1分)；明确的骨赘(osteophyte，OP)形成及可能的JSN(2分)；中等OP及明确的JSN，骨质硬化及可能的骨形态改变(3分)；较大的OP，明确的JSN，严重骨质硬化，骨畸形(4分)。

结果参考表2所示。

表2

结果显示，模型关节腔大小明显变窄、部分可见明显的骨赘形成和骨质硬化，给药可显著减轻关节骨质硬化，改善了关节腔大小；X线评分统计结果显示，给药可显著降低X线评分等级，以间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药组改善最为明显。

经过大量实验研究发现，间充质干细胞来源外泌体凝胶可提高软骨细胞存活率，将间充质干细胞来源外泌体凝胶注射至SD大鼠关节腔内，ECM和II型胶原蛋白增加，当间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药，也可以较佳的提高ECM和II型胶原酶的含量，减轻骨关节炎的症状。并且，本发明通过构建SD大鼠OA模型，间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药能够显著降低IL-1β和TNF-a的表达，减轻骨关节炎的症状，增加大鼠的活动程度。因此，间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药治疗骨关节炎兼顾了软骨再生和抗炎止痛，有效镇痛有助于改善生活质量，为治疗骨关节炎的新思路。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在制备预防或治疗骨关节疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于人或其他哺乳动物，优选地，所述间充质干细胞的来源包括脐带华通氏胶、脐带血、骨髓、牙龈、胎盘、羊膜、绒毛膜、外周血、脂肪和皮肤中的一种。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源外泌体的表达标记物为TSG1001、CD9、CD63和CD81。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源外泌体的剂型包括凝胶、注射液、脂质体、冻干粉或乳剂，优选地，所述间充质干细胞来源外泌体的剂型为凝胶。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非甾体抗炎药包括布洛芬、依托考昔、艾瑞昔布、塞来昔布、双氯芬酸、酮洛芬、吲哚美辛、萘普生、美洛昔康、萘丁美酮和吡罗昔康中的任意一种。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源外泌体的用量为100-1000μg。

7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源外泌体为腔内注射、静脉输注或外用。

8.间充质干细胞来源外泌体联合非甾体抗炎药在降低骨关节炎患者的IL-1β和TNF-a的表达，提高ECM和II型胶原酶的含量，抑制滑膜细胞增殖中的应用。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括间充质干细胞来源外泌体和其他治疗骨关节炎药物，所述其他治疗骨关节炎药物包括非甾体抗炎药、正清风痛宁、甲氨蝶呤、氨基葡萄糖、透明质酸钠、糖皮质激素、基因药物、细胞药物、生物制剂、二磷酸盐、地舒单抗、蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角蛋白及其衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物或甲壳素衍生物。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含0.1至100mg/kg体重的多糖或糖胺聚糖。

11.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含0.1至100mg/kg体重的抗炎化合物。

12.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中间充质干细胞来源外泌体的用量为100-1000μg。

13.如权利要求9-12任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的注射周期为1-2次/周或者2-3周一次；疾病稳定期为3个月注射一次药物组合物。

14.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨关节疾病选自骨关节炎、退行性关节炎、及其中涉及急性或慢性骨关节症状的其它炎症性疾病。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述其它炎症性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、骨质疏松、脊椎关节炎、强直性脊柱炎或痛风。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述急性或慢性骨关节症状选自疼痛、活动性和/或功能。

17.一种药盒，其包含：

含有如权利要求9-13任一项所述的药物组合物的瓶；